KR20090029275A - Ｆｚｄ10에 대한 종양-표적화 모노클로날 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Ｆｚｄ10에 대한 종양-표적화 모노클로날 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프리즐드 상동체 10 (FZD10: Frizzled homologue 10) 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편, 예컨대 마우스 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 FZD10-관련 질환의 치료 및/또는 예방 방법; FZD10-관련 질환의 진단 또는 예후 방법; 및 대상 내의 FZD10의 생체내 영상화 방법에 관한 것이다.
Figure P1020097001229
프리즐드 상동체 10 (FZD10), 항-FZD10 항체, 종양-표적화

Description

ＦＺＤ10에 대한 종양-표적화 모노클로날 항체 및 이의 용도{TUMOR-TARGETING MONOCLONAL ANTIBODIES TO FZD10 AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 가출원 번호 60/815,257 (2006년 6월 21일 출원)을 우선권으로 청구한다. 상기 출원의 전체 내용은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.
본 발명은 프리즐드 상동체 10 (FZD10: Frizzled homologue 10) 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편, 예컨대 마우스 모노클로날(monoclonal) 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 FZD10-관련 질환의 치료 및/또는 예방 방법; FZD10-관련 질환의 진단 또는 예후 방법; 및 대상 내의 FZD10의 생체내 영상화 방법에 관한 것이다.
암-특이적 분자에 대한 모노클로날 항체가 암 치료에서 유용한 것으로 입증되었다 ([Harris, M. (2004). Lancet Oncol, 5, 292-302]). 유방암, 악성 림프종 및 결장암에 대한 트라스투주맵 ([Baselga, J. (2004). Oncology, 61, Suupl 2 14-21]), 리툭시맵 ([Maloney, D.G., et al. (1997). Blood, 90, 2188-95]) 및 베바시주맵 ([Ferrara, N., et al. (2004). Nat Rev Drug Discov, 3, 391-400])과 같은 인간화 또는 키메라 항체의 임상 적용의 성공적인 예에 더하여, 또다른 분자 표적에 대한 다수의 모노클로날 항체가 개발 중이고, 이들의 항-종양 활성에 대해 평가되고 있다. 이러한 모노클로날 항체들은 효과적인 치료법이 없는 종양이 있는 환자에게 희망을 제공할 것으로 예상된다. 이러한 모노클로날 항체들에 대한 또다른 중요한 이슈 중 하나는 표적 분자를 발현하는 세포에 대한 이들의 특이적 반응으로 인해 심한 독성 없이 암 세포에 대해 선택적인 치료 효과를 달성하는 것이다 ([Crist, W.M., et al. (2001). J Clin Oncol, 19, 3091-102]; [Wunder, J.S., et al. (1998). J Bone Joint Surg Am, 80, 1020-33]; [Ferguson, W.S. and Goorin, A.M. (2001). Cancer Invest, 19, 292-315]).
연질 조직 육종 중에서, 골육종, 유잉(Ewing) 육종 및 가로무늬근육종은 화학요법에 대해 감수성이고, 이러한 질환들은 화학요법에 의해 잘 관리될 수 있다. 반면에, 방추 세포 육종은 화학요법 및 방사선요법에 대해 저항성이고, 이러한 육종이 있는 환자는 일반적으로 불량한 예후를 나타낸다. 활막 육종 (SS)에 대해, 수술 치료가 초기 단계의 환자에게 효과적이지만, 진행된 단계의 환자에게는 효과적인 치료 약물이 이용가능하지 않다. 따라서, 환자의 예후를 더 양호하게 개선하기 위해 신규 치료 양식의 개발이 예상된다.
종양에서의 게놈 전체에 걸친(genome-wide) 유전자 발현 분석은 신규 항암 약물 및 종양 마커의 개발을 위한 새로운 분자 표적을 확인하기 위한 유용한 정보를 제공한다. 기존의 연구에서, 본 발명가들은 23,040개의 유전자로 구성된, 게놈 전체에 걸친 cDNA 마이크로어레이를 사용하여 여러 연질 조직 육종의 유전자 발현 프로파일을 분석하였고, 프리즐드 상동체 10 (FZD10) (GenBank 접속 번호 AB027464 (서열 1) 및 BAA84093 (서열 2))가 SS에서 특이적으로, 그리고 빈번하게 상향 조절되었음을 증명하였다 ([Nagayama, S., et al. (2002) Cancer Res, 62, 5859-66]; 및 WO2004/020668). FZD10 유전자 생성물은 프리즐드 패밀리의 구성원이고, 추정 WNT 신호 수용체이다 ([Koike, J., et al. (1999). Biochem Biophys Res Commun, 262, 39-43]). 추가적인 분석은 FZD10이 SS에서 특이적으로 발현되고, 태반을 제외한 다른 정상 기관에서는 검출가능하지 않은 또는 거의 검출가능하지 않은 수준으로 발현된다는 것을 나타냈고, 이는 이러한 분자를 표적으로 하는 치료법이 부작용을 일으키지 않거나 거의 일으키지 않을 것임을 시사한다 ([Nagayama, S., et al. (2002). Cancer Res, 62, 5859-66]). RNAi 실험은 FZD10이 SS의 종양 성장에서 현저하게 수반되었음을 암시하였다 (WO2006/013733). 또한, 본 발명가들은 FZD10의 세포외 도메인 (FZD10-ECD)에 대한 토끼 폴리클로날(polyclonal) 항체를 생성시켰고, 이러한 항체가 SS의 마우스 이종이식 모델에서 항종양 활성이 있었음을 발견하였다 ([Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-12]; 및 WO2005/004912). 종합하여, FZD10에 대한 항체 치료법이 SS의 임상 결과를 개선시킬 것으로 예상될 수 있다.
발명의 개요
하기에서, 가능한 임상 용도를 위한 세포-면역화 방법에 의한 FZD10에 대한 뮤린(murine) 모노클로날 항체의 생성이 보고된다. 이러한 항체의 생체내 종양-결합 활성을 방사선핵종으로의 통상적인 방법에 더하여 근적외선 형광으로 형광 생체 내 영상화 시스템을 사용하여 평가하였다. 여기서, 본 발명가들은 시험관내 및 생체내 모두에서의 항-FZD10 모노클로날 항체의 결합 특이성, 뿐만 아니라 FZD10를 발현하는 세포에서의 이러한 항체의 내입(內入)을 밝혔고, 100 μCi 용량의 90Y-표지 항-FZD10 Mab의 단일 꼬리 정맥 주사로 처리된 SYO-1-보유 이종이식 마우스에서 현저한 항종양 효과가 관찰되었음을 발견하였다.
상기의 발견을 기초로, 본 발명가들은 FZD10에 대한 뮤린 모노클로날 항체가 SS 및 기타 FZD10-과발현 종양의 치료 및 진단에서 치료 잠재력이 있는 것으로 결론지었다.
따라서, 첫번째 양상에서, 본 발명은 서열 15, 17 및 19에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 H 사슬 (중쇄) V (가변) 영역, 및 서열 23, 25 및 27에 제시된 아미노산 서열의 CDR 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 L 사슬 (경쇄) V 영역을 포함하고, 프리즐드 상동체 10 (FZD10) 단백질 또는 이의 부분적인 펩티드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 단편, 및 단일쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 마우스 항체이다. 바람직하게는, 마우스 항체는 서열 57에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 및/또는 서열 59에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함한다. 예를 들어, 마우스 항체는 하이브리도 마(hybridoma) 클론(clone) 92-13 (FERM BP-10628)에 의해 생산될 수 있다.
별법적인 바람직한 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 바람직하게는, 키메라 항체는 서열 13에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역을 포함하고, 예를 들어, 키메라 항체는 서열 46에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키메라 항체는 서열 21에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함하고, 예를 들어, 키메라 항체는 서열 48에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 키메라 항체는 서열 13에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역 및 서열 21에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메라 항체는 서열 46에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체는 인간 항체 C (불변) 영역을 추가로 포함한다.
별법적인 바람직한 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 인간 항체 FR (프레임워크(framework)) 영역 및/또는 인간 항체 C 영역을 추가로 포함한다.
두번째 양상에서, 본 발명은 서열 31, 33 및 35에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 H 사슬 (중쇄) V (가변) 영역, 및 서열 39, 41 및 43에 제시된 아미노산 서열의 CDR 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 L 사슬 (경쇄) V 영역을 포함하고, 프리즐드 상동체 10 (FZD10) 단백질 또는 이의 부분적인 펩티드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 단편, 및 단일쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 마우스 항체이다. 바람직하게는, 마우스 항체는 서열 61에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 및/또는 서열 63에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함한다. 예를 들어, 마우스 항체는 하이브리도마 클론 93-22 (FERM BP-10620)에 의해 생산될 수 있다.
별법적인 바람직한 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 바람직하게는, 키메라 항체는 서열 29에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역을 포함하고, 예를 들어, 키메라 항체는 서열 50에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬을 포함한다. 바람직하게는, 키메라 항체는 서열 37에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함하고, 예를 들어, 키메라 항체는 서열 52에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 키메라 항체는 서열 29에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역 및 서열 37에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메라 항체는 서열 50에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 및 서열 52에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체는 인간 항체 C (불변) 영역을 추가로 포함한다.
별법적인 바람직한 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 인간 항체 FR (프레임워크) 영역 및/또는 인간 항체 C 영역을 추가로 포함한다.
별법적인 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지로 표지될 수 있다. 이같은 방사성동위원소 표지에는 90이트륨 (90Y), 125요오드 (125I) 및 111인듐 (111In)이 포함된다.
세번째 양상에서, 본 발명은 마우스 모노클로날 항체 92-13를 생산하는 하이브리도마 클론 92-13 (FERM BP-10628)을 제공한다.
네번째 양상에서, 본 발명은 마우스 모노클로날 항체 93-22를 생산하는 하이브리도마 클론 93-22 (FERM BP-10620)를 제공한다.
다섯번째 양상에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 상기 항체 또는 단편을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, FZD10과 관련된 질환은 활막 육종 (SS), 결장직장암, 위암, 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
여섯번째 양상에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 대상에서 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환 또는 이러한 질환이 발달될 소질을 진단 또는 예후하는 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터의 샘플 또는 표본을 상기 항체 또는 단편과 접촉시키는 단 계;
(b) 샘플 또는 표본 내의 FZD10 단백질을 검출하는 단계; 및
(c) 대조군과 비교된 FZD10 단백질의 상대 존재비를 기초로 대상이 질환에 걸렸는지 또는 질환이 발달될 위험이 있는지 여부를 판단하는 단계.
한 실시양태에서, FZD10과 관련된 질환은 활막 육종 (SS), 결장직장암, 위암, 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일곱번째 양상에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 상기 항체 또는 단편을 투여하는 것을 포함하는, 대상 내의 프리즐드 상동체 10 (FZD10) 단백질을 생체내 영상화하는 방법을 제공한다.
여덟번째 양상에서, 본 발명은 상기 항체 또는 단편 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
아홉번째 양상에서, 본 발명은 상기 항체 또는 단편을 포함하는, 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환의 진단 또는 예후를 위한 키트를 제공한다.
열번째 양상에서, 본 발명은 상기 항체 또는 단편을 포함하는, 프리즐드 상동체 10 (FZD10) 단백질의 생체내 영상화를 위한 제약 조성물을 제공한다.
열한번째 양상에서, 본 발명은 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환의 진단 또는 예후를 위한 키트의 제조에서의 상기 항체 또는 단편의 용도를 제공한다.
열두번째 양상에서, 본 발명은 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물의 제조에서의 상기 항체 또는 단편의 용도를 제공한다.
용어 "FZD10과 관련된 질환" (FZD10-관련 질환)은 FZD10 단백질의 과발현과 관련된 질환을 지칭한다. 이같은 질환에는 활막 육종 (SS), 결장직장암, 위암, 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "단편"은 FZD10 단백질에 대한 항체로부터 제조될 수 있고 규정된 CDR을 함유하는 임의의 항체 단편을 의미한다. 이같은 단편에는 Fab 단편, F (ab')2 단편, 및 Fv 단편이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "변형된 항체"는 FZD10에 대한 항체로부터 유래될 수 있고 규정된 CDR을 함유하는 임의의 항체를 의미한다. 이같은 변형된 항체에는 PEG-변형 항체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 항체 단편 또는 변형된 단편은 당업자에 의해 쉽게 인식될 수 있고, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
본원에서의 용어 "대상"은 FZD10-관련 질환에 걸린 대상 및 또한 FZD10-관련 질환이 있는 것으로 추측되는 대상을 지칭한다. 본 발명에서의 대상은 포유동물 및 조류 동물을 포함하는 동물일 수 있다. 예를 들어, 포유동물에는 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 토끼 및 개가 포함될 수 있다.
도 1a 내지 1f는 2개의 항-FZD10 모노클로날 항체에 대한 결합 특이성의 특성화를 나타낸다.
도 1a는 5개의 SS 세포주 (SYO-1, YaFuSS, HS-SY-2, Fuji 및 1973/99) 및 1개의 결장암 세포주 (LoVo)를 사용한 4개의 항체 39-2 및 39-10 (WO2005/004912에 개시됨), 92-13 및 93-22의 유동 세포계측법 분석을 나타낸다. 실선은 각각의 mAb에 의해 검출된 형광 강도를 나타내고, 파선은 음성 대조군으로서 면역화되지 않은 마우스 IgG와 함께 인큐베이션된 세포의 형광 강도를 도시한다.
도 1b는 도 1a에서 사용된 것과 동일한 종양 세포주에서의 FZD10의 반-정량적 RT-PCR을 나타낸다. β2-마이크로글로불린 유전자 (β2MG)의 발현이 내부 대조군으로 사용되었다.
도 1c는 외인성 FZD10에 대해 92-13 (상부 패널) 및 93-22 (하부 패널)가 지시된 유동 세포계측법 분석을 나타낸다. 결장암 세포주 SNU-C5를 빈(empty) 벡터 pCAGGS (왼쪽 패널) 또는 pCAGGS-FZD10-myc/His (오른쪽 패널)로 형질감염시키고, 형질감염 48시간 후에 분석하였다. 실선은 각각의 mAb에 의해 검출된 형광 강도를 나타내고, 파선은 음성 대조군으로서 면역화되지 않은 마우스 IgG와 함께 인큐베이션된 세포의 형광 강도를 도시한다.
도 1d는 정상적인 인간 혈액 세포에 대한 125I-표지 39-10, 39-2, 92-13 및 93-22의 결합을 나타낸다. 방사성 표지된 Mab를 표지되지 않은 동일한 항체의 부재 (흰색 막대) 또는 존재 (흑색 막대) 하에 3명의 개체 (A, B 및 C)의 정상적인 신선한 인간 혈액 각각과 함께 인큐베이션하였다.
도 1e는 125I-표지 Mab의 결합 활성을 나타낸다. 일정량의 방사성 표지된 Mab를 SYO-1 세포 및 증가되는 양의 표지되지 않은 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포에 결합된 방사능 백분율을 표지되지 않은 항체의 양에 대해 플랏팅(plotting)하였다. 흑색 원 92-13, 백색 원; 93-22.
도 1f는 자가-차단 및 교차-차단의 유동 세포계측법 분석을 나타낸다. 알렉사(Alexa)-488-표지 92-13 (상부 패널) 및 93-22 (하부 패널)를 (i) PBS 내에서, 또는 100 ㎍의 (ii) 표지되지 않은 92-13 및 (iii) 표지되지 않은 93-22의 존재 하에 SYO-1 세포와 함께 인큐베이션하였다. 실선은 각각의 알렉사488-표지 Mab에 의해 검출된 형광 강도를 나타내고, 파선은 음성 대조군으로서 PBS와 함께 인큐베이션된 세포의 형광 강도를 도시한다.
도 2는 항체 없음 (a, d, g, j, 및 m), 92-13 (b, e, h, k, 및 n) 및 93-22 (c, f, i, l, 및 o)로의 SS 및 정상적인 인간 동결 조직 절편의 면역조직화학적 분석을 나타낸다. (a-c), 활막 육종; (d-f), 신장; (g-i), 간, (j-l), 심장; (m-o), 뇌. 원래의 배율: ×100.
도 3은 111In-표지 및 125I-표지 항체의 생체분포를 나타낸다. 10 kBq의 (a) 111In-표지 92-13, (b) 125I-표지 92-13, (c) 111In-표지 93-22 및 (d) 125I-표지 93-22를 SYO-1 종양이 있는 BALB/c 누드(nude) 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 1시 (흰색 막대), 24시 (빗금 막대) 및 48시 (흑색 막대)에 기관 및 종양을 절개하고, 방사능을 측정하였다. 제시된 데이터는 2회의 독립적인 실험에서의 대표적인 데이터이다.
도 4a는 알렉사 647-표지 92-13 또는 93-22의 주사 후 SYO-1 종양이 있는 마우스의 생체내 형광 영상화를 나타낸다. 형광-표지 Mab를 20 ㎍/마우스의 용량으로 복강내 투여하였다. 모든 형광 영상을 60초 노출 시간 (f/스톱 = 2)으로 주사 전, 주사 직후 (0시), 24시, 48시 및 96시에 취득하였다. 화살표는 종양의 위치를 가리킨다. 피하 종양이 92-13 (상부 패널)은 등에, 93-22 (하부 패널)은 몸통에 위치한다. 오른쪽에 지시된 색상 막대(color bar)에 따라 알렉사647로부터의 형광 신호를 의사-색채화(pseudo-coloring)하였다. 93-22 (하부 패널)에서, 화살촉은 주사 위치를 가리킨다.
