CN101573383A - 靶向肿瘤的针对卷曲同源物10的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能结合卷曲同源物10(FZD10)蛋白的抗体或其片段，例如小鼠单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。而且，本发明涉及用于治疗和/或预防患者的FZD10相关疾病的方法；诊断或预测患者的FZD10相关疾病的方法；以及FZD10的患者体内造影的方法。

Description

靶向肿瘤的针对卷曲同源物10的单克隆抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年6月21日申请的美国临时申请号60/815,257的优先权。上述申请的全部内容都通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及能结合卷曲同源物10(Frizzled homologue 10，FZD10)蛋白的抗体或其片段，例如小鼠单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。而且，本发明涉及治疗和/或预防FZD10相关疾病的方法；FZD10相关疾病的诊断或预后方法；和在患者体内的FZD10造影方法。
发明背景
已经知道针对癌症特异性分子的单克隆抗体可用于癌症治疗(Harris，M.(2004).Lancet Oncol，5，292-302)。除了人源化或嵌合抗体(例如曲妥单抗(Baselga，J.(2004).Oncology，61，Suupl 214-21)、利妥昔单抗(Maloney，D.G.等(1997).Blood，90，2188-95)和贝伐单抗(Ferrara，N.等(2004).Nat Rev Drug Discov，3，391-400))临床用于乳癌、恶性淋巴瘤和结肠癌的成功实例之外，各种针对其它分子靶标的单克隆抗体也在开发之中并且正在评价它们的抗肿瘤活性。这些单克隆抗体有望给那些无有效疗法的肿瘤患者带来希望。这些单克隆抗体的其它重要方面之一是能达到对癌症细胞的选择性疗效而没有严重毒性，因为它们对表达靶分子的细胞的特异性反应(Crist，W.M.等(2001).J Clin Oncol，19，3091-102；Wunder，J.S.等(1998).J Bone Joint Surg Am，80，1020-33；Ferguson，W.S.和Goorin，A.M.(2001).Cancer Invest，19，292-315)。
在软组织肉瘤中，骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)和横纹肌肉瘤对化疗敏感而且这些疾病可通过化疗得以很好地控制。另一方面，梭形细胞肉瘤对化疗和放疗具有抗性，而且其患者通常预后差。对于滑膜肉瘤(SS)，手术治疗对早期患者有效，但对晚期患者却没有有效治疗药。因此，希望开发新的治疗药，以改善患者的预后。
肿瘤的基因组广泛基因表达分析提供有用信息以鉴定新的分子靶标，用于开发新的抗癌药和肿瘤标记。在先前的研究中，本发明人已经使用由23,040个基因组成的基因组广泛cDNA微阵列来分析若干软组织肉瘤的基因表达特性，并证明卷曲同源物10(FZD10)(GenBank检索号AB027464(SEQ ID NO：1)和BAA84093(SEQ ID NO：2))在SS中被特异性上调并频繁出现(Nagayama，S.等(2002)Cancer Res，62，5859-66；和WO2004/020668)。FZD10基因产物是卷曲(Frizzled)家族成员和推定的WNT信号受体(Koike，J.等(1999).Biochem Biophys ResCommun，262，39-43)。进一步分析表明FZD10在SS中特异性表达，而在除胎盘之外的其它正常器官中没有或几乎没有可检测水平，表明靶向该分子的治疗药将不会或极少引起不良反应(Nagayama，S.等(2002).Cancer Res，62，5859-66)。RNAi实验表明FZD10明显参与了SS肿瘤生长(WO2006/013733)。此外，本发明人制备了针对FZD10胞外域(FZD10-ECD)的兔多克隆抗体，并发现该抗体在小鼠的SS异种移植模型中具有抗肿瘤活性(Nagayama，S.等(2005).Oncogene，24，6201-12；和WO2005/004912)。总之，针对FZD10的抗体疗法有望改善SS的临床结果。
发明概述
在下文中，报道了通过细胞免疫方法产生针对FZD10的鼠单克隆抗体，用于可能的临床应用。用荧光体内造影系统，除了常规用放射性核素的方法之外还采用近红外荧光评价了这些抗体的体内肿瘤结合活性。在此，我们揭示了抗FZD10单克隆抗体的体外和体内结合特异性以及这些抗体在表达FZD10的细胞中的内化，并发现在用90Y标记的抗FZD10Mab按100μCi的剂量单次尾静脉治疗的携带SYO-1的异种移植小鼠中可观察到明显的抗肿瘤效应。
根据以上发现，本发明人得出结论是针对FZD10的鼠单克隆抗体在治疗和诊断SS和其它过量表达FZD10的肿瘤中的治疗潜力。
因此，第一方面，本发明提供抗体或其片段，所述抗体或其片段包含H(重)链V(可变)区和L(轻)链V区，所述H链V区包含具有SEQ ID NO：15、17和19所示的氨基酸序列或其互补决定区(CDR)功能等价物的CDR，而所述L链V区包含具有SEQ ID NO：23、25和27所示的氨基酸序列或其CDR功能等价物的CDR；并且所述抗体或其片段能结合卷曲同源物10(FZD10)蛋白或其部分肽。
在一个实施方案中，抗体或其片段选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段和单链抗体。
在一个优选的实施方案中，抗体是小鼠抗体。优选小鼠抗体包含具有SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的H链和/或具有SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的L链。例如，小鼠抗体可由杂交瘤克隆92-13(FERM BP-10628)产生。
在一个替代的优选实施方案中，抗体是嵌合抗体。优选嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的H链V区，例如，嵌合抗体可包含具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的H链。优选嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的L链V区，例如，嵌合抗体可包含具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的L链。
更优选嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的L链V区。例如，嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的L链。
在一个实施方案中，嵌合抗体还包含人抗体C(恒定)区。
在一个替代的优选实施方案中，抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，人源化抗体还包含人抗体FR(构架)区和/或人抗体C区。
第二方面，本发明提供抗体或其片段，所述抗体或其片段包含H(重)链V(可变)区和L(轻)链V区，所述H链V区包含具有SEQ ID NO：31、33和35所示的氨基酸序列或其互补决定区(CDR)功能等价物的CDR，而所述L链V区包含具有SEQ ID NO：39、41和43所示的氨基酸序列或其CDR功能等价物的CDR；并且所述抗体或其片段能结合卷曲同源物10(FZD10)蛋白或其部分肽。
在一个实施方案中，抗体或其片段选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段和单链抗体。
在一个优选的实施方案中，抗体是小鼠抗体。优选小鼠抗体包含具有SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的H链和/或具有SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的L链。例如，小鼠抗体可由杂交瘤克隆93-22(FERM BP-10620)产生。
在一个替代的优选实施方案中，抗体是嵌合抗体。优选嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的H链V区，例如，嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的H链。优选嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的L链V区，例如，嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的L链。
更优选嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的L链V区。例如，嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的L链。
在一个实施方案中，嵌合抗体还包含人抗体C(恒定)区。
在一个替代的优选实施方案中，抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，人源化抗体还包含人抗体FR(构架)区和/或人抗体C区。
在又一个替代的实施方案中，抗体或其片段可用放射性同位素标记或荧光标记来标记。这样的放射性同位素标记包括90钇(90Y)、125碘(125I)和111铟(111In)。
第三方面，本发明提供杂交瘤克隆92-13(FERM BP-10628)，其产生小鼠单克隆抗体92-13。
第四方面，本发明提供杂交瘤克隆93-22(FERM BP-10620)，其产生小鼠单克隆抗体93-22。
第五方面，本发明提供治疗或预防患者的卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的上述抗体或片段。在一个实施方案中，FZD10相关疾病选自滑膜肉瘤(SS)、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)。
第六方面，本发明提供诊断或预测患者的卷曲同源物10(FZD10)相关疾病或发病趋势的方法，所述方法包括
(a)使来自患者的样品或标本接触上述抗体或片段；
(b)检测样品或标本中的FZD10蛋白，和
(c)与对照相比，根据FZD10蛋白的相对丰度来判断患者是否患病或具有患病危险。
在一个实施方案中，FZD10相关疾病选自滑膜肉瘤(SS)、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)。
第七方面，本发明提供卷曲同源物10(FZD10)蛋白在患者体内造影的方法，所述方法包括给予患者有效量的上述抗体或片段。
第八方面，本发明提供用于治疗或预防卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的药物组合物，所述组合物包含上述抗体或片段和药学上可接受的载体或赋形剂。
第九方面，本发明提供用于诊断或预测卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的药盒，所述药盒包含上述抗体或片段。
第十方面，本发明提供卷曲同源物10(FZD10)蛋白体内造影的药物组合物，所述组合物包含上述抗体或片段。
第十一方面，本发明提供上述抗体或片段在制备用于诊断或预测卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的药盒中的用途。
第十二方面，本发明提供上述抗体或片段在制备用于预防或治疗卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的组合物中的用途。
术语“FZD10相关疾病”是指与FZD10蛋白过量表达相关的疾病。这类疾病包括但不限于滑膜肉瘤(SS)、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)。
术语“片段”是指可由针对FZD10蛋白的抗体制备的并且含有指定的CDR的任何抗体片段。这些片段包括但不限于Fab片段、F(ab′)2片段和Fv片段。
术语“修饰抗体”是指由针对FZD10的抗体衍生的并且含有指定的CDR的任何抗体。这些修饰抗体包括但不限于PEG修饰的抗体。本领域技术人员可容易地识别抗体片段或修饰片段并可按照本领域任何已知方法来制备它们。
本文所用的术语“患者”是指患有FZD10相关疾病的患者和怀疑患有FZD10相关疾病的患者。本发明的患者可以是动物，包括哺乳动物和禽类动物。例如，哺乳动物可包括人、小鼠、大鼠、猴、兔和狗。
附图简述
图1a-1f显示两种抗FZD10单克隆抗体的结合特异性特征。
图1a显示使用5种SS细胞系(SYO-1、YaFuSS、HS-SY-2、Fuji和1973/99)和1种结肠癌细胞系(LoVo)对4种抗体39-2和39-10(公开于WO2005/004912)、92-13和93-22的流式细胞术分析。实线表示通过各mAb所测的荧光强度；虚线表示与未免疫小鼠IgG一起孵育的细胞的荧光强度(作为阴性对照)。
图1b显示在与图1a所用的相同肿瘤细胞系中的FZD10的半定量RT-PCR。β2-微球蛋白基因(β2MG)的表达作为内部对照。
图1c显示针对外源FZD10的92-13(上图)和93-22(下图)的流式细胞术分析。结肠癌细胞系SNU-C5用pCAGGS空载体(左图)或pCAGGS-FZD10-myc/His(右图)转染并在转染后48小时进行分析。实线表示通过各mAb所测的荧光强度；虚线表示与未免疫小鼠IgG一起孵育的细胞的荧光强度(作为阴性对照)。
图1d显示125I标记的39-10、39-2、92-13和93-22与正常人血细胞的结合。在未标记的Mab不存在(空心柱)或存在(实心柱)下，将放射性标记的相同抗体分别与3个个体(A、B和C)的正常人新鲜血液一起孵育。
图1e显示125I标记的Mab的结合活性。将恒量的放射性标记的Mab与SYO-1细胞和递增量的未标记抗体一起孵育。将结合细胞的放射性％相对未标记抗体含量作图。实心圆：92-13，空心圆：93-22。
图1f显示self-block和cross-block的流式细胞术分析。将Alexa-488标记的92-13(上图)和93-22(下图)与SYO-1细胞在以下3种情况下一起孵育：(i)在PBS中，或(ii)在100μg未标记92-13存在下和(iii)在100μg未标记93-22存在下。带阴影的分布图表示通过各Alexa488标记的Mab所检测的荧光强度；虚线表示与PBS一起孵育的细胞的荧光强度(作为阴性对照)。
图2显示SS和正常人冷冻组织切片的免疫组织化学分析：无抗体(a、d、g、j和m)，92-13(b、e、h、k和n)和93-22(c、f、i、l和o)。(a-c)，滑膜肉瘤；(d-f)，肾；(g-i)，肝，(j-l)，心；(m-o)，脑。原始放大倍数：x100。
图3显示111In标记的抗体和125I标记的抗体的生物分布。将10kBq的(a)，111In标记的92-13，(b)，125I标记的92-13，(c)，111In标记的93-22和(d)，125I标记的93-22经静脉内注射到携带SYO-1肿瘤的BALB/c裸小鼠中。在1小时(空心柱)、24小时(阴影柱)和48小时(实心柱)时对器官和肿瘤切片并测量放射性。数据表明两次独立实验的代表性数据。
图4a表明在注射Alexa 647标记的92-13或93-22后的SYO-1荷瘤小鼠的体内荧光造影。经腹膜内给予每只小鼠20μg剂量的荧光标记的Mab。在注射前、注射后立即(0小时)、24、48和96小时，所有荧光造影均用60秒曝光时间(f/stop＝2)来获取。箭头指示肿瘤位置。皮下(S.C.)肿瘤位于背侧(对于92-13，上图)和躯干(对于93-22，下图)。根据右侧所示的色标，Alexa647的荧光信号是假彩色(pseudo-colored)。在93-22(下图)中，箭头指示注射部位。
图4b和4c表明小鼠切片器官和肿瘤的代表性图像，示于图4a，4b；92-13，和4c；93-22。i，SYO-1肿瘤；ii，肝；iii，脾；iv，肾；v，胰；vi，结肠。
图5a表明在注射Alexa647标记的92-13或93-22之后的LoVo荷瘤小鼠的体内荧光造影。与图4相同，给予荧光标记的Mab。在注射后立即(0小时)、48、72、96和120小时，所有荧光造影均用60秒曝光时间(f/stop＝2)来获取(h)。箭头指示肿瘤位置。对于92-13(上图)和93-22(下图)，皮下(S.C.)肿瘤都位于右前臂。
图5b和5c表明小鼠切片器官和肿瘤的代表性图像，示于图5a.5b；92-13，和5c；93-22。i，LoVo肿瘤；ii，肝；iii，脾；iv，肾；v，胰；vi，结肠。
