CN101573371A - 环肽类化合物的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了环肽类化合物的合成方法以及新的二肽化合物。该方法包括二肽的固相合成，所述二肽在固相反应中与第二个肽偶合。然后在偶合反应后将该肽环化。所述方法和二肽特别用于MC－4受体激动剂肽的合成。

Description

环肽类化合物的合成方法
本发明涉及环肽类化合物的合成方法。
多种肽合成方法在文献中已有描述(例如，参见美国专利号6,015,881；Mergler等(1988)Tetrahedron Letters 29：4005-4008；Mergler等(1988)Tetrahedron Letters 29：4009-4012；Kamber等(编辑)，Peptides，Chemistry and Biology，ESCOM，Leiden(1992)525-526；Riniker等(1993)Tetrahedron Letters 49：9307-9320；Lloyd-Williams等(1993)TetrahedronLetters 49：11065-11133；Andersson等(2000)Biopolymers 55：227-250；和Bray，B.L.(2003)Nature Reviews 2：587-593)。各种方法以其中合成所发生的相的物理状态而有所不同，即液相合成或固相合成。
在某些情况下，合成方法包括能够提供环肽的反应。肽类可以环化以使其结构强化并提高其体内稳定性(参见Camarero和Muir，(1999)J.Am.Chem.Soc.，121：55975598)。环肽类化合物可能更难以被机体酶类所降解，也能够增加对机体内受体的亲和性。
在现有技术中已经公开了制备环肽类化合物的各种合成方法。在某些情况下，这些方法包括线性多肽的环化。例如，采用化学交联方法制备主链环化形式的牛胰胰蛋白酶抑制剂(Goldenburg和Creighton(1983)J.Mol.Biol.，165：407413)。其它方法包括化学的(Camarero，等，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.，37：347349；Tam和Lu(1998)Prot.Sci.，7：1583 1592；Camarero和Muir(1997)Chem.Commun.，1997：1369 1370；和Zhang和Tam(1997)J.Am.Chem.Soc.119：2363 2370)和酶的(Jackson等，(1995)J.Am.Chem.Soc.，117：819 820)分子内连接方法，它使得线性的合成肽类在水性条件下有效地环化。
非重组环肽类化合物的合成通常包括固相或液相合成步骤，当其具有反应性侧链基团以及反应性末端时，通常采用含有保护基团的氨基酸或肽类。在反应物的侧链基团或不适当末端上的非预期反应可能会产生不需要的副产物，有时候甚至是大量的副产物。这些副产物和反应可能严重影响收率，或者从实际的观点来看，甚至破坏了合成的产物。为了尽可能减少副反应，常规操作是适当地掩蔽反应物的反应性侧链基团和(α-氨基)末端以有助于保证预期反应的发生。
使用Fmoc化学对α-氨基基团进行保护已经变成最近固相和液相肽合成方法的优选方法。也有显示，Fmoc化学较Boc化学更可靠，能够产生质量更高的肽类。在Fmoc合成中，除去Fmoc保护基团以提供反应性氨基末端的反应通常在弱碱(例如哌啶)存在下进行。碱处理后，通常将初生态的肽洗涤，然后使得含有活化氨基酸和偶合助剂(coupling co-reagent)的混合物与该初生态的肽接触以偶合下一个氨基酸。偶合后，未偶合试剂可以洗去，然后可以除去初生态的肽N-末端上的保护基团，然后根据相似的方法，向该初生态肽中加入其它氨基酸或肽物质。
在Fmoc化学中，氨基酸和肽反应物(包括树脂-结合的肽物质以及向生长的链中加入的其它物质)的反应性侧链基团在合成过程中通常采用侧链保护基团保持掩蔽。通常，在合成过程中，采用在α-氨基保护基团的去保护过程中(即哌啶处理)不被除去的侧链保护基团。Fmoc化学中常用的侧链保护基团通过酸解可以除去(例如，采用TFA)，包括Acm、Boc、Mtr、OtBu、Pbf、Pmc、tBu和Trt。在Fmoc化学中，如果侧链的化学结构允许的话，这些保护基团在某些氨基酸上可以获得。
尽管目前广泛采用固相化学例如Fmoc，然而其中采用这些化学的某些情况可能是存在问题的。例如，在某些情况下，除去Fmoc后，肽中间体可能会经历不需要的副反应从而产生死端产物(dead-end product)。在其它情况下，该合成方法步骤的重现性低并且是不可接受的。
这些问题在环肽合成过程中可能更加严重，因为它通常需要更艰难的偶合反应以促进选定的氨基酸侧链之间的偶合。
本发明解决了这些问题并改进和完善了环肽类合成工艺。
本发明提供了环肽类化合物制备的新方法。本发明也提供了新的肽化合物，它包含天冬氨酸残基和非天然氨基酸。这些肽化合物可以用作合成环肽类化合物的中间体，例如环黑皮质素-4受体激动剂肽类。
一方面，本发明提供了环肽类制备的特别有效和高效的方法。该方法提供了克服环肽类合成困难的途径，例如死端中间体肽类的形成。该方法很好地提供了与环肽类制备相关的有益的工艺过程，例如减少了试剂的用量或省略了环肽类合成中通常使用的某些处理工艺。总而言之，本发明的方法提供了环肽产物的更高收率并且提高了环肽的纯度。
一般而言，本发明的方法包括至少两个肽中间体片段的固相合成，其中之一为二肽。该方法避免了死端中间体片段的形成，如果不采用二肽方法，则可能形成所述死端中间体片段。
本发明提供了形成环肽的方法。该方法包括下列步骤。首先，在树脂上合成二肽片段，其中该合成提供了包含具有第一个侧链的氨基酸残基的二肽片段。然后将该二肽自树脂上裂解。将第二个肽片段与树脂偶合，该第二个肽包含具有第二个侧链的氨基酸残基。然后将被裂解的二肽片段的羧基末端与第二个肽片段的氨基末端偶合，从而形成第三个肽，该肽与树脂结合。该方法也包括通过将二肽部分的第一个侧链与第二个肽部分的第二个侧链共价偶合而将第三个肽环化的步骤。