도 4b 및 4c는 도 4a에 제시된 마우스로부터의 절개된 기관 및 종양의 대표적인 영상을 나타낸다. 4b; 92-13, 및 4c; 93-22. i, SYO-1 종양; ii, 간; iii, 지라; iv, 신장; v, 췌장; vi, 결장.
도 5a는 알렉사 647-표지 92-13 또는 93-22의 주사 후 LoVo 종양이 있는 마우스의 생체내 형광 영상화를 나타낸다. 형광-표지 Mab를 도 4에서와 같이 투여하였다. 모든 형광 영상을 60초 노출 시간 (f/스톱 = 2)으로 주사 직후 (0시), 48시, 72시, 96시 및 120시 (h)에 취득하였다. 화살표는 종양의 위치를 가리킨다. 피하 종양이 92-13 (상부 패널) 및 93-22 (하부 패널) 모두에 대해 오른쪽 앞다리에 위치한다.
도 5b 및 5c는 도 5a에 제시된 마우스의 절개된 기관 및 종양의 대표적인 영 상을 나타낸다. 5b; 92-13, 및 5c; 93-22. i, LoVo 종양; ii, 간; iii, 지라; iv, 신장; v, 췌장; vi, 결장.
도 6은 공초점 현미경검사에 의해 92-13 및 93-22의 내입이 평가되었음을 나타낸다. 세포를 PBS (a, d, 및 g), 50 ㎍/㎖의 92-13 (b, e, 및 h) 또는 93-22 (c, f, i)로 3시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 처리하였다. 세포 표면에 결합된 항체를 0.1M 글리신 완충제 (pH 2.5)로 산-박리시켰다. 세포를 고정시키고, 투과성이게 한 후, 3％ BSA로 차단하였다. 세포내 항체를 염소 항-마우스 IgG-알렉사488로 검출하고, 핵을 DAPI로 염색하였다. (a-c), SYO-1; (d-f), YaFuSS; (g-i) Lovo.
도 7은 종양 성장에 대한 90Y-표지 92-13의 효과를 나타낸다. 종양이 확립되었을 때 (0.4-2.7 ㎤), 100 μCi의 90Y-표지 92-13의 단일 꼬리 정맥 주사를 마우스에게 제공하였다.
도 8은 키메라 92-13 및 93-22 모두가 FZD10-과발현 SYO-1 세포에 특이적으로 ADCC를 유도하였음을 나타낸다. 다양한 이펙터(effector):표적 비율에서의 1 ㎍/㎖의 키메라 93-22 항체 (ch93-22) 또는 키메라 92-13 항체 (ch92-13). 다양한 도너로부터의 PBMC를 이펙터 세포로 사용하였다; (a), (c) 5명의 건강한 인간 PBMC 도너로의 SYO-1 세포에 대한 키메라 92-13의 ADCC. (b), (d) 2명의 건강한 인간 PBMC 도너로의 LoVo 세포에 대한 키메라 93-22의 ADCC. LDH 활성으로 세포독성을 정량하는 것은 [Nagayama, S., et al. Oncogene, 24, 6201-12]에 기술되어 있다.
프리즐드 상동체 10 (FZD10)는 Wnt 신호전달의 수용체인 프리즐드 패밀리의 구성원이다. 하기 기술되는 바와 같이, 본 발명가들은 의학 용도에 유용할 수 있는 FZD10 단백질에 대한 뮤린 모노클로날 항체 및 키메라 항체를 성공적으로 확립하였다.
FZD10-형질감염 세포로 마우스를 면역화시킴으로써 뮤린 모노클로날 FZD10-특이적 항체 (92-13 및 93-22 Mab)가 확립된다. 유동 세포계측법 (FACS) 분석을 사용함으로써 92-13 및 93-22 Mab 모두 SS 세포주, SYO-1 세포 및 FZD10-형질감염 COS7 세포에서 FZD10에 대한 특이적 결합 활성이 있는 것으로 나타났다. 생체 내에서의 이러한 항체들의 특이적 결합 활성을 확인하기 위해, 본 발명가들은 형광-표지 Mab를 SS 이종이식편을 지니는 마우스 내로 복강내 또는 정맥내 주사하였고, 이러한 Mab들이 FZD10-발현 종양에 결합하였지만 다른 어떠한 정상적인 마우스 조직에도 결합하지 않았음을 생체내 형광 영상화 시스템 및 방사능을 사용함으로써 발견하였다. 이어지는 Mab를 사용한 면역조직화학적 분석에서 태반을 제외한 정상적인 인간 기관에 FZD10 단백질이 부재하거나 거의 검출가능하지 않은 수준이라는 것이 확인되었다. 또한, 흥미롭게도, 본 발명가들은 Mab들이 SS 세포주, SYO-1 내로 내입되었지만, FZD10-음성 세포주인 LoVo에는 내입되지 않았음을 공초점 주사 현미경검사를 사용하여 발견하였다. 놀랍게도, 100 μCi 용량의 90Y-표지 항-FZD10 (92-13) Mab의 단일 꼬리 정맥 주사로 처리된 SYO-1-보유 이종이식 마우스에서 상당한 항종양 효과가 관찰되었다. 종합하여, 본 발명가들은 FZD10에 대한 이러한 특이적 Mab들이 부작용 위험이 최소이거나 없는 SS의 신규 진단 마커 또는 치료제로 이용될 수 있는 것으로 결론지었다.
복잡한 단백질 구조로 인해, 7-막횡단 단백질에 대한 항체를 생성시키는 것이 종종 매우 어렵다. 기존의 연구에서, 본 발명가들은 FZD10이 동종(homo)-올리고머를 형성하였음을 설명하였다 ([Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-12]). 전장 또는 부분적 재조합 FZD10 단백질을 사용함으로써 천연 형태의 FZD10을 인식할 수 있는 항-FZD10 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 여러 시도에서 실패한 후, 최종적으로 본 발명가들은 FZD10을 과발현하는 살아 있는 COS-7 세포를 Balb/c-마우스의 발바닥 내로 주사하는 것에 의한 면역화에 전념하였고, FACS 분석에 의해 살아 있는 세포 내의 천연 FZD10 형태를 인식하는 능력이 있는 항-FZD10 항체를 생산하는 2개의 하이브리도마를 성공적으로 수득하였다. 이러한 항체들이 웨스턴 블롯팅(western blotting)에서 FZD10 단백질을 검출하지 않았기 때문에, 본 발명가들은 이러한 Mab들이 FZD10의 3차 구조를 인식하는 것으로 추정하였다.
92-13 및 93-22 Mab의 생체내 분포를 조사하기 위해, 본 발명가들은 125I 및 111In-표지 항체를 사용하는 방사선핵종 양식을 기초로 하는 방법, 및 근적외선-표지 (알렉사647) 항체를 사용하는 형광 영상화를 기초로 하는 방법의 2가지 방법을 적용하였다. 근적외선 형광, 주로 인도시아닌 염료가 진단 목적을 위한 생체내 영상화에서 현재 광범위하게 사용되는데, 이러한 파장의 빛이 살아 있는 조직을 꽤 효율적으로 투과하기 때문이다 ([Chen, X., et al. (2004). Cancer Res, 64, 8009-14]). 2가지 접근법을 사용한 결과들은 매우 일치하였고, 92-13 및 93-22이 SYO-1 종양 세포에 결합하였지만 다른 정상 조직에는 결합하지 않았음을 가리켰다. 이러한 항체들이 임상 용도에 적용될 수 있는지를 확인하기 위해, 본 발명가들은 정상적인 혈액 세포에 대한 항체의 결합 활성을 추가로 시험하였다. 정상적인 인간 혈액 세포에 대한 125I-표지 92-13 및 93-22의 결합 활성은 3명의 개별적인 도너 모두에서 검출가능하지 않았다 (도 1d). 이러한 결과는 인간 말초혈 단핵 세포를 사용한 FACS 분석 결과와 일치하였고 (데이터는 제시되지 않음), 이는 FZD10 분자에 대한 매우 특이적인 결합 친화력으로 인해 SS 환자에 대한 역효과의 가능성이 거의 없으면서 이러한 2가지 항체를 임상에 적용할 수 있음을 시사하였다. 또한, 공초점 현미경검사를 사용한 시험관내 실험은 세포-표면 FZD10에 대한 92-13 및 93-22 Mab의 특이적 결합이 항체의 내입을 유도하였음을 나타냈다 (도 6). 기존에 기술된 바와 같이 ([Stein, R., et al. (2001). Criti Rev Oncol Hematol, 39, 173-80]; [Stein, R., et al. (2005). Clin Cancer Res, 11, 2727-34]), 표지된 Mab가 결합 후 내입되면, 125I-표지 항체는 라이소솜에서 대사되고 표적 종양 세포로부터 확산되는 한편, 111In-표지 항체는 라이소솜 내에 남는다. 도 3에서 관찰되는 바와 같이, 종양 내의 111In-표지 항체 및 125I-표지 항체의 방사능이 상당히 상이하였다 (도 3, a 및 b, c 및 d). 이러한 발견은 92-13 (및 93-22) Mab가 FZD10 단백질을 통해 SS 세포 내로 특이적으로 내입될 수 있음을 시사한다.
항체가 암 요법에 적용되는 경우, 하기의 3가지 메커니즘이 항-종양 활성을 발휘하는 것으로 생각된다; (i) 표적 분자가 성장 증강에 수반되는 경우, 항체의 중화가 성장 신호 전달을 차단한 후 종양 세포의 성장을 억제할 것이다; (ii) 두번째 가능성은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 유도하는 이펙터 활성이다; (iii) 세번째 경우는 항체에 접합되어 표적 종양 세포에 효과적으로 전달되는 방사선핵종 또는 항-종양 약물이다. 본 발명가들이 표적 분자 FZD10가 SS 종양 성장에 수반된다는 것을 기존에 설명하였지만, 세포 배양 배지에 첨가되었을 때 시험관 내에서 (데이터는 제시되지 않음), 또는 종양-보유 마우스에게 주사되었을 때 생체내에서 (데이터는 제시되지 않음), Mab 92-13 또는 93-22가 중화 효과를 나타내지 않았다.
방사선핵종 또는 항암 약물을 항체에 접합시키는 것 예컨대 제발린(Zevalin) (90이트륨과 접합된 항-CD20 항체) 및 마일로타그(Mylotarg) (칼리키아마이신(calicheamicin)과 접합된 항-CD33 항체)가 항체에 세포독성을 부여하는데 매우 효과적인 것으로 입증되었다 ([Wiseman, G.A. and Witzig, T.E. (2005). Cancer Biother Radiopharm, 20, 185-8]; [van der Velden, V.H., et al. (2001). Blood, 97, 3197-204]; [Carter, P. (2001). Nat Rev Cancer, 1, 118-29]). 마일로타그는 내입된 후 암 세포 내에 항-종양 약물인 칼리키아마이신을 방출함으로써 항-종양 활성을 발휘한다 ([van der Velden, V.H., et al. (2001). Blood, 97, 3197-204]). 실시예에서, 치료 실험을 위해, 90이트륨-DTPA-92-13 접합체를 생성시키고, 이의 항-종양 활성을 조사하였다. 마우스 이종이식 모델에서, 90이트륨-DTPA-92-13 처리 후 종양이 신속하게 축소되었다 (도 7). 두드러지게, 커다란 부피 (> 1㎤)의 종양을 포함하는 종양은 투여하고 나서 34일까지 수축을 나타내지 않았고, 강한 독성이 관찰되지 않았다. 항-FZD10 항체 92-13 및 93-22가 도 6에 제시된 바와 같이 항원-양성 세포 내로 효과적으로 내입되었을 것이기 때문에, Mab 92-13 및 93-22 양쪽 모두에 대한 항암 약물의 접합 또한 SS 세포에 대한 높은 항암 효과를 발휘할 것으로 예상된다. 이펙터 활성에 관하여, 키메라 92-13 및 93-22 모두 FZD10-과발현 SYO-1 세포에 특이적으로 ADCC를 유도하였지만 (도 8, a 및 c), FZD10-음성 LoVo 세포에는 이를 유도하지 않았다 (도 8, b 및 d). 특히, 키메라 92-13이 키메라 93-22과 비교하여 더 높은 세포 독성 유도를 나타냈지만, 이들의 활성은 이펙터 세포 도너에 좌우되고, 이는 아마도 Fc 수용체의 다형성으로 인해 야기될 것이다. 결론적으로, 본 발명가들은 시험관내 및 생체내에서 FZD10-과발현 종양 세포 상의 FZD10에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 성공적으로 생산하였다. 종합하여, 본 발명가들은 항-FZD10 모노클로날 항체가 FZD10을 과발현하는 SS 및 기타 종양의 치료를 위한 신규 약물 요법의 개발을 위한 잠재력이 큰 것으로 확신한다.
1. 항체의 생산
본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 FZD10-관련 질환으로부터 유래된 FZD10 단백질에 대해 특이적으로 반응한다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 전체로서의 항체 분자, 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편과 같은 이의 단편을 의미하고, 이들은 항원으로서의 단백질 또는 이의 부분적인 펩티드에 결합할 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한 항체는 인간화 또는 키메라 항체, 또는 단일쇄 Fv (scFv) 항체일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체 (폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체)는, 예를 들어, 하기의 프로세스에 의해 제조될 수 있다.
(1) 모노클로날 항체
먼저, 본 발명에서 유용한 항체의 생산을 위해 항원을 제조한다. FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드가 면역원성 단백질로 사용될 수 있다. 별법적으로, FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 발현하는 세포가 또한 면역원으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 면역원으로 사용된 FZD10 단백질의 아미노산 서열 및 이러한 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 GenBank로부터 각각 접속 번호 BAA84093 (서열 1) 및 AB027464 (서열 2)로 입수가능하다. 면역원으로서 사용하기 위한 FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 입수가능한 아미노산 서열 정보를 사용하여 고체-상 펩티드 합성 공정과 같은 당업계에 공지된 절차에 따라 합성적으로 제조할 수 있다. FZD10 단백질의 부분적인 펩티드에는 FZD10 단백질의 N-말단 세포외 도메인 (FZD10-ECD)에 상응하는, 서열 1에 제시된 아미노산 서열의 잔기 1-225를 함유하는 펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
공지된 유전자 재조합 절차에 따라 FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 코딩하는 cDNA의 서열 정보를 사용함으로써 단백질 또는 이의 부분적 펩티드, 또는 이를 발현하는 세포를 제조할 수 있다. 이같은 유전자 재조합 절차에 따른 단백질 또는 이의 부분적 펩티드, 뿐만 아니라 이를 발현하는 세포의 생산이 하기에 설명될 것이다.
상기 cDNA 서열을 적합한 벡터에 연결시킴으로써 단백질의 생산을 위한 재조합 벡터를 수득할 수 있다. 표적 FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드가 발현될 수 있도록 단백질의 생산을 위한 재조합 벡터를 숙주 내로 도입함으로써 형질전환체를 수득할 수 있다.
벡터로서, 숙주 내에서 자가 복제할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 플라스미드 DNA의 예로는 대장균으로부터 유래된 pCAGGS, pET28, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, 및 기타 플라스미드 DNA; 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 pUB110, pTP5, 및 기타 플라스미드 DNA; 및 효모로부터 유래된 YEp13, YEp24, YCp50 및 기타 플라스미드 DNA가 포함된다. 파지 DNA의 예로는 람다 파지 예컨대 λgt11 및 λZAP가 포함된다. 또한, 동물 바이러스 벡터 예컨대 레트로바이러스 벡터 및 우두 바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 및 곤충 바이러스 벡터 예컨대 배큘로바이러스 벡터를 또한 사용할 수 있다.
FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 코딩하는 DNA (이하 FZD10 DNA로 지칭됨)를, 예를 들어, 하기의 방법에 의해, 벡터 내로 삽입한다. 이러한 방법에서, 정제된 DNA를 적합한 제한 효소에 의해 절단하고, 적합한 벡터 DNA의 제한 효소 부위 또는 다중-클로닝 부위 내로 삽입하여, 벡터 내로 결찰시킨다.
프로모터 및 FZD10 DNA에 더하여, 원한다면, 포유류 세포에서 사용하기 위한 단백질의 생산을 위해 재조합 벡터 내로 임의의 인핸서(enhancer) 및 기타 시스(cis) 요소, 스플라이싱(splicing) 신호, 폴리A 부가 신호, 선별 마커, 리보솜 결합 부위 (RBS), 및 기타 요소가 결찰될 수 있다.
DNA 단편을 벡터 단편 내로 결찰시키기 위해, 공지된 DNA 결찰효소를 사용할 수 있다. DNA 단편 및 벡터 단편이 어닐링(annealing) 및 결찰됨으로써, 단백질의 생산을 위한 재조합 벡터가 생산된다.
형질전환에서 사용하기 위한 숙주는 FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드가 숙주 내에서 발현되도록 하는 한 특별히 한정되지 않는다. 숙주의 예로는 박테리아, 예를 들어, 대장균, 및 바실루스; 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae); 동물 세포, 예를 들어, COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 및 곤충 세포가 포함된다.