图6显示通过共聚焦显微镜评价92-13和93-22的内化。细胞在37℃，5％CO2中用PBS(a、d和g)、50μg/ml 92-13(b、e和h)或93-22(c、f、i)处理3小时。与细胞表面结合的抗体用0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.5)进行酸提取(acid-stripped)。将细胞固定，进行透化处理，然后用3％BSA封闭。胞内抗体用山羊抗小鼠IgG-Alexa488检测，用DAPI进行核染色。(a-c)，SYO-1；(d-f)，YaFuSS；(g-i)Lovo。
图7显示90Y标记的92-13对肿瘤生长的影响。当肿瘤建立后(0.4-2.7cm3)，小鼠接受单次尾静脉注射100μCi 90Y标记的92-13。
图8显示嵌合92-13和93-22都能特异性诱导针对过量表达FZD10的SYO-1细胞的ADCC。1μg/ml嵌合93-22抗体(ch93-22)或嵌合92-13抗体(ch92-13)以不同的效应物：靶标的比例。来自不同供体的PBMC用作效应细胞；(a)，(c)嵌合92-13与5个健康人PBMC供体的针对SYO-1细胞的ADCC。(b)，(d)嵌合93-22与2个健康人PBMC供体的针对LoVo细胞的ADCC。具有LDH活性的细胞毒性的定量测定描述于以下文献：Nagayama，S.等，Oncogene，24，6201-12。
发明详述和优选实施方案
卷曲同源物10(Frizzled homologue 10，FZD10)是卷曲(Frizzled)家族成员，是Wnt信号转导受体。正如下文所述，我们成功建立了针对FZD10蛋白的鼠单克隆抗体和嵌合抗体，用于医学用途。
通过用FZD10转染细胞免疫小鼠，建立了鼠单克隆FZD10特异性抗体(92-13Mab和93-22Mab)。通过使用流式细胞术(FACS)分析，92-13Mab和93-22Mab在SS细胞系、SYO-1细胞和FZD10转染的COS7细胞中都显示出具有针对FZD10的特异性结合活性。为了证实这些抗体在体内的特异性结合活性，本发明人通过使用体内荧光造影系统和放射性，将荧光标记的Mab经腹膜内或静脉内注射给携带SS异种移植物的小鼠并发现这些Mab与表达FZD10的肿瘤结合，但不与任何其它正常小鼠组织结合。随后用Mab进行的免疫组织化学分析证实在除胎盘之外的正常人体器官中没有或难以检出FZD10蛋白。此外，本发明人采用共聚焦激光扫描显微镜，很有兴趣地发现Mab内化到SS细胞系SYO-1中，但并不内化到FZD10阴性细胞系LoVo中。令人惊奇的是，观察到用100μCi剂量的90Y标记抗FZD10(92-13)Mab经单次尾静脉治疗携带SYO-1异种移植物的小鼠的明显的抗肿瘤效应。总之，我们得出结论是这些针对FZD10的特异性Mab可用作SS的新的诊断标记或治疗，而没有或很少有不良反应。
因为其蛋白质结构的复杂性，制备针对7次跨膜蛋白的抗体通常很困难。在先前的研究中，本发明人已证明FZD10形成同型寡聚物(Nagayama，S.等(2005).Oncogene，24，6201-12)。在多次通过使用全长或部分重组FZD10蛋白来制备能够识别FZD10天然形式的抗FZD10单克隆抗体的工作失败之后，我们终于采用了将过量表达FZD10的活COS-7细胞注射到Balb/c-小鼠脚爪垫的免疫方法，并成功获得2种产生抗FZD10抗体的杂交瘤，通过FACS分析，所述抗体在活细胞中能识别天然FZD10形式。因为这些抗体在蛋白质印迹中无法检测到FZD10蛋白，所以本发明人假设这些Mab识别FZD10的三级结构。
为了研究92-13Mab和93-22Mab的体内生物分布，本发明人采用了2种方法；一种是根据放射性核素形式，使用125I和111In标记的抗体，而另一种是根据荧光造影，使用近红外标记的(Alexa647)抗体。近红外荧光染料(主要是吲哚花菁染料)目前广泛用于诊断用体内造影，因为该波长的光能非常有效地穿透活组织(Chen，X.等(2004).Cancer Res，64，8009-14)。这两种方法得到的结果非常一致，都表明92-13和93-22与SYO-1肿瘤细胞结合，而不与其它正常组织结合。为了证实这些抗体是否可用于临床，本发明人进一步检查了抗体对正常血细胞的结合活性。在所有3个单独供体中都没有检测到125I标记的92-13和93-22与正常人血细胞的结合活性(图1d)。这些结果与用人外周血单核细胞(数据未显示)进行的FACS分析是一致的，表明这两种抗体的临床应用对SS患者几乎没有不良反应，因为它们对FZD10分子具有非常专一的结合亲和力。此外，用共聚焦显微镜进行的体外实验表明92-13Mab和93-22Mab与细胞表面FZD10的特异性结合诱导抗体的内化(图6)。如前所述(Stein，R.等(2001).Criti Rev OncolHematol，39，173-80；Stein，R.等(2005).Clin Cancer Res，11，2727-34)，如果标记的Mab在结合后内化，125I标记的抗体在溶酶体中代谢并从靶肿瘤细胞中扩散出来。其中111In标记的抗体仍然留在溶酶体中。如图3所示，在肿瘤中，111In标记的抗体和125I标记的抗体的放射性明显不同(图3，a和b，c和d)。这些发现表明92-13(和93-22)Mab可通过FZD10蛋白特异性内化到SS细胞中。
当抗体用于癌症治疗时，认为以下3种机制发挥抗肿瘤活性；(i)在靶分子参与生长增强的情况下，抗体的中和将会阻断生长信号转导并随之抑制肿瘤细胞生长；(ii)第2种可能性是效应物活性以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。(iii)第3种情况是与抗体缀合并有效递送到靶肿瘤细胞的放射性核素或抗肿瘤药。尽管本发明人先前已证明靶分子FZD10参与SS肿瘤生长，但当将Mab 92-13和Mab 93-22加入到细胞培养基(数据未显示)或注射到荷瘤小鼠体内(数据未显示)时，都没有体外中和效应。
已经知道将放射性核素或抗癌药与抗体缀合，例如吉维林(Zevalin)(缀合90钇的抗CD20抗体)和Mylotarg(缀合加利车霉素的抗CD33抗体)，对赋予抗体细胞毒性而言高度有效(Wiseman，G.A.和Witzig，T.E.(2005).Cancer Biother Radiopharm，20，185-8；van derVelden，V.H.等(2001).Blood，97，3197-204；Carter，P.(2001).Nat RevCancer，1，118-29)。Mylotarg通过内化后在癌细胞内释放抗肿瘤药加利车霉素而发挥其抗肿瘤活性(van der Velden，V.H.等(2001).Blood，97，3197-204)。在实例中，对于治疗实验，制备90钇-DTPA-92-13缀合物并研究其抗肿瘤活性。在小鼠异种移植模型中，用90钇-DTPA-92-13治疗后肿瘤快速缩小(图7)。值得注意的是，在给药后34天，包括较大体积(＞1cm3)肿瘤在内的肿瘤都不应(refraction)，而且没有观察到强烈毒性。因为抗FZD10抗体92-13和93-22很可能有效内化到抗原阳性细胞中(如图6所示)，抗癌药与Mab 92-13和Mab93-22的缀合也有望发挥对SS细胞的高抗癌效果。对于效应物活性，嵌合92-13和93-22都能特异性诱导针对过量表达FZD10的SYO-1细胞的ADCC(图8，a和c)，但不针对FZD10阴性LoVo细胞(图8，b和d)。尤其是，与嵌合93-22相比，嵌合92-13显示出更高的细胞毒性诱导性，然而，它们的活性取决于效应细胞供体，这可能是因Fc受体多态性而引起的。结果是，本发明人成功制备了在体外和体内能特异性结合过量表达FZD10的肿瘤细胞上的FZD10的单克隆抗体。总之，本发明人确信抗FZD10单克隆抗体在治疗过量表达FZD10的SS和其它肿瘤的新药物疗法的开发方面具有巨大潜力。
1.抗体的产生
本发明所用的抗体可与来自FZD10相关疾病的FZD10蛋白特异性反应。本文所用的术语“抗体”是指能与作为抗原的蛋白质或其部分肽结合的完整的抗体分子或其片段，例如Fab片段、F(ab′)2片段和Fv片段。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。它也可以是人源化或嵌合抗体或单链Fv(scFv)抗体。本发明所用的抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)可通过例如以下方法来制备。
(1)单克隆抗体
首先，制备抗原用于产生本发明所用的抗体。FZD10蛋白或其部分肽可用作免疫原性蛋白。或者，表达FZD10蛋白或其部分肽的细胞也可用作免疫原。在本发明中用作免疫原的FZD10蛋白的氨基酸序列和编码所述蛋白质的cDNA序列是公众可得的，GenBank检索号分别为BAA84093(SEQ ID NO：1)和AB027464(SEQ ID NO：2)。可以按照本领域已知方法(例如固相肽合成法)，使用可得的氨基酸序列信息，合成制备FZD10蛋白或其部分肽，作为免疫原。FZD10蛋白的部分肽包括但不限于含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列残基1-225的肽，其对应于FZD10蛋白N端胞外域(FZD10-ECD)。
可通过使用编码FZD10蛋白或其部分肽的cDNA的序列信息，按照已知的基因重组方法，制备蛋白质或其部分肽或表达它们的细胞。将在下文说明按照这样的基因重组方法来产生蛋白质或其部分肽以及表达它们的细胞。
可通过将以上cDNA序列与合适载体连接而得到用于产生蛋白质的重组载体。可通过将用于产生蛋白质的重组载体引入宿主而得到转化体，从而表达靶FZD10蛋白或其部分肽。
采用可在宿主中能够自主复制的噬菌体或质粒作为载体。质粒DNA的实例包括pCAGGS、pET28、pGEX4T、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19和来自大肠杆菌(E.coli)的其它质粒DNA；pUB110、pTP5和来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的其它质粒DNA；和YEp13、YEp24、YCp50和来自酵母菌的其它质粒DNA。噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体例如λgt11和λZAP。另外，可使用动物病毒载体，例如逆转录病毒载体和痘苗病毒载体，也可使用昆虫病毒载体，例如杆状病毒载体。
通过例如以下方法，将编码FZD10蛋白或其部分肽的DNA(在本文中称为FZD10 DNA)插入到载体中。在该方法中，纯化DNA用合适限制酶切割并插入到合适载体DNA的限制酶位点或多克隆位点上以连接成载体。
除了启动子和FZD10 DNA之外，可将任何增强子和其它顺式元件、剪接信号、聚A附加信号、选择标记、核糖体结合位点(RBS)和其它元件连接到用于在哺乳动物细胞中产生蛋白质的重组载体中，如有必要的话。
对于将DNA片段连接到载体片段中，可使用已知DNA连接酶。将DNA片段和载体片段退火并连接，因而产生用于产生蛋白质的重组载体。
并未特别指定用于转化的宿主，只要它允许FZD10蛋白或其部分肽在其中表达。宿主的实例包括细菌(例如大肠杆菌和芽孢杆菌)；酵母菌(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))；动物细胞(例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和昆虫细胞)。
例如当细菌用作宿主时，用于产生蛋白质的重组载体应当优选具有在宿主细菌中自主复制的能力并包含启动子、核糖体结合位点、FZD10 DNA和转录终止序列。重组载体还可包含调节启动子的基因。大肠杆菌的实例包括大肠杆菌BRL，芽孢杆菌的实例包括枯草芽孢杆菌。可在宿主(例如大肠杆菌)中表达的任何启动子都可用于本文中。
可通过本领域任何已知方法，将重组载体引入到宿主菌中。这些方法包括例如使用钙离子和电穿孔的方法。当酵母细胞、动物细胞或昆虫细胞用作宿主时，可通过本领域已知方法产生转化体，然后在宿主(转化体)中产生FZD10蛋白或其部分肽。
用作本发明免疫原的FZD10蛋白或其部分肽可从以上产生的转化体的培养物获取。“培养物”是指任何培养上清液、培养细胞、培养的微生物及其匀浆。通过常规的宿主培养方法在培养基中培养转化体。
用于通过使用大肠杆菌、酵母菌或其它微生物作为宿主而得到培养转化体的培养基既可以是天然培养基也可以是合成培养基，只要它包含碳源、氮源、无机盐和微生物可利用的其它组分并能使转化体有效生长。
转化体通常在25℃至37℃好氧条件下振动培养或搅拌通气培养3-6小时。培养期间，通过用例如无机酸或有机酸和碱性溶液将pH维持在接近中性水平。培养期间，在必要时，可按照插入到重组表达载体中的选择标记的不同，将抗生素(例如氨苄青霉素或四环素)加入到培养基中。
培养后，当在微生物或细胞中产生FZD10蛋白或其部分肽时，通过将微生物或细胞匀浆而提取蛋白质或其部分肽。当FZD10蛋白或其部分肽是从微生物或细胞中分泌出来时，使用培养基，或通过例如离心从培养基中除去微生物或细胞碎片。然后，通过硫酸铵沉淀、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱等常规蛋白质分离纯化的生化方法的单用或其组合，从培养物中分离并纯化FZD10蛋白或其部分肽。
可通过例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证实是否获取FZD10蛋白或其部分肽。
然后，将所得FZD10蛋白或其部分肽或转化体溶于缓冲液以制备免疫原。如有必要，可向其中加入佐剂，用于有效免疫。这样的佐剂包括例如市售弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。任何这样的佐剂都可单用或组合使用。
将如此制备的免疫原给予哺乳动物，例如兔、大鼠或小鼠。主要通过静脉内、皮下或腹膜内注射进行免疫。并未特别限定免疫间隔期，哺乳动物免疫1-3次，间隔期的范围为几天至几周。在最后一次免疫后1-7天收集产生抗体的细胞。产生抗体的细胞的实例包括脾细胞、淋巴结细胞和外周血细胞。
为了得到杂交瘤，将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合。作为准备与产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞，通常使用可用的已建立的细胞系。优选所用的细胞系具有药物选择性和特性，使得当它呈未融合形式时在HAT选择性培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)中不能生存，仅当它与产生抗体的细胞融合时才能生存。可能的骨髓瘤细胞包括例如小鼠骨髓瘤细胞系，例如P3X63-Ag.8.U1(P3U1)和NS-I。
然后，将骨髓瘤细胞与产生抗体的细胞融合。为了融合，将这些细胞混合在不含血清的动物细胞培养基(例如DMEM培养基和RPMI-1640培养基)中，优选产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞的比例为5∶1，在细胞融合促进剂例如聚乙二醇(PEG)存在下进行融合。也可通过使用市售细胞融合装置，用电穿孔进行细胞融合。
然后，在以上融合处理之后，从细胞中挑出杂交瘤。例如，将细胞悬液适宜地稀释在例如含胎牛血清的RPMI-1640培养基中，然后接种在微量滴定板上。将选择性培养基加入到各孔中，适当更换选择性培养基来培养细胞。结果，可获取在选择性培养基中开始培养约30天后生长的细胞作为杂交瘤。
然后筛选生长杂交瘤的培养上清液，看是否存在与FZD10蛋白或其部分肽反应的抗体。可按照酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)或放射免疫测定(RIA)等常规方法来进行杂交瘤的筛选。通过有限稀释来克隆融合细胞，以建立产生目标单克隆抗体的杂交瘤。
可通过常规细胞培养方法或产生腹水的方法，从已建立的杂交瘤中收集单克隆抗体。必要时，可按照硫酸铵沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤、亲和色谱等已知方法或其组合，用上述抗体收集方法来纯化抗体。
并未特别限定本发明所用的单克隆抗体的球蛋白种类，只要它们能够特异性结合FZD10蛋白并可以是任何IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。这其中优选IgG和IgM。
