PL243304B1 - Hydrolaza peptydoglikanowa, kompozycje ją obejmujące, jej zastosowania oraz sposób hydrolizy ją wykorzystujący - Google Patents

Hydrolaza peptydoglikanowa, kompozycje ją obejmujące, jej zastosowania oraz sposób hydrolizy ją wykorzystujący Download PDF

Info

Publication number
PL243304B1
PL243304B1 PL438431A PL43843121A PL243304B1 PL 243304 B1 PL243304 B1 PL 243304B1 PL 438431 A PL438431 A PL 438431A PL 43843121 A PL43843121 A PL 43843121A PL 243304 B1 PL243304 B1 PL 243304B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
aurr
glycine
peptidoglycan
bacteria
active form
Prior art date
Application number
PL438431A
Other languages
English (en)
Other versions
PL438431A1 (pl
Inventor
Izabela SABAŁA
Piotr Henryk MAŁECKI
Piotr Henryk Małecki
Karolina TROCHIMIAK
Karolina Trochimiak
Elżbieta JAGIELSKA
Elżbieta Jagielska
Weronika AUGUSTYNIAK
Weronika Augustyniak
Original Assignee
Miedzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komorkowej W Warszawie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Miedzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komorkowej W Warszawie filed Critical Miedzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komorkowej W Warszawie
Priority to PL438431A priority Critical patent/PL243304B1/pl
Priority to EP22838102.6A priority patent/EP4367230A1/en
Priority to PCT/PL2022/050043 priority patent/WO2023282776A1/en
Publication of PL438431A1 publication Critical patent/PL438431A1/pl
Publication of PL243304B1 publication Critical patent/PL243304B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
    • C12N9/6416—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24075—Lysostaphin (3.4.24.75)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01028—N-Acetylmuramoyl-L-alanine amidase (3.5.1.28)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest aktywna forma AurR, będąca - hydrolazą peptydoglikanową - zdolną do trawienia ścian bakterii Gram(+) posiadających mostki sieciujące w peptydoglikanie zbudowane z glicyny i/lub glicyny i seryny, kompozycje ją obejmujące, ich zastosowania oraz sposób hydrolizy peptydoglikanów. Aktywna forma białka AurR, przełamuje oporność bakterii Gram(+) wobec znanych enzymów zdolnych jedynie do hydrolizy ścian komórkowych z glicynowymi mostkami sieciującymi w peptydoglikanie i trawi ściany komórkowe z mostkami sieciującymi glicynowo-serynowymi.

Description

DZIEDZINA TECHNIKI
Przedmiotem wynalazku jest aktywna forma białka AurR, będąca hydrolazą peptydoglikanową zdolną do trawienia ścian bakterii Gram(+) posiadających mostki sieciujące w peptydoglikanie zbudowane z glicyny i/lub glicyny i seryny, kompozycje ją obejmujące, ich zastosowania oraz sposób hydrolizy peptydoglikanów ją wykorzystujący. Aktywna forma białka AurR, przełamuje oporność bakterii Gram(+) wobec znanych enzymów zdolnych jedynie do hydrolizy ścian komórkowych z glicynowymi mostkami sieciującymi w peptydoglikanie.
STAN TECHNIKI
Infekcje spowodowane bakteriami z rodzaju Staphylococcus, w szczególności Staphylococcus aureus, są coraz trudniejsze do leczenia ze względu na szeroko rozpowszechnioną lekooporność. Z tych względów coraz ważniejsze jest opracowanie nowych terapii zwalczających zakażenia gronkowcowe i eliminacja nosicielstwa, szczególnie wśród personelu medycznego, lecz także opracowanie bardziej skutecznych sposobów eliminacji tej bakterii ze środowiska, w tym szpitalnego. Bakterie z rodzaju Staphylococcus (gronkowce) są odpowiedzialne za cały szereg zakażeń u ludzi i zwierząt, a wiele gatunków Staphylococcus jest opornych na antybiotyki; szacuje się, że 30-50% ludzi jest nosicielami tych bakterii. Choroby dermatologiczne i zapalne mogą być powodowane przez różne gatunki bakterii, w tym gronkowce. Mogą występować spontanicznie lub np. w ranie, wrzodzie lub oparzeniu. Zakażone rany mogą stanowić zagrożenie dla życia. Dodatkowo, bakterie tworzące biofilm mogą być obecne w zakażonych ranach lub rany mogą być nimi zakażone wtórnie. Szczególnie niebezpieczne są zakażenia szczepami Staphylococcus aureus opornymi na antybiotyki, takimi jak szczepy MRSA (oporne na metycylinę Staphylococcus aureus). Zakażenia gronkowcowe są szczególnie częste w przypadku stopy cukrzycowej, odleżyn i oparzeń.
Wiadomo, że gronkowce, w szczególności S. aureus, są często przyczyną zatruć pokarmowych, gdyż wytwarzają peptydowe, termostabilne enterotoksyny wywołujące intoksykację. Ze względu na wielkotonażowy charakter produkcji przemysłu spożywczego, możliwe jest w nim zastosowanie enzymów niszczących gronkowce do poprawy mikrobiologicznej jakości żywności, jedynie przy niedrogiej i dużej dostępności takich enzymów. Wiadomo również, że bakterie z rodzaju Staphylococcus, również S. simulans , są patogenami zwierząt takich jak krowy, owce, kozy czy konie. Podobnie jak S. aureus, S. simulans powszechnie wiązany jest z zapaleniem gruczołu mlekowego u bydła (mastitis). Mimo, że zakażenia człowieka przez S. simulans są rzadkie, są spotykane u osób zajmujących się zwierzętami hodowlanymi. S. simulans związany jest też z infekcjami kostno-stawowymi, zapaleniem wsierdzia czy cukrzycowym zapaleniem kości [8].
Jednym z nowatorskich podejść eliminowania patogennych bakterii, szczególnie tych opornych na antybiotyki, jest lizowanie komórek bakteryjnych z wykorzystaniem enzymów litycznych. Znane są metody lizy komórek bakteryjnych lub uszkadzania ścian komórek bakteryjnych wymagające naruszenia struktury ściany przy pomocy specyficznych wobec niej enzymów bakteriolitycznych - hydrolaz peptydoglikanowych. Szczególnie dotyczy to bakterii Gram(+), ze względu na specyficzną budowę ich ścian komórkowych. Wiadomo, że ściany komórkowe bakterii Gram(+) różnią się między sobą rodzajem i ilością aminokwasów występujących w mostkach wiążących łańcuchy peptydoglikanów. Hydrolazy peptydoglikanowe dla swojej aktywności mogą wymagać występowania określonej kompozycji aminokwasowej i minimalnej ilości aminokwasów w mostkach sieciujących peptydoglikanów. W przypadku większości gronkowców mostek sieciujący peptydoglikanu składa się z pięciu glicyn i jest on substratem dla enzymów litycznych. Znane są hydrolazy peptydoglikanowe, jak lizostafyna i LytM, które tną mostki pięcioglicynowe charakterystyczne dla peptydoglikanów Staphylococcus np. S. aureus, i dzięki tej właściwości są one interesujące, jako potencjalne środki przeciwgronkowcowe.
Rola biologiczna lizostafyny jest dobrze poznana. Lizostafyna jest bakteriocyną wydzielaną przez Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Dojrzałe białko jest nieaktywne w stosunku do produkującego go organizmu, ale jest bardzo efektywne w cięciu ścian Staphylococcus aureus. Dojrzała lizostafyna jest białkiem monomerycznym, dla którego optymalna temperatura działania enzymu wynosi około 37-40°C, pH 7,5 a punkt izoelektryczny pI wynosi 9,5 [1,2]. Lizostafynę stosowano do niszczenia biofilmów S. aureus i S. epidermidis na sztucznych powierzchniach i testowano do pokrywania cewników [3]. W modelu mysim, lizostafyna była używana do usuwania biofilmów z cewnikowanych żył szyj nych i do leczenia zakażeń systemowych [4]. W modelu szczurzym (bawełniak) krem z lizostafyną efektywnie eliminował S. aureus z nosów zakażonych szczurów [5]. U ludzi lizostafyna była używana tylko na poziomie eksperymentalnym do leczenia zapalenia zastawki aortalnej serca spowodowanego przez gronkowca złocistego opornego na metycylinę [6].
Inny, komercyjnie dostępny enzym, Aurezyna, będący domeną katalityczną autolizyny LytM z gronkowca złocistego ma specyficzność i mechanizm działania podobne do lizostafiny [7]. Aurezyna jest endopeptydazą zdolną do trawienia wiązań w mostkach pentaglicynowych ścian komórkowych gronkowców. Posiada unikalne właściwości - jest aktywna w warunkach niskiej siły jonowej (nawet w wodzie) i w niskiej temperaturze. Z powodzeniem jest stosowana do lizy komórek gronkowców podczas izolacji DNA, RNA i białek. Dzięki zdolności do szybkiej lizy, zarówno Aurezyna, jak i inne enzymy mogą być stosowane w testach diagnostycznych do identyfikacji i oznaczania gronkowców.
Niektóre bakterie wytworzyły jednak mechanizm oporności na te enzymy, np. Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus na produkowaną przez siebie lizostafynę [9, 10]. Jest to bardzo poważne ograniczenie we wprowadzeniu lizostafyny na rynek i wciąż poszukiwane są sposoby pokonania tego problemu [11]. Gen kodujący lizostafynę zlokalizowany jest na plazmidzie pACK1. Na tym samym plazmidzie kodowany jest gen oporności (endopeptidase resistance gene, epr lub lysostaphin immunity factor, lif). Obecność genu lif, również u innych gatunków gronkowców, powoduje zwiększenie zawartości seryny i zmniejszenie zawartości glicyny w ścianie komórkowej bakterii. Uważa się, że podstawienie jednej lub kilku glicyn resztami serynowymi w mostku pentaglicynowym determinuje oporność na działanie lizostafyny [12, 13]. Podobnie jak w przypadku antybiotyków, geny warunkujące oporność na lizostafynę kodowane są na ruchomych elementach genetycznych. W związku z tym, istnieje możliwość rozprzestrzeniania się oporności. Badania dowiodły, że gatunki gronkowców wrażliwe na działanie lizostafyny, po przyjęciu konstruktu zawierającego gen oporności stawały się mniej wrażliwe lub całkowicie oporne na działanie tego enzymu [16, 17]. Pojawienie się potencjalnej oporności na lizostafynę i inne enzymy lityczne o takiej samej specyficzności jest jednym z głównych czynników ograniczających wykorzystanie tych enzymów w zwalczaniu gronkowców. Z tego względu, wyjątkowo istotne staje się poszukiwanie nowych enzymów bakteriolitycznych, które cechowałyby się poszerzoną specyficznością działania i były równie efektywne w lizowaniu gronkowców także ze zmodyfikowanymi mostkami sieciującymi. Bakterie, które zamiast typowych mostków pentaglicynowych, wykształciły mostki z podstawioną seryną są oporne na powszechne stosowane lizostafynę czy też różne formy hydrolaz M23, w tym wobec LytMCD opisanej w WO2012/144912 czy też różnych form LytMCD_LssCWT opisanych jako Chimery A i Chimery B w WO2021/0759888. Lizostafyna nie jest aktywna względem szczepów posiadających serynę w mostkach wiążących takich jak: S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus czy S. warneri czy S. aureus z wprowadzoną do mostków sieciujących seryną.
Enzym używany do zwalczania infekcji gronkowcowych u ludzi i zwierząt powinien mieć szerokie spektrum działania względem bakterii posiadających mostki sieciujące w peptydoglikanie i wykazywać aktywność hydrolazy peptydoglikanowej względem glicynowych mostków sieciujących, jak również względem mostków, w których jedna lub dwie glicyny zostały podstawione przez serynę, tj. również mostki glicynowo-serynowe - jak te występujące u S. simulans. Ani lizostafyna ani Aurezyna nie są jednak aktywne względem szczepów gronkowców posiadających serynę w mostkach sieciujących. Także chimery opisane w WO2021/0759888, które składają się z domeny katalitycznej LytM i domeny wiążącej ściany komórkowe lizostafyny, choć są aktywne w warunkach fizjologicznych, nie mają zdolności lizowania gronkowców z serynami w mostkach sieciujących. Dlatego poszukiwane i niezwykle potrzebne są enzymy, które miałyby zdolność cięcia nie tylko mostków glicynowych, ale także mostków glicynowych z podstawioną seryną/serynami (mostki glicynowo-serynowe).