在某些情况下，环化步骤包括使得酸性(第一个)侧链与碱性(第二个)侧链偶合。例如，该肽通过天冬氨酸残基的侧链和赖氨酸残基的侧链进行环化。
该方法可以用于环肽类合成，它包括非天然氨基酸。此类非天然氨基酸包括D-立体异构形式的天然L-氨基酸以及合成氨基酸(它们具有非天然存在的侧链)。在一个实施方案中，该环肽包括D-氨基酸(例如D-苯基丙氨酸)和相邻的合成氨基酸。在偶合步骤中，将包含N-末端酸性氨基酸残基和C-末端合成氨基酸的二肽与第二个肽片段的N-末端D-氨基酸偶合形成第三个肽片段。
本发明的方法可以通过环黑皮质素-4(MC-4)受体激动剂肽类的合成而举例说明，所述肽类能够选择性地刺激MC-4受体活性。MC-4受体激动剂肽类被认为可以用于治疗或预防肥胖(Huzar，D.等(1997)Cell 88：131-41)和男性勃起障碍(MED)(Sebhat，I.K.等(2002)J Med Chem.45：4589-93)。短环MC-4肽类(包括非天然氨基酸并对MC-4受体具有高选择性)的合成已经描述于美国专利号7,045,591。这些肽类由下式代表：环(Asp-Lys)戊酰基-Asp-(AAnn)-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2(SEQ ID NO：1)，其中AAnn代表非天然氨基酸结构，它描述于美国专利7,045,591。优选的MC-4激动剂肽类含有的非天然氨基酸选自4-氨基-1-苯基哌啶-4-甲酸和4-氨基-1-(2-甲基苯基)哌啶-4-甲酸。
除非另外说明，在本申请(包括说明书和权利要求)中使用的下列术语具有下面所给出的定义：
“烷基”包括1-8个碳原子的支链和直链单价饱和脂肪族烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔-丁基、各种戊基异构体和己基异构体。优选当定义R12时，“烷基”为具有1-5个碳原子的直链，最优选丁基。优选当定义R1时，“烷基”为具有4-8个碳原子的支链单价饱和脂肪族烃基，最优选为叔-丁基。
“链烯基”包括含有烯键和至多5个碳原子的直链或支链烃基，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和异丁烯基。
“烷氧基”包括式-OR基团，其中R为本文中所定义的烷基。“烷氧基”基团的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔-丁氧基、丁氧基和戊氧基。优选“烷氧基”具有1-4个碳原子。最优选当定义R3时，“烷氧基”为甲氧基。
一方面，本发明提供了新的二肽。该二肽可以用作本文中所述的环MC-4肽合成的中间体肽。在此方面，该二肽可以包括下式的天冬氨酸二肽：
Figure A20078004947400081
其中：
R1为烷基保护基团；
X为：
Figure A20078004947400091
R2、R3和R4独立为氢或具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，其中当R3为烷氧基时，R2和R4均为氢；R9为氢、具有1-3个碳原子的直链或支链烷基、具有1-3个碳原子的直链或支链烷氧基或未取代的苯氧基；R11为环己基、环庚基或具有3-8个碳原子的支链烷基；
R12为具有1-5个碳原子的烷基、具有2-5个碳原子的链烯基或具有2-5个碳原子的炔基；并且
R10为H或卤素。
在某些方面，在形成黑皮质素-4受体激动剂肽的方法中采用环二肽。该方法包括在树脂上合成权利要求1的式I的天冬氨酸二肽的步骤。然后将天冬氨酸二肽自树脂上裂解下来。然后提供与树脂结合的包含D-Phe-Arg-Trp-Lys序列的第二个肽片段。下一步，然后将该肽的羧基末端与第二个肽片段的氨基末端偶合，从而形成具有[式I]-D-Phe-Arg-Trp-Lys序列的肽。然后将该肽通过天冬氨酸残基的侧链和赖氨酸残基的侧链的共价偶合进行环化。该方法避免了死端脲中间体的形成，否则会以单体形式通过合成氨基酸(二肽的)的偶合形成该死端中间体。
根据本发明的方法制备的化合物可以用在治疗个体的体重增加的药用组合物中。
本文中所述的所有出版物和专利以其各自的完整内容在此引入本文作为参考。本文中所引用的出版物和专利仅以其公开的内容提供。本文中的一切内容均不得解释为承认本发明者无权具有先于任何出版物和/或专利的权利，包括任何本文中所引用的出版物和/或专利。
下面所述的本发明的实施方案并非欲穷尽本发明或将本发明限定在下面详述中所公开的精确内容中。另外，选择并描述实施方案是为了本领域其他技术人员能够理解和明白本发明的原则和具体实践。
本发明的方法依据环肽类制备的通用方法。它包括下列步骤：(a)通过固相合成制备包含具有第一个侧链的氨基酸残基的第一个二肽，(b)自树脂上裂解二肽，(c)通过固相合成的偶合方法制备第二个肽片段，它包含具有第二个侧链的氨基酸残基，(d)将裂解的二肽片段的羧基末端与仍然在树脂上的第二个肽片段的氨基末端偶合，从而形成第三个肽。然后将第三个肽：(e)通过将二肽部分的第一个侧链与第二个肽部分的第二个侧链共价偶合而环化。通常，将第三个肽自树脂上裂解，然后环化。
氨基酸侧链(包括第一个和第二个氨基酸侧链，它们在环化步骤中共价结合)包括保护基团，该保护基团直到二肽与第二个肽偶合后才除去。在多个实施方案中，侧链保护基团在第三个肽自树脂上裂解的步骤中除去。例如，树脂结合的第三个肽可以采用三氟乙酸处理以除去酸不稳定性侧链保护基团并裂解连接第三个肽和树脂的酸不稳定性基团。
根据本发明，“环肽”是指具有至少一对共价偶合的氨基酸侧链的肽。例如，偶合的侧链对可以包含一个氨基酸(例如肽的二肽部分的氨基酸)的反应性侧链和另一个氨基酸的反应性侧链之间形成的共价键。反应性氨基酸的氨基酸侧链可以包括酸性、碱性或含硫基团。具有代表性的环肽包括在酸性氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)的侧链和碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、色氨酸或组氨酸)的侧链之间形成的酰胺键。
环肽类也可以通过二硫键的形成而制备。二硫键通过肽中的两个适当的半胱氨酸残基的氧化偶合而形成。