在本发明中，成功建立并优选使用了鼠单克隆抗体93-22和92-13。将产生小鼠单克隆抗体93-22的杂交瘤克隆93-22由中鹤修一(Shuichi Nakatsurn)交给独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(the IPOD International Patent Organism Depository of theNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6(邮政编码305-8566)(AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，305-8566 Japan))进行了国际保藏，保藏日期为2006年6月14日，保藏号为FERM BP-10620。而且，将产生小鼠单克隆抗体92-13的杂交瘤克隆92-13由中鹤修一交给独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心进行了国际保藏，保藏日期为2006年6月28日，保藏号为FERM BP-10628。由该杂交瘤产生的单克隆抗体可优选用于本发明。
在本发明中，也可使用重组类型的单克隆抗体，所述抗体是按照常规基因重组技术经如下步骤产生的：从杂交瘤中克隆抗体基因，将抗体基因整合到合适载体中，将载体导入宿主中，然后在宿主中产生抗体(参见例如Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-75)。
更具体地讲，从产生抗体的杂交瘤中分离出编码抗FZD10小鼠单克隆抗体可变(V)区的mRNA(例如如上所述的那些)。mRNA的分离进行如下：通过胍超离心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-9)和AGPC法(Chomczynski，P.等，Anal.Biochem.(1987)162，156-9)等任何已知方法来制备总RNA，然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等自总RNA得到所需mRNA。或者，也可使用QuickPrepmRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备mRNA。
然后，用逆转录酶自mRNA合成抗体V区的cDNA。用基因RacerTM试剂盒(Invitrogen)等市售试剂盒进行cDNA的合成。也可通过5′-RACE方法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-32)，用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)并结合PCR方法来合成或扩增cDNA。
小鼠单克隆抗体92-13的H链和L链的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：57和59所示(分别由SEQ ID NO：58和60所示的核苷酸序列编码)。小鼠单克隆抗体93-22的H链和L链的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：61和63所示(分别由SEQ ID NO：62和64所示的核苷酸序列编码)。根据序列信息，可用常规方法来设计引物，用于扩增目标小鼠单克隆抗体的H链或L链。
从所得PCR产物中分离和纯化目标DNA片段并连接到载体DNA上以得到重组载体。将重组载体导入宿主(例如大肠杆菌)中，然后选择含有所需重组载体的菌落。用例如自动测序仪来证实重组载体中的目标DNA的核苷酸序列。
一旦获取编码抗FZD10抗体V区的DNA，就将该DNA整合到含有编码抗体恒定(C)区的DNA的表达载体中。
为了产生本发明所用的抗FZD10抗体，将抗体基因整合到表达载体中，使得抗体基因能够在表达控制元件(例如增强子、启动子)控制之下进行表达。宿主细胞用表达载体转化，以表达抗体。
在抗体基因表达中，编码抗体重(H)链的DNA和编码抗体轻(L)链的DNA整合到独立的表达载体中，然后用所得重组表达载体共转化宿主细胞。或者，将编码抗体H链的DNA和编码抗体L链的DNA同时整合到一个表达载体中，然后用所得重组表达载体转化宿主细胞(例如WO 94/11523)。
可通过已知方法表达抗体基因。对于在哺乳动物细胞中进行表达，可将常规使用的启动子、要表达的抗体基因和聚(A)信号(位于抗体基因3′端下游)操作性连接在一起。例如，作为有用的启动子/增强子系统，可使用人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子系统。
其它启动子/增强子系统，例如来自病毒(例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40))的那些和来自哺乳动物细胞的那些(例如人延伸因子1α(HEF1α))，也可用于表达本发明抗体。
当使用SV40启动子/增强子系统时，可按照Mulligan等人(Mulligan等，Nature(1979)277，108-14)所述的方法容易地进行基因表达。当使用HEF1α启动子/增强子系统时，可按照Mizushima等人(Mizushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)所述的方法容易地进行基因表达。
对于在大肠杆菌中进行表达，可将常规可用的启动子、用于分泌目标抗体的信号序列和抗体基因操作性连接在一起。作为启动子，可使用lacZ启动子或araB启动子。当使用lacZ启动子时，可以按照Ward等人(Ward等，Nature(1098)341，544-6；FASBE J.(1992)6，2422-7)所述的方法进行基因表达，而当使用araB启动子时，可以按照Better等人(Better等，Science(1988)240，1041-3)所述的方法进行基因表达。
对于用于分泌抗体的信号序列而言，当须将目标抗体分泌到大肠杆菌周质间隙时，可使用pelB信号序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379-83)。将分泌至周质间隙的抗体分离出来，然后重折叠，使抗体呈合适构型。
可使用来自病毒(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV))等的复制起点。为了增加宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体还可含有选择标记基因，例如氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。
为了产生本发明所用的抗体，任何表达系统(包括真核细胞系统和原核细胞系统)都可使用。真核细胞包括已建立的动物细胞系(例如哺乳动物、昆虫、霉菌和真菌、酵母)。原核细胞包括细菌细胞例如大肠杆菌细胞。优选本发明所用的抗体在哺乳动物细胞(例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero和HeLa细胞)中表达。
然后，在体外或体内培养转化宿主细胞以产生目标抗体。可采用任何已知方法进行宿主细胞的培养。本文所用的培养基可以是DMEM培养基、MEM培养基、RPMI 1640培养基或IMDM培养基。培养基可含有血清补充物，例如胎牛血清(FCS)。
在重组抗体的产生中，除了上述宿主细胞外，转基因动物也可用作宿主。例如，将抗体基因插入到原本在动物乳汁中产生的蛋白质(例如β-酪蛋白)的编码基因的预定位置上，以制备融合基因。将含有引入抗体基因的融合基因的DNA片段注射到非人类动物胚胎中，然后将胚胎引入雌性动物中。带有胚胎的雌性动物怀有转基因非人类动物。转基因非人类动物或其后代的乳汁分泌出目标抗体。为了增加含抗体乳汁的量，可将合适激素给予转基因动物(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
可将如上所述表达和产生的抗体从细胞或宿主动物体内分离出来并纯化。本发明所用的抗体的分离和纯化可在亲和柱上进行。常规使用的抗体分离和纯化的其它方法也可采用；因此并未具体限定方法。例如，各种色谱、过滤、超滤、盐析和透析方法都可单独使用或组合使用，以分离纯化目标抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Harlow，David Lane编著，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
(2)嵌合抗体和人源化抗体
在本发明中，可使用人工修饰的重组抗体，包括嵌合抗体和人源化抗体。这些修饰抗体可由任何已知方法来制备。例如，可使用为产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-5；Neuberger等，1984，Nature，312：604-8；Takeda等，1985，Nature，314：452-4)。嵌合抗体是分子中的不同部分来自不同动物物种的分子，例如具有鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子，例如“人源化抗体”。
本发明的嵌合抗体可制备如下：将抗体V区的编码DNA与人抗体C区的编码DNA连接起来，将连接产物整合到表达载体中，然后将所得重组表达载体导入宿主中，产生嵌合抗体。
人源化抗体也可称为“重塑(reshaped)人抗体”，其中将非人类哺乳动物(例如小鼠)抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体上。产生这样的人源化抗体的通用遗传重组方法也是已知的(例如EP 125023；WO96/02576)。
具体地讲，设计并合成将小鼠抗体CDR与构架区(FR)连接在一起的DNA序列，所述合成是通过PCR方法，用设计成具有与CDR和FR终止区重叠的区域的若干寡核苷酸作为引物。将所得DNA与人抗体C区的编码DNA连接起来，将连接产物整合到表达载体中。将所得重组表达载体引入到宿主中，因而产生人源化抗体(例如WO96/02576)。
选择与CDR连接的FR，使得CDR可构成功能性抗原结合位点。必要时，可以替换抗体V区FR中的氨基酸，使重塑人抗体的CDR可构成合适的抗原结合位点(Sato，K.等，Cancer Res.(1993)53，851-6)。
嵌合抗体由非人类哺乳动物抗体来源的V区和人抗体来源的C区组成。人源化抗体由非人类哺乳动物抗体来源的CDR和人抗体的FR和C区组成。人源化抗体可用于临床用途，因为针对人体的抗体抗原性减低。
本发明所用的嵌合抗体或人源化抗体的一个具体实例是其中的CDR来自小鼠单克隆抗体92-13的抗体或其中的CDR来自小鼠单克隆抗体93-22的抗体。产生这样的嵌合抗体和人源化抗体的方法如下所述。
为了克隆包含编码抗FZD10小鼠单克隆抗体V区的核苷酸序列的DNA，可从杂交瘤中分离出mRNA，并且可如上所述地使用逆转录酶来合成L链和H链的V区的各个cDNA。在cDNA的合成中，可使用寡聚(Oligo)-dT引物或与L链或H链的C区杂交的其它合适引物。可以使用例如但不限于具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的CH1(IgG2a)引物(用于H链V区)以及具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的CL1(κ)引物(用于L链V区)。
可以使用市售试剂盒(例如得自Invitrogen的GeneRacerTM试剂盒)或使用包括5′-RACE方法在内的已知方法，通过PCR(聚合酶链式反应)完成L链和H链的cDNA的扩增(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，Nucleic Acids Res.，17，2919-32，1989)。
用于扩增小鼠单克隆抗体92-13的V区DNA的特异性引物包括具有SEQ ID NO：5和6所示的核苷酸序列的引物(用于H链V区)以及具有SEQ ID NO：7和8所示的核苷酸序列的引物(用于L链V区)。使用这些引物，可以扩增具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的H链V区的编码DNA和具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的L链V区的编码DNA。用于扩增小鼠单克隆抗体93-22的V区DNA的特异性引物包括具有SEQ ID NO：53和54所示的核苷酸序列的引物(用于H链V区)以及具有SEQ ID NO：55和56所示的核苷酸序列的引物(用于L链V区)。使用这些引物，可以扩增具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的H链V区的编码DNA和具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的L链V区的编码DNA。
然后，按照常规方法对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切取目标DNA片段，回收，纯化并连接到载体DNA上。
可用已知连接试剂盒将所得DNA和载体DNA连接起来，构建重组载体。可按照以下已知方法制备载体DNA：J.Sambrook等，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。载体DNA用限制酶消化，然后用已知方法或使用自动测序仪测定所需DNA的核苷酸序列。
一旦克隆小鼠单克隆抗体L链和H链的V区的编码DNA片段(在下文中，抗体L链或H链有时称为“小鼠L链或H链”(对于小鼠抗体)和“人L链或H链”(对于人抗体)，就将小鼠V区的编码DNA与人抗体恒定区的编码DNA连接起来并表达，以收获嵌合抗体。
制备嵌合抗体的标准方法包括将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列和V区序列与哺乳动物细胞表达载体中已经存在的人抗体C区的编码序列连接起来。或者，将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列和V区序列与人抗体C区的编码序列连接起来，然后再连接到哺乳动物细胞表达载体中。
包含人抗体C区的多肽可以是任何人抗体H链或L链的C区，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4(人H链)或Cλ或Cκ(L链)。
为了制备嵌合抗体，先构建两个表达载体；也就是说，构建含有处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA的表达载体，以及含有处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA的表达载体。然后，宿主细胞(例如哺乳动物细胞(例如COS细胞))用这些表达载体共转化并在体外或体内培养转化细胞以产生嵌合抗体：参见例如WO91/16928。
或者，将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列与小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA以及小鼠前导序列与小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA都引入到一个表达载体中(参见例如WO94/11523)，再将所述载体用于转化宿主细胞；然后在体外或体内培养转化宿主以产生所需嵌合抗体。
可通过将含有编码小鼠H链V区的核苷酸序列的cDNA(在下文中也称为“H链V区的cDNA”)导入含有编码人抗体H链C区的核苷酸序列的基因组DNA(在下文中也称为“H链C区的基因组DNA”)或编码所述区的cDNA(在下文中也称为“H链C区的cDNA”)的合适表达载体中，从而获取用于表达嵌合抗体H链的载体。H链C区包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4区。
具有编码H链C区(尤其是编码Cγ1区)的基因组DNA的表达载体包括例如HEF-PMh-gγ1(WO92/19759)和DHER-INCREMENTE-RVh-PM1-f(WO92/19759)。或者，如先前文献所述方法，采用来自人PBMC(外周血单核细胞)的cDNA制备人恒定区文库(Liu，A.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第84卷，3439-43，1987；Reff，M.E.等，Blood，第83卷，第2期，435-45，1994)。
当将编码小鼠H链V区的cDNA插入到这些表达载体中时，可通过PCR方法将合适核苷酸序列引入到所述cDNA中。例如，可用两种PCR引物进行PCR，一种引物是经设计而使所述cDNA在其5′端具有合适限制酶识别序列和紧挨着其起始密码子前的Kozak共有序列，以便改善转录效率；另一种引物是经设计而使所述cDNA在其3′端具有合适限制酶识别序列和剪接供体位点，用于基因组DNA的初级转录产物的适当剪接以产生mRNA，以将这些合适核苷酸序列引入到表达载体中。
由此构建的编码小鼠H链V区的cDNA用合适限制酶处理，然后插入到所述表达载体中以构建含有编码H链C区(Cγ1区)的基因组DNA的嵌合H链表达载体。
由此构建的编码小鼠H链V区的cDNA用合适限制酶处理，与编码所述H链C区Cγ1的cDNA连接，然后插入到表达载体例如pQCXIH(Clontech)中，以构建含有编码嵌合H链的cDNA表达载体。