예를 들어, 박테리아가 숙주로 사용되는 경우, 바람직하게는 단백질 생산을 위한 재조합 벡터는 숙주 박테리아 내에서 자가 복제할 수 있어야 하고, 프로모터, 리보솜 결합 부위, FZD10 DNA, 및 전사 종결 서열을 포함하여야 한다. 재조합 벡터는 프로모터를 조절하기 위한 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 대장균의 예로는 대장균 BRL이 포함되고, 바실루스의 예로는 바실루스 서브틸리스가 포함된다. 대장균과 같은 숙주에서 발현될 수 있는 임의의 프로모터가 본원에서 사용될 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 절차에 의해 재조합 벡터를 숙주 박테리아 내로 도입할 수 있다. 이같은 절차에는, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용하는 방법 및 전기천공이 포함된다. 효모 세포, 동물 세포 또는 곤충 세포가 숙주로 사용되는 경우, 당업계에 공지된 절차에 따라 형질전환체를 생산한 후, FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 숙주 (형질전환체)에서 생산할 수 있다.
본 발명에서 면역원으로 사용하기 위한 FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 상기 생성된 형질전환체의 배양물로부터 수득할 수 있다. "배양물"은 배양 상청액, 배양된 세포, 배양된 미생물, 및 이의 균질화물 중 임의의 것을 지칭한다. 숙주를 배양하는 통상적인 공정에 의해 형질전환체가 배양 배지에서 배양된다.
대장균, 효모 또는 기타 미생물을 숙주로 사용함으로써 수득된 형질전환체를 배양하기 위한 배양 배지는, 탄소원, 질소원, 무기 염 및 미생물에 의해 사용가능한 기타 성분을 포함하고 형질전환체가 효율적으로 성장하도록 할 수 있는 한, 천연 배지 또는 합성 배지일 수 있다.
25 ℃ 내지 37℃에서 3시간 내지 6시간 동안 호기성 조건 하에 교반하면서 진탕 배양 또는 통기 배양에 의해 형질전환체가 일반적으로 배양된다. 배양하는 동안, 예를 들어, 무기 또는 유기 산 및 알칼리성 용액으로 조정함으로써, pH가 중성에 가까운 수준으로 유지된다. 배양하는 동안, 필요하다면, 재조합 발현 벡터 내로 삽입된 선별 마커에 따라 앰피실린 또는 테트라사이클린과 같은 항생제가 배지에 첨가될 수 있다.
배양 후, FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드가 미생물 또는 세포 내에서 생산되는 경우, 미생물 또는 세포를 균질화함으로써 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 추출한다. FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드가 미생물 또는 세포로부터 분비되는 경우, 배양 배지를 그대로 사용하거나, 또는 예를 들어, 원심분리에 의해, 미생물 또는 세포의 잔해물을 배양 배지로부터 제거한다. 그후, 단백질의 단리 및 정제를 위한 통상적인 생화학적 방법, 예컨대 황산암모늄 침전, 젤 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피를 개별적으로 또는 조합하여 사용함으로써, FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드를 배지로부터 단리하고 정제한다.
예를 들어, SDS 폴리아크릴아미드 젤 건기영동에 의해, FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드가 수득되었는지 여부를 확인할 수 있다.
다음으로, 수득된 FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드, 또는 형질전환체를 완충제에 용해시켜 면역원을 제조한다. 필요하다면, 효과적인 면역화를 위해 여기에 애쥬번트(adjuvant)를 첨가할 수 있다. 이같은 애쥬번트에는, 예를 들어, 시판되는 프로인트(Freund) 완전 애쥬번트 및 프로인트 불완전 애쥬번트가 포함된다. 임의의 이러한 애쥬번트들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이렇게 제조된 면역원을 포유동물 예컨대 토끼, 래트 또는 마우스에게 투여한다. 면역화는 정맥내, 피하 또는 복강내 주사에 의해 주로 수행된다. 면역화 간격은 특별히 한정되지 않고, 수일 내지 수주 범위의 간격으로 포유동물을 1 내지 3회 면역화시킨다. 최종 면역화 1 내지 7일 후에 항체-생산 세포를 수집한다. 항체-생산 세포의 예로는 지라 세포, 림프절 세포, 및 말초혈 세포가 포함된다.
하이브리도마를 수득하기 위해, 항체-생산 세포와 골수종 세포를 융합시킨다. 항체-생산 세포와 융합될 골수종 세포로서, 일반적으로 입수가능한 확립 세포주를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 사용된 세포주는 융합되지 않은 형태에서는 HAT 선별 배지 (하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘 함유)에서 생존할 수 없고, 항체-생산 세포와 융합된 경우에만 생존할 수 있도록 하는 약물 선별성 및 성질이 있어야 한다. 가능한 골수종 세포에는, 예를 들어, 마우스 골수종 세포주 예컨대 P3X63-Ag.8.U1 (P3U1), 및 NS-I가 포함된다.
다음으로, 골수종 세포를 항체-생산 세포를 융합시킨다. 융합을 위해, 이러한 세포들을 혈청을 함유하지 않는 동물 세포용 배양 배지, 예컨대 DMEM 및 RPMI-1640 배지에서 혼합하고, 바람직하게는 5:1의 항체-생산 세포 대 골수종 세포 비율로 혼합하며, 세포-융합 촉진제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재 하에 융합시킨다. 전기천공을 사용하는 시판되는 세포 융합 기구를 사용함으로써 세포 융합을 또한 수행할 수 있다.
그후, 상기 융합 처리 후 하이브리도마를 세포로부터 채집한다. 예를 들어, 세포 상청액을 적합하게 희석한 후 (예를 들어, 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지로 희석), 미량역가 플레이트 상에 플레이팅한다. 선별 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 선별 배지를 적합하게 교체하면서 세포를 배양한다. 그 결과, 선별 배지에서 배양하기 시작하고 나서 약 30일 후에 성장된 세포를 하이브리도마로 수득할 수 있다.
그후 성장 중인 하이브리도마의 배양 상청액을 FZD10 단백질 또는 이의 부분적 펩티드와 반응하는 항체의 존재에 대해 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은 통상적인 절차에 의해, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 효소 면역분석법 (EIA) 또는 방사선면역분석법 (RIA)을 사용하여 수행할 수 있다. 융합된 세포를 한계 희석에 의해 클로닝하여, 당해 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 확립한다.
예를 들어, 통상적인 세포 배양 방법에 의해 또는 복수를 생산함으로써, 확립된 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 수집할 수 있다. 필요하다면, 황산암모늄 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 젤 여과, 친화성 크로마토그래피, 또는 이의 조합과 같은 공지된 절차에 따른 상기 기술된 항체 수집 방법으로 항체를 정제할 수 있다.
본 발명에서 유용한 모노클로날 항체의 글로불린 유형은 이들이 FZD10 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한 특별하게 한정되지 않고, IgG, IgM, IgA, IgE, 및 IgD 중 임의의 것일 수 있다. 그 중에서, IgG 및 IgM가 바람직하다.
본 발명에서, 뮤린 모노클로날 항체 93-22 및 92-13가 성공적으로 확립되었고, 바람직하게 사용된다. 마우스 모노클로날 항체 93-22를 생산하는 하이브리도마 클론 93-22이 <National Institute of Advanced Industrial Science and Technology>의 IPOD(International Patent Organism Depository) (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, 305-8566 Japan)에 기탁 번호 FERM BP-10620으로 2006년 6월 14일에 Shuichi Nakatsuru에 의해 국제적으로 기탁되었다. 또한, 마우스 모노클로날 항체 92-13을 생산하는 하이브리도마 클론 92-13이 <National Institute of AIST>의 IPOD(International Patent Organism Depository)에 기탁 번호 FERM BP-10628로 2006년 6월 28일에 Shuichi Nakatsuru에 의해 국제적으로 기탁되었다. 이러한 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명에서, 통상적인 유전자 재조합 기술에 따라 하이브리도마로부터 항체 유전자를 클로닝하고, 항체 유전자를 적절한 벡터 내로 삽입하고, 벡터를 숙주 내로 도입하고, 숙주로부터 항체를 생산함으로써 생산될 수 있는 재조합-유형 모노클로날 항체가 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, [Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-75] 참조).
더욱 구체적으로, 항-FZD10 마우스 모노클로날 항체의 가변 (V) 영역을 코딩하는 mRNA를 항체-생산 하이브리도마 (예를 들어, 상기 기술된 것들)로부터 단리한다. 임의의 공지된 방법, 예컨대 구아니듐 초원심분리 방법 ([Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-9]) 및 AGPC 방법 ([Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-9])에 의해 전체 RNA를 제조한 후, mRNA 정제 키트 (Pharmacia) 등을 사용하여 전체 RNA로부터 원하는 mRNA를 생산함으로써 mRNA를 단리한다. 별법적으로, QuickPrep mRNA 정제 키트 (Pharmacia)를 사용하여 직접적으로 mRNA를 제조할 수도 있다.
다음으로, 역전사효소를 사용하여 mRNA로부터 항체 V-영역에 대한 cDNA를 합성한다. 시판되는 키트, 예를 들어, Gene Racer™ 키트 (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 또한 합성할 수 있다. PCR 방법과 조합하여 5'-Ampli FINDER RACE 키트 (Clontech)를 사용하는 5'-RACE 방법 ([Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002]; [Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-32])에 의해 cDNA를 또한 합성하거나 증폭시킬 수 있다.
마우스 모노클로날 항체 92-13의 H 사슬 및 L 사슬의 아미노산 서열이 서열 57 및 59에 각각 제시된다 (각각 서열 58 및 60에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨). 마우스 모노클로날 항체 93-22의 H 사슬 및 L 사슬의 아미노산 서열이 서열 61 및 63에 각각 제시된다 (각각 서열 62 및 64에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨). 서열 정보를 기초로, 당해 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 또는 L 사슬을 증폭시키는데 사용되는 프라이머를 통상적인 방법을 사용하여 디자인할 수 있다.
생성된 PCR 산물로부터 당해 DNA 단편을 단리 및 정제한 후, 벡터 DNA에 결찰시켜 재조합 벡터를 수득한다. 재조합 벡터를 숙주 예컨대 대장균 내로 도입하고, 원하는 재조합 벡터를 함유하는 콜로니를 선별한다. 예를 들어, 자동 서열분석기를 사용하여, 재조합 벡터 내의 당해 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인한다.
일단 항-FZD10 항체 V-영역을 코딩하는 DNA가 수득되면, 항체 불변 (C) 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터 내로 DNA를 삽입한다.
본 발명에서 사용되는 항-FZD10 항체의 생산을 위해, 발현 제어 요소 (예를 들어, 인핸서, 프로모터)의 제어 하에 항체 유전자가 발현될 수 있도록 항체 유전자를 발현 벡터 내로 통합시킨다. 항체를 발현하도록 숙주 세포를 발현 벡터로 형질전환시킨다.
항체 유전자의 발현에서, 항체의 중쇄 (H 사슬)을 코딩하는 DNA 및 경쇄 (L 사슬)을 코딩하는 DNA가 별도의 발현 벡터 내로 통합될 수 있고, 그후 생성된 재조합 발현 벡터들로 숙주 세포가 공동-형질전환된다. 별법적으로, 항체의 H-사슬을 코딩하는 DNA 및 L-사슬을 코딩하는 DNA 모두가 단일 발현 벡터 내로 함께 통합될 수 있고, 그후 생성된 재조합 발현 벡터로 숙주 세포가 형질전환된다 (예를 들어, WO 94/11523).
공지된 방법에 의해 항체 유전자가 발현될 수 있다. 포유류 세포에서의 발현을 위해, 통상적인 유용한 프로모터, 발현될 항체 유전자 및 폴리(A) 신호 (항체 유전자의 3' 말단에 대해 하류에 위치함)가 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 유용한 프로모터/인핸서 시스템으로서, 인간 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터/인핸서 시스템이 사용될 수 있다.
기타 프로모터/인핸서 시스템, 예를 들어, 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40))로부터 유래된 것들 및 포유류 세포로부터 유래된 것들 (예를 들어, 인간 연장 인자 1 알파 (HEF1 알파))이 본 발명에서 항체의 발현을 위해 또한 사용될 수 있다.
SV40 프로모터/인핸서 시스템이 사용된 경우, Mulligan 등의 방법 ([Nature (1979) 277, 108-14])에 의해 유전자 발현이 쉽게 수행될 수 있다. HEF1 알파 프로모터/인핸서 시스템이 사용된 경우, Mizushima 등의 방법 ([Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322])에 의해 유전자 발현이 쉽게 수행될 수 있다.
대장균에서의 발현을 위해, 통상적인 유용한 프로모터, 당해 항체의 분비를 위한 신호 서열 및 항체 유전자가 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터로서, lacZ 프로모터 또는 araB 프로모터가 사용될 수 있다. lacZ 프로모터가 사용된 경우, Ward 등의 방법 ([Nature (1098) 341, 544-6]; [FASBE J. (1992) 6, 2422-7])에 의해 유전자 발현이 수행될 수 있고, araB 프로모터가 사용된 경우, Better 등의 방법 ([Science (1988) 240, 1041-3])에 의해 유전자 발현이 수행될 수 있다.
항체의 분비를 위한 신호 서열에 관하여, 당해 항체가 대장균의 원형질막 주위공간 내로 분비되기를 원하는 경우, pelB 신호 서열 ([Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-83])을 사용할 수 있다. 원형질막 주위공간으로 분비된 항체를 단리한 후, 항체가 적합한 형상을 취하도록 다시 폴딩(folding)시킬 수 있다.
바이러스 (예를 들어, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스 (BPV)) 등으로부터 유래된 복제 기원이 사용될 수 있다. 숙주 세포 시스템 내에서의 유전자 카피수를 증가시키기 위해, 발현 벡터가 선별 마커 유전자, 예컨대 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제 (APH) 유전자, 티미딘 키나제 (TK) 유전자, 대장균 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라제 (Ecogpt) 유전자 및 디히드로폴레이트 환원효소 (dhfr) 유전자를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 생산을 위해, 진핵 및 원핵 세포 시스템이 포함되는 임의의 발현 시스템을 사용할 수 있다. 진핵 세포에는 동물 (예를 들어, 포유동물, 곤충, 곰팡이 및 진균류, 효모)의 확립 세포주가 포함된다. 원핵 세포에는 박테리아 세포 예컨대 대장균 세포가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 항체가 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, 골수종, BHK, Vero 및 HeLa 세포에서 발현되는 것이 바람직하다.
다음으로, 형질전환된 숙주 세포를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 배양하여 당해 항체를 생산한다. 숙주 세포의 배양은 임의의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 배양 배지는 DMEM, MEM, RPMI 1640 또는 IMDM 배지일 수 있다. 배양 배지는 혈청 보충물, 예컨대 소 태아 혈청 (FCS)을 함유할 수 있다.
재조합 항체의 생산에서, 상기 언급된 숙주 세포 이외에, 트랜스제닉(transgenic) 동물이 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 유전자를 동물의 유액에서 본래 생산되는 단백질 (예를 들어, 베타-카세인)을 코딩하는 유전자의 미리 정해진 부위 내로 삽입하여, 융합 유전자를 제조한다. 항체 유전자가 도입된 융합 유전자를 함유하는 DNA 단편을 비-인간 동물의 배아 내로 주사한 후, 배아를 암컷 동물 내로 도입한다. 배아가 내부에 있는 암컷 동물이 트랜스제닉 비-인간 동물을 낳는다. 당해 항체가 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 이의 자손으로부터의 유액 내에 분비된다. 항체를 함유하는 유액의 양을 증가시키기 위한 목적으로, 적합한 호르몬이 트랜스제닉 동물에게 투여될 수 있다 ([Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702]).
상기 기술된 바와 같이 발현 및 생산된 항체를 세포 또는 숙주 동물 신체로부터 단리하여 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체가 친화성 컬럼 상에서 단리 및 정제될 수 있다. 항체의 단리 및 정제를 위해 통상적으로 사용되는 또다른 방법들이 또한 사용될 수 있다; 따라서, 방법이 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들어, 다양한 크로마토그래피, 여과, 초여과, 염석 및 투석을 단독으로 또는 조합하여 사용하여, 당해 항체를 단리 및 정제할 수 있다 ([Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]).
(2) 키메라 항체 및 인간화 항체
본 발명에서, 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하여 인공적으로 변형된 재조합 항체가 사용될 수 있다. 이러한 변형된 항체는 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술 ([Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-5]; [Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-8]; [Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-4])을 사용할 수 있다. 키메라 항체는 상이한 부분들이 상이한 동물 종들로부터 유래된 분자, 예컨대 뮤린 mAb로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역이 있는 것, 예를 들어, "인간화 항체"이다.
항체 V-영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체 C-영역을 코딩하는 DNA에 결찰시키고, 결찰 생성물을 발현 벡터 내로 통합시키고, 생성된 재조합 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 키메라 항체를 생산함으로써 본 발명에 따른 키메라 항체를 제조할 수 있다.