通过本发明方法的实施使得相关氨基酸位于第三个肽中，从而当需要时可以诱导其侧链经历分子内酰胺键形成或二硫键形成反应。在某些情况下，该键在彼此相距约6个氨基酸的范围内的两个氨基酸之间形成。在某些情况下，该键在肽的N-末端和C-末端氨基酸之间形成。
一般而言，本发明方法可以用于任何需要长度的环肽的制备过程。例如，第三个肽可以通过二肽与具有2个或多个氨基酸的第二个肽的偶合而形成，例如具有2-10个氨基酸的肽。第二个肽可以为三肽或四肽。在一个实施方案中，该二肽与四肽偶合形成六肽。
第三个肽可以合成为全长肽(是指其中没有其它氨基酸或肽片段与该肽偶合的肽)，或者可以合成为中间体肽。中间体肽可以与其它氨基酸或肽中间体片段通过一或多个偶合步骤制备长度更长的肽。例如，当形成并且环化时，第三个肽可以是中间体化合物，其中它与其他化学部分偶合。这些其它化学部分可以是其它肽类或类型的聚合物。例如，第三个聚合物可以与亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)偶合。
氨基酸(肽可以获自该氨基酸)可以是天然存在的氨基酸残基、非天然氨基酸残基或其组合。20个常见天然存在的氨基酸残基如下：A(Ala，丙氨酸)；R(Arg，精氨酸)；N(Asn，天冬酰胺)；D(Asp，天冬氨酸)；C(Cys，半胱氨酸)Q(Gln，谷氨酰胺)；E(Glu，谷氨酸)；G(Gly，甘氨酸)；H(His，组氨酸)；I(Ile，异亮氨酸)；L(Leu，亮氨酸)；K(Lys，赖氨酸)；M(Met，蛋氨酸)；F(Phe，苯丙氨酸)；P(Pro，脯氨酸)；S(Ser，丝氨酸)；T(Thr，苏氨酸)；W(Trp，色氨酸)；Y(Tyr，酪氨酸)；和V(Val，缬氨酸)。也包括天然存在的稀少氨基酸，包括例如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。
在某些方面，在环肽中包括非天然氨基酸。非天然氨基酸包括与天然存在的氨基酸具有相似结构和反应性的有机化合物，例如D-氨基酸、β-氨基酸、ω-氨基酸(例如3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸、4-氨基丁酸等)、γ-氨基酸、环氨基酸类似物、炔丙基甘氨酸衍生物、2-氨基-4-氰基丁酸衍生物、α-氨基酸的Weinreb酰胺和氨基醇类。在本发明的一个方面，如本文中所述，美国专利号6,600,015中所述的非天然氨基酸可以用于合成含有精氨酸的肽的本发明方法中。
一或多个其它单体、寡聚和/或多聚成分的残基任选可以结合到环肽中。非-肽键也可以存在。这些非肽键可以在氨基酸残基之间、在氨基酸和非-氨基酸残基之间或两分非-氨基酸残基之间。这些可选择的非肽键可以通过本领域技术人员熟知的反应形成，可以包括但不限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲、偶氮键等。
本发明也包括制备环肽类化合物的方法，除了氨基酸残基外，该环肽类已经经过化学改变含有一或多个化学基团，有时是指修饰的肽类。此类化学基团可以位于该肽类的氨基末端、羧基末端和/或沿该肽链长方向的一或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，该肽可以包括存在于其氨基和/或羧基末端的其它化学基团，从而，例如，提高该肽的稳定性、反应性和/或溶解度。使用此类修饰的技术在本领域中是已知的。
第二个肽的固相合成方法通常包括侧链保护的氨基酸与树脂结合的初生态的肽链偶合。
根据本发明，二肽和第二个肽在固相树脂上合成。在某些实施方案中，二肽和第二个肽采用标准FMOC方法合成。参见，例如，Carpin等(1970)，J.Am.Chem.Soc.92(19)：5748-5749；Carpin等(1972)，J.Org.Chem.37(22)：3404-3409，“Fmoc固相肽合成(Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis”，Weng C.Chan和Peter D.White Eds.(2000)Oxford UniversityPress Oxford Eng(牛津大学出版社，英国，牛津)。
可以采用适用于实施固相肽合成的任何类型的载体。在优选的实施方案中，载体包括由一或多个聚合物、共聚物或聚合物组合制成的树脂，所述聚合物例如聚酰胺、聚磺酰胺、取代的聚乙烯、聚乙二醇、酚醛树脂、多糖或聚苯乙烯。聚合物载体也可以是任何具有足够不溶性的固体，它们对肽合成中使用的溶剂是惰性的。固体载体通常包括连接基团，生长肽在合成过程中与其偶合，所述连接基团可以在需要的条件下裂解自载体上释放肽。适当的固体载体可以具有下列可裂解的连接基团：可光解的、可TFA裂解的、可HF裂解的、可氟离子裂解的、可还原裂解的、可Pd(O)裂解的、可亲核性裂解的或可极性裂解的。优选的连接基团可以在能够使得裂解的肽仍然基本上被整体保护的条件下裂解。
在一个优选的合成方法中，二肽在酸敏感性固体载体上合成，该载体包含三苯甲基，更优选在包含具有侧链氯基团的三苯甲基的树脂上合成，例如2-氯代三苯甲基氯(2-CTC)树脂(Barlos等(1989)Tetrahedron Letters30(30)：3943-3946)。实例也包括三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂、4-氨基丁-1-醇2-氯代三苯甲基树脂、4-氨基甲基苯甲酰基2-氯代三苯甲基树脂、3-氨基丙-1-醇2-氯代三苯甲基树脂、溴代乙酸2-氯代三苯甲基树脂、氰基乙酸2-氯代三苯甲基树脂、4-氰基苯甲酸2-氯代三苯甲基树脂、glicinol 2-氯代三苯甲基树脂、丙酸2-氯代三苯甲基树脂、乙二醇2-氯代三苯甲基树脂、N-Fmoc羟基胺2-氯代三苯甲基树脂、肼2-氯代三苯甲基树脂。某些优选的固体载体包括聚苯乙烯，它可以与二乙烯基苯共聚合，形成可以锚定反应性基团的载体物质。
肽物质通常可以在珠的表面和珠的内部与树脂珠连接。FMOC和侧链保护的肽很容易在被保护的状态下采用弱酸性试剂自树脂上裂解，例如稀TFA的DCM或乙酸溶液。