可通过将编码小鼠L链V区的cDNA与编码人抗体L链C区的基因组DNA或cDNA连接起来并引入到合适表达载体中，获取用于表达嵌合抗体L链的载体。L链C区包括例如κ链和λ链。
当构建含有编码小鼠L链V区的cDNA的表达载体时，可将合适核苷酸序列例如识别序列或Kozak共有序列通过PCR方法引入到所述表达载体中。
编码人Lλ链C区的cDNA的完整核苷酸序列可通过DNA合成仪来合成并通过PCR方法来构建。已知人Lλ链C区具有至少4种不同同种型，每种同种型都可用于构建表达载体。
所构建的编码人Lλ链C区的cDNA和以上构建的编码小鼠L链V区的cDNA可以在合适限制酶位点间连接并插入到表达载体例如pQCXIH(Clontech)中，以构建含有编码嵌合抗体Lλ链的cDNA的表达载体。
可以自例如含有基因组DNA的HEF-PM1k-gk，构建有待与编码小鼠L链V区的DNA连接的编码人Lκ链C区的DNA(参见WO92/19759)。或者，如前所述地采用来自人PBMC(外周血单核细胞)的cDNA制备人恒定区文库(Liu，A.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第84卷，3439-43，1987；Reff，M.E.等，Blood，第83卷，第2期，435-45，1994)。
可通过PCR方法将合适限制酶的识别序列引入到编码Lκ链C区的DNA的5′端及3′端，而如上构建的编码小鼠L链V区的DNA与编码Lκ链C区的DNA可彼此连接并插入到表达载体例如pQCXIH(Clontech)中，以构建含有编码嵌合抗体Lκ链的cDNA的表达载体。
为了制备将小鼠单克隆抗体CDR移植到人抗体上的人源化抗体，最好在小鼠单克隆抗体FR与人抗体FR之间存在高度同源性。因此，将小鼠抗FZD10单克隆抗体H链和L链的V区与所有已用ProteinData Bank阐明结构的已知抗体的V区之间进行比较。此外，它们同时还与由Kabat等根据抗体FR的长度、氨基酸的同源性等而分类的人抗体亚组(HSG：人亚组)进行比较：Kabat，E.A.等，US Dep，Healthand Human Services，US Government Printing Offices，1991。
设计编码人源化抗体V区的DNA的第一步是根据设计来选择人抗体V区。例如，与小鼠抗体V区FR具有大于80％同源性的人抗体V区FR可用于产生人源化抗体。
在人源化抗体中，C区和所述抗体V区构架(FR)区来自人，而V区的互补决定区(CDR)来自小鼠。可以按照称为CDR移植的方式，通过PCR方法产生包含人源化抗体V区的多肽，只要人抗体的DNA片段适合作为模板。“CDR移植”是指制备编码小鼠来源的CDR的DNA片段并替代人抗体CDR作为模板的方法。
如果有待用作模板的人抗体DNA片段不适合的话，数据库中登记的核苷酸序列可通过DNA合成仪来合成，而且人源化抗体V区的DNA可通过PCR方法来产生。此外，当数据库中仅登记氨基酸序列时，将可按照以下报道的方法，根据抗体的密码子使用，自氨基酸序列推导出完整核苷酸序列：Kabat，E.A.等，载于US Dep.Health andHuman Services，US Government Printing Offices，1991。该核苷酸序列是在DNA合成仪中合成的，而人源化抗体V区的DNA可通过PCR方法来制备并引入到合适的宿主中，接着表达它以产生所需多肽。
通过PCR方法的CDR移植的通用方法描述于下文，当可使用作为模板的人抗体DNA片段时。
首先，合成对应于相应CDR的小鼠来源的DNA片段。根据先前克隆的小鼠H链和L链的V区的核苷酸序列，合成CDR 1至3。例如，当根据小鼠单克隆抗体92-13来产生人源化抗体时，H链V区CDR序列可以是SEQ ID NO：15(VH CDR1)、17(VH CDR2)和19(VHCDR3)所示的氨基酸序列；而L链V区CDR序列可以是SEQ ID NO：23(VL CDR1)、25(VL CDR2)和27(VL CDR3)所示的氨基酸序列。例如，当根据小鼠单克隆抗体93-22来产生人源化抗体时，H链V区CDR序列可以是SEQ ID NO：31(VH CDR1)、33(VH CDR2)和35(VHCDR3)所示的氨基酸序列；而L链V区CDR序列可以是SEQ ID NO：39(VL CDR1)、41(VL CDR2)和43(VL CDR3)所示的氨基酸序列。
人源化抗体H链V区的DNA可与任何人抗体H链C区(例如人H链Cγ1区)的DNA连接起来。如上所述，H链V区的DNA可用合适限制酶处理并与处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的编码人H链C区的DNA连接起来，构成含有人源化H链V区和人H链C区的DNA的表达载体。
人源化抗体L链V区的DNA可与任何人抗体L链C区(例如人L链Cλ区)的DNA连接起来。L链V区的DNA可用合适限制酶处理并与处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的编码人Lλ链C区的DNA连接起来，构成含有人源化L链V区和人Lλ链C区的DNA的表达载体。
编码人源化抗体H链V区和人H链C区的DNA以及编码人源化L链V区和人L链C区的DNA也可导入一个表达载体(例如公开于WO94/11523的载体)中，所述载体可用于转化宿主细胞，然后在体内或体外培养转化宿主以产生所需人源化抗体。
为了产生嵌合或人源化抗体，应当制备如上所述的两个表达载体。因此，对于嵌合抗体，构建包含处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA的表达载体，以及包含处于表达控制元件控制之下的小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA的表达载体。对于人源化抗体，构建包含处于表达控制元件控制之下的人源化H链V区和人H链C区的编码DNA的表达载体，以及包含处于表达控制元件控制之下的人源化L链V区和人L链C区的编码DNA的表达载体。
然后，宿主细胞例如哺乳动物细胞(例如COS细胞)可用这些表达载体共转化，在体外或体内培养所得转化细胞以产生嵌合或人源化抗体(参见例如WO91/16928)。
或者，将编码H链V区和C区的DNA和编码L链V区和C区的DNA连接在一个载体中并转化到合适宿主细胞中以产生抗体。因此，在嵌合抗体的表达中，可将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列、小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA以及小鼠前导序列、小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA引入到一个表达载体(例如公开于例如WO94/11523中的载体)中。在人源化抗体的表达中，可将人源化H链V区和人H链C区的编码DNA以及人源化L链V区和人L链C区的编码DNA引入到一个表达载体(例如公开于例如WO94/11523中的载体)中。这样的载体用于转化宿主细胞并在体内或体外培养转化宿主以产生目标嵌合或人源化抗体。
任何表达系统都可用于产生针对本发明FZD10蛋白的嵌合或人源化抗体。例如，真核细胞包括动物细胞，例如已建立的哺乳动物细胞系、真菌细胞和酵母细胞；原核细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌。优选本发明的嵌合或人源化抗体在哺乳动物细胞(例如COS或CHO细胞)中表达。
用于在哺乳动物细胞中表达的任何常规启动子都可使用。优选使用例如人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子。另外，用于在哺乳动物细胞中进行基因表达的启动子可包括病毒启动子(例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒(SV)40的启动子)和哺乳动物细胞来源的启动子(例如人多肽链延伸因子-1α(HEF-1α)的启动子)。例如，按照Mulligan等人的方法(Mulligan等，Nature，277，108-14，1979)可以容易地使用SV40启动子；Mizushima，S.等人的方法(Mizushima，S.等，Nucleic Acids Research，18，5322，1990)可容易地与HEF-1α启动子一起使用。
复制起点包括来自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳头瘤病毒(BPV)的那些。此外，表达载体可包含以下酶的基因作为选择标记，用于增加宿主细胞系统中的基因拷贝数：磷酸转移酶APH(3′)II或I(neo)、胸苷激酶(TK)、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)或二氢叶酸还原酶(DHFR)。
用嵌合或人源化抗体的编码DNA转化的转化体经培养而产生的目标嵌合或人源化抗体，可从细胞中分离纯化出来。
通过使用蛋白A琼脂糖柱进行目标嵌合或人源化抗体的分离纯化，也可使用蛋白质分离纯化时所用的任何方法，因此对此并未限定。例如，可任选选择或组合色谱、超滤、盐析和透析方法以分离纯化嵌合或人源化抗体。
嵌合抗体或人源化抗体分离之后，所得纯化抗体的浓度可通过ELISA测得。
可通过任何已知方法进行抗原结合活性或其它活性(包括嵌合抗体或人源化抗体与正常细胞的结合活性)的测定(Antibodies ALaboratory Manual，Harlow，David Lane编著，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。
对于抗体的抗原结合活性的测定方法，可采用ELISA(酶联免疫吸附测定)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)或荧光测定等技术。
(3)抗体片段和修饰抗体
本发明所用的抗体可以是其任何片段或修饰抗体，只要它能结合FZD10蛋白并抑制其活性。例如，抗体片段包括Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv(scFv)(由通过合适接头连接在一起的H链Fv片段或L链Fv片段组成)。具体地讲，这样的抗体片段可通过以下方法来产生：用酶(例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)将抗体切割成抗体片段，或通过构建抗体片段的编码基因并将该基因插入到表达载体，再将所得重组表达载体导入合适宿主细胞，因而表达抗体片段(参见例如Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)，152，2968-76；Better，M.& Horwitz，A.H.，Methods inEnzymology(1989)，178，476-96，Academic Press，Inc.；Pluckthun，A.&Skerra，A.，Methods in Enzymology(1989)178，497-515，Academic Press，Inc.；Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-63；Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(1989)121，663-9；和Bird，R.E.等，TrendsBiotechnol.(1991)9，132-7)。或者，可构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science，246：1275-81)以允许快速而容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
可将H链V区通过接头(优选肽接头)与L链V区连接而产生scFv(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，5879-83)。scFv的H链V区和L链V区可来自本文所述的任一种抗体。与V区结合的肽接头可以是任意一条链肽，例如12-19个氨基酸残基的肽链。
作为修饰抗体，也可使用例如与任何分子(例如聚乙二醇)缀合的抗FZD10抗体或其片段。这样的修饰抗体也包括在本发明的“抗体”中。可通过抗体的化学修饰来制备修饰抗体。本领域已经建立了适于该目的的化学修饰技术。
2.治疗用途
以下描述了用本发明抗体来治疗和/或预防FZD10相关疾病的方法和药物组合物。治疗结果是，就肿瘤而言，在已治疗患者中至少产生健康益处，包括但不限于肿瘤的消除、肿瘤症状的缓解和对肿瘤转移扩散的控制。
具体地讲，本发明的治疗和/或预防患者的FZD10相关疾病的方法包括给予有需要的患者上述抗体或片段。
本文所用的术语“患者”是指罹患FZD10相关疾病的患者，也指怀疑患有FZD10相关疾病的患者。本发明的患者可以是动物，包括哺乳动物和禽类动物。例如，哺乳动物可包括人、小鼠、大鼠、猴、兔和狗。
本文所用的术语“FZD10相关疾病”是指与FZD10蛋白过量表达相关的疾病。具体地讲，FZD10相关疾病包括但不限于滑膜肉瘤(SS)、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)。
本文所述的抗体或其片段能特异性结合FZD10蛋白，所以当将抗体或其片段给予患者时，它与患者的FZD10蛋白结合并可抑制FZD10蛋白的活性。或者，当将抗体或其片段与治疗部分缀合并给予患者时，将它递送到患者体内表达FZD10蛋白的区域(即患病区)，治疗部分可选择性递送到患病区并在此发挥作用。这样的治疗部分可以是已知或即将开发的对FZD10相关疾病具有疗效的任何治疗药，包括但不限于放射性同位素标记和化疗药。可根据不同要素(包括β-射线的能量及其发射效率、发射的γ-射线存在与否、其能量和发射效率、物理半衰期和标记方法)来选择用作治疗药的放射性同位素标记。通常，可使用基于钇(例如90y)和碘(例如125I和131I)的放射性同位素标记。化疗药可以是已知或即将开发用于治疗FZD10相关疾病的任何药物，包括但不限于甲氨蝶呤、紫杉醇、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、顺铂、卡铂、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、伊达比星、柔红霉素、放线菌素D、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇和多西他赛。本文所述的抗体或其片段可选择性结合FZD10蛋白，而不与正常细胞结合，所以可以有效避免由抗体或其片段、或放射性同位素或化疗药所引起的副作用，因此治疗效力高。
可将本文所述的抗体或其片段以有效量给予患者，以治疗或预防FZD10相关疾病。有效量是指在受治疗者体内足以产生健康益处的抗体或其片段的量。含本发明抗体的药物组合物的配制和给药方法如下所述。
可按常规方法，使用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂来配制本发明所用的药物组合物。
可将抗体或其片段配制成用于通过例如推注或连续输注的胃肠外注射(即静脉内或肌内)给药。注射用制剂可以呈单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器中，其中添加防腐剂。组合物可呈混悬剂、溶液剂或者在油性或水性溶媒中的乳剂的形式，并且可含有配方剂(formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可呈冻干粉剂形式，在临用前用无菌无热源水等合适溶媒来配制。
可通过标准药学方法，在细胞培养物或实验动物中测定抗体或片段、或与其缀合的治疗部分的毒性和疗效，例如测定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间剂量比就是治疗指数，可用LD/ED比值来表示。
优选具有大治疗指数的抗体或治疗部分。尽管可使用具有毒副作用的抗体或部分，但要小心设计这类抗体或部分在患病组织位置上所靶向的递送系统，以便降低对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。
在细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于计算人用的剂量范围。这样的抗体剂量优选在包括没有或少有毒性的ED50的循环血浆浓度范围内。在该范围内的剂量因所用剂型、所用的给药途径和所缀合的治疗部分的类型和用量的不同而异。对于本发明方法所用的任何抗体，开始可根据细胞培养测定来估计有效量。在动物模型中计算剂量，以达到如细胞培养中所测的包括IC50(即试验抗体的浓度达到症状的半最大抑制)的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更精确地测定人用剂量。可通过例如高效液相色谱来测定血浆水平。