UJAWNIENIE WYNALAZKU
W świetle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie wskazanych niedogodności i dostarczenie enzymu litycznego o aktywności endopeptydazy działającego względem ścian bakterii Gram(+) zawierających zarówno mostki pięcioglicynowe, jak również substytucję reszt glicynowych przez reszty serynowe w mostkach sieciujących łańcuch peptydoglikanów, w szczególności względem S. aureus opornego na działanie dostępnych endopeptydaz glicylo-glicynowych, który to enzym będzie wytwarzany w sposób wydajny, będzie stabilny, zapewni wysoką specyficzność działania względem substratu oraz wysoką aktywność, jak również będzie działać efektywnie w szerokim zakresie pH.
Gen, KXA44996, kodujący białko AurR o długości 410 aminokwasów z Staphylococcus simulans, DSM20322 został zidentyfikowany w genomie Staphylococcus simulans, DSM20322 [18], wyizolowany, sklonowany i zsekwencjonowany przez twórców niniejszego wynalazku. Białko AurR o pełnej długości składa się z trzech domen funkcjonalnych (Fig. 1): (1) N-terminalnej domeny regulatorowej, (2) domeny katalitycznej AurR tj. CDAurR o sekwencji charakterystycznej dla białek z rodziny M23 różnej od lizostafyny, oraz (3) domeny CWTAurR - C-terminalnej domeny wiążącej ścianę komórkową bakterii (CTW od Cell Wall Targeting). SP - jest 36 aminokwasowym peptydem sygnalnym, L - linkerem umieszczonym między CDAurR a CWTAurR.
Nieoczekiwanie okazało się, że aktywna forma AurR jest hydrolazą peptydoglikanową o rozszerzonej aktywności substratowej, która nie tylko podobnie jak LytM czy lizostafyna tnie glicynowe mostki sieciujące w ścianie komórek gronkowców prowadząc do lizy komórek bakteryjnych, ale w przeciwieństwie do w/w enzymów aktywna forma AurR ma zdolności przecinania także mostków, w których jedna lub dwie glicyny zostały podstawione przez serynę/y (mostków glicynowo-serynowych). Hydrolazą peptydoglikanową w postaci aktywnej formy AurR przełamuje więc mechanizm oporności bakterii na hydrolazy glicylo-glicynowe, gdy mostki sieciujące w peptydoglikanie zbudowane są z glicyny i seryny.
Twórcy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że stabilna i aktywna forma białka AurR ze Staphylococcus simulans, zawierająca domenę katalityczną CDAurR przezwycięża wskazane niedogodności, gdyż lizuje zarówno ściany bakterii zawierające pentaglicynę, jak również te zawierające serynę lub dwie seryny w mostku sieciującym. Aktywna forma AurR jest w stanie efektywnie degradować ściany bakterii Gram(+), szczególnie S. aureus i S. simulans w szerokim zakresie warunków, w tym w środowisku podobnym do warunków fizjologicznych zarówno o niskiej jak i wysokiej konduktywności, w szerokim zakresie stężenia soli, w tym w wysokim stężeniu soli, jak również działa efektywnie w szerokim zakresie pH.
Twórcy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że aktywna forma białka AurR z Staphylococcus simulans zawierająca domenę katalityczną CDAurR lizuje zarówno bakterie zawierające pentaglicynę, jak i te z seryną/serynami w mostku sieciującym i jest w stanie efektywnie degradować ściany bakterii Gram(+), szczególnie S. aureus i S. simulans. Aktywne formy białka AurR według wynalazku wykazują również wysoką stabilność.
Istota niniejszego wynalazku opiera się więc na znalezieniu aktywnej formy białka AurR kodowanego przez KXA44996 z Staphylococcus simulans wykazującego nowe nieznane dotychczas właściwości enzymatyczne i wykazaniu, że możliwe jest wykorzystanie aktywnej formy AurR do prowadzenia proteolizy substratu peptydowego przykładowo ścian bakterii Gram(+) zawierającego resztę serynową oprócz reszt glicynowych.
Wynalazek dotyczy hydrolazy peptydoglikanowej zdolnej do trawienia ścian bakterii Gram(+) posiadających mostki sieciujące w peptydoglikanie zarówno glicynowe jak i glicynowo-serynowe zawierającej aktywną formę białka AurR, która to zawiera jako domenę katalityczną CDAurR, przy czym sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej CDAurR jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1, korzystanej sekwencja CDAurR jest w co najmniej 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1; przy czym mostki sieciujące składają się z co najmniej trzech glicyn lub glicyn i seryny/seryn.
W korzystnej hydrolazie peptydoglikanowej aktywna forma białka AurR jest w postaci jednodomenowej aktywnej formy AurR zawierającej domenę katalityczną CDAurR, ale nie zawierającej domeny wiążącej ścianę komórkową bakterii CWTAurR.
W korzystnej hydrolazie peptydoglikanowej aktywną formę AurR w postaci jednodomenowej stanowi domena katalityczna AurR158-295 o SEQ ID NO: 1.
W korzystnej hydrolazie peptydoglikanowej że aktywną formę AurR w postaci jednodomenowej stanowi AurR- o SEQ ID NO: 4.
W korzystnej hydrolazie peptydoglikanowej aktywna forma białka AurR jest w postaci dwudomenowej aktywnej formy AurR zawierającej domenę katalityczną CDAurR oraz domenę wiążącą ścianę komórkową bakterii CWTAurR, przy czym sekwencja aminokwasowa domeny wiążącej ścianę komórkową bakterii CWTAurR jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2, korzystanej sekwencja CWTAurR jest w co najmniej 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2.
W korzystnej hydrolazie peptydoglikanowej sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej CDAurR połączona jest z sekwencją domeny wiążącej ścianę komórkową bakterii CWTAurR poprzez sekwencję aminokwasową linkera, przy czym korzystną sekwencję linkera stanowią aminokwasy 139-159 z SEQ ID NO: 3.
W korzystnej hydrolazie peptydoglikanowej aktywną formę AurR w postaci dwudomenowej stanowi AurR158-410 o SEQ ID NO: 3.
W korzystnej hydrolazie peptydoglikanowej aktywną formę AurR w postaci dwudomenowej stanowi AurR+o SEQ ID NO: 5.
Wynalazek również dotyczy konstruktu genetycznego kodującego hydrolazę peptydoglikanową według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również kompozycji do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+), która zawiera hydrolazę peptydoglikanową według wynalazku oraz nośnik, przy czym kompozycja przeznaczona jest do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) posiadających w peptydoglikanie mostki sieciujące glicynowe i/lub glicynowo-serynowe.
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej hydrolazę peptydoglikanową według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą do zastosowania jako lek do leczenia chorób i/lub stanów zapalnych wywołanych bakteriami Gram(+) posiadającymi glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, przy czym korzystnie bakterie Gram(+) są wybrane z rodzaju Staphylococcus, korzystnie S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
Wynalazek dotyczy również kompozycji kosmetycznej lub pielęgnacyjnej do zastosowań kosmetycznych, pielęgnacyjnych i higienicznych u ludzi i/lub zwierząt, która zawiera hydrolazę peptydoglikanową według wynalazku, przy czym kompozycja zawiera dodatkowo co najmniej jeden nośnik dopuszczony w zastosowaniach kosmetycznych, pielęgnacyjnych, higienicznych u ludzi i/lub zwierząt i jest przeznaczona do stosowania zewnętrznego.
Wynalazek dotyczy również kompozycji zawierającej hydrolazę peptydoglikanową według wynalazku oraz nośnik do zastosowania jako środek antyseptyczny, środek przeciwbakteryjny, środek do odkażania powierzchni stosowany wobec bakterii Gram(+) posiadających glicynowe i/lub glicynowoserynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, przy czym korzystnie kompozycja stosowana jest wobec bakterii Gram(+) z rodzaju Staphylococcus, korzystnie S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
Korzystnie kompozycja do zastosowania jako środek antyseptyczny, środek przeciwbakteryjny, środek do odkażania powierzchni, jest w postaci płynu, emulsji, żelu, płynu do rozpylania, lotionu, nawilżonej chustki lub opatrunku, korzystnie opatrunek jest w postaci plastra z opatrunkiem, plastra z hydrożelem, gazy z naniesioną kompozycją, opatrunku hydrokoloidowego, opatrunku hydrowłóknistego, opatrunku alginianowego, bandaża z naniesioną kompozycją.
Wynalazek dotyczy również niemedycznego zastosowania hydrolazy peptydoglikanowej według wynalazku i/lub kompozycji do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) według wynalazku do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, przy czym korzystnie bakteriami Gram(+) są bakterie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
Wynalazek dotyczy również niemedycznego zastosowania hydrolazy peptydoglikanowej według wynalazku i/lub kompozycji do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) według wynalazku jako środka bakteriostatycznego lub bakteriobójczego przeciwko bakteriom Gram(+), szczególnie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri, posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, przy czym korzystnie środek stosowany jest w przemyśle spożywczym, szczególnie jako dodatek do żywności dla ludzi i/lub zwierząt lub do odkażania powierzchni i pomieszczeń, które mają kontakt z żywnością lub półproduktami żywnościowymi, korzystniej środek stosowany jest w przemyśle m leczarskim i przetworach mlecznych.
W korzystnym niemedycznym zastosowaniu hydrolazy peptydoglikanowej według wynalazku i/lub kompozycji do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) według wynalazku jako środka bakteriostatycznego lub bakteriobójczego przeciwko bakteriom Gram(+), środek stosowany jest w przemyśle kosmetycznym, korzystnie jako dodatek do kosmetyków polepszający ich jakość mikrobiologiczną, jako dodatek do płynów, kremów, mleczek, lotionów.
W korzystnym niemedycznym zastosowaniu hydrolazy peptydoglikanowej według wynalazku i/lub kompozycji do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) według wynalazku jako środka bakteriostatycznego lub bakteriobójczego przeciwko bakteriom Gram(+), środek stosowany jest w ochronie zdrowia, do odkażania powierzchni narzędzi i przyrządów stosowanych w medycynie i diagnostyce, oraz innych powierzchni, w szczególności powierzchni szpitalnych i laboratoryjnych.
W korzystnym niemedycznym zastosowaniu hydrolazy peptydoglikanowej według wynalazku i/lub kompozycji do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) według wynalazku jako środka bakteriostatycznego lub bakteriobójczego przeciwko bakteriom Gram(+), środek stosowany jest jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w postaci płynu, emulsji, żelu, płynu do rozpylania, lotionu, nawilżonej chustki.
Wynalazek dotyczy również sposobu hydrolizy peptydoglikanów posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące, przy czym sposób obejmuje etapy, w których
a) w środowisku wodnym kontaktuje się aktywną formę AurR według wynalazku z substratem peptydowym posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie;
b) hydrolizuje się substrat peptydowy posiadający glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie.
W korzystnym sposobie hydrolizy peptydoglikanów hydrolizowane są peptydoglikany ścian komórkowych bakterii Gram(+), korzystnie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
W korzystnym sposobie hydrolizy peptydoglikanów etap b) prowadzi się w temperaturze od 4°C do 45°C.
SZCZEGÓŁOWE PRZEDSTAWIENIE WYNALAZKU
Termin „aktywna forma AurR” zgodnie z niniejszym opisem oznacza białka, polipeptydy, peptydy lub rekombinowane białka, polipeptydy i peptydy o aktywności hydrolazy peptydoglikanowej zdolnej do trawienia ścian bakterii Gram(+) posiadających mostki sieciujące w peptydoglikanie zarówno glicynowe, jak i glicynowo-serynowe, które to obejmują domenę katalityczną CDAurR o sekwencji aminokwasowej identycznej lub wykazującej wysoką identyczność do sekwencji aminokwasowej zawierającej aminokwasy od pozycji 158 do 295 w wyjściowym białku AurR kodowanym przez KXA44996 (co odpowiada SEQ ID NO: 1, oraz aa 1-138 SEQ ID NO: 2), korzystnie na poziomie co najmniej 80%, 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczności.
Przykładowe, opisywane w niniejszym opisie w przykładach wykonań, aktywne formy AurR dotyczące AurR158-295 (SEQ ID NO: 1), AurR158-410 (SEQ ID NO: 3), AurR- (SEQ ID NO: 4), AurR+ (SEQ ID NO: 5) wykazują aktywność proteolityczną endopeptydazy względem mostków sieciujących złożonych z glicyny, jak również z substytucją seryny/seryn. Jest oczywistym, że pewne zmiany w sekwencji aminokwasowej polipeptydu aktywnej formy AurR czy też w sekwencji nukleotydowej kodującej taki polipeptyd skutkujące zmianą w sekwencji aminokwasowej nie będą wpływały na zmianę aktywności polipeptydu, szczególnie jeśli zmiany te nie dotyczą centrum aktywnego białka.