在某些实施方案中，第二个肽可以在树脂上合成，它可以在树脂裂解后使得C-末端酰胺基团形成。在一个优选的实施方案中，第二个肽在FmocRink Amide MBHA树脂上合成。此类树脂可以用于采用Fmoc化学的肽酰胺的合成，它被用于固定羧酸，该羧酸随后以酰胺裂解。
为了进一步讨论本发明，除非另外说明，在下列讨论范围内的术语“树脂”通常是指含有偶合的初生态的肽的树枝。因此，通常实施使得树脂与试剂接触的步骤从而影响初生态的肽。
对于固相合成而言，适当的反应容器可以根据合成环肽所需要的量而选择。肽的批量合成可以在反应容器中进行，该容器的特征包括滤器、搅拌器、温度计、加热和/或冷却配件、试剂入口和产物出口以及导管、惰性气体入口/起泡装置。
反应容器可以在加入树脂前进行预处理，从而防止树脂非特异性地附着于容器的内壁上。例如，硅烷化试剂(例如二氯代二甲基硅烷)可以与溶剂一起加至容器中，例如与树脂相容的溶剂，该溶剂可以在固相合成过程中使用，例如二氯甲烷(DCM)。预处理后，容器可以洗涤以除去残留的硅烷化试剂。
为了提供携有第一个偶合的氨基酸的载体，可以制备树脂，例如，洗涤，然后与含有活化的、被保护的氨基酸的溶液一起温育。第一个氨基酸和随后的与树脂偶合的氨基酸通常包含N-末端保护基团、侧链保护基团(取决于特定的氨基酸)和能够与树脂的侧链基团反应的基团，或者能够与侧链氨基酸反应的基团。
在优选的方面，第一个氨基酸在羧基末端与载体连接，而N-末端和侧链基团通过保护基团进行适当的保护。作为实例，FRWK(SEQ ID NO：1)第二个肽(四肽)的固相合成通过首先在Knorr(Fmoc Rink Amide MBHA)树脂上加载一个被保护的赖氨酸残基自羧基-末端向氨基-末端方向进行。
保护基团的性质和使用在本领域中是熟知的。通常，适当的保护基团是能够有助于防止与之相连的原子或部分(例如，氧或氮)在处理和合成过程中参与不需要的反应的任何类型的基团。保护基团包括侧链保护基团和氨基-或N-末端保护基团。保护基团也可以防止羧酸、硫醇等的反应或结合。
氨基-末端保护基团包括与氨基酸的α-氨基偶合的化学部分。通常，氨基-末端的保护基团可以在去保护反应中除去，然后将下一个氨基酸加至生长的肽链中，但是当肽自载体上裂解时可以保持该保护基团。氨基末端保护基团的选择可以取决于各种因素，例如，进行的合成的类型以及需要的中间体产物或终产物。如本发明实施方案中所述，Fmoc氨基-末端保护基团用于二肽和第二个肽的合成。
侧链保护基团是指与氨基酸的侧链偶合的化学基团(即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基团)，它有助于防止侧链部分与肽合成、处理等步骤中使用的化学试剂反应。侧链保护基团的选择可以取决于各种因素，进行的合成反应的类型、肽所经历的处理过程、需要的中间体产物或终产物。侧链保护基团的性质也取决于其氨基酸的性质。通常，选择在固相合成反应中α-氨基去保护过程中不除去的侧链保护基团。因此，α-氨基保护基团和侧链保护基团通常是不同的。
在某些情况下，根据固相合成和其它肽处理过程中使用的试剂类型，氨基酸可能不需要侧链保护基团的存在。这通常是当侧链在标准合成条件下为非反应性时的情况。此类氨基酸通常在侧链中不包含反应性氧、氮或硫。在侧链中不包含反应性氧、氮或硫的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。
侧链保护基团的实例包括乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、叔-丁基、三苯基甲基(三苯甲基)、四氢吡喃基、苄基醚(Bzl)和2，6-二氯代苄基(DCB)、叔-丁氧基羰基(BOC)、硝基、对甲苯磺酰基(Tos)、金刚烷基氧基羰基、呫吨基(Xan)、苄基、2，6-二氯代苄基、甲基、乙基和叔丁基酯、苄基氧基羰基(Z)、2-氯代苄基氧基羰基(2-CI-Z)、Tos、叔戊基氧基羰基(Aoc)和芳族或脂肪族氨基甲酸乙酯类保护基团，还包括光不稳定性基团例如硝基藜芦基(veritryl)氧基羰基(NVOC)和氟化物不稳定性基团例如三甲基甲硅烷基氧基羰基(TEOC)。
优选的侧链保护基团包括：对于Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)氨基酸残基，为t-Bu基团；对于His(H)、Gln(Q)和Asn(N)氨基酸残基，为trt基团；对于Lys(K)和Trp(W)氨基酸残基，为Boc基团。肽的氨基酸残基的任何一或多个侧链可以采用标准保护基团保护，例如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁基氧基羰基(Boc)。
在本发明的另一方面，合成第二个肽的方法包括侧链保护的氨基酸偶合的一或多个步骤，该氨基酸携有酸不稳定性的α-氨基保护基团。在这些方面，该侧链保护基团在用于除去酸不稳定性α-氨基保护基团的条件下不被除去。例如，侧链保护基团应当与α-氨基保护的Boc氨基酸在化学上相容。
根据本发明，侧链保护基团在固相合成过程以及二肽与第二个肽的固相偶合过程中通常保留在二肽和第二个肽上。(通常，固相偶合步骤完成后，进行去保护步骤自肽上除去一或多个保护基团并自树脂上裂解肽。)
为了制备用于固相合成的树脂，可以将树脂在溶剂中预洗涤。例如，将固相树脂(如Knorr树脂)加至肽室(peptide chamber)中，采用适当的溶剂预洗涤。可以进行洗涤以制备用于与树脂偶合的第一个氨基酸接触的树脂。其中，可以进行预洗涤以提高第一个氨基酸与树脂的偶合效率。预洗涤溶剂可以根据偶合反应中使用的溶剂(或溶剂混合物)的类型选择，反之亦然。
对于包含N-末端保护基团(在随后的偶合氨基酸步骤之前除去)的树脂而言，洗涤可以在能够将保护基团自树脂上裂解的化合物存在下进行。例如，Fmoc-保护的Knorr树脂可以采用哌啶/DMF混合物去保护。
适用于洗涤以及随后的偶合反应的溶剂包括二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷等以及这些试剂的混合物。其它可用的溶剂包括DMSO、吡啶、氯仿、二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮及其混合物。在某些情况下，偶合可以在双相溶剂系统中进行，例如DMF和DCM的混合物。