根据患者的状况和年龄和/或给药途径，本领域技术人员可以选择本发明药物组合物的合适剂量。例如，给予本发明药物组合物，其用量使本发明抗体给予患者的日剂量为约3至约15μg/kg患者体重，优选约10至约15μg/kg患者体重。根据患者的状况和年龄、给药途径和对药物组合物的反应，选择给药间隔和次数。例如，药物组合物给予患者的次数可为1至5次，优选每天1次，给予5-10天。
可系统给予或局部给予药物组合物。优选以定向递送方式给予，使活性成分递送到患病部位。
在具体的实施方案中，本发明的方法和组合物可与包括但不限于以下一种化疗药或其组合联用，用于治疗或预防FZD10相关疾病：甲氨蝶呤、紫杉醇、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、顺铂、卡铂、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、伊达比星、柔红霉素、放线菌素D、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇和多西他赛。
对于放疗，根据所治疗FZD10相关疾病的类型，可使用任何放疗方案。例如但不限于，可给予X射线辐射。也可将发射γ射线的放射性同位素(例如镭、钴和其它元素的放射性同位素)给予暴露组织。
在另一个实施方案中，给予化疗或放疗，优选至少1小时、5小时、12小时、1天、1周、1个月，更优选数月(例如至多3个月)，然后使用本发明的方法和含有本发明抗体的组合物。可按本领域已知的任何方法，在给予本发明方法和组合物进行治疗之前、同时或之后给予化疗或放疗。
3.诊断和预后用途
如本文所述，针对FZD10蛋白或其片段的抗体也可用作诊断和预后。这样的诊断方法可用于检测FZD10相关疾病和罹患所述疾病的危险是否存在。本发明FZD10相关疾病的诊断和/或预后方法包括用本发明的抗体或其片段，免疫检测或测定样品中来自该病的FZD10蛋白。具体地讲，患者的FZD10相关疾病或发病趋势的诊断或预后方法包括：
(a)使来自患者的样品或标本接触针对FZD10蛋白或其片段的抗体；
(b)检测样品中的FZD10蛋白；和
(c)与对照相比，根据FZD10蛋白的相对丰度来判断患者是否患病或具有患病危险。
可按照任何方法进行本发明的诊断和/或预后方法，只要它是使用抗体的测定，即免疫学测定。因此可使用本发明抗体或其片段作为测定所用抗体来检测FZD10蛋白。例如，可使用免疫组织化学染色、免疫测定例如酶免疫测定(ELISA和EIA)、免疫荧光测定、放免测定(RIA)或蛋白质印迹来检测FZD10蛋白。
本发明的FZD10相关疾病诊断和/或预后方法所测定的样品并未具体限定，只要它是含有来自FZD10相关疾病的FZD10蛋白的生物样品。样品的实例包括细胞或器官的提取物、组织切片、以及血液、血清、血浆、淋巴细胞培养上清液、尿、脊髓液、唾液、汗液和腹水。用本发明抗体或其片段在肿瘤组织、肿瘤活检样品和转移组织等样品中检测到的FZD10蛋白含量，尤其可用作FZD10相关疾病的指数。
例如本文所述的抗体及其片段可用于定量或定性检测FZD10蛋白。本发明的抗体(或其片段)还可用于组织学，例如在免疫荧光或免疫电镜中用于原位检测FZD10蛋白。通过自患者采集组织学样品(例如石蜡包埋的组织切片(例如手术标本))并对其采用本发明的标记抗体，从而完成原位检测。优选通过用标记的抗体(或其片段)覆盖样品而使用抗体(或其片段)。采用本发明，本领域技术人员将会容易地知道，可以修改各种组织学方法(例如染色方法)中的任一种，以便达到这样的原位检测。
FZD10蛋白的免疫测定通常包括在可检测标记的本发明抗体的存在下，孵育待检患者样品，例如生物体液、组织提取物、新收获的细胞或在细胞培养物中孵育的细胞裂解物，并通过本领域众所周知的各种技术中的任一种来检测结合抗体。
将样品接触并固定在固相支持物或载体(例如硝酸纤维素)上或能固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的另一种固体支持物上。然后用合适缓冲液洗涤支持物，再用针对FZD10的可检测标记的抗体处理。固相支持物再次用缓冲液洗涤以除去未结合抗体。再通过常规方法检测固体支持物上结合标记的数量。
术语“固相支持物或载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支持物。本领域技术人员将会知道用于结合抗体或抗原的许多合适载体，或者将通过使用常规实验来确定合适载体。
按照众所周知的方法可测定给定批次的抗FZD10抗体的结合活性。对于每次测定，本领域技术人员将会通过使用常规实验来测定可操作的和优化的测定条件。
为了方便地测定本发明抗体(或其片段)与样品中来自FZD10相关疾病患病部位的FZD10蛋白之间的反应，可通过标记本发明抗体直接测定反应，或用标记的第二抗体间接进行测定。后一种间接测定方法，例如ELISA夹心测定或竞争性测定，优选用于具有更好敏感性的本发明方法。
本文所用的标记的实例如下。过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶和生物素-抗生物素蛋白复合物都可用于酶免疫测定。异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、取代的异硫氰酸罗丹明、二氯三嗪异硫氰酸盐和Alexa488都可用于免疫荧光测定。氚、碘(例如125I和131I)和铟(例如111In)都可用于放免测定。NADH-FMNH2-萤光素酶测定、鲁米诺-过氧化氢-POD系统、吖啶酯和二氧杂环丁烷化合物可用于免疫发光测定。
可按照常规方法将标记连接在抗体上。例如，可通过戊二醛方法、马来酰亚胺方法、吡啶二硫醚方法、或酶免疫测定的高碘酸方法和放免测定的氯胺T方法或Bolton-Hunter方法，将标记连接在抗体上。
可按照已知方法进行测定(Ausubel，F.M.等主编，Short Protocolsin Molecular Biology，第11章，“Immunology”John Wiley & Sons，Inc.1995)。
例如当本发明的抗体是用上述标记直接标记时，使样品接触标记的抗体而构成FZD10蛋白与抗体复合物。然后分离未结合的标记抗体，并根据结合的标记抗体和未结合的标记抗体的量来测定样品中的FZD10蛋白含量。
当使用标记的第二抗体时，允许本发明的抗体在第一反应中与样品反应，允许所得复合物在第二反应中与标记的第二抗体反应。第一反应和第二反应可以按相反顺序进行，同时或者彼此间隔一段时间。第一和第二反应得到[FZD10蛋白]-[本发明的抗体]-[标记的第二抗体]的复合物或[本发明的抗体]-[FZD10蛋白]-[标记的第二抗体]的复合物。然后分离未结合的标记第二抗体，并根据结合的标记第二抗体和未结合的标记第二抗体的含量来测定样品中的FZD10蛋白含量。
根据另一个实施方案，本发明的抗体用放射性同位素或荧光标记来标记，标记的抗体经胃肠外给予患者。因此，可以非侵入方式快速找到FZD10相关疾病的原发肿瘤和相关转移肿瘤的位置。这样的诊断方法称为肿瘤体内造影，本领域技术人员可以容易地理解其方法。可将标记的抗体系统或局部给予患者，优选通过胃肠外途径，例如静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射或皮下注射。
如上所述，本发明的抗体与FZD10蛋白特异性反应，因而可用在FZD10相关疾病的诊断和/或预后试剂盒中。
本发明的诊断和/或预后试剂盒包含本发明的抗体或其片段。通过使用本发明的诊断和/或预后试剂盒来检测怀疑患有FZD10相关疾病的患者样品中的FZD10蛋白，可以快速而简便地确定患者是否患有FZD10相关疾病。使用这些免疫反应的疾病诊断和/或预后试剂盒是众所周知的，本领域技术人员可以容易地选择并非抗体的合适成分。本发明的诊断和/或预后试剂盒可用于任何方法，只要是免疫测定方法。
实施例：
根据以下非限制性实施例将进一步说明本发明。
以下实施例所用的细胞系和组织标本制备如下。具体地讲，将来自滑膜肉瘤(HS-SY-2、YaFuSS、1973/99、Fuji和SYO-1)、结肠癌(LoVo、SNU-C4和SNU-C5)、HEK293和COS7细胞的细胞系单层培养在补充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌药溶液的合适培养基中，并维持在37℃、含5％CO2的空气中。在知情同意后获取原发性滑膜肉瘤(SS)样品并在切除后立即在液氮中快速冷冻并贮存于-80℃。
实施例1
抗FZD10单克隆抗体的产生
(1)经细胞免疫而产生单克隆抗体
在4周龄雌性Balb/c小鼠脚爪垫上用经2×107pCAGGS/neo-FZD10-myc/His(Medical and Biological Laboratories，Nagoya，Japan)转染的2×107COS-7细胞进行免疫接种，产生了小鼠抗FZD10单克隆抗体(Mab)。pCAGGS/neo-FZD10-myc/His的构建先前已有报道(Nagayama，S.等(2005).Oncogene，24，6201-12)，它可表达FZD10 cDNA的完整编码序列和其C端的Myc和His表位标记。在细胞免疫前1天，小鼠用弗氏完全佐剂(Mitsubishi Kagaku Iatron，Inc.，Tokyo，Japan)免疫。收获免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞系融合。杂交瘤经亚克隆后，通过细胞ELISA检测其分泌免疫球蛋白的能力，所述免疫球蛋白可结合FZD10的胞外域(FZD10氨基酸残基1-225)。对于细胞ELISA，将表达FZD10-myc/His(FZD10 cDNA的完整编码序列和其C端的Myc和His表位标记)的COS-7细胞接种在96孔板。然后，将50μl得自杂交瘤的培养上清液加入到该板中，并在室温下孵育30分钟。洗涤细胞后，加入1∶10000稀释度的山羊抗小鼠IgG-POD(Medical and Biological Laboratories，Nagoya，Japan)，在室温下孵育30分钟。在OD450-620nm处检测结合抗体。进一步分析阳性克隆的特异性结合活性。这些克隆包括：克隆39-2和39-10(公开于WO2005/004912，称为5F2)以及92-13和93-22。通过IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche)测定，所有Mab都是IgG2a同种型。Mab在蛋白G-琼脂糖凝胶上进行亲和纯化，供进一步表征用。
将产生小鼠单克隆抗体93-22的杂交瘤克隆93-22由中鹤修一交给独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6(邮政编码305-8566))进行了国际保藏，保藏日期为2006年6月14日，保藏号为FERM BP-10620。而且，将产生小鼠单克隆抗体92-13的杂交瘤克隆92-13由中鹤修一交给独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心进行了国际保藏，保藏日期为2006年6月28日，保藏号为FERM BP-10628。
(2)用放射性核素标记抗体
通过氯胺T方法制备了125I标记的Mab(Arano，Y.等(1999).Cancer Res，59，128-34)。将740kBq/2μl Na125I加入到10μg Mab的100μl 0.3M磷酸钠缓冲液中。再加入1μg氯胺T的3μl 0.3M磷酸钠缓冲液，在室温下孵育5分钟。用Biospin柱6(Bio-Rad)纯化标记的抗体。
为了用111In标记Mab，将1mg Mab的100μl 50mM硼酸缓冲液(pH8.5)与溶于二甲基甲酰胺的异硫氰酸基苄基二乙撑三胺五乙酸(SCN-BZ-DTPA；Macrocyclics)(摩尔比为1∶3)缀合。在37℃孵育20小时后，用Biospin柱6纯化Mab缀合物。40μl 111In在60μl 0.25M乙酸缓冲液(pH5.5)中孵育并与10μg/μl Mab-DTPA缀合物在室温下混合1小时。用Biospin柱6纯化标记的抗体。
为了产生缀合90y-的92-13，将92-13和DTPA与赖氨酸残基缀合。DTPA-92-13用钇标记至比活为100μCi/mg，90Y-DTPA-92-13的免疫反应性约为70％。
(3)Alexa647标记的Mab的合成
按照制造商的使用说明，用Alexa647单克隆抗体标记试剂盒(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，用Alexa-Fluoro647标记Mab。Alexa647反应染料具有琥珀酰亚胺酯部分，其可与蛋白质的伯胺反应，通过大小排阻柱纯化所得Mab-染料缀合物。
实施例2
抗FZD10单克隆抗体的结合活性
本发明人用两种方法评价小鼠-单克隆抗体的结合亲和性：用荧光染料的流式细胞术分析和用125I的放射性测定。
(1)流式细胞术(FACS)分析
为了研究4种抗体39-2和39-10(公开于WO2005/004912)、92-13和93-22的细胞结合亲和性，我们进行了流式细胞术(FACS)实验。对于间接荧光的流式细胞术分析，将5×106细胞悬液与10μg/ml Mab或未免疫小鼠IgG(Beckman Coulter)在4℃孵育30分钟。用PBS洗涤后，加入2μg荧光山羊抗小鼠IgG(Alexa Fluor 488，Molecular Probes，Eugene，Oregon)，将细胞悬液在4℃孵育30分钟，用于FACScan(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)分析。对于直接免疫荧光测定，在过量(100μg)未标记Mab存在或不存在的条件下，将细胞与2μgAlexa488-Mab一起在4℃孵育30分钟并进行FACScan分析。
为了证实FZD10在细胞系中表达，我们进行了RT-PCR。对于RT-PCR实验，用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从细胞系中提取总RNA，并且使各总RNA的3μg等分试样进行逆转录。用cDNA作为模板，用以下引物进行PCR扩增：5’-TATCGGGCTCTTCTCTGTGC-3’(SEQ ID NO：9)和5’-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3’(SEQ ID NO：10)(对于FZD10)和5’-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3’(SEQ ID NO：11)和5’-TCACATGGTTCACACGGCAG-3’(SEQ ID NO：12)(对于内部控制用的β2-微球蛋白(β2MG))。
如图1a所示，所有4种Mab即39-2、39-10、92-13和93-22以FZD10剂量依赖方式结合4种表达FZD10的SS细胞系(即SYO-1、YafuSS、HS-SY-2和Fuji)，但不结合2种细胞系(即1973/99和LoVo)，其中未检测到FZD10的转录物。下表1表明这些Mab的相对平均荧光强度(MFI)与FZD10表达水平之间的关系，见图1b。另外，尤其是，我们已证明，92-13Mab和93-22Mab也结合用FZD10-myc/His构建体转染的SNU-C5，而未检测到与用空载体转染的SNU-C5细胞的结合(图1c)，表明这些针对FZD10蛋白的92-13Mab和93-22Mab的特异性结合。
表1.抗FZD10mAb与人SS细胞系SYO-1、YaFuSS、HS-SY-II、Fuji、1973/99和人结肠癌细胞系LoVo的结合
Figure A20068005562500431
如上所述，通过流式细胞仪测定了FZD10的MFI。
(2)对正常血细胞的结合活性
为了证实这些抗体是否可用于临床用途，本发明人进一步检查了抗体对正常血细胞的结合活性。为了评价Mab对正常血细胞的非特异性结合活性，将125I标记的Mab与100μl健康新鲜血一起孵育。在室温下孵育1小时后，如上所述地测定细胞沉淀的放射性。
在所有3个单独供体中，都没有检测到125I标记的92-13Mab和93-22Mab对正常人血细胞的结合活性，而在所有3个单独供体中都检测到39-2Mab和39-10Mab(图1d)。这些结果与用人外周血单核细胞(数据未显示)进行的FACS分析是一致的，表明仅92-13和93-22抗体的临床应用对SS患者几乎没有不良反应，因为对FZD10分子具有非常专一的结合亲和性。因此，我们仅集中在92-13和93-22抗体上，进行进一步分析。
(3)另外的分析
此外，用125I标记的Mab进行了结合测定(参见实施例1(2))以评价对细胞表面上的FZD10分子的结合亲和性。对于放射性分析，将实施例1(2)中制备的0.5kBq(0.001μg抗体)125I标记的Mab加入到100μl含不同量的未标记的相同Mab的细胞悬液中。在室温下孵育1小时后，细胞悬液以800xg离心。取出上清液，测定细胞沉淀的放射性。
结果表明92-13抗体的结合特异性要比93-22抗体的高；在相同条件下，约33％92-13与细胞结合，约9％93-22抗体与细胞结合(图1e)。当以剂量依赖性方式加入未标记抗体时，结合抗体的量下降。