Aktywna forma AurR może być (i) jednodomenową aktywną formą AurR, gdy posiada jedynie domenę katalityczną CDAurR - korzystnie na poziomie co najmniej 80%, 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczności z SEQ ID NO: 1, przykładowo jednodomenową aktywną formą AurR są AurR158-295 o SEQ ID NO: 1, AurR- o SEQ ID NO: 4, lub (ii) dwudomenową aktywna formą AurR, gdy posiada zarówno domenę katalityczną CDAurR wykazującą na poziomie aminokwasowym co najmniej 80%, 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczności z SEQ ID NO: 1 jak i domenę wiążącą ścianę komórkową bakterii CWTAurR o sekwencji wykazującą na poziomie aminokwasowym co najmniej 80%, 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczności z SEQ ID NO: 2, lub stanowiącą AurR317-410 SEQ ID NO: 2, przykładową dwudomenową aktywną formą AurR jest AurR158-410 o SEQ ID NO: 3, AurR+ o SEQ ID NO: 5.
Dwudomenowa aktywna forma AurR dzięki domenie CWTAurR zachowuje aktywność w szerszym zakresie pH czy siły jonowej w porównaniu do lizostafyny czy aktywnej formy AurR pozbawionej domeny CWTAurR. Z kolei jednodomenowa aktywna forma AurR jest bardziej stabilna podczas przechowywania w temperaturze 37°C.
Jako warunki o niskiej konduktywności należy rozumieć konduktywność poniżej 10 mS/cm, jako warunki o wysokiej konduktywności należy rozumieć konduktywność powyżej 10 mS/cm.
Jako „substrat peptydowy” czy „substrat białkowy” dla aktywnej formy AurR, zgodnie z ninie jszym opisem należy rozumieć peptyd, polipeptyd czy białko zbudowane z co najmniej trzech glicyn lub glicyn i seryny/seryn, które są rozpoznawane i cięte przez aktywną formę AurR. Substratem peptydowym dla aktywnej formy AurR będą więc w szczególności mostki glicynowe lub glicynowo-serynowe w peptydoglikanach bakterii Gram(+) - S. simulans, S. epidermidis, S. aureus jak również zawierające serynę w mostkach sieciujących, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus haemolyticus i inne.
Do bakterii Gram(+), które zawierają glicyny i ewentualnie seryny w mostkach sieciujących zaliczane są niektóre bakterie z rodzaju Staphylococcus, do których należą gatunki S. aureus, S. epidermidis , S. roseus, S. carnosus, S. lactis, S. saprophyticus oraz z rodzaju Micrococcus takie jak M. caseolyticus, M. candidans, M. naucinus, M. vernae.
Analiza biochemiczna wykazała, że pełnej długości białko AurR nie jest aktywne. Aktywność wykazuje jedynie aktywna forma białka AurR czyli formy enzymu (i) zawierające domenę katalityczną CDAurR z dołączoną domeną CWTAurR wiążącą ściany komórkowe bakterii, przykładowo AurR158-410, AurR+, który jest aktywny w warunkach reakcji w środowisku o wysokiej konduktywności; jak i w warunkach niskiej konduktywności (ii) aktywne formy białka AurR zawierające jedynie domenę katalityczną CDAurR, przykładowo AurR158-295, Aur-, które to są najbardziej aktywne w warunkach niskiej konduktywności. Preferowaną aktywną formą białka AurR jest polipeptyd AurR158-295, AurR158-410, AurR-, AurR+.
Zgodnie z wynalazkiem w sposobie proteolizy, zwłaszcza ścian komórek bakteryjnych Gram(+), kontaktuje się aktywną formę białka AurR z substratem peptydowym, korzystnie ze ścianami bakterii Gram(+), w środowisku wodnym o zróżnicowanej konduktywności. W korzystnym sposobie proteolizy kontaktowanie prowadzone jest w temperaturze w zakresie od około 0°C, korzystniej od około 4°C do około 45°C, korzystniej w zakresie 21°C - 37°C. Ponadto pH środowiska reakcji korzystnie mieści się w zakresie odpowiadającym pH od około 6 do około 9, zwłaszcza mieści się w zakresie od około 7 do około 9. Korzystnie bakteriami Gram(+) są bakterie należące do rodzaju Staphylococcus, korzystnie gatunki wybrane z grupy obejmującej: S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. roseus, S. haemolyticus, S. warneri.
Zgodnie z wynalazkiem kompozycja z aktywną formą białka AurR stosowana jest jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy, zwłaszcza przeciwko bakteriom Gram(+), szczególnie z rodzaju Staphylococcus, zawierającym mostki pięcioglicynowe, jak i takie z substytucją serynową. Korzystna kompozycja jest przeznaczona do odkażania powierzchni, korzystnie jest w postaci płynu, emulsji, żelu, płynu do rozpylania, lotionu lub nawilżonej chustki. Kompozycja może być uzupełniona o odpowiedni nośnik, środek konserwujący, środek zapachowy, bufor, jak również inne składniki użyteczne w eliminacji bakterii w szczególności detergenty, rozpuszczalniki, antybiotyki, bakteriocyny.
Zgodnie z wynalazkiem kompozycja z aktywną formą białka AurR stosowana jest jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w przemyśle spożywczym. Środek stosowany jest szczególnie jako dodatek do żywności dla ludzi i zwierząt lub do odkażania powierzchni.
Zgodnie z wynalazkiem kompozycja z aktywną formą białka AurR stosowana jest jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w ochronie zdrowia. Środek stosowany jest szczególnie do odkażania powierzchni narzędzi i przyrządów stosowanych w medycynie i diagnostyce, oraz innych powierzchni, w szczególności powierzchni szpitalnych i laboratoryjnych, korzystnie stosowany jest przeciwko bakteriom Gram(+), szczególnie należącym do rodzaju Staphylococcus, zawierających zarówno mostki pięcioglicynowe jak również substytucję reszt glicynowych przez reszty serynowe w mostkach sieciujących łańcuchy peptydoglikanów.
Zgodnie z wynalazkiem aktywna forma białka AurR stosowana jest do izolacji struktur komórkowych z bakterii Gram(+). Taka izolacja struktur komórkowych możliwa jest m.in. dla bakterii z rodzaju Staphylococcus, zawierających zarówno mostki pięcioglicynowe jak również substytucję reszt glicynowych przez reszty serynowe w mostkach wiążącym łańcuch peptydoglikanów, zwłaszcza z gatunków wybranych z grupy obejmującej: S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. roseus, S. haemolyticus, S. warneri.
Zgodnie z wynalazkiem aktywna forma białka AurR stosowana jest w diagnostyce bakterii Gram(+) zwłaszcza bakterii należących do rodzaju Staphylococcus.
Zgodnie z wynalazkiem aktywna forma białka AurR stosowana jest do impregnacji lub pokrycia powierzchni narażonych na kontakt z bakteriami Gram(+).
Zgodnie z wynalazkiem aktywna forma białka AurR wchodzi w zestaw do lizy bakterii Gram(+). Liza bakterii prowadzona jest w celu izolacji struktur komórkowych z bakterii Gram(+), w szczególności DNA, RNA, białek, peptydów, glikopeptydów, lipidów lub użytecznych metabolitów.
Aktywna forma AurR może być stosowana jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w medycynie, weterynarii i diagnostyce. Środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy obejmujący aktywną formę AurR będzie stosowany przeciwko bakteriom Gram(+), korzystnie należącym do rodzaju Staphylococcus, zawierających zarówno mostki pięcioglicynowe jak również substytucję reszt glicynowych przez reszty serynowe w mostkach sieciujących łańcuchy peptydoglikanów. Taki środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy stosowany będzie do odkażania powierzchni narzędzi i przyrządów stosowanych w medycynie, weterynarii i diagnostyce, powierzchni szpitalnych i laboratoryjnych oraz jako środek powierzchniowo czynny na powierzchnie, które mogą być zanieczyszczone bakteriami. Taki środek może być stosowany sam albo w kombinacji z innymi składnikami użytecznymi w eliminacji bakterii w szczególności detergentami, rozpuszczalnikami, antybiotykami, bakteriocynami lub innymi enzymami. Stosowany środek może obejmować odpowiedni nośnik, stabilizator, bufor lub inne dodatki. Aktywna forma może być stosowana jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w postaci płynu, emulsji, żelu, płynu do rozpylania, lotionu, nawilżonej chusteczki i im podobnych.
Aktywna forma AurR może być stosowana jako środek do diagnostyki określonych gatunków bakterii Gram(+), korzystnie należących do rodzaju Staphylococcus szczególnie gatunków takich jak przykładowo: S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. roseus, S. haemolyticus, S. warneri. Aktywna forma AurR może być stosowana jako narzędzie do prowadzenia specyficznej proteolizy bakterii w celu bezpośredniej diagnostyki gatunków lub szczepów bakteryjnych jak również w etapie wstępnej lizy komórek w celu dalszej diagnostyki przykładowo metodami takimi jak PCR, hybrydyzacja kwasów nukleinowych, metodami immunologicznymi, i immunofluorescencyjnymi, ELISA i metodami opartymi na zawartości komórek bakteryjnych jak oceny enzymatyczne i inne.
Aktywna forma AurR może być stosowana jako narzędzie do naruszania ścian komórkowych bakterii Gram(+) przykładowo w celu izolacji struktur komórkowych z bakterii Gram(+). Naruszanie ścian komórkowych bakterii w celu ich lizy może być wspomagane dodaniem detergentów, czy innych czynników osłabiających strukturę ściany komórkowej, jak innych enzymów. Naruszanie ścian komórkowych może być również prowadzone w celu uzyskania protoplastów, umożliwienia transformacji komórki bakteryjnej, izolacji materiału genetycznego, białek jak i użytecznych metabolitów przykładowo długołańcuchowych węglowodanów.
Aktywna forma AurR będzie więc wchodziła w skład i stosowana w zestawach przeznaczonych do naruszania ścian komórkowych bakterii Gram(+) przykładowo w celu izolacji struktur komórkowych z bakterii Gram(+). Takie zestawy są również objęte zakresem wynalazku.
Aktywna forma AurR może być stosowana jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w przemyśle spożywczym. Taki środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy stosowany będzie jako dodatek do żywności dla ludzi i zwierząt, do odkażania powierzchni, które mają kontakt z żywnością w szczególności sprzętu, narzędzi i wyposażenia wykorzystywanego w przemyśle spożywczym jak i pomieszczeń, które mają kontakt z żywnością lub półproduktami. Aktywna forma AurR będzie szczególnie stosowana w przemyśle mleczarskim i przetworach mlecznych.
Aktywna forma AurR będzie również stosowana do impregnacji lub pokrycia powierzchni narażonych na kontakt z bateriami Gram(+). Aktywna forma AurR może być stosowana jako połączona z, lub dodana do, nośników typu polimery, kopolimery czy nanonośniki jak nanokulki czy nanorurki, przykładowo nanorurki węglowe. Pokrywane lub impregnowane powierzchnie mogą dotyczyć najróżniejszych powierzchni przykładowo pomieszczeń, narzędzi, maszyn, urządzeń, sprzętu medycznego, diagnostycznego czy laboratoryjnego. Takie pokryte lub zaimpregnowane powierzchnie warstwą obejmującą aktywną formę AurR będą przez dłuższy czas działały bakteriobójczo i/lub bakteriostatycznie na bakterie Gram(+).
Aktywna forma AurR może być stosowana jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w przemyśle kosmetycznym, środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy stosowany będzie jako dodatek do kosmetyków polepszający ich jakość mikrobiologiczną, jako dodatek do płynów, kremów, mleczek, lotionów, lub jako środek do odkażania powierzchni, lub do odkażania różnych powierzchni, sprzętu, narzędzi i wyposażenia wykorzystywanego w przemyśle kosmetycznym.
Dojrzała - forma białka AurR (KXA44996)
Zarówno lizostafyna jak i wyjściowe białko AurR produkowane są w formie trzydomenowej, i wykazują co najwyżej bardzo niską aktywność. AurR jest aktywna w postaci dojrzałej, składającej się z dwóch domen - domeny katalitycznej (CDAurR) i domeny wiążącej ścianę komórkową (CWTAurR). W postaci dwudomenowej została wyprodukowana i wykorzystana w przykładach AurR+, podczas gdy Aur- jest białkiem jednodomenowym z domeną katalityczną.
Rozszerzona aktywność aktywnej formy AurR
Zarówno lizostafyna jak i aktywna forma AurR są aktywne względem bakterii zawierających mostki pięcioglicynowe w peptydoglikanach jak np. te u S. aureus. To co było nieoczywiste i zaskakujące to dodatkowa aktywność aktywnej formy białka AurR, wobec gronkowców ze ścianami komórkowymi, w których mostki sieciujące zbudowane są zarówno z glicyn, jak i seryn, np. w szczepie S. simulans CCM3583.