在某些实施方案中，第二个肽通过将保护的氨基酸加载到树脂上或加载到初生态的肽链上而制备，加载的量为每摩尔树脂约1.5当量的氨基酸。
偶合反应可以在一或多个化合物存在下进行，所述化合物能够增强或改善偶合反应。能够提高反应速率并降低副反应速率的化合物包括膦和脲盐，它们可以在叔碱(例如，二异丙基乙基胺(DIEA)和三乙胺(TEA))的存在下将保护的氨基酸转化为活化的种类(例如，BOP、PyBOPO、HBTU和TBTU都可以制备为HOBt酯)。其它试剂通过提供保护性试剂有助于防止外消旋化。这些试剂包括添加辅助亲核试剂的碳二亚胺(例如，DCC或WSCDI)，所述亲核试剂例如1-羟基-苯并三唑(HOBt)、1-羟基-氮杂苯并三唑(HOAt)或HOSu。
偶合的完成可以通过定性茚三酮实验监测。当确定偶合反应完成后，偶合反应混合物采用溶剂洗涤，肽物质的每一个随后的氨基酸残基重复进行偶合循环。最后的偶合循环后，将该树脂采用溶剂(例如DMF)洗涤。
为了偶合下一个氨基酸，N-末端保护基团(例如，Fmoc基团)的除去通常采用试剂处理完成，该试剂包括20-50％(体积比)哌啶的溶剂(例如二甲基甲酰胺(DMF))溶液。除去Fmoc保护基团后，通常进行数次洗涤以除去残留的哌啶和Fmoc副产物(例如二苯并富烯及其哌啶加合物)。
第一个氨基酸与树脂以需要的加载系数偶合并且除去N-末端保护基团后，可以加入随后的氨基酸以制备肽中间体片段。可以根据加载系数(loading factor)以化学计量过剩的氨基酸使用随后的氨基酸。优选在偶合步骤中使用的氨基酸的量为1.3当量(过量0.3)或更多，最优选约1.5当量(过量0.5)。该过量也有助于该反应耐受去保护试剂中的过量的碱。
可以重复偶合、洗涤、N-末端基团去保护和洗涤步骤直到形成需要的第二个肽，例如FRWK(SEQ ID NO：1)。固相合成后，将第二个肽保留在树脂上从而使得它能够在固相反应中与二肽偶合。
本发明的二肽包括具有侧链的氨基酸残基，该侧链随后(第三个肽形成后)与第二个肽的氨基酸残基的侧链偶合。
在本发明的某些方面，该二肽含有非天然氨基酸。具有代表性的二肽包括天冬氨酸残基和美国专利号6,600,015中所述的非天然氨基酸。可以将二肽与FRWK第二个肽结合的树脂偶合从而提供MC-4受体肽，然后可以将其环化。
优选在二肽中：
X为：
Figure A20078004947400171
R3为烷氧基，R2和R4均为氢。如果R3为OCH3，则非天然氨基酸为1-氨基-4-(4-甲氧基苯基)环己烷-1-甲酸(4MeOAPC)。
在某些方面，R1为具有4-8个碳原子的支链烷基，例如叔丁基。
在某些方面，R12为烷基，例如C4烷基。
在一个特殊的方面，二肽含有戊酰基-Asp-(OtBu)-4MeO-APC-OH。
在一个典型的实施方案中，二肽通过固相合成方法合成。该合成包括使得氨基-保护的非天然氨基酸(例如Fmoc-4-MeO-Apc-OH)与适用于Fmoc合成的树脂(例如2-CTC树脂)进行偶合。先进行标准偶合反应和树脂洗涤，然后采用哌啶处理以除去Fmoc基团。然后，使得氨基-和侧链保护的氨基酸(例如Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH)与非天然氨基酸偶合。再一次进行标准偶合反应和树脂洗涤，然后采用哌啶处理以除去Fmoc基团。
除去Fmoc后，N-末端采用链烷酰基保护。例如，N-末端采用脂肪酸酐处理。适当的脂肪酸酐为戊酸酐，它为N-末端提供了戊酰基。
为了自树脂上除去二肽，裂解处理以使裂解的二肽仍然携有侧链保护基团的方式进行。仍然保留保护基团有助于防止不需要的偶合或裂解后二肽的其它不需要的反应。在采用FMOC或相似的化学成分合成肽的情况下，保护的裂解可以通过任何需要的模式进行，例如通过使用相对弱的酸性试剂(例如乙酸或稀TFA)在溶剂(例如DCM)中进行，它也可以使得树脂膨胀，用于裂解和分离过程。优选0.5-10重量百分比(优选1-3重量百分比)的TFA的DCM溶液。二肽自树脂上裂解后，可以将化合物加至裂解的二肽组合物中，加入的量应当足以淬灭裂解反应。例如，在一个实施方案中，将吡啶(淬灭化合物)加至组合物中，加入的量约为前面裂解反应中加入的TFA的量的两倍。然后二肽产物可以在溶剂中浓缩并用水性液体萃取。
为了提供第三个肽，将二肽与第二个肽偶合，该第二个肽是树脂结合的。在典型的方法中，将二肽戊酰基-Asp-(OtBu)-4MeO-APC-OH与第二个肽：(D)Phe-Arg-Trp-Lys-树脂的羧基末端偶合，其中第二个肽的氨基酸的侧链是被保护的(但Phe除外)。一个典型的偶合方法采用溶剂(例如DMF和DCM)中的HOBT、HBTU和DIEA。偶合进行的时间应当足以产生阴性茚三酮反应(例如过夜)。
然后，采用浓TFA溶液将树脂偶合的第三个肽(即二肽与树脂-结合的第二个肽偶合)自树脂上裂解。
自固相树脂上裂解第三个肽的步骤可以根据下面典型方法的线路进行。然而，可以采用能够自树脂上有效裂解第三个肽的任何适当的方法。例如，将含有酸性裂解试剂的约5-20(优选约10)体积的溶剂加至容器中。随后将树脂珠浸入获得的试剂中。当将液体内容物于适当的温度下搅拌适当的时间时，裂解反应就发生了。搅拌有助于防止珠的聚集。适当的时间和温度条件取决于各种因素，例如使用的酸性试剂、肽的性质、树脂的性质等。
在一个实施方案中，于约15℃-约30℃，优选于约20℃-约25℃，搅拌约2-3小时，将第三个肽自树脂上裂解。
采用浓酸性溶液的裂解也能够导致氨基酸侧链保护基团的失去。
裂解后，肽沉淀出来。在某些实施方案中，将液体例如甲基-叔-丁基醚(MTBE)加至裂解的肽中使其沉淀。
沉淀后，沉淀的肽可以使用沉淀用液体和稀碱的组合物洗涤。在一个实施方案中，沉淀的肽采用2％DIEA的MTBE混合物洗涤。通过尽可能减少或消除赖氨酸侧链上TFA酰胺的形成，碱洗涤有助于随后的环化过程。
然后可以将沉淀的肽固体干燥。