인간화 항체는 "재성형(reshaped) 인간 항체"로 또한 지칭되고, 비-인간 포유동물 (예를 들어, 마우스)의 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)이 인간 항체의 것에 그래프트된다. 이같은 인간화 항체를 생산하기 위한 일반적인 유전자 재조합 절차가 또한 공지되어 있다 (예를 들어, EP 125023; WO 96/02576).
구체적으로, 마우스 항체 CDR들이 프레임워크 영역 (FR)들을 통해 결찰된 DNA 서열을 디자인하고, CDR들 및 FR들의 말단 영역에 중첩되는 영역이 있도록 디자인된 여러 올리고뉴클레오티드들을 프라이머로 사용하여 PCR 방법에 의해 합성한다. 생성된 DNA를 인간 항체 C-영역을 코딩하는 DNA에 결찰시키고, 결찰 생성물을 발현 벡터 내로 통합시킨다. 생성된 재조합 발현 벡터를 숙주 내로 도입함으로써, 인간화 항체가 생산된다 (예를 들어, WO 96/02576).
CDR들을 통해 결찰된 FR들은 CDR들이 기능성 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 선별된다. 필요하다면, 재성형 인간 항체가 적합한 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 항체 V-영역의 FR 내의 아미노산(들)이 교체될 수 있다 ([Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-6]).
키메라 항체는 비-인간 포유동물 항체로부터 유래된 V-영역 및 인간 항체로부터 유래된 C-영역으로 구성된다. 인간화 항체는 비-인간 포유동물 항체로부터 유래된 CDR 및 인간 항체로부터 유래된 FR 및 C-영역으로 구성된다. 인간 신체에 대한 항체의 항원성이 감소되었기 때문에, 인간화 항체는 임상 용도에 유용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 키메라 항체 또는 인간화 항체의 구체적인 예는 CDR이 마우스 모노클로날 항체 92-13으로부터 유래된 항체 또는 CDR이 마우스 모노클로날 항체 93-22로부터 유래된 항체이다. 이같은 키메라 항체 및 인간화 항체를 생산하는 방법이 하기에 기술된다.
항-FZD10 마우스 모노클로날 항체의 V 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 클로닝하기 위해, 하이브리도마로부터 mRNA를 단리할 수 있고, L 및 H 사슬의 V 영역 내의 각각의 cDNA를 상기 기술된 바와 같이 역전사효소를 사용하여 합성할 수 있다. cDNA의 합성에서, L 또는 H 사슬 C 영역에 혼성화가능한 올리고-dT 프라이머 또는 기타 적합한 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들어, H 사슬 V 영역에 대한 서열 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 CH1 (IgG2a) 프라이머 및 L 사슬 V 영역에 대한 서열 4에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 CL1 (카파) 프라이머를 사용할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
L 및 H 사슬 모두의 cDNA의 증폭을 시판되는 키트 (예를 들어, GeneRacer™ 키트 (Invitrogen))를 사용하여 또는 5'-RACE 방법 ([Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988]; [Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res., 17, 2919-32, 1989])이 포함되는 공지된 방법을 사용하여 PCR (중합효소 연쇄 반응)에 의해 수행할 수 있다.
마우스 모노클로날 항체 92-13의 V 영역에 대한 DNA를 증폭시키기 위한 특정 프라이머에는 H 사슬 V 영역에 대한 서열 5 및 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 프라이머 및 L 사슬 V 영역에 대한 서열 7 및 8에 제시된 뉴클레오티드 서열의 프라이머가 포함된다. 이러한 프라이머들을 사용하여, 서열 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA 및 서열 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA를 증폭시킬 수 있다. 마우스 모노클로날 항체 93-22의 V 영역에 대한 DNA를 증폭시키기 위한 특정 프라이머에는 H 사슬 V 영역에 대한 서열 53 및 54에 제시된 뉴클레오티드 서열의 프라이머 및 L 사슬 V 영역에 대한 서열 55 및 56에 제시된 뉴클레오티드 서열의 프라이머가 포함된다. 이러한 프라이머들을 사용하여, 서열 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA 및 서열 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA를 증폭시킬 수 있다.
그후, 증폭된 생성물을 통상적인 절차에 따라 아가로스 젤 전기영동에 적용하고, 당해 DNA 단편을 절단, 회수, 정제하여, 벡터 DNA에 결찰시킨다.
수득된 DNA 및 벡터 DNA를 공지된 결찰 키트를 사용하여 결찰시켜, 재조합 벡터를 구축할 수 있다. 벡터 DNA는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다: [J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. 벡터 DNA를 제한 효소(들)로 소화시키고, 원하는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 공지된 방법에 의해 또는 자동 서열분석기를 사용하여 결정할 수 있다.
일단 마우스 모노클로날 항체의 L 및 H 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA 단편이 클로닝되면 (이하에서, 때때로 항체의 L 또는 H 사슬이 마우스 항체에 대해서 "마우스 L 또는 H 사슬", 인간 항체에 대해서 "인간 L 또는 H 사슬"로 지칭될 수 있다), 마우스 V 영역을 코딩하는 DNA 및 인간 항체 불변 영역을 코딩하는 DNA를 결찰 및 발현시켜, 키메라 항체를 산출한다.
키메라를 제조하기 위한 표준 방법은 클로닝된 cDNA 내에 존재하는 마우스 리더(leader) 서열 및 V 영역을 포유류 세포의 발현 벡터 내에 이미 존재하는 인간 항체 C 영역을 코딩하는 서열에 결찰시키는 것을 수반한다. 별법적으로, 클로닝된 cDNA 내에 존재하는 마우스 리더 서열 및 V 영역 서열이 인간 항체 C 영역을 코딩하는 서열에 결찰된 후, 포유류 세포 발현 벡터에 결찰된다.
인간 항체 C 영역을 포함하는 폴리펩티드는 인간 H 사슬에 대한 C 감마 1, C 감마 2, C 감마 3 또는 C 감마 4 또는 L 사슬에 대한 C 람다 또는 C 카파가 예를 들어 포함되는, 인간 항체의 임의의 H 또는 L 사슬 C 영역일 수 있다.
키메라 항체를 제조하기 위해, 2개의 발현 벡터, 즉, 발현 제어 요소 예컨대 인핸서/프로모터 시스템의 제어 하의 마우스 L 사슬 V 영역 및 인간 L 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터, 및 발현 제어 요소 예컨대 인핸서/프로모터 시스템의 제어 하의 마우스 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터가 먼저 구축된다. 그후, 숙주 세포 예컨대 포유류 세포 (예를 들어, COS 세포)가 이러한 발현 벡터들로 공동-형질전환되고, 형질전환된 세포가 시험관 내에서 또는 생체 내에서 배양되어, 키메라 항체가 생산된다: 예를 들어, WO91/16928 참조.
별법적으로, 클로닝된 cDNA 내에 존재하는 마우스 리더 서열 및 마우스 L 사슬 V 영역 및 인간 L 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA, 뿐만 아니라 마우스 리더 서열 및 마우스 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA가 단일 발현 벡터 내로 도입되고 (예를 들어, WO94/11523 참조), 상기 벡터가 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다; 그후, 형질전환된 숙주가 생체 내에서 또는 시험관 내에서 배양되어, 원하는 키메라 항체가 생산된다.
키메라 항체의 H 사슬의 발현을 위한 벡터는 마우스 H 사슬 V 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA (이하에서, "H 사슬 V 영역에 대한 cDNA"로 또한 지칭됨)를 인간 항체의 H 사슬 C 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 DNA (이하에서, "H 사슬 C 영역에 대한 게놈 DNA로 또한 지칭됨") 또는 이러한 영역을 코딩하는 cDNA (이하에서, "H 사슬 C 영역에 대한 cDNA"로 또한 지칭됨)를 함유하는 적절한 발현 벡터 내로 도입함으로써 수득될 수 있다. H 사슬 C 영역은, 예를 들어, C 감마 1, C 감마 2, C 감마 3 또는 C 감마 4 영역을 포함한다.
H 사슬 C 영역을 코딩하는 게놈 DNA, 특히 C 감마 1 영역을 코딩하는 것이 있는 발현 벡터에는, 예를 들어, HEF-PMh-g 감마 1 (WO92/19759) 및 DHER- INCREMENT E-RVh-PM1-f (WO92/19759)가 포함된다. 별법적으로, 기존에 기술된 바와 같이 인간 PBMC (말초혈 단핵 세포)로부터의 cDNA를 사용하여 인간 불변 영역 라이브러리를 제조할 수 있다 ([Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987]; [Reff, M.E. et al., Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994]).
마우스 H 사슬 V 영역을 코딩하는 cDNA가 이러한 발현 벡터 내로 삽입되는 경우, PCR 방법을 통해 상기 cDNA 내로 적합한 적합한 뉴클레오티드 서열이 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 cDNA에 이의 5'-말단에 적절한 제한 효소에 대한 인식 서열이 있고, 이의 개시 코돈 직전에 코작(Kozak) 컨센서스(consensus) 서열이 있어, 전사 효율이 개선되도록 디자인된 PCR 프라이머, 뿐만 아니라 상기 cDNA에 이의 3'-말단에 적절한 제한 효소에 대한 인식 서열이 있고, mRNA를 제공하기 위해 게놈 DNA의 1차 전사 생성물을 정확하게 스플라이싱시키기 위한 스플라이스 도너 부위가 있도록 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 PCR을 실행하여, 이러한 적합한뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내로 도입할 수 있다.
마우스 H 사슬 V 영역을 코딩하는 이렇게 구축된 cDNA를 적절한 제한 효소(들)로 처리한 후, 이를 상기 발현 벡터 내로 삽입하여, H 사슬 C 영역 (C 감마 1 영역)을 코딩하는 게놈 DNA를 함유하는 키메라 H 사슬 발현 벡터를 구축한다.
마우스 H 사슬 V 영역을 코딩하는 이렇게 구축된 cDNA를 적절한 제한 효소(들)로 처리하고, 상기 H 사슬 C 영역 C 감마 1을 코딩하는 cDNA에 결찰시키고, 발현 벡터 예컨대 pQCXIH (Clontech) 내로 삽입하여, 키메라 H 사슬을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터를 구축한다.
키메라 항체의 L 사슬의 발현을 위한 벡터는 마우스 L 사슬 V 영역을 코딩하는 cDNA 및 인간 항체의 L 사슬 C 영역을 코딩하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 결찰시키고, 적절한 발현 벡터 내로 도입함으로써 수득될 수 있다. L 사슬 C 영역은, 예를 들어, 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다.
마우스 L 사슬 V 영역을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터가 구축될 때, 적합한 뉴클레오티드 서열 예컨대 인식 서열 또는 코작 컨센서스 서열이 상기 발현 벡터 내로 PCR 방법을 통해 도입될 수 있다.
인간 L 람다 사슬 C 영역을 코딩하는 cDNA의 전체 뉴클레오티드 서열이 DNA 합성기에 의해 합성될 수 있고, PCR 방법을 통해 구축될 수 있다. 인간 L 람다 사슬 C 영역에는 4가지 이상의 상이한 이소타입(isotype)이 있는 것으로 공지되어 있고, 각각의 이소타입이 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다.
인간 L 람다 사슬 C 영역을 코딩하는 구축된 cDNA 및 마우스 L 사슬 V 영역을 코딩하는 상기 구축된 cDNA를 적절한 제한 효소 부위 사이에서 결찰시키고, 발현 벡터 예컨대 pQCXIH (Clontech) 내로 삽입하여, 키메라 항체의 L 람다 사슬을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다.
마우스 L 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA에 결찰될 인간 L 카파 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA가, 예를 들어, 게놈 DNA를 함유하는 HEF-PM1k-gk로부터 구축될 수 있다 (WO92/19759 참조). 별법적으로, 기존에 기술된 바와 같이 인간 PBMC (말초혈 단핵 세포)로부터의 cDNA를 사용하여 인간 불변 영역 라이브러리가 제조될 수 있다 ([Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987]; [Reff, M.E. et al., Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994]).
적절한 제한 효소에 대한 인식 서열이, PCR 방법을 통해, L 카파 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA의 5'- 및 3'-말단 내로 도입될 수 있고, 상기 구축된 바와 같은 마우스 L 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA 및 L 카파 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 서로 결찰시키고, 발현 벡터 예컨대 pQCXIH (Clontech) 내로 삽입하여, 키메라 항체의 L 카파 사슬을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다.
마우스 모노클로날 항체의 CDR이 인간 항체에 그래프트된 인간화 항체를 제조하기 위해, 마우스 모노클로날 항체의 FR과 인간 항체의 FR 사이에 높은 상동성이 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 단백질 데이터 은행(Protein Data Bank)을 사용하여 구조가 해명된 모든 공지된 항체의 V 영역과 마우스 항-FZD10 모노클로날 항체의 H 및 L 사슬의 V 영역을 비교한다. 추가로, 이들이 항체 FR의 길이, 아미노산 상동성 등을 기초로 Kabat 등에 의해 분류된 인간 항체 하위집단 (HSG: 인간 하위집단)과 동시에 비교된다: [Kabat, E.A. et al, US Dep, Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991].
인간화 항체 V 영역을 코딩하는 DNA를 디자인하기 위한 첫번째 단계는 디자인을 위한 기초로서 인간 항체 V 영역을 선별하는 것이다. 예를 들어, 마우스 항체 V 영역의 FR과의 상동성이 80％를 초과하는 인간 항체 V 영역의 FR이 인간화 항체의 생산에서 사용될 수 있다.
인간화 항체에서, 상기 항체의 C 영역 및 V 영역의 프레임워크 (FR) 영역은 인간으로부터 유래되고, V 영역의 상보성 결정 영역 (CDR)은 마우스로부터 유래된다. 인간화 항체의 V 영역을 포함하는 폴리펩티드는 인간 항체의 DNA 단편이 주형으로 이용가능한 한 PCR 방법에 의해 CDR-그래프트화로 칭해지는 방식으로 생산될 수 있다. "CDR-그래프트화"는 마우스-유래 CDR을 코딩하는 DNA 단편이 제조되어 주형으로서의 인간 항체의 CDR을 대체하는 방법을 지칭한다.
주형으로 사용될 인간 항체의 DNA 단편이 입수가능하지 않은 경우, 데이터베이스에 등록된 뉴클레오티드 서열을 DNA 합성기에서 합성할 수 있고, 인간화 항체의 V 영역에 대한 DNA를 PCR 방법에 의해 생산할 수 있다. 또한, 아미노산 서열만이 데이터베이스에 등록된 경우, [Kabat, E.A. et al., US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991]에 보고된 바와 같이 항체에서의 코돈 사용에 대한 지식을 기초로 아미노산 서열로부터 전체 뉴클레오티드 서열을 추론할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열이 DNA 합성기에서 합성되고, 인간화 항체 V 영역의 DNA가 PCR 방법에 의해 제조되어 적절한 숙주 내로 도입된 후 발현되어, 원하는 폴리펩티드가 생산될 수 있다.
주형으로서의 인간 항체의 DNA 단편이 입수가능한 경우의 PCR 방법에 의한 CDR-그래프트화의 일반적인 절차가 하기에 기술된다.
먼저, 각각의 CDR에 상응하는 마우스 유래 DNA 단편을 합성한다. CDR 1 내지 3을 기존에 클로닝된 마우스 H 및 L 사슬 V 영역의 뉴클레오티드 서열을 기초로 합성한다. 예를 들어, 인간화 항체가 마우스 모노클로날 항체 92-13을 기초로 생산되는 경우, H 사슬 V 영역의 CDR 서열은 서열 15 (VH CDR1), 17 (VH CDR2) 및 19 (VH CDR3)에 제시된 바와 같은 아미노산 서열일 수 있고; L 사슬 V 영역의 CDR 서열은 서열 23 (VL CDR1), 25 (VL CDR2) 및 27 (VL CDR3)에 제시된 바와 같은 아미노산 서열일 수 있다. 인간화 항체가 마우스 모노클로날 항체 93-22를 기초로 생산되는 경우, H 사슬 V 영역의 CDR 서열은 서열 31 (VH CDR1), 33 (VH CDR2) 및 35 (VH CDR3)에 제시된 바와 같은 아미노산 서열일 수 있고; L 사슬 V 영역의 CDR 서열은 서열 39 (VL CDR1), 41 (VL CDR2) 및 43 (VL CDR3)에 제시된 바와 같은 아미노산 서열일 수 있다.
인간화 항체의 H 사슬 V 영역에 대한 DNA가 임의의 인간 항체 H 사슬 C 영역, 예를 들어, 인간 H 사슬 C 감마 1 영역에 대한 DNA에 결찰될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, H 사슬 V 영역에 대한 DNA를 적절한 제한 효소로 처리하고, 발현 제어 요소 예컨대 인핸서/프로모터 시스템의 제어 하에 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA에 결찰시켜, 인간화된 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역에 대한 DNA를 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다.
인간화 항체의 L 사슬 V 영역에 대한 DNA가 임의의 인간 항체 L 사슬 C 영역, 예를 들어, 인간 L 사슬 C 람다 영역에 대한 DNA에 결찰될 수 있다. L 사슬 V 영역에 대한 DNA를 적절한 제한 효소로 처리하고, 발현 제어 요소 예컨대 인핸서/프로모터 시스템의 제어 하에 인간 L 람다 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA에 결찰시켜, 인간화된 L 사슬 V 영역 및 인간 L 람다 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다.