Brak domeny wiążącej ścianę komórkowa CWTAurR w aktywnej formie AurR
Zarówno lizostafyna, jak i aktywna forma AurR są aktywne względem bakterii zawierających mostki pentaglicynowe w peptydoglikanach, jak np. te u S. aureus. Białka te rozpoznają mostki jako takie, prawdopodobnie przynajmniej częściowo poprzez interakcje z rowkiem w centrum aktywnym. Lizostafyna posiada domenę CWT podobnie jak dwudomenową aktywna forma AurR+, która także posiada własną domenę wiążącą ścianę komórkową CVTAurR, dzięki której zachowuje aktywność w szerszym zakresie pH czy siły jonowej w porównaniu do lizostafyny czy aktywnej formy AurR- pozbawionej domeny CWTAurR. Z kolei białko jednodomenowe, aktywna forma AurR- z domeną CDAurR, ale bez domeny CWTAurR, jest bardziej stabilna podczas przechowywania w temperaturze 37°C i działa szybciej w optymalnych warunkach pH i siły jonowej.
Aktywna forma AurR lizuje efektywnie żywe komórki S. aureus
Twórcy wykazali, że aktywne formy AurR podane z zewnątrz efektywnie lizują żywe komórki bakterii Gram(+), zarówno S. aureus, jak i S. simulans, wiążąc się i prowadząc proteolizę substratów peptydowych ich ścian komórkowych. Podana z zewnątrz aktywna forma białek AurR jednodomenowa lub dwudomenowa hamuje dalszy wzrost gronkowców i działała jako środek bakteriostatyczny i bakteriobójczy prowadząc do lizy komórek S. aureus i S. simulans. Zostało to potwierdzone w przeprowadzonych testach lizowania ścian komórkowych poprzez pomiary zmiany gęstości optycznej zawiesiny komórkowej i monitorowanie redukcji liczby tworzonych kolonii. Wcześniejsze doświadczenia wykazały jedynie zdolność do degradowania ścian komórkowych zawierających pentaglicynę przez lizostafynę. Testy wykazały, że jedno i dwudomenowe aktywne formy AurR są aktywne wobec szczepu S. simulans CCM3583, który posiada mostki sieciujące zawierające reszty glicynowe i reszty serynowe i lizuje komórki bakteryjne z dużo większą efektywnością niż lizostafyna.
Aktywność aktywnej formy AurR i lizostafyny zależy w różny sposób od pH
Aktywność określonej hydrolazy peptydoglikanowej była wyznaczona w teście lizowania ścian komórkowych S. aureus i S. simulans poprzez pomiary zmian gęstości optycznej zawiesiny komórkowej.
Prawdopodobnie ze względu na pozostałą aktywność enzymatyczną innych enzymów w ścianach komórkowych obserwowano nieznaczne zmniejszenie zmętnienia również w kontroli, przy nieobecności egzogennie dodanego enzymu. Dlatego wszystkie wartości OD mierzone przy długości fali 595 nm były wyrażone jako procent kontroli. Wartość zbliżona do 100% wskazuje bardzo małą aktywność, podczas gdy niskie OD wskazuje na wysoką aktywność enzymu. Lizostafyna była bardzo efektywna w pH około 7-9 i nieco mniej w pH 10 względem komórek S. aureus. Zakres aktywności dwudomenowej aktywnej formy białka AurR względem komórek S. aureus jest znacznie szerszy i znajduje się w całym testowanym zakresie od pH 5.4 do pH 10.9, będąc najbardziej aktywnym przy pH 7-10. Jednodomenowa aktywna forma białka AurR jest aktywna w przedziale pH 6-8, zachowując największą aktywność w pH 6-7. Większy reżim obserwuje się przy lizie komórek S. simulans, gdzie lizostafyna posiada nieznaczną aktywność w przedziale pH 5,4-8, podczas gdy dwudomenową aktywna forma białka AurR lizuje komórki S. simulans znacznie efektywnej w pH 5,4-8, przy optimum w pH 7-8. Jednodomenowa aktywna forma białka AurR wykazuje wysoką aktywność w zakresie pH 5,4-8, największą aktywność w pH około 7.
Zależność aktywności aktywnej formy białka AurR i lizostafyny od konduktywności (przewodności właściwej) środowiska reakcji
Nieoczekiwanie okazało się, że wydajność lizy bakterii przez aktywną formę białka AurR zależy w oczywisty sposób od konduktywności (przewodności właściwej) środowiska reakcji (Fig. 4), przy czym ta zależność jest zmienna w zależności od typu lizowanych komórek, S. aureus czy S. simulans. W buforach o niskiej konduktywności degradacja ścian komórkowych S. aureus przez jednodomenową aktywną formę AurR jest bardziej efektywna, w przeciwieństwie do dwudomenowej aktywnej formy AurR która działa najlepiej w buforach o wyższej konduktywności natomiast jest mniej skuteczna w buforach o niskiej konduktywności.
Konduktywność odzwierciedla oba parametry łącznie tj. stężenie jonów i ich ruchliwość. Sprawdzono wpływ konduktywności na aktywność jednodomenowej i dwudomenowej aktywnej formy AurR w roztworach o zmieniającej się sile jonowej przez zmianę stężenia NaCl w zakresie od 0 do 250 mM. Liza komórek S. simulans przez dwudomenową aktywną formę AurR jest najbardziej efektywna przy umiarkowanej i niskiej sile jonowej, od 0,1 mS/cm do 10 mS/cm podczas gdy efektywność lizy komórek S. aureus nieznacznie się różni w przedziale od 0,1 mS/cm do 20 mS/cm.
Zależność aktywności aktywnej formy AurR od temperatury
Wykazano, że zarówno jedno i dwudomenowe aktywne formy AurR są białkami stabilnymi i działającymi efektywnie w szerokim zakresie temperatur od około 4°C do około 45°C. Enzymy te działają już w temperaturze 4°C.
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są również niniejszym włączone jako referencje.
KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Fig. 1. przedstawia (A) schematycznie organizację domen w białku AurR o pełnej długości kodowanym przez gen z locus KXA44996: SP - peptyd sygnalny, ND - domena N-terminalna, CD - domena katalityczna, CWT - domena rozpoznająca ściany komórkowe, L - linker łączący CD i CWT. Zakresy wzięte w klamrę oznaczają zasięg domenowy przedstawionych białek: AurR- jednodomenowej aktywnej formy AurR składającej się z domeny katalitycznej CDAurR i AurR+ dwudomenowej aktywnej formy AurR składającej się z domeny katalitycznej CDAurR połączonej linkerem (L) z domeną rozpoznającą ścianę komórkową CWTAurR; (B) szczegółowy zakres domen i sekwencja AurR+. (C) przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowych Chimery A (opisanej w WO2021/0759888) z AurR+ oraz (D) Lss z AurR+ wraz z podaniem statystyki uzyskanych wyników przyrównania sekwencji.
Fig. 2. przedstawia zależność spadku liczby kolonii i spadku OD595 pod wpływem działania enzymu AurR- w trzech różnych stężeniach w porównaniu z lizostafyną (Lss), K - kontrola - brak dodanego enzymu. (A) Spadek CFU S. simulans przedstawiony w skali logarytmicznej w 5, 15, 30, 70 i 125 min. (B) Liza komórek S. simulans monitorowana przy OD595. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) zawiesiny komórkowej S. simulans. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji prowadzonych przez 125 min. przy pomiarach co 2,5 min w optymalnych buforach dla enzymów. (C) Spadek CFU S. aureus przedstawiony w skali logarytmicznej po 5, 15, 30, 70 i 125 min. (D) Liza komórek S. aureus monitorowana przy OD595. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) zawiesiny komórkowej S. aureus. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji prowadzonych przez 125 min. przy pomiarach co 2,5 min w optymalnych buforach dla enzymów.
Fig. 3. Przedstawia zależność spadku ilości jednostek tworzących kolonię i spadku OD595 pod wpływem działania enzymu AurR+ w trzech różnych stężeniach w porównaniu z lizostafyną (L ss). C kontrola (brak enzymu). (A) Spadek CFU S. simulans przedstawiony w skali logarytmicznej w 5, 15, 30, 70 i 125 min. (B) Liza komórek S. simulans monitorowana przy OD595. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) zawiesiny komórkowej S. simulans. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji prowadzonych przez 125 min. przy pomiarach co 2,5 min w optymalnych buforach dla enzymów. (C) Spadek CFU S. aureus przedstawiony w skali logarytmicznej w 5, 15, 30, 70 i 125 min. (D) Liza komórek S. aureus monitorowana przy OD595. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) zawiesiny komórkowej S. aureus. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji prowadzonych przez 125 min. przy pomiarach co 2,5 min w optymalnych buforach dla enzymów.
Fig. 4. Przedstawia wpływ siły jonowej buforu reakcyjnego na aktywność lityczną AurR- linia ciągła i AurR-i- linia przerywana na S. aureus. Liza była prowadzona w 50 mM buforze glicynowym pH 8.0 uzupełnionym o NaCl o stężeniach od 0 do 250 mM. Ze względu na stały trend pokazano wyniki do 150 mM NaCl. Konduktywność roztworu reakcji mierzono w temperaturze pokojowej. Wyniki są wyr ażone jako % początkowego OD (%OD595) zawiesiny komórkowej - 100%. Przedstawione wyniki zostały zebrane po 45 min. prowadzenia lizy w temperaturze pokojowej.
Fig. 5. Przedstawia porównanie aktywności Lss (A), AurR- (B) i AurR+ (C) w różnych warunkach pH wobec S. aureus. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) zawiesiny komórkowej S. aureus. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji w 60 min.
Fig. 6. Przedstawia porównanie aktywności Lss (A), AurR- (B) i AurR+ (C) w różnych warunkach pH wobec S. simulans. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) zawiesiny komórkowej S. simulans. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji w 100 min.
Fig. 7. Przedstawia porównanie aktywności AurR- i AurR+ wobec S. aureus (A) i (B) i AurRi AurR+ wobec S. simulans (C) i (D) w obecności czynnika chelatującego metale - fenanatroliny. Używano różnych stężeń fenantroliny (0,12 mM - 2 mM) i dla porównania pokazano również aktywność enzymu bez fenantroliny - 0. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) badanej zawiesiny komórkowej. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji po w 60 min.
Fig. 8. Przedstawia porównanie aktywności AurR- i AurR+ wobec S. aureus (A) i (B) i AurRi AurR+ wobec S. simulans (C) i (D) w obecności różnych stężeń czynnika chelatującego metale EDTA. Używano różnych stężeń EDTA (0,6 mM - 250 mM) i dla porównania pokazano również aktywność enzymu bez EDTA - 0. Na figurze przedstawiono zakres stężeń przy których obserwowano zmiany aktywności. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) badanej zawiesiny komórkowej. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji w 60 min.
Fig. 9. Przedstawia porównanie wpływu temperatury przechowywania enzymów na lizę komórek bakteryjnych: AurR+ na S. aureus i S. simulans (A) i (B) i AurR- na S. aureus i S. simulans (C) i (D). Enzymy były przechowywanie odpowiednio w -80°C, 4°C, 21°C i 37°C przez 2, 6, 16, 44 dni. Wyniki są wyrażone jako % wartość aktywności świeżego enzymu wyrażonego jako 100%. Na wykresie przedstawiono wyniki uzyskane dla reakcji po 60 min.
Fig. 10. Przedstawia porównanie wpływ temperatury dla enzymów AurR- i AurR+ na lizę komórek bakteryjnych S. aureus (A) i S. simulans (B). Reakcje prowadzone były w temperaturze 4°C, 21 °C, 37°C i 45°C przez 60 min. Wyniki są wyrażone jako % początkowego OD (%OD595) badanej zawiesiny komórkowej.
SPOSOBY WYKONANIA WYNALAZKU
Poniższe przykłady umieszczono jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
PRZYKŁADY
Przykład 1
Wytwarzanie różnych form AurR produktu genu ΚΧΑ44996.
Na podstawie analizy przewidywanej sekwencji białka AurR i porównanie jej do innych znanych domen zdefiniowano obecność co najmniej dwóch domen: katalitycznej (CD) i wiążącej (CWT) połączonych krótkim peptydem (Fig. 1A, B). Sekwencje aminokwasową AurR porównano z sekwencjami dojrzałej lizostafyny i Chimery A składających się z domen katalitycznych i domeny wiążącej CWT (Fig. 1C, D). W obydwu przypadkach poziom identyczności wynosił około 64%, a podobieństwa 72%.