然后将沉淀的肽溶于适当的溶剂并使其经过环化反应。如果环化过程涉及酸性氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)侧链和碱性氨基酸(例如赖氨酸、谷氨酰胺或组胺)侧链之间酰胺键形成，则它可以采用偶合方法中常规试剂进行，例如HBTU  和DIEA。对于肽戊酰基-Asp-(4-MeO-Apc)-D-Phe-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO.：2)而言，环化导致天冬氨酸和赖氨酸侧链的共价偶合，从而提供了环(Asp-Lys)戊酰基-Asp-(4-MeO-Apc)-D-Phe-Arg-Lys-NH2。
在一个优选的实施方案中，环化采用浓肽溶液进行。例如，环化反应在浓度约15g/L至约25g/L(肽/溶剂)的范围内进行。在一个实施方案中，环化反应可以于约20℃至约25℃进行约1小时。环化后，反应可以用水淬灭。
环化后，该肽可以经色谱纯化。该肽也可以经历一或多个盐交换。例如，肽TFA盐可以经盐交换获得肽-乙酸盐和肽-乳酸盐。这可以通过将该肽上样到柱上完成，然后用需要的乙酸盐(例如，乙酸铵)冲洗柱以洗脱该肽。乳酸盐可以通过将乳酸溶液与肽-乙酸盐混合形成，然后将混合物冷冻干燥。
根据本发明方法制备的化合物可以用于提供在体外具有选择性的MC-4受体激动活性。已知的是，MC4-R活性的激动剂能够引起人类肥胖小鼠模型食物摄入的减少。因此，给于这些化合物能够激动MC4-R活性，它在体重调节中是很重要的。含有本发明化合物的药用组合物可以以有效浓度制备为制剂，通过各种方法给于患有体重异常增加的人类或动物患者，可以单独给于或者作为不利医学病症或疾病(例如II型糖尿病)的部分治疗给药。可以采用多种给药技术。活性化合物的平均量可以更改，并特别取决于有资质的医师或兽医师的建议和处方。
使用下列缩写和定义：ACN(乙腈)，Arg(精氨酸/精氨酰基)，Asp(天冬氨酸/天冬氨酰基)，Boc(叔丁基氧基羰基)，2-CTC(2-氯代三苯甲基氯)，DCM(二氯甲烷)，DI(去离子化的)，DIEA(二异丙基乙基胺)，DMF(二甲基甲酰胺)，DTT(二硫苏糖醇)，Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)，HBTU(O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N’-四甲基六氟磷酸脲)，HOBt(1-羟基苯并三唑)，HPLC(高效液相色谱)，Lys(赖氨酸/赖氨酰基)，MTBE(甲基-叔-丁基醚)，NH4OAc(乙酸铵)，OMe(甲氧基)，Phe(苯基丙氨酸/苯基丙氨酰基)，Pbf(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)，Tfa(三氟乙酸)，Trp(色氨酸/色氨酰基)。
实施例1
Fmoc-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂的制备
Figure A20078004947400201
Knorr树脂去保护
向6-L SPPS中加入305.38g Knorr树脂和3.6LDMF。以100RPM搅拌30分钟，然后除去DMF。再加入3.0LDMF。将温度调节至25℃。清空反应器，采用2×3.6L 20％哌啶/DMF去保护60分钟。采用4×3.6L DMF洗涤树脂。
偶合Fmoc-Lys(Boc)-OH
192.8g Fmoc-L-赖氨酸(Boc)-OH
63.44g HOBT水合物
68.0g DIEA
1.7L DMF。
将溶液冷却至5℃，与157.0gHBTU在1L DMF中混合，冷却至5℃15分钟。将活化的酯溶液加至SPPS中，采用0.6L DCM洗涤。将偶合反应持续进行3h。(反应器体积＝4.7L)。在2和3小时时取样监测反应完成(Kaiser)。两个样本均为茚三酮无色反应。清空反应器，用4×3.6L DMF洗涤。清空反应器，采用2×3.6L 20％哌啶/DMF分别去保护30分钟。采用4×3.6L DMF洗涤树脂。
偶合Fmoc-Trp(Boc)-OH
125.32g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH
63.44g HOBT水合物
68.0g DIEA
1.7L DMF。
将溶液冷却至5℃，与157.0g HBTU在1L DMF中混合，冷却至5℃15分钟。将活化的酯溶液加至SPPS中，采用0.6L DCM洗涤。偶合反应持续进行9h。(反应器体积＝5L)。在3小时时取样监测反应完成(Kaiser)。样本为茚三酮无色反应。清空反应器，用4×3.6L DMF洗涤。清空反应器，采用2×3.6L 20％哌啶/DMF去保护30分钟。采用4×3.6L DMF洗涤树脂。
偶合Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH
267.5g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH
63.44g HOBT水合物
68.0g DIEA
1.7L DMF。
将溶液冷却至5℃，与157.0g HBTU在1L DMF中混合，冷却至5℃15分钟。将活化的酯溶液加至SPPS中，采用0.6L DCM洗涤。偶合反应持续进行3h。(反应器体积＝5L)。在3小时时取样监测反应完成(Kaiser)。样本为茚三酮无色反应。清空反应器，用4×3.6LDMF洗涤。清空反应器，采用2×3.6L 20％哌啶/DMF去保护30分钟。采用4×3.6L DMF洗涤树脂。
偶合Fmoc-D-Phe-OH
159.7g Fmoc-D-Phe-OH
63.44g HOBT水合物
68.0g DIEA
1.7L DMF。
将溶液冷却至5℃，与157.0g HBTU在1L DMF中混合，冷却至5℃15分钟。将活化的酯溶液加至SPPS中，采用0.6L DCM洗涤。偶合反应持续进行3h。(反应器体积＝5L)。在3小时时取样监测反应完成(Kaiser)。样本为茚三酮无色反应。清空反应器，用4×3.6L DMF洗涤。清空反应器，采用4×2L甲醇洗涤。上样的树脂在氮气流下干燥。取得0.37g样品。
重量＝493.81g(Lot 503-024)
实施例2
戊酰基-Asp-(OtBu)-4-MeO-Apc-OH的制备