인간화 항체의 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA 및 인간화된 L 사슬 V 영역 및 인간 L 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 단일 발현 벡터 예컨대 WO94/11523에 개시된 벡터 내로 또한 도입할 수 있고, 상기 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고, 형질전환된 숙주를 생체 내에서 또는 시험관 내에서 배양하여, 원하는 인간화 항체를 생산할 수 있다.
키메라 또는 인간화 항체를 생산하기 위해, 상기 언급된 바와 같은 2개의 발현 벡터가 제조되어야 한다. 따라서, 키메라 항체와 관련하여, 발현 제어 요소 예컨대 인핸서/프로모터의 제어 하의 마우스 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터, 및 발현 제어 요소의 제어 하의 마우스 L 사슬 V 영역 및 인간 L 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터가 구축된다. 인간화 항체와 관련하여, 발현 제어 요소의 제어 하의 인간화된 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터, 및 발현 제어 요소의 제어 하의 인간화된 L 사슬 V 영역 및 인간 L 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터가 구축된다.
그후, 숙주 세포 예컨대 포유류 세포 (예를 들어, COS 세포)를 이러한 발현 벡터들로 공동-형질전환시킬 수 있고, 생성된 형질전환된 세포를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 배양하여 키메라 또는 인간화 항체를 생산할 수 있다 (예를 들어, WO91/16928 참조).
별법적으로, H 사슬 V 및 C 영역을 코딩하는 DNA 및 L 사슬 V 및 C 영역을 코딩하는 DNA를 단일 벡터에 결찰시키고, 적절한 숙주 세포 내로 형질전환시켜 항체를 생산할 수 있다. 따라서, 키메라 항체의 발현에서, 클로닝된 cDNA 내에 존재하는 마우스 리더 서열, 마우스 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA, 뿐만 아니라 마우스 리더 서열, 마우스 L 사슬 V 영역 및 인간 L 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA가 단일 발현 벡터 예컨대 WO94/11523에 예를 들어 개시된 벡터 내로 도입될 수 있다. 인간화 항체의 발현에서, 인간화된 H 사슬 V 영역 및 인간 H 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA 및 인간화된 L 사슬 V 영역 및 인간 L 사슬 C 영역을 코딩하는 DNA가 단일 발현 벡터 예컨대 WO94/11523에 예를 들어 개시된 벡터 내로 도입될 수 있다. 이같은 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 숙주를 생체내에서 또는 시험관내에서 배양하여 당해 키메라 또는 인간화 항체를 생산한다.
임의의 발현 시스템을 사용하여 본 발명에 따른 FZD10 단백질에 대한 키메라 또는 인간화 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물 세포에는 동물 세포 예컨대 확립된 포유류 세포주, 진균류 세포 및 효모 세포가 포함되고, 원핵생물 세포에는 박테리아 세포 예컨대 대장균이 포함된다. 바람직하게는, 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 포유류 세포 예컨대 COS 또는 CHO 세포에서 발현된다.
포유류 세포에서의 발현에 유용한 임의의 통상적인 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 극초기 프로모터가 바람직하게 사용된다. 또한, 포유류 세포에서의 유전자 발현을 위한 프로모터에는 바이러스 프로모터, 예컨대 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 및 원숭이 바이러스 (SV) 40의 프로모터, 및 포유류 세포에서 유래된 프로모터, 예컨대 인간 폴리펩티드 사슬 연장 인자-1 알파 (HEF-1 알파)의 프로모터가 포함된다. 예를 들어, SV40 프로모터를 [Mulligan et al., Nature, 277, 108-14, 1979]의 방법에 따라 용이하게 사용할 수 있고; [Mizushima, S. et al., Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990]의 방법이 HEF-1 알파 프로모터와 함께 쉽게 사용될 수 있다.
복제 기원에는 SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 또는 소 유두종 바이러스 (BPV)로부터 유래된 것들이 포함된다. 또한, 발현 벡터는 숙주 세포 시스템에서의 유전자 카피수를 증가시키기 위한 선별 마커로서 포스포트랜스페라제 APH(3') II 또는 I (neo), 티미딘 키나제 (TK), 대장균 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라제 (Ecogpt) 또는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)에 대한 유전자를 포함할 수 있다.
키메라 또는 인간화 항체를 코딩하는 DNA로 형질전환된 형질전환체를 배양함으로써 생산된 당해 키메라 또는 인간화 항체를 세포로부터 단리한 후 정제할 수 있다.
당해 키메라 또는 인간화 항체의 단리 및 정제는 단백질 A 아가로스 컬럼을 사용함으로써 수행될 수 있지만, 단백질의 단리 및 정제에서 사용되는 임의의 방법에 의해 또한 수행될 수 있고, 따라서 한정되지 않는다. 예를 들어, 크로마토그래피, 초여과, 염석 및 투석을 임의로 선택하거나 조합하여, 키메라 또는 인간화 항체를 단리 및 정제할 수 있다.
키메라 항체 또는 인간화 항체를 단리한 후, 생성된 정제된 항체의 농도를 ELISA에 의해 결정할 수 있다.
키메라 항체 또는 인간화 항체의 항원-결합 활성, 또는 정상 세포에 대한 결합 활성이 포함되는 기타 활성을 임의의 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다 ([Antibodies A Laboratory Manual, Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]).
항체의 항원-결합 활성을 결정하기 위한 방법으로서, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), EIA (효소 면역분석법), RIA (방사선면역분석법) 또는 형광 분석법과 같은 기술을 사용할 수 있다.
(3) 항체 단편 및 변형된 항체
본 발명에서 사용된 항체는 FZD10 단백질에 결합하고 이의 활성을 억제할 수 있는 한 임의의 항체 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편에는 Fab, F(ab')2, Fv, 또는 적절한 링커를 통해 서로 연결된 H-사슬 Fv 단편 또는 L-사슬 Fv 단편으로 구성된 단일쇄 Fv (scFv)가 포함된다. 구체적으로, 이같은 항체 단편은 효소 (예를 들어, 파파인, 펩신)를 사용하여 항체를 항체 단편으로 절단하는 것에 의해, 또는 항체 단편을 코딩하는 유전자를 구축하고, 이를 발현 벡터 내로 삽입하고, 생성된 재조합 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입함으로써, 항체 단편을 발현시키는 것에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, [Co, M. S., et al., J. Immunol. (1994), 152, 2968-76]; [Better, M. & Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989), 178, 476-96, Academic Press, Inc.]; [Pluckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Academic Press, Inc.]; [Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-63]; [Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-9]; 및 [Bird, R.E. et al., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-7] 참조). 별법적으로, 원하는 특이성이 있는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인하도록 Fab 발현 라이브러리를 구축할 수 있다 ([Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-81]).
scFv는 H-사슬 V-영역을 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통해 L-사슬 V-영역에 결찰시킴으로써 생산될 수 있다 ([Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-83]). scFv 내의 H-사슬 V-영역 및 L-사슬 V-영역은 본원에 기술된 항체들 중 임의의 하나로부터 유래될 수 있다. V-영역에 결합되는 펩티드 링커는 임의의 단일쇄 펩티드, 예를 들어, 아미노산 잔기 12-19개의 펩티드일 수 있다.
변형된 항체로서, 예를 들어, 임의의 분자 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)에 접합된 항-FZD10 항체 또는 이의 단편을 또한 사용할 수 있다. 이같은 변형된 항체 또한 본 발명의 "항체"에 포함된다. 변형된 항체는 항체의 화학적 변형에 의해 제조될 수 있다. 이러한 목적에 적절한 화학적 변형 기술은 당업계에 이미 확립되어 있다.
2. 치료 용도
본 발명의 항체를 사용하여 FZD10-관련 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 제약 조성물이 하기에 기술된다. 치료 결과는 적어도 치료된 대상에서 건강에 좋은 이익을 일으키는 것이고, 암의 경우, 이러한 이익에는 종양의 완화, 종양 증상의 고식, 및 종양의 전이성 확산의 제어가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
구체적으로, 본 발명에 따라 대상에서 FZD10-관련 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 상기 기술된 항체 또는 단편을 투여하는 것을 포함한다.
본원에서의 용어 "대상"은 FZD10-관련 질환에 걸린 대상, 및 또한 FZD10-관련 질환이 있는 것으로 추측되는 대상을 지칭한다. 본 발명에서의 대상은 포유동물 및 조류 동물이 포함되는 동물일 수 있다. 예를 들어, 포유동물에는 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 토끼 및 개가 포함될 수 있다.
본원에서의 용어 "FZD10-관련 질환"은 FZD10 단백질의 과발현과 관련된 질환을 지칭한다. 구체적으로, FZD10-관련 질환에는 활막 육종 (SS), 결장직장암, 위암, 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 항체 또는 이의 단편은 FZD10 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 따라서 항체 또는 이의 단편이 대상에게 투여되는 경우, 이는 대상 내의 FZD10 단백질에 결합하고, FZD10 단백질의 활성이 억제될 수 있다. 별법적으로, 항체 또는 이의 단편이 치료용 모이어티(moiety)에 접합되어 대상에게 투여되는 경우, 이는 대상 내의 FZD10 단백질을 발현하는 영역 (즉, 병든 영역)으로 전달되고, 치료용 모이어티가 병든 영역으로 선별적으로 전달되어 그곳에서 작용할 수 있다. 이같은 치료용 모이어티는 FZD10-관련 질환에 대한 치료 효능이 있는 것으로 공지되었거나 이러한 효능이 있도록 개발될 임의의 치료제일 수 있고, 여기에는 방사성동위원소 표지 및 화학요법제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 치료제로서 사용될 수 있는 방사성동위원소 표지는 β-선 에너지 및 이의 방출 효율, 방출되는 γ-선의 존재 또는 부재, 이의 에너지 및 방출 효율, 신체 반감기, 및 표지 절차가 포함되는 다양한 요소에 따라 선별될 수 있다. 일반적으로, 이트륨 (예컨대 90Y) 및 요오드 (예컨대 125I 및 131I)를 기초로 하는 방사성동위원소 표지가 사용될 수 있다. 화학요법제는 FZD10-관련 질환을 치료하기 위해 공지되었거나 이를 위해 개발될 임의의 작용제일 수 있고, 여기에는 메토트렉세이트, 탁솔, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 시스플라틴, 카르보플라틴, 미토마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우로루비신, 닥티노마이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파클라탁셀 및 도세탁셀이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편은 FZD10 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 정상 세포에는 결합하지 않아, 항체 또는 이의 단편, 또는 방사성동위원소 또는 화학요법제에 의해 야기되는 부작용을 효과적으로 예방할 수 있고, 따라서 치료 효능이 높을 수 있다.
본원에 기술된 항체 또는 이의 단편은 FZD10-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 유효량으로 대상에게 투여될 수 있다. 유효량은 치료된 대상에서 건강에 좋은 이익을 초래하는데 충분한 항체 또는 이의 단편의 양을 지칭한다. 제약 조성물이 본 발명의 항체를 함유하는 경우 사용될 수 있는 제형 및 투여 방법이 하기에 기술된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형될 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 주사에 의한, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입을 통한 비경구 투여 (즉, 정맥내 또는 근육내 투여)용으로 제형될 수 있다. 주사용 제형은, 첨가된 방부제와 함께, 단위 투여 형태로, 예를 들어, 앰풀 또는 다중-용량 컨테이너로 제시될 수 있다. 조성물은 좌약, 용액, 또는 유성 또는 수성 비히클 내의 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형제 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 별법적으로, 항체는 사용 전에 적절한 비히클, 예를 들어, 발열원이 없는 무균수로 재구성하기 위한 동결건조된 분말 형태일 수 있다.
항체 또는 단편 또는 이에 접합된 치료용 모이어티의 독성 및 치료 효능을, 예를 들어, LD50 (집단의 50％에 치사성인 용량) 및 ED50 (집단의 50％에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이고, 이는 비율 LD/ED로 표현될 수 있다.
높은 치료 지수를 나타내는 항체 또는 치료용 모이어티가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 항체 또는 모이어티가 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화시키고, 이에 의해 부작용을 감소시키기 위해, 이같은 항체 또는 모이어티를 침범된 조직 부위에 표적화시키는 전달 시스템을 디자인하도록 주의하여야 한다.
인간에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 제형하는데 세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 이같은 항체의 투여량은 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 순환 혈장 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태, 사용된 투여 경로 및 접합된 치료용 모이어티의 유형 및 양에 따라 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 임의의 항체에 대해, 세포 배양 분석법으로부터 유효 용량이 먼저 추정될 수 있다. 용량을 동물 모델에서 제형하여, 세포 배양에서 결정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 테스트 항체의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성한다. 이같은 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내의 수준을, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.
대상의 용태 및 연령 및/또는 투여 경로에 따라 좌우되지만, 당업자는 본 발명의 제약 조성물의 적합한 용량을 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명에 따른 항체가 하루에 대상의 체중 1 ㎏ 당 약 3 내지 약 15 ㎍, 바람직하게는 대상의 체중 1 ㎏ 당 약 10 내지 약 15 ㎍의 양으로 대상에게 투여되는 양으로 투여된다. 투여 간격 및 시간은 대상의 용태 및 연령, 투여 경로, 및 제약 조성물에 대한 응답을 고려하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물이 대상에게 5 내지 10일 동안 하루에 1 내지 5회, 바람직하게는 1회 투여될 수 있다.
제약 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 바람직하게는, 침범된 부위에 활성 성분이 전달되도록 표적화 전달 방식으로 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 메토트렉세이트, 탁솔, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 시스플라틴, 카르보플라틴, 미토마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우로루비신, 닥티노마이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파클라탁셀 및 도세탁셀을 포함하지만 이에 한정되지 않는 화학요법제 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 FZD10-관련 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용된다.
방사선 요법과 관련하여, 치료될 FZD10-관련 질환의 유형에 따라 임의의 방사선 요법 프로토콜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 그러나 비제한적으로, X-선 방사선이 투여될 수 있다. 감마선을 방출하는 방사성동위원소, 예컨대 라듐, 코발트 및 기타 원소의 방사능 동위원소가 조직 노출을 위해 또한 투여될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체를 함유하는 조성물 및 방법을 사용하는 것에 이어서 화학요법 또는 방사선 요법이 투여되고, 바람직하게는 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 하루, 1주일, 1개월 동안, 더욱 바람직하게는 수개월 동안 (예를 들어, 3개월까지) 투여된다. 본 발명에 따른 방법 및 조성물을 사용하는 치료 전에, 이와 동시에 또는 이에 이어서 투여되는 화학요법 또는 방사선 요법은 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다.
3. 진단 및 예후 용도
FZD10 단백질 또는 이의 단편에 대해 지시된 항체를, 본원에 기술된 바와 같이, 진단 및 예후에서 또한 사용할 수 있다. 이같은 진단 방법을 사용하여 FZD10-관련 질환의 존재 또는 부재 및 질환이 있을 위험을 검출할 수 있다. 본 발명의 FZD10-관련 질환의 진단 및/또는 예후 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편을 사용하여 샘플 내의 질환으로부터 유래된 FZD10 단백질을 면역학적으로 검출 또는 결정하는 것을 포함한다. 구체적으로, 볼 발명에 따른 대상에서 FZD10-관련 질환 또는 이러한 질환이 발달될 소질을 진단 또는 예후하는 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 대상으로부터의 샘플을 FZD10 단백질에 대한 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 샘플 내의 FZD10 단백질을 검출하는 단계; 및
(c) 대조군과 비교된 FZD10 단백질의 상대 존재비를 기초로 대상이 질환에 걸렸는지 또는 질환이 발달될 위험이 있는지 여부를 판단하는 단계.
본 발명의 진단 및/또는 예후 방법은 항체를 사용하는 분석법, 즉 면역학적 분석법인 한 임의의 절차를 기초로 수행될 수 있다. 따라서, 분석법에서 사용되는 항체로 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 사용하여 FZD10 단백질을 검출할 수 있다. 예를 들어, FZD10 단백질을 면역조직화학적 염색, 면역분석법 예컨대 효소 면역분석법 (ELISA 및 EIA), 면역형광 분석법, 방사선면역분석법 (RIA), 또는 웨스턴 블롯팅을 사용함으로써 검출할 수 있다.
본 발명의 FZD10-관련 질환의 진단 및/또는 예후 방법에서 테스트되는 샘플은 FZD10-관련 질환으로부터 유래된 FZD10 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플인 한 특별히 한정되지 않는다. 샘플의 예로는 세포 또는 기관의 추출물, 및 조직 절편, 뿐만 아니라, 혈액, 혈청, 혈장, 림프구 배양 상청액, 소변, 척수액, 타액, 땀, 및 복수가 포함된다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 사용함으로써 종양 조직, 종양 생검, 및 전이 조직과 같은 샘플에서 결정된 FZD10 단백질의 존재비는 FZD10-관련 질환의 지표로서 특히 유용하다.