Wyizolowano genomowe DNA Staphylococcus simulans DSM 20322. Fragmenty DNA odpowiadające domenie katalitycznej 158-295 białka wyjściowego AurR i domenie katalitycznej łącznie z domeną wiążącą 158-410 białka wyjściowego AurR zastały namnożone metodą PCR z wykorzystaniem genomowego DNA Staphylococcus simulans DSM 20322 jako matrycy, wstawione do wektora pET30. Sekwencja kodująca była poprzedzona metką His-tag o sekwencji aminokwasowej MHHHHHH połączonej z sekwencją rozpoznawaną przez proteazę TEV. Zarówno jednodomenowa, jak i dwudomenowa aktywna forma AurR okazała się występować w formie ciał inkluzyjnych, więc wprowadzono fuzyjną domenę MBP (Maltose Binding Domain) celem zwiększenia rozpuszczalności białek. Rozpuszczalną formę białek AurR- i AurR+ otrzymano przez ekspresję konstruktów w E. coli szczep BL21(DE3). Ekspresję indukowano podczas fazy logarytmicznej wzrostu bakterii na pożywce LB przy OD595 około 1 stosując 1 mM IPTG i kontynuowano przez 16 h w 18°C. Rekombinowane białka oczyszczano metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie agarozowej Ni-NTA (Qiagen), proteazą TEV odcinano Histag w przypadku dwudomenowej aktywnej formy AurR, nazwanej AurR+ i His- tagowanego MBP w przypadku jednodomenowej aktywnej formy AurR, nazwanej AurR-, a następnie oczyszczano przez filtrację w żelu na kolumnie Superdex™ 75 pg (GE Healthcare) zgodnie z zaleceniami producentów. Po uprzednim odcięciu odpowiednio sekwencji His-tag i His-tagowanego MBP, otrzymane oczyszczone preparaty AurR+ o SEQ ID NO: 5 oraz AurR- o SEQ ID NO: 4 wykorzystywano w dalszych doświadczeniach jako stabilne aktywne formy białka AurR.
Dojrzała forma lizostafyny (Lss) używana w przykładach porównawczych została również wyprodukowana w ten sam sposób [19].
PL 243304 Β1
Przykład 2
Wpływ enzymów AurR+ i AurR- na komórki bakteryjne S. aureus i S. simulans.
Przeprowadzono test lizowania ścian komórkowych poprzez pomiary zmian gęstości optycznej zawiesiny komórkowej (ang. turbidity reduction assay) z jednoczesnym określeniem liczby bakterii poprzez pomiar jednostek tworzących kolonię CFU.
Komórki bakteryjne S. aureus i S. simulans hodowane w pożywce TSB w 37°C z wytrząsaniem 80 rpm) zbierano w logarytmicznej fazie wzrostu, wirowano, przemywano i zawieszano w buforze do testowania 50 mM glicyna o pH 8 do uzyskania OD595 około 1. Enzym AurR i AurR+ otrzymany w Przykładzie 1 dodawano do stężeń końcowych 200 nM, 100 nM i 50 nM a lizostafynę do 200 nM. 200 μΙ mieszaniny reakcyjnej przenoszono na płytkę mikrotitracyjną. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej z 10 sekundami wytrząsania, co 2,5 min. OD zawiesiny mierzono przy długości fali 595 nm przez 125 minut od rozpoczęcia reakcji. Jako kontrolę stosowano lizostafynę i bakterie zawieszone w buforze bez enzymu. Każdy eksperyment przeprowadzono dwa razy w trzykrotnych powtórzeniach. Wyniki pomiarów przedstawiono na Fig. 2B, D oraz Fig. 3B, D. Równolegle 1 ml mieszanin o takim samym składzie inkubowano w temperaturze pokojowej. Pobierano 100 μΙ roztworu w czasie 5, 15, 30, 70 i 125 min. Wykonywano rozcieńczenia od 10 do 107 przez seryjne pobieranie 20 μΙ próbki i mieszanie jej z 180 μΙ buforu z dodatkiem 2 mM inhibitora metalopeptydaz - phenantroliny. Pobierano 5 μΙ każdego rozcieńczenia i nakładano na szalki Petriego z pożywką TSB z agarem, które następnie inkubowano 24 h w 37°C. Kolonie liczono i określano liczbę CFU. Wyniki pomiarów przedstawiono na Fig. 2A, C i Fig. 3A, C. Podsumowane wyniki dla testów redukcji CFU S. simulans przedstawiono w Tabeli 1 a redukcji CFU S. aureus w Tabeli 2. Pokazano spadek rzędów wielkości liczby komórek i procent redukcji początkowej liczby komórek bakteryjnych w czasie. Wykazano w obecności enzymów zależność zmiany gęstości zawiesiny komórkowej poprzez pomiar OD ze spadkiem liczby komórek bakteryjnych. Tym samym wykazano skuteczność enzymów AurR- i AurR+ w lizowaniu komórek S. aureus posiadających mostki pięcioglicynowe, jak również komórek S. simulans zawierających w mostkach sieciujących seryne/y. Wykazano dużo wyższą aktywność enzymów AurR- i AurR+ wobec S. simulans w porównaniu do lizostafyny.
Tabela 1. Średnia z rzędu wielkości redukcji liczby komórek i średnia z % redukcji początkowej liczby komórek S. simulans przez enzymy AurR- i AurR+ w czasie ± odchylenie standardowe
Rząd wielkości redukcji liczby komórek % redukc i początkowej liczby komórek
30 min 70 min 125min 30 min 70 min 125min
AurR+ 200nM 2,0 + 0,0 2,5 ± 0,5 3,0 ± 0,0 98,6 ±0,2 99,7 ± 0,2 99,9 ± 0,0
AurR+ lOOnM 1,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 86,6 ±0,7 98,6 ± 0,3 99,6 ±0,1
AurR+ 50nM - 0,5 ± 0,5 1,5 ± 0,5 45,0 ± 14,2 76,0 ± 16,8 93,8 ±5,2
AurR- 200nM 2,5 + 0,5 3,5 ± 0,5 4,0 ± 0,0 99,7 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
AurR- lOOnM 1,0 ±0,0 2,0 ± 0,0 3,0 ± 0,0 94,1 ±2,6 98,6 ± 1,0 99,8 ± 0,1
AurR- 50nM 1,0 ±0,0 1,0 ± 0,0 3,0 ± 1,0 87,3 ± 2,4 97,2 ± 1,3 98,9 ± 1,1
Lss 200nM 0,5 ± 0,5 - 0,5 ± 0,5 19,9 ±4,6 54,9 ± 3,8 75,2 ± 10,6
Tabela 2. Średnia z rzędu wielkości redukcji liczby komórek i średnia z % redukcji początkowej liczby komórek S. aureus przez enzymy AurR- i AurR+ w czasie i odchylenie standardowe
Rząd wielkości redukcji liczby komórek % redukcji początkowej liczby komórek
30 min 70 min 125min 30 min 70 min 125min
AurR+ 200nM 3,0 ± 1,0 3,5 ± 0,5 5,5 ± 0,5 99,7 ±0,2 99,9 ± 0,1 100,0 ± 0,0
AurR+ lOOnM 2,5 ± 0,5 2,5 ± 1,5 3,5 ± 0,5 97,7 ±2,2 97,5 ± 2,5 99,9 ± 0,1
AurR+ 50nM 1,0 ± 1,0 1,5 ± 0,5 2,5 ± 0,5 91,0 ±7,6 96,6 ± 2,6 99,7 ± 0,1
AurR- 200nM 4,0 ± 1,0 7,0 ± 1,0 7,0 ± 1,0 100,0 ±0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
AurR- lOOnM 3,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0 7,0 ± 1,0 99,8 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
AurR- 50nM 3,0 + 0,0 4,0 ± 0,0 4,5 ± 0,5 99,8 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
Lss 200nM 4,5 ± 0,5 7,0 ± 1,0 7,0 ± 1,0 100,0 ±0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
Przykład 3
Wpływ konduktywności środowiska reakcji na aktywność lityczną aktywnej formy AurRi AurR+ na podstawie testu lizowania ścian komórkowych poprzez pomiary zmian gęstości optycznej zawiesiny komórkowej
Komórki bakteryjne S. aureus i S. simulans hodowane w pożywce TSB w 37°C z wytrząsaniem zbierano w logarytmicznej fazie wzrostu, przemywano i zawieszano w podwójnie destylowanej wodzie do OD595 około 2 i nakładano 50 μl na płytkę mikrotitracyjną. 50 μl AurR+ i AurR- oraz lizostafyny otrzymanych w Przykładzie 1 wszystkie rozpuszczone w podwójnie destylowanej wodzie nakładano na płytkę mikrotitracyjną z próbkami bakterii. Końcowe stężenie enzymów wynosiło 100 nM. Do każdego dołka dodawano 100 μl 50 mM bufom glicynowego o pH 8,0 uzupełnionego o różne stężenia NaCl, od 0 - 500 mM. Mierzono konduktywność buforów stosując konduktometr Mettler-Toledo SevenCompact Conductivity S230. Pomiary konduktywności prowadzono w temperaturze pokojowej. OD zawiesiny mierzono przy długości fali 595 nm w momencie rozpoczęcia reakcji i co 2,5 min przez 45 min. Aktywność lityczną liczono jako procent OD595 kontroli (próbki takie same jak dla reakcji, ale bez enzymu). Każdy eksperyment przeprowadzono dwa razy w trzykrotnych powtórzeniach. Wyniki dla czasu 45 min dla enzymów AurR- i AurR+ względem komórek bakteryjnych S. aureus przedstawiono na Fig. 4. Stwierdzono, że aktywne formy AurR w postaci enzymów AurR- i AurR+ są aktywne w buforach o różnej konduktywności. Aktywność AurR- względem S. aureus była szczególnie wysoka w środowisku reakcji o konduktywności pomiędzy 0,5 a 2 mS/cm redukując OD zawiesiny o 80% w 15 min. W przypadku AurR+ wysoką aktywność względem S. aureus zaobserwowano dla wszystkich mierzonych warunków powyżej 0,08 mS/cm.
Przykład 4
Wpływ warunków buforowych na skuteczność lityczną aktywnej formy AurR-, AurR+ i lizostafyny vs. S. aureus.
Komórki bakteryjne i enzymy były przygotowane jak w Przykładzie 3. Aktywność enzymów testowano w buforach o różnym pH i podobnej wyjściowej konduktywności około 2 mS/cm z dodatkiem optymalnego stężenia soli - 3 mM dla AurR- i 100 mM dla AurR+ i Lss. Test lizowania ścian komórkowych poprzez pomiary zmian gęstości optycznej zawiesiny komórkowej prowadzono jak w Przykładzie 2 i 3. AurR+ okazała się działać w najszerszym spektrum pH od 7 do 10,9. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 5: dla Lss (A), dla AurR+ (B) i AurR- (C). ^Vykazano, że aktywność Lss względem S. aureus jest wysoka w buforach o pH od 7 do 9. Jednodomenowa AurR wykazuje wysokie działanie w buforze o pH 8-9.
Przykład 5
Wpływ warunków buforowych na skuteczność lityczną aktywnej formy AurR-, AurR+ i lizostafyny vs. S. simulans.
Test lizowania ścian komórkowych poprzez pomiary zmian gęstości optycznej zawiesiny komórkowej prowadzono jak w powyższych przykładach. Komórki bakteryjne i enzymy były przygotowane jak w Przykładzie 3. Testowane były bufory o różnym pH i podobnej wyjściowej konduktywności około 2 mS/cm z dodatkiem optymalnego stężenia soli - 3 mM dla AurR- i 100 mM dla AurR+ i Lss. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 6 dla Lss (A), dla AurR+ (B) i AurR- (C). Wykazano, że aktywność Lss względem S. simulans jest bardzo niska w buforach o pH 5,4 do 8. Dwudomenową AurR+ okazała się działać najlepiej w pH od 7 do 8, ale aktywność zaobserwowano także w buforze o pH 5,4 i pH 6. Jednodomenowa AurR- działa w zakresie pH 5,4 - 8.0, i wykazuje najwyższą aktywność w buforze o pH 7.
Przykład 6
Wpływ czynników kompleksujących jony metali, EDTA i fenantroliny, na skuteczność aktywnej formy AurR-, AurR+ vs. S. simulans i S. aureus.
Test lizowania ścian komórkowych poprzez pomiary zmian gęstości optycznej zawiesiny komórkowej przy różnym stężeniu czynników kompleksujących prowadzono jak w powyższych przykładach. Komórki bakteryjne były przygotowane jak w Przykładzie 3. Na płytkę mikrotitracyjną dodawano 100 μl roztworów - 50 mM bufor glicynowego o pH 8.0 uzupełnionych o optymalne dla enzymów stężenie soli i dodatkowo różne stężenia czynników kompleksujących jony metalu. Dla fenantroliny były to stężenia 0 do 2 mM zarówno dla AurR- jak i AurR+. Dla EDTA były to stężenia od 0 do 250 mM dla enzymu AurR+ i od 0 do 31 mM dla AurR-. Na płytkę dodawano bakterie, a tuż przed pomiarem dodawano enzymy do końcowego stężenia 100 nM. Aktywność lityczną policzono jako procent kontroli OD595 (próbki takie same jak dla reakcji, ale bez enzymu). Każdy eksperyment przeprowadzono w trzykrotnych powtórzeniach. Fenantrolina hamowała liżę komórek S. aureus i S. simulans przez AurR- już w bardzo niskich stężeniach, podczas gdy AurR+ wykazywała nieco lepszą tolerancję w stosunku do tego inhibitora (Fig. 7A i B). W przypadku reakcji z EDTA dla obydwu enzymów wykazano podobne tendencje, ale jednocześnie dużo wyższą tolerancję niż dla fenantroliny (Fig. 8).