Figure A20078004947400221
Fmoc-4-MeO-Apc-OH上样
向6-LSPPS中加入300.07g 2-CTC-树脂和3L DCM。搅拌30分钟。制备84.87g Fmoc-4-MeO-Apc-OH的2.1L DMF和0.3L DCM的溶液。将溶液搅拌30分钟，加入69.83g DIEA。然后加入溶液以膨胀树脂。继续搅拌20h。移出树脂，与3L DMF一起搅拌5分钟。通过加入0.3L DIEA的0.27L甲醇溶液并搅拌1小时完成末端封端。移出树脂，用3L DMF洗涤，随后再加入1.5L DMF。然后将树脂用5×3L DCM洗涤(第5次洗涤为UV阴性)。然后将树脂用3×3L DMF洗涤。移出树脂，用2×2.3L 20％哌啶/DMF去保护30分钟。用5×2.3L DMF洗涤树脂。将样品裂解，上样测定
上样＝0.45mmol/g
获得重量352.5g。
偶合Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH
129.2g Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH
48.2g HOBT水合物
50.8g DIEA
1.33L DMF。
将溶液冷却至5℃，与119.2g HBTU在0.67L DMF中混合，冷却至5℃15分钟。将活化的酯溶液加至采用0.6L DCM洗涤的SPPS中。偶合反应持续进行过夜。样本为茚三酮无色反应。清空反应器，用4×2.3L DMF洗涤。清空反应器，用2×2.3L 20％哌啶/DMF去保护30分钟。用5×2.3LDMF洗涤树脂。
用戊酸酐保护。
将146.3g戊酸酐、0.274L DIEA的1.5L DMF溶液加至SPPS中。将溶液用1.2L DMF洗涤，将反应物搅拌30分钟，取样进行HPLC监测反应。反应完成。清空反应器，用4×2.3L DMF洗涤。用3×2.3L DCM洗涤树脂。
裂解
向SPPS中加入3L DCM，冷却至0℃。冷却后清空反应器。加入30mL三氟乙酸的3L DCM(1％)溶液，于0-5℃搅拌30分钟。加入60mL吡啶并搅拌5分钟。清空反应器，于20-25℃用4×2.3L DCM洗涤。将裂解溶液于0-5℃储存过夜。于浴温30℃和真空度250Torr条件下在旋转蒸发仪中通过蒸馏将DCM浓缩至体积为～1L，同时加入150mL DI水。将DCM/水转移至分液漏斗，移出水层。有机层用3×100mL DI水洗涤。将有机层与100mL DI水合并，于浴温30℃在旋转蒸发仪中通过蒸馏除去DCM。真空度增加至100Torr直到没有DCM存在。将烧瓶的内容物固化。向烧瓶中加入400mL DCM以溶解固体。转移至分液漏斗中，除去水层。蒸馏DCM，同时于浴温30℃加入325mL DI水汽提(stripping)直到于100Torr下DCM不再存在。过滤收集固体，用100mL DI水洗涤，随后再加入50mLDI水。将产物在真空下于20-25℃干燥。
重量＝50.5g
收率＝55.6％(自Fmoc-4-MeO-Apc-OH)
＝63.5％(基于上样量)
纯度＝96.15％(ANHPLC)
实施例3
戊酰基-Asp(OtBu)-4-MeO-Apc-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂的制备
Figure A20078004947400241
Fmoc-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂的去保护
向6-LSPPS中加入452.8g Fmoc-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)- 树脂。用3L DCM膨胀树脂。清空反应器，用4×3L DMF洗涤。移出树脂，用2×3L 20％哌啶/DMF去保护30分钟。用3×3L DMF洗涤树脂并移出。
采用戊酰基-Asp(OtBu)-4-MeO-Apc-OH偶合
159.0g戊酰基-Asp(OtBu)-4-MeO-Apc-OH
48.14g HOBT水合物
45.66g DIEA
1.5L DMF。
将溶液冷却至5℃，与119.52g HBTU在1LDMF中混合，冷却至5℃15分钟。将活化的酯溶液加至SPPS中，用0.6LDCM洗涤。将偶合反应持续进行过夜。(反应物体积～5L)。取样监测反应完成(Kaiser)。样品茚三酮无色。清空反应器，用3×3L DMF洗涤。清空反应器，用73×3L DCM洗涤。将树脂转移至2-L烧结玻璃滤器，用氮气向下吹过。(注意：由于在6-LSPPS中存在不锈钢筛网，所以将树脂转移至2-LSPPS进行裂解)
重量＝499.81g
实施例4
戊酰基-Asp(OtBu)-4-MeO-Apc-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)
Figure A20078004947400251
Figure A20078004947400261
向2-LSPPS中加入150.08g戊酰基 -Asp(OtBu)-4-MeO-Apc-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂和1L DCM中以膨胀树脂。自75.02g DTT、75mL DI水、1.46L TFA制备裂解溶液。移出树脂，向反应器中加入裂解溶液。将反应器于20-25℃搅拌2小时20分钟。向5加仑烧瓶中加入12L MTBE并冷却至0-5℃。将裂解溶液移入5加仑保护的大玻璃瓶中形成沉淀。向反应器中加入500mLTFA并搅拌5分钟，随后加入500mL MTBE。搅拌2分钟，将溶液移入保护的大玻璃瓶中。将保护的大玻璃瓶中的内容物充分搅拌，然后转移至250mL FLPE瓶(8个瓶子，每个瓶子～230mL)中。将瓶子以2600RPM离心1分钟。移出上清液，再充入瓶中。该过程持续直到所有的混悬液被处理。向每一个瓶中充入MTBE(共～1.8L)，封口并震摇至悬浮的固体产生，然后离心。制备35mL DIEA的1.46L MTBE溶液。将约175mLDIEA/MTBE溶液加至8个瓶中的每一个。将瓶封口并震摇，在冰箱中于5℃储存过夜。将瓶自冰箱中取出，以2500RPM离心，移出上清液。将220mL 2％DIEA的MTBE溶液加至每一个瓶中。将瓶封口、震摇并离心。移出上清液，将220mL MTBE加至每一个瓶中、震摇并移出。将该操作采用220mL MTBE重复三次。将获得的湿的固体在200Torr真空下干燥过夜。注意：真空应当逐渐增加，否则肽会暴沸损失。