예를 들어, 본원에 기술된 항체 및 이의 단편을 사용하여 FZD10 단백질을 정량적으로 또는 정성적으로 검출할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 항체 (또는 이의 단편)을 FZD10 단백질의 원위치(in situ) 검출을 위해 면역형광 또는 면역전자 현미경검사에서와 같이 조직학적으로 사용할 수 있다. 원위치 검출은 대상으로부터 조직학적 샘플, 예컨대 파라핀-매립 조직 절편 (예컨대 수술 표본)을 제거하고 여기에 표지된 본 발명의 항체를 도포함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 표지된 항체 (또는 이의 단편)를 샘플에 오버레이(overlay)함으로써 항체 (또는 이의 단편)이 도포된다. 본 발명을 사용하여, 이같은 원위치 검출을 달성하기 위해 임의의 광범위한 조직학적 방법 (예컨대 염색 절차)가 변형될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
FZD10 단백질에 대한 면역분석법은 시험될 대상으로부터의 샘플, 예컨대 생체액, 조직 추출물, 신선하게 수확된 세포, 또는 세포 배양에서 인큐베이션된 세포의 용해물을 검출가능하게 표지된 본 발명의 항체의 존재 하에 인큐베이션하고, 결합된 항체를 당업계에 주지된 다수의 기술 중 임의의 기술에 의해 검출하는 것을 전형적으로 포함할 것이다.
샘플을 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 고체 상 지지체 또는 캐리어 예컨대 니트로셀룰로스, 또는 또다른 고체 지지체와 접촉시켜 그 위에 고정시킬 수 있다. 그후, 지지체를 적절한 완충제로 세정한 후, 검출가능하게 표지된 FZD10에 대한 항체로 처리할 수 있다. 그후, 고체 상 지지체를 완충제로 2차 세정하여, 결합되지 않은 항체를 제거할 수 있다. 그후, 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양을 통상적인 수단에 의해 검출할 수 있다.
용어 "고체 상 지지체 또는 캐리어"는 항원 또는 항체와 결합할 수 있는 임의의 지지체를 의미한다. 항체 또는 항원의 결합을 위한 다수의 적절한 캐리어가 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 당업자가 일상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다.
소정의 로트의 항-FZD10 항체의 결합 활성을 주지된 방법에 따라 결정할 수 있다. 당업자는 일상적인 실험을 사용함으로써 각각의 결정에 대한 실효적이고 최적인 분석 조건을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 항체 (또는 이의 단편)와 샘플 내의 FZD10-관련 질환이 침범한 부위로부터 유래된 FZD10 단백질 간의 반응을 검출하기 위해, 본 발명의 항체를 표지함으로써 반응을 직접적으로 검출할 수 있거나, 또는 표지된 2차 항체를 사용함으로써 간접적으로 검출할 수 있다. 후자의 간접적 검출 절차, 예컨대 ELISA의 경쟁적 분석법 또는 샌드위치 분석법이 더 양호한 감도를 위해 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용된다.
본원에서 사용하기 위한 표지의 예는 하기와 같다. 퍼옥시다제 (POD), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 요소분해효소, 카탈라제, 글루코스 산화효소, 락테이트 탈수소효소, 아밀라제, 및 비오틴-아비딘 복합체가 효소 면역분석법에서 사용될 수 있다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 치환된 로다민 이소티오시아네이트, 디클로로트리아진 이소티오시아네이트 및 알렉사488이 면역형광 분석법에서 사용될 수 있다. 트리튬, 요오드 (예컨대 125I, 및 131I), 및 인듐 (예컨대 111In)이 방사선면역분석법에서 사용될 수 있다. NADH-FMNH2-루시페라제 분석법, 루미놀-과산화수소-POD 시스템, 아크리디늄 에스테르, 및 디옥세탄 화합물이 면역발광 분석법에서 사용될 수 있다.
통상적인 절차에 따라 표지가 항체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 효소 면역분석법에서 글루타르알데히드 방법, 말레이미드 방법, 피리딜 디술피드 방법, 또는 페리오데이트 방법에 의해 표지가 항체에 부착될 수 있고, 방사선면역분석법에서 클로르아민 T 방법 또는 볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 방법에 의해 부착될 수 있다.
공지된 절차에 따라 분석법이 수행될 수 있다 ([Ausubel, F.M. et al. Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 11 "Immunology" John Wiley & Sons, Inc. 1995]).
예를 들어, 본 발명의 항체가 상기 기술된 표지로 직접 표지되는 경우, 샘플을 표지된 항체와 접촉시킴으로써, FZD10 단백질과 항체 간에 복합체를 형성시킨다. 그후, 결합되지 않은 표지된 항체를 분리하고, 결합된 표지된 항체의 양 또는 결합되지 않은 표지된 항체의 양을 기초로 샘플 내의 FZD10 단백질의 수준을 결정할 수 있다.
표지된 2차 항체가 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 1차 반응에서 샘플과 반응시키고, 생성된 복합체를 표지된 2차 항체와 2차 반응에서 반응시킨다. 1차 반응 및 2차 반응이 반응들 사이에 약간의 시간 간격이 있으면서 역순으로 수행될 수 있다. 1차 및 2차 반응으로 [FZD10 단백질]-[본 발명의 항체]-[표지된 2차 항체]의 복합체 또는 [본 발명의 항체]-[FZD10 단백질]-[표지된 2차 항체]의 복합체가 형성된다. 그후, 결합되지 않은 표지된 2차 항체를 분리하고, 결합된 표지된 2차 항체의 존재비 또는 결합되지 않은 표지된 2차 항체의 존재비를 기초로 샘플 내의 FZD10 단백질의 수준을 결정할 수 있다.
또다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체가 방사성동위원소 또는 형광 표지로 표지되고, 표지된 항체가 대상에게 비경구적으로 투여된다. 따라서, FZD10-관련 질환의 1차 종양 및 관련된 전이된 종양의 국재성이 비-침습성 방식으로 신속하게 발견될 수 있다. 이같은 진단 방법은 종양 생체내 영상화로 공지되고, 당업자는 이의 절차를 용이하게 이해할 수 있다. 표지된 항체를 대상에게 전신 또는 국소 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 경로 예컨대 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사 또는 피하 주사를 통해 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 상기 언급된 바와 같이 FZD10 단백질과 특이적으로 반응하고, 이에 의해 FZD10-관련 질환의 진단 및/또는 예후를 위한 키트에서 사용될 수 있다.
본 발명의 진단 및/또는 예후를 위한 키트는 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 진단 및/또는 예후를 위한 키트를 사용하여 FZD10-관련 질환에 걸린 것으로 추측되는 대상으로부터의 샘플 내의 FZD10 단백질을 검출함으로써, 대상이 FZD10-관련 질환에 걸렸는지 여부를 신속하고 용이하게 확인할 수 있다. 이같은 면역학적 반응을 사용하는 질환의 진단 및/또는 예후를 위한 키트는 광범위하게 공지되어 있고, 당업자는 항체 이외의 적합한 성분을 용이하게 선택할 수 있다. 본 발명의 진단 및/또는 예후를 위한 키트는 면역분석법을 위한 수단인 한 임의의 수단에서 사용될 수 있다.
하기의 비-제한적인 실시예들에 의해 본 발명이 추가로 설명될 것이다.
하기의 실시예에서 사용된 세포주 및 조직 표본은 하기 기술된 바와 같이 제조되었다. 구체적으로, 활막 육종 (HS-SY-2, YaFuSS, 1973/99, Fuji 및 SYO-1), 결장암 (LoVo, SNU-C4 및 SNU-C5)으로부터의 세포주, HEK293 및 COS7 세포를 10％ 소 태아 혈청 및 1％ 항생제/항진균제 용액이 보충된 적합한 배지에서 단층으로 성 장시키고, 37℃에서 5％ CO2를 함유하는 공기에서 유지시켰다. 1차 활막 육종 (SS) 샘플을 사전 동의 후 수득하여, 절제 직후 액체 질소에서 순간(snap)-동결시키고, -80℃에서 보관하였다.
실시예 1
항-FZD10 모노클로날 항체의 생성
(1) 세포 면역화에 의한 모노클로날 항체의 생성
4주령 암컷 Balb/c 마우스를 발바닥에서 2×107 개의 pCAGGS/neo-FZD10-myc/His (Medical and Biological Laboratories (Nagoya, Japan))로 형질감염된 2×107 개의 COS-7 세포로 면역화시킴으로써 마우스 항-FZD10 모노클로날 항체 (Mab)를 생성시켰다. pCAGGS/neo-FZD10-myc/His의 구축은 기존에 보고되어 있고 ([Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-12]), 이는 FZD10 cDNA의 전체 코딩 서열 및 C 말단 상의 Myc 및 His 에피토프 태그(tag)를 발현한다. 세포 면역화 하루 전날 마우스를 프로인트 완전 애쥬번트 (Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. (Tokyo, Japan))로 면역화시켰다. 면역화된 마우스로부터의 지라 세포를 수확하고, 골수종 세포주와 융합시켰다. 하이브리도마를 서브클로닝하고, FZD10의 세포외 도메인 (FZD10의 아미노산 잔기 1-225)에 결합하는 면역글로불린을 분비하는 능력에 대해 세포 ELISA에 의해 분석하였다. 세포 ELISA를 위해, FZD10-myc/His (FZD10 cDNA의 전체 코딩 서열 및 C 말단 상의 Myc 및 His 에피토프 태그)를 발현하는 COS-7 세포를 96-웰 플레이트 상에 파종하였다. 이어서, 하이브리도 마로부터 수득된 배양 상청액 50 ㎕를 플레이트에 첨가하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 세정한 후, 염소 항-마우스 IgG-POD (Medical andBiological Laboratories (Nagoya, Japan))를 1:10000 희석으로 첨가하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 OD450-620nm에서 검출하였다. 양성 클론을 특이적 결합 활성에 대해 추가로 분석하였다. 이러한 클론에는 클론 39-2 및 39-10 (WO2005/004912에 개시됨, 5F2로 지칭됨), 뿐만 아니라 92-13 및 93-22이 포함된다. 모든 Mab는 이소스트립(IsoStrip) 마우스 모노클로날 항체 이소타입결정 키트 (Roche)에 의해 결정된 바와 같이 IgG2a 이소타입이었다. 추가적인 특성화를 위해 Mab를 단백질 G-세파로스 상에서 친화력 정제하였다.
마우스 모노클로날 항체 93-22를 생산하는 하이브리도마 클론 93-22가 <National Institute of Advanced Industrial Science and Technology>의 IPOD(International Patent Organism Depository) (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, 305-8566 Japan)에 기탁 번호 FERM BP-10620으로 2006년 6월 14일에 Shuichi Nakatsuru에 의해 국제적으로 기탁되었다. 또한, 마우스 모노클로날 항체 92-13을 생산하는 하이브리도마 클론 92-13이 <National Institute of AIST>의 IPOD(International Patent Organism Depository)에 기탁 번호 FERM BP-10628로 2006년 6월 28일에 Shuichi Nakatsuru에 의해 국제적으로 기탁되었다.
(2) 방사선핵종으로의 항체의 표지
125I-표지 Mab를 클로르아민 T 방법 ([Arano, Y., et al. (1999). Cancer Res, 59, 128-34])에 의해 제조하였다. 740 kBq/2㎕의 Na125I를 100 ㎕의 0.3M 인산나트륨 완충제 내의 10 ㎍의 Mab에 첨가하였다. 3 ㎕의 0.3M 인산나트륨 완충제 내의 1 ㎍의 클로르아민-T를 추가로 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 표지된 항체를 바이오스핀(Biospin) 컬럼 6 (Bio-Rad)을 사용하여 정제하였다.
Mab를 111In으로 표지하기 위해, 100 ㎕의 50 mM 보레이트 완충제 (pH 8.5) 내의 1 mg의 Mab를 디메틸포름아미드 내의 이소티오시아네이토 벤질 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (SCN-BZ-DTPA; Macrocyclics)에 1:3의 몰비로 접합시켰다. 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션한 후, Mab 접합체를 바이오스핀 컬럼 6을 사용하여 정제하였다. 40 ㎕의 111In을 60 ㎕의 0.25M 아세트산 완충제 (pH 5.5)에서 인큐베이션하고, 10 ㎍/㎕의 Mab-DTPA 접합체 내로 1시간 동안 실온에서 혼입시켰다. 표지된 항체를 바이오스핀 컬럼 6을 사용하여 정제하였다.
90Y가 접합된 92-13을 생성시키기 위해, 92-13을 라이신 잔기로 DTPA와 접합시켰다. DTPA-92-13을 100 μCi/mg의 비활성으로 이트륨으로 표지하였고, 90Y-DTPA-92-13의 면역반응성은 약 70％였다.
(3) 알렉사647-표지 Mab의 합성.
알렉사647 모노클로날 항체 표지 키트 (Molecular Probes (Eugene, Oregon))를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 Mab를 알렉사-플루오로647로 표지하였다. 알렉사647 반응성 염료에는 단백질의 1차 아민과 반응하는 숙신이미딜 에스테르 모이어티가 있고, 생성된 Mab-염료 접합체를 크기 배제 컬럼에 의해 정제하였다.
실시예 2
항-FZD10 모노클로날 항체의 결합 활성
본 발명가들들은 마우스-모노클로날 항체의 결합 친화력을 평가하기 위해 2가지 방법을 적용하였다; 형광 염료를 사용한 유동 세포계측 분석, 및 125I를 사용한 방사능 측정.
(1) 유동 세포계측법 (FACS) 분석
39-2 및 39-10 (WO2005/004912에 개시됨), 92-13 및 93-22의 4가지 항체의 세포-결합 친화력을 조사하기 위해, 본 발명가들은 유동 세포계측법 (FACS) 실험을 수행하였다. 간접적인 형광으로의 유동 세포계측 분석을 위해, 5×106 개의 세포의 현탁액을 10 ㎍/㎖의 Mab 또는 면역화되지 않은 마우스 IgG (Beckman Coulter)와 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. PBS로 세정한 후, 2 ㎍의 형광 염소 항-마우스 IgG (알렉사 플루오르 488, Molecular Probes (Eugene, Oregon))를 첨가하고, FACScan (Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ))에 의한 분석을 위해 세포 현탁액을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 직접적인 면역형광 분석을 위해, 세포를 과량 (100 ㎍)의 표지되지 않은 Mab의 존재 또는 부재 하에 2 ㎍의 알렉사 488-Mab와 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, FACScan에 의해 분석하였다.
세포주에서의 FZD10의 발현을 확인하기 위해, 본 발명가들을 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 실험을 위해, TRIzol 시약 (Invitrogen (Carlsbad, CA, USA))을 사용하여 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 각각의 전체 RNA의 3 ㎍ 분취량을 역전사시켰다. cDNA를 주형으로 사용하여 하기의 프라이머들로 PCR 증폭을 수행하였다: FZD10에 대한 5'-TATCGGGCTCTTCTCTGTGC-3' (서열 9) 및 5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3' (서열 10), 및 내부 대조군인 β2-마이크로글로불린 (β2MG)에 대한 5'-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3' (서열 11) 및 5'-TCACATGGTTCACACGGCAG-3' (서열 12).
도 1a에 제시된 바와 같이, 4개의 Mab 39-2, 39-10, 92-13 및 93-22 모두 4개의 FZD10-발현 SS 세포주인 SYO-1, YafuSS, HS-SY-2, 및 Fuji에 FZD10-용량 의존적 방식으로 결합하였지만, FZD10의 형질전환체가 검출되지 않은 2개의 세포주 1973/99 및 LoVo에는 결합하지 않았다. 하기의 표 1은 이러한 Mab들의 상대적인 평균 형광 강도 (MFI)와 도 1b에 제시된 FZD10의 발현 수준 간의 상관 관계를 가리킨다. 또한, 특히, 본 발명가들은 92-13 및 93-22 Mab가 FZD10-myc/His 구축물로 형질감염된 SNU-C5에 또한 결합한 반면, 빈 벡터로 형질감염된 SNU-C5 세포와는 결합이 검출되지 않았음을 증명하였고 (도 1c), 이는 FZD10 단백질에 대한 이러한 92-13 및 93-22 Mab의 특이적인 결합을 시사한다.
Figure 112009003689919-PCT00001
(2) 정상적인 혈액 세포에 대한 결합 활성
이러한 항체들이 임상 용도에 적용될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명가들은 정상적인 혈액 세포에 대한 항체의 결합 활성을 추가로 시험하였다. 정상적인 혈액 세포에 대한 Mab의 비-특이적 결합 활성을 평가하기 위해, 125I-표지 Mab를 100 ㎕의 건강한 신선한 혈액과 함께 인큐베이션하였다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 세포 펠렛의 방사능을 상기 기술된 바와 같이 측정하였다.
정상적인 인간 혈액 세포에 대한 125I-표지 92-13 및 93-22 Mab의 결합 활성은 3명의 개별적인 도너 모두에서 검출불가능하였지만, 39-2 및 39-10 Mab의 결합 활성은 3명의 개별적인 도너 모두에서 검출되었다 (도 1d). 이러한 결과는 인간 말초혈 단핵 세포를 사용한 FACS 분석 결과와 일치하였고 (데이터는 제시되지 않음), 이는 FZD10 분자에 대한 매우 특이적인 결합 친화력으로 인해 92-13 및 93-22 항체만이 SS 환자에 대한 역효과의 가능성이 거의 없으면서 임상용으로 적용될 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명가들은 추가적인 분석을 위해 92-13 및 93-22 항체에만 초점을 맞추었다.