Przykład 7
Wpływ temperatury przechowywania enzymów na ich właściwości lizowania ścian komórkowych bakterii.
Komórki bakteryjne i enzymy były przygotowane jak w Przykładzie 3. Enzymy uprzednio były przechowywane w różnych warunkach temperaturowych: -80°C, 4°C, 21°C i 37°C przez 2, 6, 16 i 44 dni. Aktywność lityczną oceniano jako procent gęstości kontroli mierzonej jako OD595 (próbki takie same jak dla reakcji, ale bez enzymu). Każdy eksperyment przeprowadzono dwa razy w trzykrotnych powtórzeniach. Wyniki znormalizowano względem aktywności świeżo przygotowanych enzymów AurRi AurR+ Fig. 9A i B. Reakcję lityczną prowadzono na komórkach S. aureus przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Obydwa enzymy wykazywały wysoką stabilność w trakcie przechowywania w różnych warunkach temperaturowych nawet przez 44 dni.
Przykład 8
Wpływ temperatury prowadzenia reakcji z aktywnymi formami AurR: AurR- i AurR+ na lizę komórek bakteryjnych S. aureus i S. simulans.
Enzymy AurR- i AurR+ bardzo wydajnie lizują komórki bakteryjne S. aureus i S. simulans w temperaturze pokojowej i wyższej, zachowując aktywność także w 45°C. Enzymy wykazywały też aktywność w niskiej temperaturze (+4°C), w szczególności w stosunku do S. aureus.
Przykład 9
Aktywność enzymu AurR+ w surowicy różnych organizmów.
Badano aktywność enzymu AurR+ w surowicy w porównaniu z enzymami Lss i LytMCD_LSSCWT (Chimera A, przedstawiona jako sekwencja SEQ ID NO: 5 w publikacji WO2021/075988). 100 nM enzymów inkubowano w 50 mM buforze glicynowym pH 8,0, 100 mM NaCl lub płodowej surowicy bydlęcej, surowicy ludzkiej, surowicy końskiej lub surowicy królika w obecności początkowej liczby komórek 1x106 CFU/ml. W doświadczeniu użyto szczepów S. aureus z mostkami sieciującymi zawierającymi GGGGG lub GGSGG i S. simulans CCM 3583, który zawiera serynę w mostkach sieciujących (GGSGG). Inkubacje prowadzono przez 4 godziny w 37°C. Liczbę komórek bakteryjnych określano przez seryjne rozcieńczenia na płytkach z agarem TSB (test punktowy). Wyniki przedstawiono w Tabeli 3 jako spadek log10 (średnia ± SD). Eksperyment powtórzono dwa lub trzy razy. Enzym AurR+ wykazuje dużo wyższą efektywność w eliminowaniu gronkowców zarówno z glicynowymi mostkami sieciującymi, jak i mostkami zawierającymi serynę w porównaniu do lizostafiny i LytMCD_LSSCWT.
PL 243304 Β1
Tabela 3
Rząd spadku początkowej liczby komórek bakteryjnych (± odchylenie standardowe)
S. aureus GGGGG 5. aureus GGSGG S. simulans CCM 3583 (seryna/y w mostkach sieciujących)
Bufor glicyno wy
Kontrola bez enzymu 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 -0,5 + 0,7
AurR+ 6,0 ± 0,0 5,0 ± 1A 6,0 ± 0,0
Lss 6,0 + 0,0 3,5 ±0,7 3,0 ± 0,0
LytM_CWT 6,0 ±0,0 5,0 ± 1,4 3,0 ± 0,0
Surowica bydlęca
Kontrola bez enzymu 0,0 ± 0,0 0,0 + 0,0 -2,0 + 0,0
AurR± 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0
Lss 6,0 + 0,0 2,0 ± 0,0 -1,0 + 0,0
LytM CWT 6,0 ±0,0 2,0 ± 0,0 -1,0 ± 0,0
Surowica ludzka
Kontrola bez enzymu -1,0 ± 0,0 -1,0 ± 0,0 -1,0 ± 0,0
AurR-i- 7,0 ± 0,0 7,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0
Lss 7,0 ±0,0 1,6 ±0,5 0,3 ± 0,6
LytM_CWT 7,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 0,3 ± 0,6
Surowica końska
Kontrola bez enzymu 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 -2,5 ±0,7
AurR+ 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0
Lss 6,0 ±0,0 2,0 ± 0,0 -2,0 ± 0,0
LytM_CWT 6,0 ±0,0 2,0 ± 0,0 -2,0 + 0,0
Surowica królicza
Kontrola bez enzymu -0,5 ± 0,7 -0,5 ± 0,7 -1,5 + 0,7
AurR+ 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,7 3,0 ± 0,0
Lss 6,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 -1,0 ± 0,0
LytM_CWT 6,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 -1,0 ± 0,0
Objaśnienie sekwencji:
SEQ ID NO: 1 AurR158'295' - sekwencja aminokwasowa białka jednodomenowej aktywnej formy AuR, która odpowiada 138 aminokwasom od 158 do 295 białka AurR kodowanego przez gen ΚΧΑ44996; domena CD AurR:
MEPYASAQWLTKYQLTAGYGHYNLNINNGMHYGADFAMPIGTPVRAITGGKIIEAGWSPYGGGNQIGVKEPDGSHYQ
WYMHLSQLNVRVGDYISTGQIIGKSGSTGFSTGPHLHFQRMVGGLGNNYAQNPIPFLKQYG
SEQ ID NO: 2 AurR317·410· - sekwencja aminokwasów domeny CWT - domeny wiążącej ścianę komórkową z AuR, która odpowiada 94 aminokwasom 317-410 sekwencji wyjściowego białka AurR:
STYKVDGKGTYYKAESASFTANYDIKTRLNGPFRSNPQSGVLHPGQTIKYDTVMKQDGHVWVVYTGYSGKRIYLPVR
TWDKNSNTLGPLWGI1N
SEQ ID NO: 3 AurR158'410' - sekwencja aminokwasowa dwudomenowej aktywnej formy AurR, która odpowiada aminokwasom 158-410 białka AurR kodowanego przez gen ΚΧΑ44996: Aminokwasy 1-138 odpowiadają domenie CD z AurR (SEQ ID NO: 1); L-linker stanowią 21 aminokwasy 139-159 SEQ ID NO: 3, co odpowiada aminokwasom 196-316 sekwencji wyjściowego białka AurR- ppodkreslone i pochylone, CWT - domenę wiążącą ścianę komórkową z AurR stanowią 94 aminokwasy 160253 z SEQ ID NO: 3 co odpowiada aminokwasom 317-410 sekwencji wyjściowego białka AurR:
PL 243304 Β1
MEPYASAQWLTKYQLTAGYGHYNLNINNGMHYGADFAMPIGTPVRAITGGKIIEAGWSPYGGGNQIGVKEPDGSHYQ
WYMHL SQLNVRVGDYISTGQ11GKS GS TGFS TGPHLHFQRMVGGLGNNYAQNPIP FLKQYGYGSNTSGYTPPyNRyG APSTNSTYKVDGKGTYYKAESASFTANYDIKTRLNGPFRSNPQSGVLHPGQTIKYDTVMKQDGHVWWYTGYSGKRI
YLPVRTWDKN5NTLGPLWGIIN
SEQ ID NO: 4 AurR- - sekwencja aminokwasowa jednodomenowej aktywnej formy AurR, która obejmuje SEQ ID NO: 1 - tu jako AA od 4 do 141 z pozostałymi na końcu N trzema aminokwasami po odciętym MBP z wektora - poniżej jako zacienienie:
SNAMEPYASAQWLTKYQLTAGYGHYNLNINNGMHYGADFAMPIGTPVRAITGGKIIEAGWSPYGGGNQIGVKEPDGS
ΗΥ0ΜΥΜΗΕ30ΕΝνΗν00ΥΙ3Τ0ζ)ΙΙ6Κ505Ι6Ρ3Τ6ΡΗΕΗΡ0ΕΜν06Ε6ΝΝΥΑ2ΝΡΙΡΕΕΚςΥ6
SEQ ID NO: 5 AurR+ - sekwencja aminokwasowa dwudomenowej aktywnej formy AurR z S. simulans. Obejmuje sekwencję AurR158·410 wraz z fragmentem wektora, którą stanowią aminokwasy 1-3 na N końcu - poniżej jako szare zacienienie:
ŚNAMEPYASAQWLTKYQLTAGYGHYNLNINNGMHYGADFAMPIGTPVRAITGGKIIEAGWSPYGGGNQIGVKEP θσ5ΗΥ0ΜΥΜΗΕ50ΕΝνΡνοθΥΙ5ΤΟ0ΙΙΟΚ3α5ΤΟΕ2τσΡΗΕΗΕΏΚΜνασΕαΝΝΥΑ0ΝΡΙΡΓΕΚ<2ΥΟΥΰ3ΝΤ3Θ YTPPVNRVQAPSTNSTYKVDGKGTYYKAESASFTANYDIKTRLNGPERSNPQSGVLHPGQTIKYDTVMKQDGHV WWYTGYSGKRIYLPVRTWDKNSNTLGPLWGIIN
Bibliografia:
1. Biochem BiophynRenCommun. 1965 Apr 23; 19:383-9. doi: 10.1016/0006-291 x(65)90473-0. LYSO-STAPHIN: ENZYMATIC MODĘ OF ACTION, Η P BROWDER, W A ZYGMUNT, J R YOUNG, PATAVORMINA, PMID: 14317407 DOI: 10.1016/0006-291x(65)90473-0
2. Eur J Biochem. 1973 Oct 5;38(2):293-300. doi: 10.1111/j.1432-1033.1973.tb03061 ,x. Studies on lysostaphin. Separation and characterization of three enzymes, O J lversen, A Grov, PMID: 4773876 DOI: 10.1111/j.1432-1033.1973.tb03061 ,x
3. Antimicrob AgentnChemother. 2004 Jul;48(7):2704-7. doi: 10.1128/AAC.48.7.27042707.2004. Lysostaphin-coated catheters eradicate Staphylococccus aureus challenge and błock surface colonization, Anjali Shah, James Mond, Scott Walsh, PMID: 15215130 PMCID: PMC434171 DOI: 10.1128/AAC.48.7.2704-2707.2004
4. J Antimicrob Chemother. 2009 Jul;64(1 ):94-100. doi: 10.1093/jac/dkp145. Epub 2009 Apr 27. Lysostaphin eradicates established Staphylococcus aureus biofilms in jugular vein catheterized mice, John F Kokai-Kun, Tanya Chanturiya, James J Mond, PMID: 19398455 DOI: 10.1093/jac/dkp145
5. Antimicrob AgentnChemother. 2003 May;47(5): 1589-97. doi: 10.1128/aac.47.5.15891597.2003. Lysostaphin cream eradicates Staphylococcus aureus nasal colonization in a cotton rat model, John F Kokai-Kun , Scott M Walsh, Tanya Chanturiya, James J Mond, PMID: 12709327 PMCID: PMC153340 DOI: 10.1128/aac.47.5.1589-1597.2003
6. Antimicrob AgentnChemother. 1998 Jun;42(6): 1355-60. doi: 10.1128/AAC.42.6.1355. Lysostaphin treatment of experimental methicillin-resistant Staphylococcus aureus aortic valve endocarditis, M W Climo, R L Patron, B P Goldstein, G L Archer, PMID: 9624475 PMCID: PMC105603 DOI: 10.1128/AAC.42.6.1355
7. BMC Microbiol. 2012 Jun 6; 12:97. doi: 10.1186/1471-2180-12-97. Anti-staphylococcal activities of lysostaphin and LytM catalytic domain, Izabela Sabala, Ing-Marie Jonsson, Andrej Tarkowski, Matthias Bochtler PMID: 22672475 PMCID: PMC3413552 DOI: 10.1186/1471-218012-97
8. AAD Cane Rep. 2016 Dec 4;2(6):428-429. doi: 10.1016/j.jdcr.2O16.08.015. eCollection 2016 Nov. Staphylococcus simulans: An emerging cutaneous pathogen, Bridget E Shields, Amanda J Tschetter , Karolyn A Wanat, PMID: 27957522 PMCID: PMC5143409 DOI: 10.1016/j.jdcr.2016.08.015
9. Antimicrob AgentnChemother. 2001 May;45(5):1431-7. doi: 10.1128/AAC.45.5.14311437.2001. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus, M W Climo, K Ehlert, G L Archer, PMID: 11302806 PMCID: PMC90484 DOI: 10.1128/AAC.45.5.1431-1437.2001
10. J Bacteriol. 2006 Sep;188(17):6286-97. doi: 10.1128/JB.00457-06. Staphylococcus aureus mutants with increased lysostaphin resistance, Angelika Grundling, Dominique M Missiakas, Olaf Schneewind, PMID: 16923896 PMCID: PMC1595375 DOI: 10.1128/JB.00457-06
11. Biotechnol Bioeng. 2019 Dec;116(12):3149-3159. doi: 10.1002/bit.27143. Epub 2019 Sep 3. Reducing Staphylococcus aureus resistance to lysostaphin using CRISPR-dCas9, Xia Wu, Jian Zha, Mattheos A G Koffas, Jonathan S Dordick, PMID: 31433061 DOI:
10.1002/bit.27143
12. Appl Environ Microbiol. 1995 Apr;61(4): 1475-9. doi: 10.1128/AEM.61.4.1475-1479.1995.
The lysostaphin endopeptidase resistance gene (epr) specifies modification of peptidoglycan cross bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus, H P DeHart, H E Heath, L S Heath, P A LeBlanc, G L Sloan, PMID: 7747966 PMCID: PMC167404 DOI: 10.1128/AEM.61.4.1475-1479.1995
13. Mol Microbiol. 1997 Mar;23(6): 1251-65. doi: 10.1046/j.1365-2958.1997.2911657.x. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostaphin immunity factor (Lif) of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus, G Thumm, F Gotz, PMID: 9106216 DOI: 10.1046/j.1365-2958.1997.2911657.x
14. J Bacteriol. 1997 Jul; 179(13):4311-8. doi: 10.1128/jb.179.13.4311-4318.1997. epr, which encodes glycylglycine endopeptidase resistance, is homologous to femAB and affects serine content of peptidoglycan cross bridges in Staphylococcus capitis and Staphylococcus aureus, M Sugai, T Fujiwara, K Ohta, H Komatsuzawa, M Ohara, H Suginaka, PMID: 9209049 PMCID: PMC179255 DOI: 10.1128/jb. 179.13.4311-4318.1997
15. J Bacteriol. 2006 Sep;188(17):6286-97. doi: 10.1128/JB.00457-06. Staphylococcus aureus mutants with increased lysostaphin resistance, Angelika Grundling, Dominique M Missiakas, Olaf Schneewind, PMID: 16923896, PMCID: PMC1595375 DOI: 10.1128/JB.00457-06
16. Antimicrob Agent^Chemother. 2007 Feb;51(2):475-82. doi: 10.1128/AAC.00786-06. Epub 2006 Nov 13. Lysostaphin-resistant variants of Staphylococcus aureus demonstrate reduced fitness in vitro and in vivo, Caroline Kusuma, Anna Jadanova, Tanya Chanturiya, John F Kokai-Kun, PMID: 17101683 PMCID: PMC1797764 DOI: 10.1128/AAC.00786-06
17. J Bacteriol. 1997 Jan;179(1):9-16. doi: 10.1128/jb.179.1.9-16.1997. Cell wall monoglycine crossbridges and methicillin hypersusceptibility in a femAB null mutant of methicillin-resistant Staphylococeus aureus, A M Stranden, K Ehlert, H Labischinski, B Berger-Bachi, PMID: 8981974 PMCID: PMC178655 DOI: 10.1128/jb.179.1.9-16.1997
18. J Clin Microbiol. 1975 Jan;1(1):82-8. doi: 10.1128/JCM.1.1.82-88.1975. Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species, W E Kloos, K H Schleifer, PMID: 170303 PMCID: PMC274946 DOI: 10.1128/JCM.1.1.82-88.1975
19. FEBS J. 2014 Sep;281(18):4112-22. doi: 10.1111/febs.12929. Crystal structure of the antimicrobial peptidase lysostaphin from Staphylococcus simulans I Sabala, E Jagielska, P T Bardelang, H Czapinska, S O Dahms, J A Sharpe, R James, M E Than, N R Thomas, M Bochtler. PMID: 25039253; PMCID: PMC4286107
PL 243304 Β1
Lista sekwencji <110> MIBMIK <120> Hydrolaza peptydoglikanowa, sposób proteolizy ja wykorzystujący oraz jej zastosowania <130> PPL1167AGR <160> 5 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 138 <212> PRT <213> Staphylococcus simulans<213> Staphylococcus simulans <400> 1
Met Glu Pro Tyr Ala Ser Ala Gin Trp Leu Thr Lys Tyr Gin Leu Thr
1 5 10 15
Ala Gly Tyr Gly His Tyr Asn Leu Asn Ile Asn Asn Gly Met His Tyr
20 25 30
Gly Ala Asp Phe Ala Met Pro Ile Gly Thr Pro Val Arg Ala Ile Thr
35 40 45
Gly Gly Lys Ile Ile Glu Ala Gly Trp Ser Pro Tyr Gly Gly Gly Asn
50 55 60
Gin Ile Gly Val Lys Glu Pro Asp Gly Ser His Tyr Gin Trp Tyr Met
65 70 75 80
His Leu Ser Gin Leu Asn Val Arg Val Gly Asp Tyr Ile Ser Thr Gly
85 90 95
Gin Ile ile Gly Lys Ser Gly Ser Thr Gly Phe Ser Thr Gly Pro His
100 105 110
Leu His Phe Gin Arg Met Val Gly Gly Leu Gly Asn Asn Tyr Ala Gin
115 120 125
Asn Pro Ile Pro Phe Leu Lys Gin Tyr Gly
130 135
<210> 2
<211> 253
<212> PRT
<213> Staphylococcus simulans
<400> 2
Met Glu Pro Tyr Ala Ser Ala Gin Trp Leu Thr lys Tyr Gin leu Thr
1 5 10 15
Ala Gly Tyr Gly His Tyr Asn leu Asn Ile Asn Asn Gly Met His Tyr
20 25 30
Gly Ala Asp Phe Ala Met Pro Ile Gly Thr Pro Val Arg Ala Ile Thr
35 40 45
Gly Gly Lys Ile Ile Glu Ala Gly Trp Ser Pro Tyr Gly Gly Gly Asn
50 55 60
PL 243304 Β1
Gin Ile Gly Val 65
His Leu ser Gin
Gin Ile Ile Gly
100
Leu His Phe Gin
115
Asn Pro Ile Pro
130
Gly Tyr Thr Pro 145
Thr Tyr Lys Val
Ser Phe Thr Ala
180
Arg Ser Asn Pro
195
Tyr Asp Thr Val
210
Gly Tyr Ser Gly 225
Asn Ser Asn Thr
Lys Glu Pro Asp 70
Leu Asn Val Arg 85
Lys Ser Gly Ser
Arg Met Val Gly
120
Phe Leu Lys Gin
135
Pro Val Asn Arg
150
Asp Gly Lys Gly 165
Asn Tyr Asp Ile
Gin Ser Gly Val
200
Met Lys Gin Asp
215
Lys Arg Ile Tyr
230
Leu Gly Pro Leu 245
Gly Ser His Tyr 75
Val Gly Asp Tyr 90
Thr Gly Phe Ser 105
Gly Leu Gly Asn
Tyr Gly Tyr Gly 140
Val Gin Ala Pro
155
Thr Tyr Tyr Lys 170
Lys Thr Arg Leu 185
Leu His Pro Gly
Gly His Val Trp
220
Leu Pro Val Arg
235
Trp Gly Ile Ile 250
Gin Trp Tyr Met 80 ile ser Thr Gly 95
Thr Gly Pro His 110
Asn Tyr Ala Gin 125
Ser Asn Thr Ser
Ser Thr Asn Ser 160 Ala Glu Ser Ala
175
Asn Gly Pro Phe 190
Gin Thr Ile Lys 205
Val Val Tyr Thr
Thr Trp Asp Lys 240
Asn <210> 3 <211> 253 <212> PRT <213> Staphylococcus simulans <400> 3
Met Glu Pro Tyr 1
Ala Gly Tyr Gly
Gly Ala Asp Phe
Gly Gly Lys Ile
Gin Ile Gly Val 65
His Leu Ser Gin
Gin Ile Ile Gly
100
Leu His Phe Gin
115
Asn Pro Ile Pro
130
Gly Tyr Thr Pro 145
Thr Tyr Lys Val
Ser Phe Thr Ala
180
Arg Ser Asn Pro 195
Tyr Asp Thr Val
210
Gly Tyr Ser Gly 225
Asn Ser Asn Thr
Ala Ser Ala Gin 5
His Tyr Asn Leu
Ala Met Pro Ile 40
Ile Glu Ala Gly 55
Lys Glu Pro Asp 70
Leu Asn Val Arg 85
Lys Ser Gly Ser
Arg Met Val Gly 120
Phe Leu Lys Gin 135
Pro Val Asn Arg 150
Asp Gly Lys Gly 165
Asn Tyr Asp Ile
Gin Ser Gly Val 200
Met Lys Gin Asp 215
Lys Arg Ile Tyr 230
Leu Gly Pro Leu 245
Trp Leu Thr Lys 10
Asn Ile Asn Asn
Gly Thr Pro Val
Trp Ser Pro Tyr
Gly Ser His Tyr 75
Val Gly A$p Tyr 90
Thr Gly Phe Ser 105
Gly Leu Gly Asn
Tyr Gly Tyr Gly 140
Val Gin Ala Pro
155
Thr Tyr Tyr Lys 170
Lys Thr Arg Leu 185
Leu His Pro Gly
Gly His Val Trp
220
Leu Pro Val Arg
235
Trp Gly Ile Ile 250
Tyr Gin Leu Thr 15
Gly Met His Tyr
Arg Ala Ile Thr 45
Gly Gly Gly Asn
Gin Trp Tyr Met
Ile Ser Thr Gly 95
Thr Gly Pro His
110
A$n Tyr Ala Gin 125
Ser Asn Thr Ser
Ser Thr Asn Ser
160
Ala Glu Ser Ala
175
Asn Gly Pro Phe
190
Gin Thr Ile Lys 205
Val Val Tyr Thr
Thr Trp Asp Lys
240
Asn <210> 4 <211> 141 < 212> PRT < 213> Staphylococcus simulans < 400> 4
PL 243304 Β1
Ser Asn Ala Met Glu Pro Tyr Ala Ser Ala Gin Trp Leu Thr Lys Tyr 15 1015
Gin Leu Thr Ala Gly Tyr Gly His Tyr Asn Leu Asn Ile Asn Asn Gly 20 2530
Met His Tyr Gly Ala Asp Phe Ala Met Pro Ile Gly Thr Pro Val Arg 35 4045
Ala Ile Thr Gly Gly Lys ILe Ile Glu Ala Gly Trp Ser Pro Tyr Gly 50 5560
Gly Gly Asn Gin Ile Gly Val Lys Glu Pro Asp Gly Ser His TyrGin
70 7580
Trp Tyr Met His Leu Ser Gin Leu Asn Val Arg Val Gly Asp TyrIle
9095
Ser Thr Gly Gin Ile Ile Gly Lys Ser Gly Ser Thr Gly Phe Ser Thr 100 105110
Gly Pro His Leu His Phe Gin Arg Met Val Gly Gly Leu Gly Asn Asn 115 120125
Tyr Ala Gin Asn Pro Ile Pro Phe Leu Lys Gin Tyr Gly 130 135140 <210> 5 <211> 256 < 212> PRT < 213> Staphylococcus simulans < 400> 5
Ser Asn Ala Met Glu Pro Tyr Ala Ser Ala Gin Trp Leu Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Gin Leu Thr Ala 20 Gly Tyr Gly His Tyr 25 Asn Leu Asn Ile Asn 30 Asn Gly
Met His Tyr 35 Gly Ala Asp Phe Ala 40 Met Pro Ile Gly Thr 45 Pro Val Arg
Ala Ile 50 Thr Gly Gly Lys Ile 55 Ile Glu Ala Gly Trp 60 Ser Pro Tyr Gly
Gly 65 Gly Asn Gin Ile Gly 70 Val Lys Glu Pro Asp 75 Gly Ser His Tyr Gin 80
Trp Tyr Met His Leu 85 Ser Gin Leu Asn Vai 90 Arg Val Gly Asp Tyr 95 Ile
Ser Thr Gly Gin 100 Ile Ile Gly Lys Ser 105 Gly Ser Thr Gly Phe 110 Ser Thr
Gly Pro His 115 Leu His Phe Gin Arg 120 Met Val Gly Gly Leu 125 Gly Asn Asn
Tyr Ala 130 Gin Asn Pro Ile Pro 135 Phe Leu Lys Gin Tyr 140 Gly Tyr Gly Ser
Asn 145 Thr Ser Gly Tyr Thr 150 Pro Pro Val Asn Arg 155 Val Gin Ala Pro Ser 160
Thr Asn Ser Thr Tyr 165 Lys Val Asp Gly Lys 170 Gly Thr Tyr Tyr Lys 175 Ala
Glu Ser Ala Ser 180 Phe Thr Ala Asn Tyr 185 Asp Ile Lys Thr Arg 190 Leu Asn
Gly Pro Phe 195 Arg Ser Asn Pro Gin 200 Ser Gly Val Leu His 205 Pro Gly Gin
Thr Ile 210 Lys Tyr Asp Thr Val 215 Met Lys Gin Asp Gly 220 His Val Trp Val
val 225 Tyr Thr Gly Tyr Ser 230 Gly Lys Arg Ile Tyr 235 Leu Pro val Arg Thr 240
Trp Asp Lys Asn Ser 245 Asn Thr Leu Gly Pro 250 Leu Trp Gly Ile Ile 255 Asn

Claims (25)

1. Hydrolaza peptydoglikanowa zdolna do trawienia ścian bakterii Gram(+) posiadających mostki sieciujące w peptydoglikanie zarówno glicynowe jak i glicynowo-serynowe zawierająca aktywną formę białka AurR, która zawiera jako domenę katalityczną CDAurR, przy czym sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej CDAurR jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1, korzystniej sekwencja CDAurR jest w co najmniej 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1;
przy czym mostki sieciujące składają się z co najmniej trzech glicyn lub glicyn i seryny/seryn.