我们随后用流式细胞术进行了92-13Mab与93-22Mab的结合克争性分析。两种Alexa488标记的抗体与细胞的结合分别完全被大量未标记抗体(图1f，ii和iii)阻断，表明92-13Mab和93-22Mab很可能识别FZD10的非常类似或相同的表位。这些发现表明这些Mab能特异性识别SS细胞表面表达的FZD10。
实施例3
免疫组织化学
为了评价92-13和93-22与人体组织的结合特异性，我们用冷冻组织切片进行了免疫组织化学分析。冷冻正常成人器官的组织切片(BioChain，Hayward，California)用4％低聚甲醛在4℃固定15分钟，再与5μg/ml Mab在室温下孵育1小时。然后，加入小鼠ENVISIONPolymer Reagent(DAKO)并用过氧化物酶底物(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐)显色。
结果见图2。图2显示SS和正常人体冷冻组织切片的免疫组织化学分析：无抗体(a、d、g、j和m)，92-13(b、e、h、k和n)和93-22(c、f、i、l和o)。(a-c)，滑膜肉瘤；(d-f)，肾；(g-i)，肝，(j-l)，心；(m-o)，脑。按照预期，我们观察到对SS标本(图2，a、b和c)和胎盘(数据未显示)中的FZD10的强烈免疫反应性，但在正常的肾、心、脑和肝(图2，d-o)中没有检测到免疫反应性，这与RNA印迹和RT-PCR实验结果一致(Nagayama，S.等(2005).Oncogene，24，6201-6212)。
实施例4
抗FZD10Mab在Balb/c小鼠异种移植模型中的生物分布
用两种独立方法(放射性核素造影和荧光造影)，在BALB/c小鼠中检测92-13和93-22在体内模型中的分布。
(1)体内放射性核素造影
按照所规定的指南，在动物设施中进行了体内实验。给BALB/cAJcl-nu小鼠(雌性，7周龄)在侧腹经皮下(s.c.)注射SYO-1肿瘤细胞(5×106细胞)的0.1ml PBS。对于生物分布研究，具有完全建立肿瘤的小鼠通过尾静脉接受10kBq(0.5-1μg)125I标记的Mab和10kBq(0.5-1μg)111In标记的Mab。在1、24、48小时给动物实施安乐死，测定体重和组织放射性。对于所有样品，用％注射剂量/g组织表示分布。对于生物分布的光学造影，除了使用SYO-1肿瘤小鼠之外还使用携带LoVo-肿瘤的小鼠。如上所述地将LoVo肿瘤细胞(1×107细胞)经皮下(s.c.)注射到BALB/cA Jcl-nu小鼠体内。当肿瘤完全建立后，对小鼠进行造影研究。
图3a的结果表明，血液相关的111In-92-13的放射性从注射后1小时的35％的注射剂量/克(％ID/g)下降到48小时后的12％。肝、肾、肠、脾、胰、肺、心、胃和肌肉相关的111In-92-13的放射性基本保持恒定或在整个观察期间逐渐下降(图3a)。肿瘤相关的111In-92-13的放射性在整个实验中积累，从注射后1小时的2％ID/g至48小时后的11％ID/g。另一方面，图3b证明肿瘤相关的125I标记的92-13的放射性没有明显增加，尽管血液相关的放射性从1小时的25％下降到48小时后的7％，而其它正常器官相关的放射性却保持恒定。125I标记的抗体在内化后可能在细胞内降解。111In标记的93-22在注射后48小时也在SYO-1肿瘤中积累(图3c)，125I标记的93-22表现出很少积累(图3d)，表明其内化与92-13一样。
(2)体内荧光造影
用IVISTM造影系统系列100(Xenogen，Alameda，CA)进行体内荧光造影。优化Cy5.5滤光器用于在体内获得Alexa647-Mabs荧光。SYO-1荷瘤小鼠经腹膜内注射20μg Alexa647标记的Mab并在不同时间点进行荧光造影。在注射Mab前4天，给小鼠喂食不含苜蓿的饲料，以降低背景荧光。当获取图像后，用2％异氟烷(Abbott Laboratories)麻醉小鼠，放入IVIS系统中。Mab注射后4天给小鼠实施安乐死，切取肿瘤和主要器官，获取荧光图像。
如图4a所示，在注射后24小时在肿瘤位置上可检测到大量荧光。对于Mab 92-13和Mab 93-22都观察到结合肿瘤的荧光；信号在注射后约48小时达到最大水平，并在注射后96小时仍可检测到。在注射后120小时，本发明人处死这些小鼠并检测肿瘤和重要的正常器官(肝、脾、肾、胰、结肠)中的荧光强度(图4b和4c)。在切取的肿瘤中观察到非常强的荧光信号，而在正常器官中却没有检测到荧光信号。为了证实结合特异性，本发明人用抗原阴性细胞系LoVo，在裸小鼠中进行异种移植，并注入Alexa647标记的Mab，进行荧光造影分析。在携带LoVo的小鼠中，在肿瘤位置(图5a)、切取的肿瘤或其它器官(图5b和5c)上都没有检测到荧光。这些结果表明，这些Mab在体内也能特异性结合表达FZD10的肿瘤细胞。
实施例5
抗FZD10Mab内化到抗原阳性细胞中
为了研究这些Mab在与细胞表面结合后的分子行为，用体外造影系统追踪其定位。
以5×104细胞/孔的密度，将细胞接种到8孔带小室的玻片(NalgeNunc International，Naperville，IL)上。将细胞与Mab一起在37℃、在含5％CO2的空气小室中孵育3小时。将结合在细胞表面的Mab用酸性提取缓冲液(acid stripping buffer)(0.1M甘氨酸，500mM NaCl，pH2.5)在4℃提取10分钟，再用500mM Tris(pH7.5)中和。细胞再用3.7％甲醛在室温下固定15分钟，通过与0.2％曲通X-100接触10分钟而透化，再用3％牛血清白蛋白在室温下封闭1小时。为了检测细胞中内化的Mab，将样品与Alexa488标记的山羊抗小鼠IgG(1∶700稀释度)在室温下孵育1小时。用DAPI(Vectashield，Vector Laboratories，Burlingame，CA)制备浸片并在Leica TCS SP1共聚焦镜下进行分析。
如图6所示，通过用Alexa488标记的山羊抗小鼠IgG检测的共聚焦显微镜造影，在Mab与细胞一起孵育3小时后，Mab 92-13和Mab 93-22都能有效掺入到SYO-1细胞和YaFuSS细胞的胞质溶胶中(图6，a-f)。另一方面，这些Mab的荧光信号在不表达FZD10的LoVo细胞中几乎检测不到(图6，g-i)，表明Mab与细胞表面FZD10的特异性结合诱导了抗体的内化。
实施例6
Mab的特异性细胞毒性
当将92-13和93-22直接加入到培养细胞中时，对肿瘤细胞生长没有影响(数据未显示)。对于治疗研究，按照与实施例4相同的方式，让SYO-1肿瘤在BALB/cA Jcl-nu小鼠体内生长。用卡尺测量肿瘤直径，如前所述地用以下公式计算肿瘤体积：0.5×(较大直径)×(较小直径)2(Nagayama，S.等(2005).Oncogene，24，6201-12)。当肿瘤体积达到0.4-2.8cm3以上时，将携带皮下SYO-1肿瘤的Balb/c裸小鼠随机分配到治疗组中并经尾静脉接受静脉内注射100μCi 90Y标记的Mab或对照Mab。给小鼠称重并纪录肿瘤直径。
图7显示肿瘤体积在治疗后立即明显减小，在1周内几乎对所有小鼠都进行了追踪。当将50μCi 90Y-DTPA-92-13给予小鼠时，＞1cm3体积的肿瘤在治疗2周后仍然不应，尽管它们在治疗后立即显示出肿瘤尺寸的明显减小。小鼠表现出体重的暂时下降(10～15％)，但它们却在1周之内恢复，而且未观察到肉眼可见的中毒征兆(数据未显示)。
实施例7
嵌合抗体的产生
通过将各小鼠抗体的可变区序列替换为处于CMV启动子控制之下的人IgG1恒定区，产生对应于小鼠92-13抗体和93-22抗体、ch92-13和ch93-22的嵌合抗体。从杂交瘤克隆92-13和93-22中提取总RNA。用GeneRacerTM试剂盒(Invitrogen)自总RNA合成cDNA。用正向引物(GeneRacerTM5’Primer)和反向引物扩增单克隆抗体可变区序列；CH1(IgG2a)；5’-AATTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3’(SEQ ID NO：3)(对于重链和CL1(κ))；5’-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3’(SEQID NO：4)(对于轻链)。对PCR产物进行测序并测定m92-13和m93-22可变区的编码序列。
结果，小鼠Ig H链可变区和L链可变区的氨基酸序列测定如下：
92-13，H链可变区：
MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNINDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGARGSRFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：13)，由核苷酸序列SEQ ID NO：14编码，和
92-13，L链可变区：
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYVATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPYTFGGGTKL(SEQ ID NO：21)，由核苷酸序列SEQ ID NO：22编码；和
93-22，H链可变区：
MGWSRIFLFLLSITAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARGGNYGWFAYWGQGTLVTVSAGS(SEQ ID NO：29)，由核苷酸序列SEQ ID NO：30编码，和
93-22，L链可变区：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELYTFGGGTKLGS(SEQID NO：37)，由核苷酸序列SEQ ID NO：38编码。下划线表示信号序列。
抗体的CDR(互补决定区)序列测定如下：
92-13，INDTYMH(SEQ ID NO：15)为VH CDR1，RIDPANGNTKYD(SEQ ID NO：17)为VH CDR2，GSRFAY(SEQ IDNO：19)为VH CDR3，RASENIYSNLA(SEQ ID NO：23)为VL CDR1，VATNLAD(SEQ ID NO：25)为VL CDR2，和QHFWGTPY(SEQ IDNO：27)为VL CDR3；和
93-22，SSWMN(SEQ ID NO：31)为VH CDR1，RIYPGDGDTNYN(SEQ ID NO：33)为VH CDR2，GGNYGWFAY(SEQ ID NO：35)为VHCDR3，RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO：39)为VL CDR1，LASNLES(SEQ ID NO：41)为VL CDR2，和QHSRELY(SEQ ID NO：43)为VL CDR3。
另外，小鼠单克隆抗体92-13、93-22和39-10的H链和L链的氨基酸序列测定如下：
92-13，H链：SEQ ID NO：58(由核苷酸序列SEQ ID NO：57编码)；
92-13，L链：SEQ ID NO：60(由核苷酸序列SEQ ID NO：59编码)；
93-22，H链：SEQ ID NO：62(由核苷酸序列SEQ ID NO：61编码)；
93-22，L链：SEQ ID NO：64(由核苷酸序列SEQ ID NO：63编码)；
39-10，H链：SEQ ID NO：66(由核苷酸序列SEQ ID NO：65编码)；
39-10，L链：SEQ ID NO：68(由核苷酸序列SEQ ID NO：67编码)。
根据所测序列，设计用于m92-13可变区的特定引物：5′-AATAGCGGCCGCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTT-3′(SEQ ID NO：5)和5′-AATAGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC-3′(SEQ IDNO：6)(对于重链)和5′-AATAGCGGCCGCACCATGAGTGTGCCCACTCAGG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-TTCCAGCTTGGTCCCCCC-3′(SEQ ID NO：8)(对于轻链)。而且，设计用于m93-22可变区的特定引物：5’-AATAGCGGCCGCACCATGGGATGGAGCCGGATCTTT-3’(SEQ ID NO：53)和5’-AATAGGATCCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTT-3’(SEQ ID NO：54)(对于重链)和5’-AATAGCGGCCGCACCATGGAGACAGACACACTCCT-3’(SEQ ID NO：55)和5’-AATAGGATCCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGT-3’(SEQ IDNO：56)(对于轻链)。为了构建嵌合抗体的表达载体，制备2个盒载体。将编码人IgG1(CH1-CH3)的DNA片段插入到pQCXIH(Clontech)(pQCXCHIH)中，并将编码人Igκ(CL1)的DNA片段插入到pQCXIP(pQCXCLIP)中。为了得到编码人IgG1或人Igκ的DNA片段，按照已报道的方法(Liu，A.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第84卷，3439-43，1987；Reff，M.E.等，Blood，第83卷，第2期，435-45，1994)，用来自人PBMC(外周血单核细胞)的cDNA制备人恒定区文库。将编码m92-13和m93-22重链和轻链的可变区的DNA经PCR扩增，测序并分别用NotI位点和BamHI位点而亚克隆到pQCXCHIH和pQCXCLIP中。用这些载体共转染到CHO细胞中。转染细胞在含500μg/ml潮霉素和10μg/ml嘌罗霉素的F-12培养基中培养。当细胞生长到接近汇合时，将培养基更换为无血清培养基(CHO-S-SFM II；GIBCO)，然后用蛋白A-亲和柱(GE Amersham)自培养细胞上清液中纯化嵌合抗体并测序。嵌合抗体ch92-13重链序列包括由核苷酸序列SEQ ID NO：45编码的SEQ ID NO：46；而嵌合抗体ch92-13轻链序列包括由核苷酸序列SEQID NO：47编码的SEQ ID NO：48。嵌合抗体ch93-22重链序列包括由核苷酸序列SEQ ID NO：50编码的SEQ ID NO：49；而嵌合抗体ch93-22轻链序列包括由核苷酸序列SEQ ID NO：51编码的SEQ IDNO：52。
实施例8
嵌合抗体的结合活性
如前所述地使用LDH活性测定了由嵌合92-13和93-22诱导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性(Nagayama，S.等(2005).Oncogene，24，6201-6212)。通过Ficoll-Plaque(Amersham Bioscience)自健康供体的肝素化外周血中分离新鲜效应细胞。在补充有5％FBS的0.1ml无酚红RPMI 1640的96孔板上，一式四份，以不同E∶T比例，将效应细胞(E)和靶细胞(T)(各5×103/孔)与嵌合92-13、嵌合93-22或未免疫人IgG一起在37℃共孵育6小时。通过在490nm处测定吸光度来确定释放在培养上清液中的LDH。按照制造商的指南来计算特定细胞毒性的％。
对于效应物活性，嵌合92-13和93-22都特异性诱导针对过量表达FZD10的SYO-1细胞的ADCC(图8，a和c)，但不针对FZD10阴性LoVo细胞(图8，b和d)。具体地讲，与嵌合93-22相比，嵌合92-13表现出更高的细胞毒性诱导性；然而，它们的活性依赖于效应细胞供体，可能由Fc受体多态性引起。
本文所提及的每篇申请和专利以及以上每篇申请和专利中引用的每篇文献全都通过引用结合到本文中。此外，本文所引用的所有文件、本文所引用文件中引用或参考的所有文献、以及本文所引用或提及的任何制造商的说明指南或产品目录，都通过引用结合到本文中。
本发明所述方法和系统的各种修改和变动都是本领域技术人员显而易见的，而不偏离本发明的范围和精神。尽管本发明已经用具体优选实施方案来描述，但是应当知道所要求保护的本发明并不限于这些具体的实施方案，在本发明范围内可以对其进行许多修改和附加。当然，分子生物学或相关领域技术人员显而易见的是，为了实施本发明而对所述方式进行的不同修改也包括在权利要求的范围之内。此外，以下从属权利要求的特征可与独立权利要求的特征进行不同组合，而不偏离本发明的范围。
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(OncoTherapy Science，Inc.)