(3) 추가적인 분석
또한, 125I-표지 Mab (실시예 1 (2) 참조)를 사용하여 결합 분석법을 수행하여, 세포 표면 상의 FZD10 분자에 대한 결합 친화력을 평가하였다. 방사능 분석을 위해, 실시예 1 (2)에서 제조된 125I-표지 Mab 0.5kBq (0.001 ㎍ 항체)를 다양한 양의 표지되지 않은 동일한 Mab가 있는 세포 현탁액 100 ㎕에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 현탁액을 800×g에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠렛의 방사능을 측정하였다.
결과는 93-22 항체보다 더 높은 92-13 항체의 친화력을 나타냈다; 동일한 조건 하에 약 33％의 92-13이 세포에 결합하였고, 약 9％의 93-22 항체가 세포에 결합하였다 (도 1e). 용량-의존적인 방식으로 표지되지 않은 항체가 첨가됨에 따라 결합된 항체의 양이 감소하였다.
이어서 본 발명가들은 유동 세포계측법을 사용하여 92-13과 93-22 Mab의 결합 경쟁 분석을 수행하였다. 알렉사488-표지 항체 양쪽 모두의 세포 결합이 서로에 대한 다량의 표지되지 않은 항체에 의해 완전히 차단되었고 (도 1f, ii 및 iii), 이는 92-13 및 93-22 Mab가 FZD10의 매우 유사한 또는 동일한 에피토프를 인식할 것임을 시사한다. 이러한 발견들은 이러한 Mab들이 SS 세포의 세포 표면 상에서 발현된 FZD10을 특이적으로 인식할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 3
면역조직화학
인간 조직에 대한 92-13 및 93-22의 결합 특이성을 평가하기 위해, 본 발명가들은 동결된 조직 절편을 사용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 동결된 정상적인 성인 기관으로부터의 조직 절편 (BioChain (Hayward, California))을 4％ 파라포름알데히드로 4℃에서 15분 동안 고정하고, 5 ㎍/㎖ Mab와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 마우스 ENVISION 폴리머 시약 (DAKO)을 첨가하고, 퍼옥시다제 기질 (3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드)로 가시화시켰다.
결과가 도 2에 제시된다. 도 2는 항체 없음 (a, d, g, j, 및 m), 92-13 (b, e, h, k, 및 n) 및 93-22 (c, f, i, l, 및 o)으로의 SS 및 정상적인 인간 동결 조직 절편에서의 면역조직화학적 분석을 나타낸다. (a-c), 활막 육종; (d-f), 신장; (g-i), 간, (j-l), 심장; (m-o), 뇌. 예상대로, 본 발명가들은 SS 표본 (도 2, a, b, 및 c) 및 태반 (데이터는 제시되지 않음)에서 FZD10에 대한 강한 면역반응성을 관찰하였지만, 정상적인 신장, 심장, 뇌 및 간에서는 검출되지 않았고 (도 2, d-o), 이는 노던(northern)-블롯 및 RT-PCR 실험 결과와 일치하였다 ([Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-6212]).
실시예 4
Balb/c 마우스 이종이식 모델에서의 항-FZD10 Mab의 생체분포
생체내 모델에서의 92-13 및 93-22의 분포를 BALB/c 마우스에서 2가지 독립적인 방법인 방사선핵종 영상화 및 형광 영상화에 의해 시험하였다.
(1) 생체내 방사선핵종 영상화
생체내 실험을 기관의 지침에 따라 동물 시설에서 수행하였다. BALB/cA Jcl-nu 마우스 (암컷, 7주령)에게 0.1 ㎖ PBS 내의 SYO-1 종양 세포 (5×106개의 세포)를 옆구리에 피하 (s.c.) 주사하였다. 생체분포 연구를 위해, 충분하게 확립된 종양이 있는 마우스에게 10 kBq (0.5-1 ㎍)의 125I-표지 Mab 및 10 kBq (0.5-1 ㎍)의 111In-표지 Mab를 꼬리 정맥을 통해 제공하였다. 1시, 24시, 48시에, 동물을 안락사시키고, 조직의 중량 및 방사능을 측정하였다. 모든 샘플에 대해 조직 1 g 당 주사된 용량의 ％로 분포가 표현되었다. 생체분포의 광학적 영상화를 위해, LoVo-종양이 있는 마우스를 SYO-1 종양 마우스에 더하여 사용하였다. LoVo 종양 세포 (1×107개의 세포)를 상기 기술된 바와 같이 BALB/cA Jcl-nu 마우스 내로 s.c. 주사하였다. 종양이 충분하게 확립되었을 때, 마우스를 영상화 연구에 적용하였다.
도 3a의 결과는 혈액과 관련된 111In-92-13의 방사능이 주사 1시간 후 35％ 주사 용량/g (％ID/g)에서 48시간 후 12％로 감소되었음을 나타낸다. 간, 신장, 장, 지라, 췌장, 폐, 심장, 위 및 근육과 관련된 111In-92-13의 방사능은 관찰하는 동안 꽤 일정하게 유지되거나 또는 감소되었다 (도 3a). 종양과 관련된 111In-92-13의 방사능은 주사 1시간 후 2％ ID/g에서 48시간 후 11％ ID/g로 실험 동안 축적되었다. 반면에, 도 3b는 혈액과 관련된 방사능은 1시간 후 25％에서 48시간 후 7％로 떨어졌고, 기타 정상 기관과 관련된 방사능은 일정하게 유지되었지만, 종양과 관련된 125I-표지 92-13의 방사능이 유의하게 증가하지 않았음을 나타낸다. 125I-표지 항체가 내입 후 세포 내부에서 분해되었을 수 있었다. 111In-표지 93-22 또한 주사 48시간 후 SYO-1 종양 내로 축적되었고 (도 3c), 125I-표지 93-22는 불량한 축적을 나타냈으며 (도 3d), 이는 92-13과 마찬가지로 이의 내입을 시사한다.
(2) 생체내 형광 영상화
IVIS™ 영상화 시스템 100 시리즈 (Xenogen (Alameda, CA))로 생체내 형광 영상화를 수행하였다. 최적화된 Cy5.5 필터를 사용하여 생체 내에서의 알렉사647-Mab 형광을 취득하였다. SYO-1 종양이 있는 마우스에게 20 ㎍의 알렉사647-표지 Mab를 복강내 주사하고, 이어서 다양한 시점에 형광 영상화에 적용하였다. 배경 형광을 감소시키기 위하여, Mab를 주사하기 전에 4일 동안 알팔파(alfalfa)를 함유하지 않는 식품을 마우스에게 먹이로 주었다. 영상을 취득할 때, 마우스를 2％의 이소플루란 (Abbott Laboratories)으로 마취하고, IVIS 시스템 내에 놓았다. Mab 주사 4일 후 마우스를 안락사시키고, 종양 및 주요 기관을 절개하고, 형광 영상을 수득하였다.
도 4a에 제시된 바와 같이, 주사 후 24시간에 종양의 위치에서 상당량의 형광이 검출되었다. 종양에 결합된 형광이 Mab 92-13 및 93-22 모두에 대해 관찰되었다; 주사 후 약 48시간에 신호가 최대 수준에 도달하였고, 주사 후 96시간에 검출가능하였다. 본 발명가들은 이러한 마우스들을 주사 후 120시간에 희생시키고, 종양 및 또한 주요 정상 기관 (간, 지라, 신장, 췌장, 결장)에서 형광 강도를 측정하였다 (도4b 및 4c). 절개된 종양에서 매우 강한 형광 신호가 관찰된 반면, 정상 기관에서는 형광 신호가 검출되지 않았다. 결합 특이성을 확인하기 위해, 본 발명가들은 항원-음성 세포주인 LoVo를 사용하여 누드 마우스에서 이종이식편을 생성시켰고, 알렉사647-표지 Mab를 주사하고, 형광 영상화 분석을 수행하였다. LoVo가 있는 마우스에서, 종양 위치 (도 5a), 또는 절개된 종양 또는 기타 기관 (도 5b 및 5c)에서 형광이 검출되지 않았다. 이러한 결과는 이러한 Mab들이 생체 내에서 FZD10-발현 종양 세포에 또한 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5
항원-양성 세포 내로의 항-FZD10 Mab의 내입
세포 표면에의 결합 후 이러한 Mab들의 분자성 거동을 조사하기 위해, 이들의 국재성을 시험관내 영상화 시스템을 사용하여 추적하였다.
세포를 8-웰 챔버 슬라이드 (Nalge Nunc International (Naperville, IL)) 내로 5×104개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 Mab와 함께 5％ CO2를 함유하는 공기 챔버에서 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 표면에 결합된 Mab를 산 박리 완충제 (0.1M 글리신, 500mM NaCl, pH 2.5)로 4℃에서 10분 동안 제거하고, 500mM 트리스(Tris) (pH 7.5)로 중화시켰다. 그후, 세포를 3.7％ 포름알데히드로 15분 동안 실온에서 고정시키고, 0.2％ 트리톤(Triton)X-100에 10분 동안 노출시켜 투과성이도록 한 후, 3％ 소 혈청 알부민으로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 세포 내로 내입된 Mab를 검출하기 위해, 샘플들을 알렉사488-표지 염소-항 마우스 IgG (1:700 희석)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 DAPI (Vectashield, Vector Laboratories (Burlingame, CA)로 마운팅하고, 라이카(Leica) TCS SP1 공초점 광학 하에 분석하였다.
도 6에 제시된 바와 같이, 알렉사488-표지 염소 항-마우스 IgG를 사용하여 검출된 공초점 현미경 영상화에 의해 Mab 92-13 및 93-22 모두가 Mab를 세포와 함께 인큐베이션한지 3시간 후에 SYO-1 세포 및 YaFuSS 세포의 세포질 내로 효율적으로 혼입되었다 (도 6, a-f). 반면에, 이러한 Mab들의 형광 신호는 FZD10 발현이 없는 LoVo 세포에서는 거의 검출가능하지 않았고 (도 6, g-i), 이는 세포 표면 FZD10에 대한 Mab의 특이적 결합이 항체의 내입을 유도하였음을 증명한다.
실시예 6
Mab의 특이적 세포독성
배양된 세포 내로 직접 첨가되었을 때 92-13 및 93-22는 종양 세포 성장에 대한 효과가 없었다 (데이터는 제시되지 않음). 치료법 연구를 위해, SYO-1 종양을 BALB/cA Jcl-nu 마우스에서 실시예 4에서와 동일한 방식으로 성장시켰다. 종양의 직경을 캘리퍼스로 측정하고, 종양 부피를 기존에 기술된 바와 같은 0.5 × (더 큰 직경) × (더 작은 직경)2의 식을 사용하여 결정하였다 ([Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-12]). 종양 부피가 0.4-2.8 ㎤ 초과에 도달했을 때, 피하 SYO-1 종양이 있는 Balb/c-nude 마우스들을 치료 군으로 무작위로 할당하고, 100 μCi의 90Y-표지 Mab 또는 대조군 Mab를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 마우스를 칭량하고, 종양 직경을 기록하였다.
도 7은 치료 직후 종양 부피가 현저하게 감소하였고, 모든 마우스에서 1주일 이내에 미량으로 감소하였음을 나타낸다. 50 μCi의 90Y-DTPA-92-13이 마우스에게 제공되었을 때, 부피가 1 ㎤을 초과하는 종양이 치료 직후 종양 크기에서 현저한 감소를 나타냈지만, 치료 2주 후 퇴축되었다. 마우스들이 일시적인 체중 감소 (10~15％)를 나타냈지만, 1주 내에 회복되었고, 가시적인 독성 징후가 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 7
키메라 항체의 생성
CMV 프로모터의 제어 하에 인간 IgG1 불변 영역에 대한 각각의 마우스 항체의 가변 영역 서열의 대체에 의해 마우스 92-13 및 93-22 항체에 상응하는 키메라 항체인 ch92-13 및 ch93-22가 생성되었다. 하이브리도마 클론 92-13 및 93-22로부터 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA로부터 GeneRacer™ 키트 (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 모노클로날 항체의 가변 영역의 서열을 전방향 프라이머 (GeneRacer™ 5'프라이머) 및 역방향 프라이머; CH1 (IgG2a); 중쇄에 대한 5'-AATTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3' (서열 3), 및 CL1 (카파); 경쇄에 대한 5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3' (서열 4)를 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물을 서열분석하고, m92-13 및 m93-22 가변 영역을 코딩하는 서열을 결정하였다.
그 결과, 마우스 Ig H-사슬 가변 영역 및 L-사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 하기와 같이 결정되었다:
92-13, H-사슬 가변 영역:
MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNINDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGARGSRFAYWGQGTLVTVSA (서열 13) (서열 14의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨), 및
92-13, L-사슬 가변 영역:
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYVATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPYTFGGGTKL (서열 21) (서열 22의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨); 및
93-22, H-사슬 가변 영역:
MGWSRIFLFLLSITAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARGGNYGWFAYWGQGTLVTVSAGS (서열 29) (서열 30의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨), 및
93-22, L-사슬 가변 영역:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELYTFGGGTKLGS (서열 37) (서열 38의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨). 밑줄은 신호 서열을 가리킨다.
항체의 CDR (상보성 결정 영역) 서열이 하기와 같이 결정되었다:
92-13, VH CDR1으로서의 INDTYMH (서열 15), VH CDR2로서의 RIDPANGNTKYD (서열 17), 및 VH CDR3로서의 GSRFAY (서열 19), VL CDR1으로서의 RASENIYSNLA (서열 23), VL CDR2로서의 VATNLAD (서열 25), 및 VL CDR3로서의 QHFWGTPY (서열 27); 및
93-22, VH CDR1으로서의 SSWMN (서열 31), VH CDR2로서의 RIYPGDGDTNYN (서열 33), 및 VH CDR3로서의 GGNYGWFAY (서열 35), VL CDR1으로서의 RASKSVSTSGYSYMH (서열 39), VL CDR2로서의 LASNLES (서열 41), 및 VL CDR3로서의 QHSRELY (서열 43).
또한, 마우스 모노클로날 항체 92-13, 93-22 및 39-10의 H 사슬 및 L 사슬의 아미노산 서열이 하기와 같이 결정되었다:
92-13, H 사슬: 서열 58 (서열 57의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨);
92-13, L 사슬: 서열 60 (서열 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨);
93-22, H 사슬: 서열 62 (서열 61의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨);
93-22, L 사슬: 서열 64 (서열 63의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨);
39-10, H 사슬: 서열 66 (서열 65의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨);
39-10, L 사슬: 서열 68 (서열 67의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨).
결정된 서열에 따라, m92-13 가변 영역에 대한 특이적 프라이머를 디자인하였다: 중쇄를 위한 5'-AATAGCGGCCGCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTT-3' (서열 5) 및 5'-AATAGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC-3' (서열 6) 및 경쇄를 위한 5'-AATAGCGGCCGCACCATGAGTGTGCCCACTCAGG-3' (서열 7) 및 5'-TTCCAGCTTGGTCCCCCC-3' (서열 8). 또한, m93-22 가변 영역에 대한 특정 프라이머를 디자인하였다: 중쇄를 위한 5'-AATAGCGGCCGCACCATGGGATGGAGCCGGATCTTT-3' (서열 53) 및 5'-AATAGGATCCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTT-3' (서열 54) 및 경쇄를 위한 5'-AATAGCGGCCGCACCATGGAGACAGACACACTCCT-3' (서열 55) 및 5'-AATAGGATCCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGT-3' (서열 56). 키메라 항체에 대한 발현 벡터를 구축하기 위해, 2개의 카세트 벡터를 제조하였다. 인간 IgG1 (CH1-CH3)을 코딩하는 DNA 단편을 pQCXIH (Clontech) 내로 삽입하였고 (pQCXCHIH), 인간 Igκ (CL1)를 코딩하는 DNA 단편을 pQCXIP 내로 삽입하였다 (pQCXCLIP). 인간 IgG1 또는 인간 Igκ를 코딩하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 기존에 보고된 방법 ([Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987]; [Reff, M.E. et al., Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994])에 의해 인간 PBMC (말초혈 단핵 세포)로부터의 cDNA를 사용하여 인간 불변 영역 라이브러리를 제조하였다. m92-13 및 m93-22 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 PCR-증폭시키고, 서열 분석하고, NotI 및 BamHI 부위를 사용하여 각각 pQCXCHIH 및 pQCXCLIP 내로 서브클로닝하였다. 이러한 벡터들을 CHO 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 500 ㎍/㎖ 하이그로마이신(Hygromycin) 및 10 ㎍/㎖ 푸로마이신(Puromycin)을 함유하는 F-12 배지에서 배양하였다. 세포들이 준(sub)-전면성장으로 성장했을 때, 배지를 무혈청 배지 (CHO-S-SFM II; GIBCO)로 교환하고, 배양된 세포의 상청액으로부터 단백질 A-친화력 컬럼 (GE Amersham)을 사용하여 키메라 항체를 정제하고, 서열분석하였다. 키메라 항체 ch92-13의 중쇄의 서열은 서열 45의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 46을 포함하였고; 키메라 항체 ch92-13의 경쇄의 서열은 서열 47의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 48을 포함하였다. 키메라 항체 ch93-22의 중쇄의 서열은 서열 49의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 50을 포함하였고; 키메라 항체 ch93-22의 경쇄의 서열은 서열 51의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 52를 포함하였다.