2. Hydrolaza peptydoglikanowa według zastrz. 1, znamienna tym, że aktywna forma białka AurR jest w postaci jednodomenowej aktywnej formy AurR zawierającej domenę katalityczną CDAurR, ale nie zawierającej domeny wiążącej ścianę komórkową bakterii CWTAurR.
3. Hydrolaza peptydoglikanowa według zastrz. 1-2, znamienna tym, że aktywną formę AurR w postaci jednodomenowej stanowi domena katalityczna AurR158-295 o SEQ ID NO: 1.
4. Hydrolaza peptydoglikanowa według zastrz. 1-2, znamienna tym, że aktywną formę AurR w postaci jednodomenowej stanowi AurR- o SEQ ID NO: 4.
5. Hydrolaza peptydoglikanowa według zastrz. 1, znamienna tym, że aktywna forma białka AurR jest w postaci dwudomenowej aktywnej formy AurR zawierającej domenę katalityczną CDAurR oraz domenę wiążącą ścianę komórkową bakterii CWTAurR, przy czym sekwencja aminokwasowa domeny wiążącej ścianę komórkową bakterii CWTAurR jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawionej w SEQ ID NO: 2, korzystnej sekwencja CWTAurR jest w co najmniej 85%, 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej na poziomie 98% lub więcej identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2.
6. Hydrolaza peptydoglikanowa według zastrz. 1 oraz 5, znamienna tym, że sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej CDAurR połączona jest z sekwencją domeny wiążącej ścianę komórkową bakterii CWTAurR poprzez sekwencję aminokwasową linkera, przy czym korzystną sekwencję linkera stanowią aminokwasy 139-159 z SEQ ID NO: 3.
7. Hydrolaza peptydoglikanowa według zastrz. 1 oraz 5-6, znamienna tym, że aktywną formę AurR w postaci dwudomenowej stanowi AurR158-410 o SEQ ID NO: 3.
8. Hydrolaza peptydoglikanowa według zastrz. 1 oraz 5-6, znamienna tym, że aktywną formę AurR w postaci dwudomenowej stanowi AurR+ o SEQ ID NO: 5.
9. Konstrukt genetyczny kodujący hydrolazę peptydoglikanową jak określoną w zastrz. 1-8.
10. Kompozycja do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+), znamienna tym, że zawiera hydrolazę peptydoglikanową jak określoną w zastrz. 1-8 oraz nośnik, przy czym kompozycja przeznaczona jest do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) posiadających w peptydoglikanie mostki sieciujące glicynowe i/lub glicynowo-serynowe.
11. Kompozycja farmaceutyczna zawierającą hydrolazę peptydoglikanową jak określoną w zastrz. 1-8 oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą do zastosowania jako lek do leczenia chorób i/lub stanów zapalnych wywołanych bakteriami Gram(+) posiadającymi glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, przy czym korzystnie bakterie Gram(+) są wybrane z rodzaju Staphylococcus, korzystnie są S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że jest w postaci płynu, emulsji, żelu, płynu do rozpylania, lotionu, nawilżonej chustki lub opatrunku, korzystnie opatrunek jest w postaci plastra z opatrunkiem, plastra z hydrożelem, gazy z naniesioną kompozycją, opatrunku hydrokoloidowego, opatrunku hydrowłóknistego, opatrunku alginianowego, bandaża z naniesioną kompozycją.
13. Kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna do zastosowań kosmetycznych, pielęgnacyjnych i higienicznych u ludzi i/lub zwierząt, znamienna tym, że zawiera hydrolazę peptydoglikanową jak określoną w zastrz. 1-8, przy czym kompozycja zawiera dodatkowo co najmniej jeden nośnik dopuszczony w zastosowaniach kosmetycznych, pielęgnacyjnych, higienicznych u ludzi i/lub zwierząt i jest przeznaczona do stosowania zewnętrznego.
14. Kompozycja zawierająca hydrolazę peptydoglikanową jak określoną w zastrz. 1-8 oraz nośnik do zastosowania jako środek antyseptyczny, środek przeciwbakteryjny, środek do odkażania powierzchni stosowany wobec bakteri Gram(+) posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, przy czym korzystnie kompozycja stosowana jest wobec bakterii Gram(+)z rodzaju Staphylococcus , korzystnie wybranych z S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że jest w postaci płynu, emulsji, żelu, płynu do rozpylania, lotionu, nawilżonej chustki lub opatrunku, korzystnie opatrunek jest w postaci plastra z opatrunkiem, plastra z hydrożelem, gazy z naniesioną kompozycją, opatrunku hydrokoloidowego, opatrunku hydrowłóknistego, opatrunku alginianowego, bandaża z naniesioną kompozycją.
16. Niemedyczne zastosowanie hydrolazy peptydoglikanowej jak określonej w zastrz. 1-8 i/lub kompozycji jak określonej w zastrz. 10 do proteolizy ścian komórkowych bakterii Gram(+) posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, przy czym korzystnie bakteriami Gram(+) są bakterie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
17. Niemedyczne zastosowanie hydrolazy peptydoglikanowej jak określonej w zastrz. 1-8 i/lub kompozycji jak określonej w zastrz. 10 jako środka bakteriostatycznego lub bakteriobójczego przeciwko bakteriom Gram(+) posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie, korzystnie przeciwko bakteriom z rodzaju Staphylococcus, korzystniej S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że środek stosowany jest w przemyśle spożywczym, szczególnie jako dodatek do żywności dla ludzi i/lub zwierząt lub do odkażania powierzchni i pomieszczeń, które mają kontakt z żywnością lub z półproduktami żywnościowymi.
19. Zastosowanie według zastrz. 17-18, znamienne tym, że środek stosowany jest w przemyśle mleczarskim i przetworach mlecznych.
20. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że środek stosowany jest w przemyśle kosmetycznym, korzystnie jako dodatek do kosmetyków polepszający ich jakość mikrobiologiczną, korzystnie jako dodatek do płynów, kremów, mleczek, lotionów.
21. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że środek stosowany jest w ochronie zdrowia do odkażania powierzchni narzędzi i przyrządów stosowanych w medycynie i diagnostyce, oraz innych powierzchni, w szczególności powierzchni szpitalnych i laboratoryjnych.
22. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że środek stosowany jest jako środek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy w postaci płynu, emulsji, żelu, płynu do rozpylania, lotionu, nawilżonej chustki.
23. Sposób hydrolizy peptydoglikanów posiadających glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące, znamienny tym, że obejmuje poniższe etapy, w których
a) w środowisku wodnym kontaktuje się aktywną formę AurR jak określoną w zastrz. 1-8 z substratem peptydowym posiadającym glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie;
b) hydrolizuje się substrat peptydowy posiadający glicynowe i/lub glicynowo-serynowe mostki sieciujące w peptydoglikanie.
24. Sposób hydrolizy peptydoglikanów według zastrz. 23, znamienny tym, że hydrolizowane są peptydoglikany ścian komórkowych bakterii Gram(+), korzystnie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie S. aureus, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri.
25. Sposób hydrolizy peptydoglikanów według zastrz. 23-24, znamienny tym, że etap b) prowadzi się w temperaturze od 4°C do 45°C.
PL438431A 2021-07-09 2021-07-09 Hydrolaza peptydoglikanowa, kompozycje ją obejmujące, jej zastosowania oraz sposób hydrolizy ją wykorzystujący PL243304B1 (pl)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL438431A PL243304B1 (pl) 2021-07-09 2021-07-09 Hydrolaza peptydoglikanowa, kompozycje ją obejmujące, jej zastosowania oraz sposób hydrolizy ją wykorzystujący
EP22838102.6A EP4367230A1 (en) 2021-07-09 2022-07-06 Peptidoglycan hydrolase, compositions comprising it, uses thereof, and a method of hydrolysis utilizing it
PCT/PL2022/050043 WO2023282776A1 (en) 2021-07-09 2022-07-06 Peptidoglycan hydrolase, compositions comprising it, uses thereof, and a method of hydrolysis utilizing it

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL438431A PL243304B1 (pl) 2021-07-09 2021-07-09 Hydrolaza peptydoglikanowa, kompozycje ją obejmujące, jej zastosowania oraz sposób hydrolizy ją wykorzystujący

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL438431A1 PL438431A1 (pl) 2023-01-16
PL243304B1 true PL243304B1 (pl) 2023-07-31

Family

ID=84801892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL438431A PL243304B1 (pl) 2021-07-09 2021-07-09 Hydrolaza peptydoglikanowa, kompozycje ją obejmujące, jej zastosowania oraz sposób hydrolizy ją wykorzystujący

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4367230A1 (pl)
PL (1) PL243304B1 (pl)
WO (1) WO2023282776A1 (pl)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL394619A1 (pl) 2011-04-19 2012-10-22 Miedzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej I Komórkowej Sposób proteolizy, peptydaza, kompozycja do stosowania jako srodek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy, zestaw oraz zastosowania aktywnej formy LytM z S. aureus lub jej pochodnej
NO3144387T3 (pl) * 2015-09-15 2018-08-11
PL243303B1 (pl) 2019-10-13 2023-07-31 Miedzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komorkowej Rekombinowany polipeptyd do zastosowania do leczenia, kompozycje go zawierające oraz jego zastosowania

Also Published As

Publication number Publication date
EP4367230A1 (en) 2024-05-15
WO2023282776A1 (en) 2023-01-12
PL438431A1 (pl) 2023-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2009273845B2 (en) Triple acting antimicrobials that are refractory to resistance development
Nelson et al. Endolysins as antimicrobials
Schmelcher et al. Listeria bacteriophage peptidoglycan hydrolases feature high thermoresistance and reveal increased activity after divalent metal cation substitution
JP2020189860A (ja) バクテリオファージ溶解素によるバイオフィルムの防止、破壊および処置
CN109963578A (zh) 针对金黄色葡萄球菌的新抗微生物剂
US9789167B2 (en) Polypeptide mixes with antibacterial activity
US20130295070A1 (en) Protease stable cell wall lysing enzymes
AU2017263563A1 (en) Broth microdilution method for evaluating and determining minimal inhibitory concentration of antibacterial polypeptides
Bhagwat et al. Opportunities for broadening the application of cell wall lytic enzymes
CA3158146A1 (en) Recombinant polypeptide for use as a medicine, antiseptic agent, antibacterial agent, anti-inflammatory agent, compositions comprising it and uses thereof
JP6022544B2 (ja) ペプチド加水分解の方法、ペプチダーゼ、静菌剤および殺菌剤としての使用のための組成物、黄色ブドウ球菌からのＬｙｔＭの活性型またはその誘導体のキットおよび使用
PL243304B1 (pl) Hydrolaza peptydoglikanowa, kompozycje ją obejmujące, jej zastosowania oraz sposób hydrolizy ją wykorzystujący
JP4533896B2 (ja) 陽イオン性抗微生物ペプチドおよびその使用方法
Blomstrand et al. Antibacterial and Hemolytic Activity of Antimicrobial Hydrogels Utilizing Immobilized Antimicrobial Peptides
JP2011520439A (ja) 修飾型エンドリシンＰｌｙ５１１