The University of Tokyo
National University Corporation Gunma University
<120>靶向肿瘤的针对卷曲同源物10的单克隆抗体及其用途
<130>PH-2818PCT
<150>US 60/815,257
<151>2006-06-21
<160>68
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2811
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
acacgtccaa cgccagcatg cagcgcccgg gcccccgcct gtggctggtc ctgcaggtga   60
tgggctcgtg cgccgccatc agctccatgg acatggagcg cccgggcgac ggcaaatgcc  120
agcccatcga gatcccgatg tgcaaggaca tcggctacaa catgactcgt atgcccaacc  180
tgatgggcca cgagaaccag cgcgaggcag ccatccagtt gcacgagttc gcgccgctgg  240
tggagtacgg ctgccacggc cacctccgct tcttcctgtg ctcgctgtac gcgccgatgt  300
gcaccgagca ggtctctacc cccatccccg cctgccgggt catgtgcgag caggcccggc  360
tcaagtgctc cccgattatg gagcagttca acttcaagtg gcccgactcc ctggactgcc  420
ggaaactccc caacaagaac gaccccaact acctgtgcat ggaggcgccc aacaacggct  480
cggacgagcc cacccggggc tcgggcctgt tcccgccgct gttccggccg cagcggcccc  540
acagcgcgca ggagcacccg ctgaaggacg ggggccccgg gcgcggcggc tgcgacaacc  600
cgggcaagtt ccaccacgtg gagaagagcg cgtcgtgcgc gccgctctgc acgcccggcg  660
tggacgtgta ctggagccgc gaggacaagc gcttcgcagt ggtctggctg gccatctggg  720
cggtgctgtg cttcttctcc agcgccttca ccgtgctcac cttcctcatc gacccggccc  780
gcttccgcta ccccgagcgc cccatcatct tcctctccat gtgctactgc gtctactccg  840
tgggctacct catccgcctc ttcgccggcg ccgagagcat cgcctgcgac cgggacagcg     900
gccagctcta tgtcatccag gagggactgg agagcaccgg ctgcacgctg gtcttcctgg     960
tcctctacta cttcggcatg gccagctcgc tgtggtgggt ggtcctcacg ctcacctggt    1020
tcctggccgc cggcaagaag tggggccacg aggccatcga agccaacagc agctacttcc    1080
acctggcagc ctgggccatc ccggcggtga agaccatcct gatcctggtc atgcgcaggg    1140
tggcggggga cgagctcacc ggggtctgct acgtgggcag catggacgtc aacgcgctca    1200
ccggcttcgt gctcattccc ctggcctgct acctggtcat cggcacgtcc ttcatcctct    1260
cgggcttcgt ggccctgttc cacatccgga gggtgatgaa gacgggcggc gagaacacgg    1320
acaagctgga gaagctcatg gtgcgtatcg ggctcttctc tgtgctgtac accgtgccgg    1380
ccacctgtgt gatcgcctgc tacttttacg aacgcctcaa catggattac tggaagatcc    1440
tggcggcgca gcacaagtgc aaaatgaaca accagactaa aacgctggac tgcctgatgg    1500
ccgcctccat ccccgccgtg gagatcttca tggtgaagat ctttatgctg ctggtggtgg    1560
ggatcaccag cgggatgtgg atttggacct ccaagactct gcagtcctgg cagcaggtgt    1620
gcagccgtag gttaaagaag aagagccgga gaaaaccggc cagcgtgatc accagcggtg    1680
ggatttacaa aaaagcccag catccccaga aaactcacca cgggaaatat gagatccctg    1740
cccagtcgcc cacctgcgtg tgaacagggc tggagggaag ggcacagggg cgcccggagc    1800
taagatgtgg tgcttttctt ggttgtgttt ttctttcttc ttcttctttt tttttttttt    1860
ataaaagcaa aagagaaata cataaaaaag tgtttaccct gaaattcagg atgctgtgat    1920
acactgaaag gaaaaatgta cttaaagggt tttgttttgt tttggttttc cagcgaaggg    1980
aagctcctcc agtgaagtag cctcttgtgt aactaatttg tggtaaagta gttgattcag    2040
ccctcagaag aaaacttttg tttagagccc tccgtaaata tacatctgtg tatttgagtt    2100
ggctttgcta cccatttaca aataagagga cagataactg ctttgcaaat tcaagagcct    2160
cccctgggtt aacaaatgag ccatccccag ggcccacccc caggaaggcc acagtgctgg    2220
gcggcatccc tgcagaggaa agacaggacc cggggcccgc ctcacacccc agtggatttg    2280
gagttgctta aaatagactc tggccttcac caatagtctc tctgcaagac agaaacctcc    2340
atcaaacctc acatttgtga actcaaacga tgtgcaatac atttttttct ctttccttga  2400
aaataaaaag agaaacaagt attttgctat atataaagac aacaaaagaa atctcctaac  2460
aaaagaacta agaggcccag ccctcagaaa cccttcagtg ctacattttg tggcttttta  2520
atggaaacca agccaatgtt atagacgttt ggactgattt gtggaaagga ggggggaaga  2580
gggagaagga tcattcaaaa gttacccaaa gggcttattg actctttcta ttgttaaaca  2640
aatgatttcc acaaacagat caggaagcac taggttggca gagacacttt gtctagtgta  2700
ttctcttcac agtgccagga aagagtggtt tctgcgtgtg tatatttgta atatatgata  2760
tttttcatgc tccactattt tattaaaaat aaaatatgtt ctttaaaaaa a           2811
<210>2
<211>581
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val Met Gly
1               5                   10                  15
Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly
            20                  25                  30
Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn
        35                  40                  45
Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala
    50                  55                  60
Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His
65                  70                  75                  80
Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr
                 85                  90                  95
Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln
            100                 105                 110
Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp
        115                 120                 125
Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn
    130                 135                 140
Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg
145                 150                 155                 160
Gly Ser Gly Leu Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro His Ser
                165                 170                 175
Ala Gln Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Cys
            180                 185                 190
Asp Asn Pro Gly Lys Phe His His Val Glu Lys Ser Ala Ser Cys Ala
        195                 200                 205
Pro Leu Cys Thr Pro Gly Val Asp Val Tyr Trp Ser Arg Glu Asp Lys
    210                 215                 220
Arg Phe Ala Val Val Trp Leu Ala Ile Trp Ala Val Leu Cys Phe Phe
225                 230                 235                 240
Ser Ser Ala Phe Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Asp Pro Ala Arg Phe
                245                 250                 255
Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe Leu Ser Met Cys Tyr Cys Val
            260                 265                 270
Tyr Ser Val Gly Tyr Leu Ile Arg Leu Phe Ala Gly Ala Glu Ser Ile
        275                 280                 285
Ala Cys Asp Arg Asp Ser Gly Gln Leu Tyr Val Ile Gln Glu Gly Leu
    290                 295                 300
Glu Ser Thr Gly Cys Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Tyr Tyr Phe Gly
305                 310                 315                 320
Met Ala Ser Ser Leu Trp Trp Val Val Leu Thr Leu Thr Trp Phe Leu
                325                 330                 335
Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala Ile Glu Ala Asn Ser Ser
            340                 345                 350
Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Ile Pro Ala Val Lys Thr Ile Leu
        355                 360                 365
Ile Leu Val Met Arg Arg Val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly Val Cys
    370                 375                 380
Tyr Val Gly Ser Met Asp Val Asn Ala Leu Thr Gly Phe Val Leu Ile
385                 390                 395                 400
Pro Leu Ala Cys Tyr Leu Val Ile Gly Thr Ser Phe Ile Leu Ser Gly
                405                 410                 415
Phe Val Ala Leu Phe His Ile Arg Arg Val Met Lys Thr Gly Gly Glu
            420                 425                 430
Asn Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg Ile Gly Leu Phe Ser
        435                 440                 445
Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr Cys Val Ile Ala Cys Tyr Phe Tyr
    450                 455                 460
Glu Arg Leu Asn Met Asp Tyr Trp Lys Ile Leu Ala Ala Gln His Lys
465                 470                 475                 480
Cys Lys Met Asn Asn Gln Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met Ala Ala
                485                 490                 495
Ser Ile Pro Ala Val Glu Ile Phe Met Val Lys Ile Phe Met Leu Leu
            500                 505                 510
Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Thr Ser Lys Thr Leu
        515                 520                 525
Gln Ser Trp Gln Gln Val Cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys Ser Arg
    530                 535                 540
Arg Lys Pro Ala Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Ile Tyr Lys Lys Ala
545                 550                 555                 560
Gln His Pro Gln Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu Ile Pro Ala Gln
                565                 570                 575
Ser Pro Thr Cys Val
            580
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RT-PCR的人工合成引物
<400>3
aattttcttg tccaccttgg tg                     22
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RT-PCR的人工合成引物
<400>4
ctaacactca ttcctgttga agctct                 26
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>5
aatagcggcc gcaccatgaa atgcagctgg gttatctt                     38
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>6
aatagctagc tgcagagaca gtgaccagag tcc                         33
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>7
aatagcggcc gcaccatgag tgtgcccact cagg                        34
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>8
ttccagcttg gtcccccc                                          18
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RT-PCR的人工合成引物序列
<400>9
tatcgggctc ttctctgtgc                                        20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RT-PCR的人工合成引物序列
<400>10
gactgggcag ggatctcata                                      20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RT-PCR的人工合成引物序列
<400>11
ttagctgtgc tcgcgctact                                      20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RT-PCR的人工合成引物序列
<400>12
tcacatggt t cacacggcag                                     20
<210>13
<211>137
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1               5                   10                  15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
        35                  40                  45
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135
<210>14
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠
<400>14
atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag     60
gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc    120
tgcacagctt ctggcttcaa cattaacgac acctatatgc actgggtgaa gcagaggcct    180
gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaatac taaatatgac    240
ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg    300
cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctag aggagcacgg    360
gggagtagat ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a             411
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>15
Ile Asn Asp Thr Tyr Met His
1               5
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>16
attaacgaca cctatatgca c                     21
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>17
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp
1               5                   10
<210>18
<211>36
<212>DNA
<213>小鼠
<400>18
aggattgatc ctgcgaatgg taatactaaa tatgac    36
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>小鼠
<400>19
Gly Ser Arg Phe Ala Tyr
1               5
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>小鼠
<400>20
gggagtagat ttgcttac                                      18
<210>21
<211>124
<212>PRT
<213>小鼠
<400>21
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
            100                 105                 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120
<210>22
<211>372
<212>DNA
<213>小鼠
<400>22
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt     60
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc    120
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag    180
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgtt gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca    240
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct    300
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg    360
gggaccaagc tg                                                        372
<210>23
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>23
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>24
<211>33
<212>DNA
<213>小鼠
<400>24
cgagcaagtg agaatattta cagtaattta gca                     33
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>25
Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1               5
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>26
gtctatgttg caacaaactt agcagat                     27
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>27
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr
1               5
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>28
caacattttt ggggtactcc gtac                        24
<210>29
<211>139
<212>PRT
<213>小鼠
<400>29
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser
    130                 135
<210>30
<211>417
<212>DNA
<213>小鼠
<400>30
atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag     60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc    120
tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct    180
ggacagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat    240
gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg    300
caactcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcaag agggggtaac    360
tacggctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggatcc       417
<210>31
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>31
Ser Ser Trp Met Asn
1               5
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>小鼠
<400>32
agtagctctt ggatgaac                     18
<210>33
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>33
Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
1               5                   10
<210>34
<211>36
<212>DNA
<213>小鼠
<400>34
cggatttatc ctggagatgg agatactaac tacaat          36
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>35
Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr
1               5
<210>36
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>36
gggggtaact acggctggtt tgcttac                     27
<210>37
<211>129
<212>PRT
<213>小鼠
<400>37
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly
        115                 120                 125
Ser
<210>38
<211>456
<212>DNA
<213>小鼠
<400>38
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt     60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc    120
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac    180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct    240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat    300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gctgtacacg    360
ttcggagggg ggaccaagct gggatccgaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc    420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatct                              456
<210>39
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>39
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1               5                   10                  15
<210>40
<211>45
<212>DNA
<213>小鼠
<400>40
agggccagca aaagtgtcag tacatctggc tatagttata tgcac    45
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>41
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1               5
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>42
cttgcatcca acctagaatc t                              21
<210>43
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>43
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr
1               5
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>44
cagcacagta gggagctgta c                     21
<210>45
<211>1404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体H链序列
<400>45
atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag   60
gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc  120
tgcacagctt ctggcttcaa cattaacgac acctatatgc actgggtgaa gcagaggcct  180
gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaatac taaatatgac  240
ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg  300
cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctag aggagcacgg  360
gggagtagat ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agctagcacc  420
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg  480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca  540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac  600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc  660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt   720
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc   780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca   840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac   900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac   960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag  1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa  1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag  1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag  1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc  1260
gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg  1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc  1380
ctctccctgt ccccgggtaa atga                                         1404
<210>46
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体H链序列.
<400>46
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1               5                   10                  15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
        35                  40                  45
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
    130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
                165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
    210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225                 230                 235                 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>47
<211>705
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体L链序列
<400>47
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt   60
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc  120
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag  180
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgtt gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca  240
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct  300
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg  360
gggaccaagc tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca  420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat  480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag  540
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgaca  600
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc  660
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag                  705
<210>48
<211>234
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体L链序列
<400>48
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
            100                 105                 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
    130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
        195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
    210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>49
<211>1398
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体H链序列
<400>49
atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag   60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc  120
tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct  180
ggacagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat  240
gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg  300
caactcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcaag agggggtaac  360
tacggctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggatccgcc  420
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc  480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg  540
aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga  600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac  660
acctgcaacg taaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa  720
tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc  780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg  840
gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg  900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg  960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag  1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag  1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc  1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc  1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc  1380
ctgtctccgg gtaaatga                                                1398
<210>50
<211>465
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体H链序列
<400>50
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
225                 230                 235                 240
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
                245                 250                 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
            260                 265                 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
        275                 280                 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
    290                 295                 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
        355                 360                 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385                 390                 395                 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
                405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
            420                 425                 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        435                 440                 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
Lys
465
<210>51
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体L链序列
<400>51
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt   60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc  120
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac  180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct  240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat  300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gctgtacacg  360
ttcggagggg ggaccaagct gggatccgaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc  420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg  480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa  540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc  600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa  660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag  720
<210>52
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的抗REG4嵌合抗体L链序列
<400>52
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu 6lu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly
        115                 120                 125
Ser Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>53
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>53
aatagcggcc gcaccatggg atggagccgg atcttt                     36
<210>54
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>54
aataggatcc tgcagagaca gtgaccagag tccctt                     36
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>55
aatagcggcc gcaccatgga gacagacaca ctcct                      35
<210>56
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR的人工合成引物
<400>56
aataggatcc cagcttggtc ccccctccga acgt                       34
<210>57
<211>1404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：92-13H链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1404)
<223>
<400>57
atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg     48
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1               5                   10                  15
gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag     96
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
cca ggg gcc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att    144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
        35                  40                  45
aac gac acc tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg    192
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
    50                  55                  60
gag tgg att gga agg att gat cct gcg aat ggt aat act aaa tat gac    240
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp
65                  70                  75                  80
ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac    288
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
                85                  90                  95
aca gcc tac ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc    336
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
tat tac tgt gct aga gga gca cgg ggg agt aga ttt gct tac tgg ggc    384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc aaa aca aca gcc cca tcg    432
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
    130                 135                 140
gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg    480
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
145                 150                 155                 160
act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg    528
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
                165                 170                 175
acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct    576
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc    624
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
        195                 200                 205
tcg agc acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg    672
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
    210                 215                 220
gca agc agc acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca    720
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
225                 230                 235                 240
atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt    768
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
                245                 250                 255
gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg    816
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
            260                 265                 270
atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag    864
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
        275                 280                 285
gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta    912
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
    290                 295                 300
cac aca gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc    960
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
305                 310                 315                 320
cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc   1008
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
                325                 330                 335
aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc   1056
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta   1104
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
        355                 360                 365
tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act   1152
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
    370                 375                 380
ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag   1200
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
385                 390                 395                 400
tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca    1248
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
                405                 410                 415
gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg    1296
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
            420                 425                 430
gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc    1344
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
        435                 440                 445
cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act    1392
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
    450                 455                 460
ccg ggt aaa tga                                                    1404
Pro Gly Lys
465
<210>58
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：92-13H链
<400>58
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1               5                   10                  15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
        35                  40                  45
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
    130                 135                 140
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
145                 150                 155                 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
                165                 170                 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
        195                 200                 205
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
    210                 215                 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
225                 230                 235                 240
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
        275                 280                 285
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
    290                 295                 300
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
            420                 425                 430
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
        435                 440                 445
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
    450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>59
<211>705
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：92-13L链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(705)
<223>
<400>59
atg agt gtg ccc act cag gtc ctg ggg ttg ctg ctg ctg tgg ctt aca     48
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
gat gcc aga tgt gac atc cag atg act cag tct cca gcc tcc cta tct     96
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
            20                  25                  30
gta tct gtg gga gaa act gtc acc atc aca tgt cga gca agt gag aat    144
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
        35                  40                  45
att tac agt aat tta gca tgg tat cag cag aaa cag gga aaa tct cct    192
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
    50                  55                  60
cag ctc ctg gtc tat gtt gca aca aac tta gca gat ggt gtg cca tca    240
Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca cag tat tcc ctc aag atc aac    288