실시예 8
키메라 항체의 결합 활성
키메라 92-13 및 93-22에 의해 유도된 항체-의존적 세포 독성 (ADCC) 활성을 기존에 기술된 바와 같이 LDH 활성을 사용하여 결정하였다 ([Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-6212]). 신선한 이펙터 세포를 피콜-플라크(Ficoll-Plaque) (Amersham Bioscience)에 의해 건강한 도너의 헤파린처리된 말초혈로부터 단리하였다. 96-웰 플레이트에서 5％ FBS가 보충된 페놀 레드-프리(free) RPMI 1640 0.1 ㎖에서, 키메라 92-13, 키메라 93-22 또는 면역화되지 않은 인간 IgG와 함께, 이펙터 세포 (E) 및 표적 세포 (T) (각각 5×103개/웰)를 다양한 E:T 비율로 4중으로 6시간 동안 37℃에서 공동 인큐베이션하였다. 배양 상청액에 방출된 LDH를 490 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다. 제조업자의 설명서에 따라 특이적 세포독성의 백분율을 계산하였다.
이펙터 활성과 관련하여, 키메라 92-13 및 93-22 모두 FZD10-과발현 SYO-1 세포에 특이적으로 ADCC를 유도하였지만 (도 8, a 및 c), FZD10-음성 LoVo 세포에 대해서는 유도하지 않았다 (도 8, b 및 d). 특히, 키메라 92-13은 키메라 93-22와 비교하여 더 높은 세포 독성 유도를 나타냈다; 그러나, 이들의 활성은 이펙터 세포 도너에 좌우되고, 이는 아마도 Fc 수용체의 다형성에 의해 야기되었을 것이다.
본 문서에서 언급된 각각의 출원 및 특허, 및 각각의 상기 출원 및 특허에서 인용 또는 참조된 각각의 문헌은 거명에 의해 본원에 포함된다. 또한, 본문에서 인용된 모든 문헌, 및 본문에서 인용된 문헌에서 인용 또는 참조된 모든 문헌, 및 본문에서 인용 또는 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조업자의 설명서 또는 카탈로그가 거명에 의해 본원에 포함된다.
본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이같은 특정 실시양태에 과도하게 한정되지 않아야 하고, 이에 대한 많은 변형 및 부가가 본 발명의 범주 내에서 이루어질 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련된 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형이 청구항의 범주 내인 것으로 의도된다. 또한, 하기의 종속항들의 양상의 다양한 조합이 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 독립항들의 양상과 함께 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> OncoTherapy Science, Inc. The University of Tokyo National University Corporation Gunma University <120> Tumor-targeting monoclonal antibodies and chimeric antibodies to FZD10 and uses thereof <130> PH-2818PCT <150> US 60/815,257 <151> 2006-06-21 <160> 68 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2811 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acacgtccaa cgccagcatg cagcgcccgg gcccccgcct gtggctggtc ctgcaggtga 60 tgggctcgtg cgccgccatc agctccatgg acatggagcg cccgggcgac ggcaaatgcc 120 agcccatcga gatcccgatg tgcaaggaca tcggctacaa catgactcgt atgcccaacc 180 tgatgggcca cgagaaccag cgcgaggcag ccatccagtt gcacgagttc gcgccgctgg 240 tggagtacgg ctgccacggc cacctccgct tcttcctgtg ctcgctgtac gcgccgatgt 300 gcaccgagca ggtctctacc cccatccccg cctgccgggt catgtgcgag caggcccggc 360 tcaagtgctc cccgattatg gagcagttca acttcaagtg gcccgactcc ctggactgcc 420 ggaaactccc caacaagaac gaccccaact acctgtgcat ggaggcgccc aacaacggct 480 cggacgagcc cacccggggc tcgggcctgt tcccgccgct gttccggccg cagcggcccc 540 acagcgcgca ggagcacccg ctgaaggacg ggggccccgg gcgcggcggc tgcgacaacc 600 cgggcaagtt ccaccacgtg gagaagagcg cgtcgtgcgc gccgctctgc acgcccggcg 660 tggacgtgta ctggagccgc gaggacaagc gcttcgcagt ggtctggctg gccatctggg 720 cggtgctgtg cttcttctcc agcgccttca ccgtgctcac cttcctcatc gacccggccc 780 gcttccgcta ccccgagcgc cccatcatct tcctctccat gtgctactgc gtctactccg 840 tgggctacct catccgcctc ttcgccggcg ccgagagcat cgcctgcgac cgggacagcg 900 gccagctcta tgtcatccag gagggactgg agagcaccgg ctgcacgctg gtcttcctgg 960 tcctctacta cttcggcatg gccagctcgc tgtggtgggt ggtcctcacg ctcacctggt 1020 tcctggccgc cggcaagaag tggggccacg aggccatcga agccaacagc agctacttcc 1080 acctggcagc ctgggccatc ccggcggtga agaccatcct gatcctggtc atgcgcaggg 1140 tggcggggga cgagctcacc ggggtctgct acgtgggcag catggacgtc aacgcgctca 1200 ccggcttcgt gctcattccc ctggcctgct acctggtcat cggcacgtcc ttcatcctct 1260 cgggcttcgt ggccctgttc cacatccgga gggtgatgaa gacgggcggc gagaacacgg 1320 acaagctgga gaagctcatg gtgcgtatcg ggctcttctc tgtgctgtac accgtgccgg 1380 ccacctgtgt gatcgcctgc tacttttacg aacgcctcaa catggattac tggaagatcc 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gagttgctta aaatagactc tggccttcac caatagtctc tctgcaagac agaaacctcc 2340 atcaaacctc acatttgtga actcaaacga tgtgcaatac atttttttct ctttccttga 2400 aaataaaaag agaaacaagt attttgctat atataaagac aacaaaagaa atctcctaac 2460 aaaagaacta agaggcccag ccctcagaaa cccttcagtg ctacattttg tggcttttta 2520 atggaaacca agccaatgtt atagacgttt ggactgattt gtggaaagga ggggggaaga 2580 gggagaagga tcattcaaaa gttacccaaa gggcttattg actctttcta ttgttaaaca 2640 aatgatttcc acaaacagat caggaagcac taggttggca gagacacttt gtctagtgta 2700 ttctcttcac agtgccagga aagagtggtt tctgcgtgtg tatatttgta atatatgata 2760 tttttcatgc tccactattt tattaaaaat aaaatatgtt ctttaaaaaa a 2811 <210> 2 <211> 581 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val Met Gly 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly 20 25 30 Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn 35 40 45 Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala 50 55 60 Ala Ile Gln Leu His 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atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag 60 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 240 gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcaag agggggtaac 360 tacggctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggatcc 417 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Mouse <400> 31 Ser Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Mouse <400> 32 agtagctctt ggatgaac 18 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Mouse <400> 33 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 1 5 10 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Mouse <400> 34 cggatttatc ctggagatgg agatactaac tacaat 36 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <400> 35 Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Mouse <400> 36 gggggtaact acggctggtt tgcttac 27 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ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 120 tgcacagctt ctggcttcaa cattaacgac acctatatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaatac taaatatgac 240 ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctag aggagcacgg 360 gggagtagat ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa atga 1404 <210> 46 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A sequence of H chain of anti-REG4 chimeric antibody with signal sequence. <400> 46 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 47 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A sequence of L chain of anti-REG4 chimeric antibody with signal sequence. <400> 47 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgtt gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgaca 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 48 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A sequence of L chain of anti-REG4 chimeric antibody with signal sequence. <400> 48 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 49 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A sequence of H chain of anti-REG4 chimeric antibody with signal sequence. <400> 49 atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag 60 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 240 gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcaag agggggtaac 360 tacggctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggatccgcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg taaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatga 1398 <210> 50 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A sequence of H chain of anti-REG4 chimeric antibody with signal sequence. <400> 50 Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 51 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A sequence of L chain of anti-REG4 chimeric antibody with signal sequence. <400> 51 atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gctgtacacg 360 ttcggagggg ggaccaagct gggatccgaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 <210> 52 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A sequence of L chain of anti-REG4 chimeric antibody with signal sequence. <400> 52 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 35 40 45 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly 115 120 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<211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 56 aataggatcc cagcttggtc ccccctccga acgt 34 <210> 57 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide: 92-13 H chain <220> <221> CDS <222> (1)..(1404) <223> <400> 57 atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag 96 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 cca ggg gcc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 aac gac acc tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg 192 Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga agg att gat cct gcg aat ggt aat act aaa tat gac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80 ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 aca gcc tac ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gct aga gga gca cgg ggg agt aga ttt gct tac tgg ggc 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc aaa aca aca gcc cca tcg 432 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg 480 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160 act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg 528 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 165 170 175 acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct 576 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc 624 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 195 200 205 tcg agc acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg 672 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 gca agc agc acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca 720 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240 atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt 768 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 245 250 255 gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg 816 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 260 265 270 atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag 864 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 275 280 285 gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta 912 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 290 295 300 cac aca gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc 960 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 305 310 315 320 cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc 1008 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 325 330 335 aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc 1056 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta 1104 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 355 360 365 tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act 1152 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 370 375 380 ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag 1200 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 385 390 395 400 tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca 1248 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 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Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 195 200 205 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 260 265 270 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 275 280 285 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile 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gtc ctg ggg ttg ctg ctg ctg tgg ctt aca 48 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 gat gcc aga tgt gac atc cag atg act cag tct cca gcc tcc cta tct 96 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 gta tct gtg gga gaa act gtc acc atc aca tgt cga gca agt gag aat 144 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 att tac agt aat tta gca tgg tat cag cag aaa cag gga aaa tct cct 192 Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 cag ctc ctg gtc tat gtt gca aca aac tta gca gat ggt gtg cca tca 240 Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca cag tat tcc ctc aag atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 agc ctg cag tct gaa gat ttt ggg agt tat tac tgt caa cat ttt tgg 336 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 ggt act ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg 384 Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag cag 432 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc tac 480 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga caa 528 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 165 170 175 aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc acc 576 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa cga 624 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 195 200 205 cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca ccc 672 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 210 215 220 att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag 705 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 60 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide: 92-13 L chain <400> 60 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 165 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att gga cgg att tat cct gga gat gga gat act aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 ggg aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288 Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg caa ctc agc agc ctg acc tct gtg gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat ttc tgt gca aga ggg ggt aac tac ggc tgg ttt gct tac tgg ggc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc aaa aca aca gcc cca tcg 432 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg 480 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160 act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg 528 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 165 170 175 acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct 576 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc 624 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 195 200 205 tcg agc acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg 672 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 gca agc agc acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca 720 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240 atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt 768 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 245 250 255 gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg 816 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 260 265 270 atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag 864 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 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Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 195 200 205 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 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gag gat gct gca acc tat tac tgt 336 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 cag cac agt agg gag ctg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa 384 Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 ata aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc 432 Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac 480 Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn 145 150 155 160 aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt 528 Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 165 170 175 gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa 576 Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys 180 185 190 gac agc acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag 624 Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu 195 200 205 tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca 672 Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser 210 215 220 act tca ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag 714 Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 64 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide: 93-22 L chain <400> 64 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 35 40 45 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 165 170 175 Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys 180 185 190 Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu 195 200 205 Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser 210 215 220 Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 65 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide: 39-10 H chain <220> <221> CDS <222> (1)..(1395) <223> <400> 65 atg gat tgg ctg tgg aac ttg cta ttc ctg atg gca gct gcc caa agt 48 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 atc caa gca cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag 96 Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 cct gga gag aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc 144 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser 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Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys 370 375 380 atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac 1200 Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 385 390 395 400 aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac 1248 Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp 405 410 415 tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag 1296 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys 420 425 430 aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt 1344 Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly 435 440 445 ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa 1392 Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 450 455 460 tga 1395 <210> 66 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide: 39-10 H chain <400> 66 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr 195 200 205 Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 210 215 220 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 260 265 270 Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro 275 280 285 Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala 290 295 300 Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 325 330 335 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu 355 360 365 Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys 370 375 380 Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 385 390 395 400 Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys 420 425 430 Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly 435 440 445 Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 67 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide: 39-10 L chain <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <223> <400> 67 atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggt tcc aca ggt gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 gtg tct cta ggg cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 gtt gat agt tat ggc aat agt ttt atg cac tgg tac cag cag aaa cca 192 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct 240 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 ggg atc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc 288 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc acc att aat cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt 336 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 cag caa agt aat gag gat cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca 432 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg 480 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc 576 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 aaa gac agc acc 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Claims (42)

  1. 서열 15, 17 및 19에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 H 사슬 (중쇄) V (가변) 영역, 및 서열 23, 25 및 27에 제시된 아미노산 서열의 CDR 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 L 사슬 (경쇄) V 영역을 포함하고, 프리즐드(Frizzled) 상동체 10 (FZD10) 단백질 또는 이의 부분적인 펩티드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 단편, 및 단일쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 마우스 항체인 항체 또는 이의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 마우스 항체가 서열 57에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 및/또는 서열 59에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  5. 제3항에 있어서, 마우스 항체가 하이브리도마(hybridoma) 클론(clone) 92-13 (FERM BP-10628)에 의해 생산되는 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 항체 또는 이의 단편.
  7. 제6항에 있어서, 키메라 항체가 서열 13에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 키메라 항체가 서열 46에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  9. 제6항에 있어서, 키메라 항체가 서열 21에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  10. 제6항 또는 제9항에 있어서, 키메라 항체가 서열 48에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  11. 제6항에 있어서, 키메라 항체가 서열 13에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역 및 서열 21에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  12. 제6항 또는 제11항에 있어서, 키메라 항체가 서열 46에 제시된 아미노산 서 열의 H 사슬 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체가 인간 항체 C (불변) 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  14. 제1항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 항체 또는 이의 단편.
  15. 제14항에 있어서, 인간화 항체가 인간 항체 FR (프레임워크(framework)) 영역 및/또는 인간 항체 C 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  16. 서열 31, 33 및 35에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 H 사슬 (중쇄) V (가변) 영역, 및 서열 39, 41 및 43에 제시된 아미노산 서열의 CDR 또는 이에 대해 기능적으로 등가인 CDR을 포함하는 L 사슬 (경쇄) V 영역을 포함하고, 프리즐드 상동체 10 (FZD10) 단백질 또는 이의 부분적인 펩티드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편.
  17. 제16항에 있어서, 항체가 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 단편, 및 단일쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편.
  18. 제16항에 있어서, 항체가 마우스 항체인 항체 또는 이의 단편.
  19. 제18항에 있어서, 마우스 항체가 서열 61에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 및/또는 서열 63에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  20. 제18항에 있어서, 마우스 항체가 하이브리도마 클론 93-22 (FERM BP-10620)에 의해 생산되는 항체 또는 이의 단편.
  21. 제16항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 항체 또는 이의 단편.
  22. 제21항에 있어서, 키메라 항체가 서열 29에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 키메라 항체가 서열 50에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  24. 제21항에 있어서, 키메라 항체가 서열 37에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  25. 제21항 또는 제24항에 있어서, 키메라 항체가 서열 52에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  26. 제21항에 있어서, 키메라 항체가 서열 29에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 V 영역 및 서열 37에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬 V 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  27. 제21항 또는 제26항에 있어서, 키메라 항체가 서열 50에 제시된 아미노산 서열의 H 사슬 및 서열 52에 제시된 아미노산 서열의 L 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체가 인간 항체 C (불변) 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  29. 제16항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 항체 또는 이의 단편.
  30. 제29항에 있어서, 인간화 항체가 인간 항체 FR (프레임워크) 영역 및/또는 인간 항체 C 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지로 표지된 항체 또는 이의 단편.
  32. 제31항에 있어서, 방사성동위원소 표지가 90이트륨 (90Y), 125요오드 (125I) 및 111인듐 (111In)으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편.
  33. 마우스 모노클로날 항체 92-13을 생산하는 하이브리도마 클론 92-13 (FERM BP-10628).
  34. 마우스 모노클로날 항체 93-22를 생산하는 하이브리도마 클론 93-22 (FERM BP-10620).
  35. 대상에게 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, FZD10과 관련된 질환이 활막 육종 (SS), 결장직장암, 위암, 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)으로부터 선택되는 방법.
  37. (a) 대상으로부터의 샘플 또는 표본을 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편과 접촉시키는 단계;
    (b) 샘플 또는 표본 내의 FZD10 단백질을 검출하는 단계; 및
    (c) 대조군과 비교된 FZD10 단백질의 상대 존재비를 기초로 대상이 질환에 걸렸는지 또는 질환이 발달될 위험이 있는지 여부를 판단하는 단계
    를 포함하는, 대상에서 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환 또는 이러한 질환이 발달될 소질을 진단 또는 예후하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, FZD10과 관련된 질환이 활막 육종 (SS), 결장직장암, 위암, 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)으로부터 선택되는 방법.
  39. 대상에게 유효량의 제31항 또는 제32항에 따른 항체 또는 단편을 투여하는 것을 포함하는, 대상 내의 프리즐드 상동체 10 (FZD10) 단백질을 생체내 영상화하는 방법.
  40. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
  41. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는, 프리즐드 상동체 10 (FZD10)과 관련된 질환의 진단 또는 예후를 위한 키트.
  42. 제31항 또는 제32항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는, 프리즐드 상동체 10 (FZD10) 단백질의 생체내 영상화를 위한 제약 조성물.
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