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
                85                  90                  95
agc ctg cag tct gaa gat ttt ggg agt tat tac tgt caa cat ttt tgg    336
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
            100                 105                 110
ggt act ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg    384
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag cag    432
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
    130                 135                 140
tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc tac    480
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga caa    528
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
                165                 170                 175
aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc acc    576
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            180                 185                 190
tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa cga    624
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
        195                 200                 205
cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca ccc    672
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
    210                 215                 220
att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag                        705
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225                 230
<210>60
<211>234
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：92-13L链
<400>60
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
            100                 105                 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
    130                 135                 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
                165                 170                 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            180                 185                 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
        195                 200                 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
    210                 215                 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225                 230
<210>61
<211>1404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：93-22H链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1404)
<223>
<400>61
atg gga tgg agc cgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca ata act gca ggt     48
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
gtc cat tgc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag     96
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
cct ggg gcc tca gtg aag att tcc tgc aaa gct tct ggc tac gca ttc    144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
        35                  40                  45
agt agc tct tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggt ctt    192
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
gag tgg att gga cgg att tat cct gga gat gga gat act aac tac aat    240
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
ggg aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc    288
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
aca gcc tac atg caa ctc agc agc ctg acc tct gtg gac tct gcg gtc    336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
tat ttc tgt gca aga ggg ggt aac tac ggc tgg ttt gct tac tgg ggc    384
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc aaa aca aca gcc cca tcg    432
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
    130                 135                 140
gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg    480
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
145                 150                 155                 160
act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg    528
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
                165                 170                 175
acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct    576
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc     624
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
        195                 200                 205
tcg agc acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg     672
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
    210                 215                 220
gca agc agc acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca     720
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
225                 230                 235                 240
atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt     768
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
                245                 250                 255
gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg     816
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
            260                 265                 270
atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag     864
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
        275                 280                 285
gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta     912
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
    290                 295                 300
cac aca gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc     960
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
305                 310                 315                 320
cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc    1008
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
                325                 330                 335
aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc    1056
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta    1104
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
        355                 360                 365
tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act    1152
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
    370                 375                 380
ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag    1200
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
385                 390                 395                 400
tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca    1248
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
                405                 410                 415
gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg    1296
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
            420                 425                 430
gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc    1344
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
        435                 440                 445
cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act    1392
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
    450                 455                 460
ccg ggt aaa tga                                                    1404
Pro Gly Lys
465
<210>62
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：93-22H链
<400>62
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
    130                 135                 140
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
145                 150                 155                 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
                165                 170                 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
        195                 200                 205
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
    210                 215                 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
225                 230                 235                 240
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
        275                 280                 285
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
    290                 295                 300
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
            420                 425                 430
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
        435                 440                 445
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
    450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>63
<211>714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：93-22L链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(714)
<223>
<400>63
atg gag aca gac aca ctc ctg tta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca     48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
ggt tcc act ggt gac att gtg ctg aca cag tct cct gct tcc tta gct     96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
            20                  25                  30
gta tct ctg ggg cag agg gcc acc atc tca tgc agg gcc agc aaa agt    144
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
        35                  40                  45
gtc agt aca tct ggc tat agt tat atg cac tgg tac caa cag aaa cca    192
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat ctt gca tcc aac cta gaa tct    240
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
ggg gtc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg gca gac ttc acc    288
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
ctc aac atc cat cct gtg gag gag gag gat gct gca acc tat tac tgt    336
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
cag cac agt agg gag ctg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa    384
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
        115                 120                 125
ata aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc    432
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
    130                 135                 140
agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac    480
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
145                 150                 155                 160
aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt    528
Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser
                165                 170                 175
gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa    576
Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys
            180                 185                 190
gac agc acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag    624
Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu
        195                 200                 205
tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca    672
Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser
    210                 215                 220
act tca ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag            714
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225                 230                 235
<210>64
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：93-22L链
<400>64
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
        115                 120                 125
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
    130                 135                 140
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
145                 150                 155                 160
Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser
                165                 170                 175
Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu
        195                 200                 205
Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser
    210                 215                 220
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225                 230                 235
<210>65
<211>1395
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：39-10H链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1395)
<223>
<400>65
atg gat tgg ctg tgg aac ttg cta ttc ctg atg gca gct gcc caa agt     48
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
atc caa gca cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag     96
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
            20                  25                  30
cct gga gag aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc    144
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
aca aac tat gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta    192
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
aag tgg atg ggc tgg ata aac acc aac act gga gag cca aca tat gct    240
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
gaa gag ttc aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc    288
Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
                85                  90                  95
act gcc tat ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca    336
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
            100                 105                 110
tat ttc tgt gca aga ggg ggg tac ggg gac tac tgg ggc caa ggc acc    384
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat cca    432
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
    130                 135                 140
ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta gga    480
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
145                 150                 155                 160
tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg aac    528
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn
                165                 170                 175
tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg cag    576
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
            180                 185                 190
tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc tcg agc acc    624
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr
        195                 200                 205
tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc agc    672
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
    210                 215                 220
acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc    720
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
225                 230                 235                 240
tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc    768
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
                245                 250                 255
gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg    816
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
            260                 265                 270
agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca    864
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
        275                 280                 285
gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct    912
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
    290                 295                 300
cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc    960
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val
305                 310                 315                 320
agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc   1008
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
                325                 330                 335
aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc   1056
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
            340                 345                 350
atc tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg   1104
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
        355                 360                 365
cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc   1152
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
    370                 375                 380
atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac    1200
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn
385                 390                 395                 400
aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac    1248
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
                405                 410                 415
tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag    1296
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
            420                 425                 430
aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt    1344
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
        435                 440                 445
ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa    1392
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
    450                 455                 460
tga                                                                1395
<210>66
<211>464
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：39-10H链
<400>66
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
    130                 135                 140
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
145                 150                 155                 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn
                165                 170                 175
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
            180                 185                 190
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr
        195                 200                 205
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
    210                 215                 220
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
                245                 250                 255
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
            260                 265                 270
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
        275                 280                 285
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
    290                 295                 300
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
                325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
            340                 345                 350
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
        355                 360                 365
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
    370                 375                 380
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn
385                 390                 395                 400
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
                405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
            420                 425                 430
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
        435                 440                 445
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>67
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：39-10L链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(717)
<223>
<400>67
atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca     48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
ggt tcc aca ggt gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct     96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
            20                  25                  30
gtg tct cta ggg cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt    144
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
        35                  40                  45
gtt gat agt tat ggc aat agt ttt atg cac tgg tac cag cag aaa cca    192
Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct    240
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
ggg atc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc    288
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
ctc acc att aat cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt    336
Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
cag caa agt aat gag gat cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg    384
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
gaa atc aaacgg gct gat gct gca ccaact gta tcc atc ttc cca cca      432
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg    480
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145                 150                 155                 160
aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc    528
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
                165                 170                 175
agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc    576
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
            180                 185                 190
aaa gac agc acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac    624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
        195                 200                 205
gag tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca    672
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
    210                 215                 220
tca act tca ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag        717
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225                 230                 235
<210>68
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽：39-10L链
<400>68
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
        35                  40                  45
Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
                165                 170                 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
        195                 200                 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
    210                 215                 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225                 230                 235

Claims (42)

1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO：15、17和19所示的氨基酸序列或其互补决定区(CDR)功能等价物的CDR，而所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO：23、25和27所示的氨基酸序列或其CDR功能等价物的CDR；并且所述抗体或其片段能结合卷曲同源物10(FZD10)蛋白或其部分肽。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段和单链抗体。
3.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体是小鼠抗体。
4.权利要求3的抗体或其片段，其中所述小鼠抗体包含具有SEQID NO：57所示的氨基酸序列的重链和/或具有SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的轻链。
5.权利要求3的抗体或其片段，其中所述小鼠抗体是由杂交瘤克隆92-13(FERM BP-10628)产生的。
6.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体是嵌合抗体。
7.权利要求6的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQID NO：13所示的氨基酸序列的重链可变区。
8.权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的重链。
9.权利要求6的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区。
10.权利要求6或9的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的轻链。
11.权利要求6的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区。
12.权利要求6或11的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的轻链。
13.权利要求6-12中任一项的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体还包含人抗体恒定区。
14.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体是人源化抗体。
15.权利要求14的抗体或其片段，其中所述人源化抗体还包含人抗体构架区和/或人抗体恒定区。
16.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO：31、33和35所示的氨基酸序列或其互补决定区(CDR)功能等价物的CDR，而所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO：39、41和43所示的氨基酸序列或其CDR功能等价物的CDR；并且所述抗体或其片段能结合卷曲同源物10(FZD10)蛋白或其部分肽。
17.权利要求16的抗体或其片段，其中所述抗体选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段和单链抗体。
18.权利要求16的抗体或其片段，其中所述抗体是小鼠抗体。
19.权利要求18的抗体或其片段，其中所述小鼠抗体包含具有SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的重链和/或具有SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的轻链。
20.权利要求18的抗体或其片段，其中所述小鼠抗体是由杂交瘤克隆93-22(FERM BP-10620)产生的。
21.权利要求16的抗体或其片段，其中所述抗体是嵌合抗体。
22.权利要求21的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的重链可变区。
23.权利要求21或22的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的重链。
24.权利要求21的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链可变区。
25.权利要求21或24的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的轻链。
26.权利要求21的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链可变区。
27.权利要求21或26的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的轻链。
28.权利要求21-27中任一项的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体还包含人抗体恒定区。
29.权利要求16的抗体或其片段，其中所述抗体是人源化抗体。
30.权利要求29的抗体或其片段，其中所述人源化抗体还包含人抗体构架区和/或人抗体恒定区。
31.权利要求1-30中任一项的抗体或其片段，所述抗体或其片段用放射性同位素标记或荧光标记来标记。
32.权利要求31的抗体或其片段，其中所述放射性同位素标记选自90钇(90Y)、125碘(125I)和111铟(111In)。
33.一种杂交瘤克隆92-13(FERM BP-10628)，其产生小鼠单克隆抗体92-13。
34.一种杂交瘤克隆93-22(FERM BP-10620)，其产生小鼠单克隆抗体93-22。
35.一种用于治疗或预防患者的卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的权利要求1-32中任一项的抗体或其片段。
36.权利要求35的方法，其中所述FZD10相关疾病选自滑膜肉瘤(SS)、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)。
37.一种用于诊断或预测患者的卷曲同源物10(FZD10)相关疾病或发病趋势的方法，所述方法包括
(a)使来自患者的样品或标本接触权利要求1-32中任一项的抗体或其片段；
(b)检测所述样品或标本中的FZD10蛋白；和
(c)与对照相比，根据FZD10蛋白的相对丰度来判断所述患者是否患有所述疾病或具有患所述疾病的危险。
38.权利要求37的方法，其中所述FZD10相关疾病选自滑膜肉瘤(SS)、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)。
39.一种用于患者卷曲同源物10(FZD10)蛋白的体内造影方法，所述方法包括给予患者有效量的权利要求31或32的抗体或其片段。
40.一种用于治疗或预防卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的药物组合物，所述组合物包含权利要求1-32中任一项的抗体或其片段以及药学上可接受的载体或赋形剂。
41.一种用于诊断或预测卷曲同源物10(FZD10)相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-32中任一项的抗体或其片段。
42.一种用于卷曲同源物10(FZD10)蛋白体内造影的药物组合物，所述组合物包含权利要求31或32的抗体或其片段。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922912A (zh) * 2015-08-10 2018-04-17 国立大学法人富山大学 抗原特异性单克隆抗体制作方法
CN109219445A (zh) * 2016-04-01 2019-01-15 上海斯丹赛生物技术有限公司 嵌合抗原受体修饰细胞治疗癌症的应用
CN110036110A (zh) * 2016-10-06 2019-07-19 肿瘤疗法科学股份有限公司 针对fzd10的单克隆抗体及其用途

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2628221A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Anti-frizzled receptor antibodies for treating cancer
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
CN101558308A (zh) * 2006-11-14 2009-10-14 诺瓦提斯公司 治疗、诊断或检测癌症的方法
CA2706732A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to the pcrv antigen of pseudomonas aeruginosa
PT2331136T (pt) 2008-09-26 2018-03-27 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligação a frizzled e utilizações dos mesmos
JP5407042B2 (ja) * 2009-12-16 2014-02-05 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 セセルニン−１の使用、滑膜肉腫の予後予測方法及び検査用試薬キット
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
JP2013530929A (ja) 2010-04-01 2013-08-01 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合剤およびその使用
EP2720721B1 (en) 2011-06-17 2017-08-30 President and Fellows of Harvard College Frizzled 2 as a target for therapeutic antibodies in the treatment of cancer
CA2844289C (en) * 2011-08-12 2020-01-14 Omeros Corporation Anti-fzd10 monoclonal antibodies and methods for their use
US9777055B2 (en) 2012-04-20 2017-10-03 Thomas Jefferson University Engineered antibody for inhibition of fibrosis
US9266959B2 (en) 2012-10-23 2016-02-23 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using frizzled-binding agents
AU2014212081A1 (en) 2013-02-04 2015-08-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a Wnt pathway inhibitor
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
WO2016040895A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 xxTHE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY Wnt signaling agonist molecules
UY36404A (es) 2014-11-21 2016-06-01 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware ANTICUERPOS MONOCLONALES (Ab) COMO DETECTORES DE CD73 E INHIBIDORES DE SU ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN
CA2968382A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
WO2017070567A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 The Research Foundation For The State University Of New York Klebsiella pneumoniae antibodies and methods to treat klebsiella pneumoniae infections
US10654934B2 (en) 2016-04-01 2020-05-19 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
JP7305543B2 (ja) 2017-01-26 2023-07-10 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子およびその使用
AU2018393076A1 (en) 2017-12-19 2020-07-02 Surrozen Operating, Inc. Anti-LRP5/6 antibodies and methods of use
JP7330977B2 (ja) 2017-12-19 2023-08-22 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド Ｗｎｔサロゲート分子及びその使用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB9009548D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
EP0628639B1 (en) 1991-04-25 1999-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
GB9414580D0 (en) 1994-07-19 1994-09-07 Cancer Res Campaign Tech Materials and methods relating to the diagnosis of synovial sarcomas
US5994098A (en) 1997-06-02 1999-11-30 Smithkline Beecham Corporation Human 7-TM receptor similar to murine frizzled-6 gene
EP0943684A3 (en) 1998-03-10 2002-01-23 Smithkline Beecham Plc Frizzled-like polypeptides and polynucleotides
GB9819681D0 (en) 1998-09-09 1998-11-04 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
AU2001251034A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Gene Logic, Inc Gene expression profiles in esophageal tissue
CN1311081C (zh) 2000-08-19 2007-04-18 爱克斯澳迪亚有限公司 干细胞分化
US6964849B2 (en) 2001-01-11 2005-11-15 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US6991901B2 (en) 2001-01-11 2006-01-31 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
EP1463928A2 (en) 2001-04-18 2004-10-06 Protein Design Labs Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
US7682607B2 (en) 2001-05-01 2010-03-23 The Regents Of The University Of California Wnt and frizzled receptors as targets for immunotherapy in head and neck squamous cell carcinomas
US20030044409A1 (en) 2001-05-01 2003-03-06 Carson Dennis A. Immunologic compositions and methods for studying and treating cancers expressing frizzled antigens
AU2002317105A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 University Of British Columbia Methods for identifying therapeutic agents for treating diseases involving wnt polypeptides and wnt receptors
WO2004020668A2 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Oncotherapy Science, Inc. Method for treating synovial sarcoma
WO2005004912A1 (en) * 2003-07-11 2005-01-20 Oncotherapy Science, Inc. Method for treating synovial sarcoma
EP1549144A4 (en) 2002-10-04 2010-01-06 Univ California METHODS OF TREATING CANCER BY INHIBITING WNT SIGNALING
EP1789549A1 (en) 2004-08-05 2007-05-30 The University of Tokyo Method for treating synovial sarcoma using sirna for fzd10

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922912A (zh) * 2015-08-10 2018-04-17 国立大学法人富山大学 抗原特异性单克隆抗体制作方法
CN109219445A (zh) * 2016-04-01 2019-01-15 上海斯丹赛生物技术有限公司 嵌合抗原受体修饰细胞治疗癌症的应用
CN109219445B (zh) * 2016-04-01 2022-08-26 上海煦顼技术有限公司 嵌合抗原受体修饰细胞治疗癌症的应用
CN110036110A (zh) * 2016-10-06 2019-07-19 肿瘤疗法科学股份有限公司 针对fzd10的单克隆抗体及其用途
CN110036110B (zh) * 2016-10-06 2023-02-03 肿瘤疗法科学股份有限公司 针对fzd10的单克隆抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
US8221751B2 (en) 2012-07-17
EP2044123A1 (en) 2009-04-08
CA2655289C (en) 2016-08-23
ES2405618T3 (es) 2013-05-31
EP2386577A9 (en) 2011-12-28
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