粗品干燥的线性六肽的重量＝47.05g
实施例5
环(Asp-Lys)戊酰基-Asp-(4-MeOApc)-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2
Figure A20078004947400271
装备：2-L夹层容器，涡轮搅拌器，氮和真空入口，热电偶，计量泵流程
向2-L容器中加入49.46g HBTU和1.5L DMF。于20-25℃搅拌直到溶解。制备50.0g戊酰基-Asp-(4-MeOApc)-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2的1.5L DMF溶液，它含有50mL DIEA。将搅拌调节至139RPM，于20-25℃以25mL/分钟的速率计量加入线性六肽溶液。～1h后，反应物取样用于分析。发现反应完成，然后加入100mL DI水以淬灭反应。将溶液一式两份转移至2-L圆底烧瓶中，于30℃、真空压力＜9Torr的条件下在旋转蒸发仪上蒸馏溶剂。
粗品产物的重量＝154.11g
分析＝10％w/w(含肽15.4g)
实施例6
色谱纯化：环(Asp-Lys)戊酰基-Asp-(4-MeO-Apc)-D-Phe-Arg-Lys-NH21∶1三氟乙酸盐
Figure A20078004947400272
Figure A20078004947400281
对三批产品环MC-4六肽进行色谱纯化，用于毒理学研究。在PursuitC18 10micron，50×250mm柱上于低pH进行纯化。总收率为85％，总纯度为94％。三批的起始粗品纯度为10wt％或更低。低粗品纯度降低了上样量，造成了显著的注射溶液过滤问题。总共进行35次注射。在35次注射中，28次为粗品注射，7次为再循环注射。经过色谱纯化，自39.7g含有粗品的环MC-4中获得33.7g纯化的环MC-4。本纯化的收集针对的是中间的90％，用于毒理学分析。根据本纯化中组分分析，将纯度提高至90％以上可能降低预计收率至50-60％。
制备性色谱：
注射溶液：环MC-4粗品在不含固体的1.5mg/mL(含有MC-4)注射溶液中的制备由于分离的粗品的低分析(low assay)和高盐含量而变得复杂。(表1)实验了多个不同过滤配置，采用降低孔径大小的三层玻璃纤维滤器能够获得最好的过滤效果。采用125mm直径滤器的该滤器配置能够成功地过滤500mL的注射溶液。这要求将每一份1000mL注射溶液分为两次单独过滤，然后合并滤液用于注射。
缓冲液制备：在20L保护的大玻璃瓶中制备预备性缓冲液，用于流动相A和流动相B。两种流动相均为0.1％TFA溶液，pH约为2。两种流动相溶液均用于环MC-4的纯化。所有的百分比均为体积百分比。
流动相A为含有0.1％TFA的90/10H2O/ACN
流动相B为含有0.1％TFA的10/90H2O/ACN
色谱条件：环MC-4在预填充的Varian Pursuit C18柱(10micron，50×250mm)上纯化。采用Agilent 1100制备性HPLC，装配有用于注射溶液上样的大口径溶剂开关阀和13个用于流份收集的定位阀。每一次注射可以根据粗品分析的要求在含有环MC-4的1.0g-1.5g粗品之间变动。自每次注射收集5个或更多个流分，根据HPLC流分分析合并流分。每次注射的循环时间约为2小时。发现下列洗脱条件最适合获得最好的纯化结果：
柱：Pursuit C18，10μm，50×250mm
检测器：280nm(8nm波长宽度，350/20nm ref)
柱温：室温
流速：80ml/min
流动相：A＝含有0.1％TFA的90/10H2O/ACN
B＝含有0.1％TFA的10/90H2O/ACN
上样：手动调整泵A开关阀设定60mL/min的速度
梯度洗脱：起始条件为25％B
0-45min线性梯度至57％B
45.0-45.1min逐步至70％B
45.1-55.0min持续70％B(洗柱)
55.0-52.0线性梯度洗脱至25％B
52.0-72.025％B(柱再平衡)
循环注射：用等体积的水稀释收集的流分，再注射到柱上，再循环注射较前收集的组分(front cuts)和较后收集的组分(back cuts)。该循环采用同样的梯度洗脱条件。
粗品注射溶液的制备：自三次实验室操作分离的粗品用于制备注射溶液。该粗品纯度的范围为含有8％-10％的纯品。所有的粗品批次均为深色的，含有不溶性固体。在注射溶液中的环MC-4的需要的最终过滤的浓度为1.5mg/mL(含有)。根据粗品的w/w分析，最终的实际浓度约为15mg/mL分离的粗品。
表1
  分析(％w/w)   纯度(％AN)
  8.0   30.70
  10.0   46.30
  10.5   45.30
下列方法用于制备1072mL过滤用注射溶液：根据w/w分析，将1.5g含有环MC-4的样品溶于160mL DMF中。缓慢搅拌下将溶解的溶液加入160mL含有0.1％TFA的ACN。在持续搅拌下加入含有0.1％TFA的752mL水。然后将该粗品溶液通过孔径大小减小的3层玻璃纤维滤器过滤(Whatman)。
上层GF/D2.7μm孔(1823125)
中层GF/C1.2μm孔(1822125)
底层GF/F 0.7μm孔(1825125)
采用125mm直径滤器的该滤器配置用于真空过滤500mL的注射溶液。这要求将每一份1000mL注射溶液分为两次单独过滤，然后合并滤液用于注射。最终的滤液于室温下并且在注射前一刻完成。滤液冷却并且于室温下静置较长时间可能导致溶液变得浑浊。该方法可以根据需要按比例放大或缩小。
根据表2的时间表，通过流分收集器自柱洗脱液收集流分。这些时间可以根据需要调节。
表2
Figure A20078004947400301
Figure A20078004947400311
实施例7
盐交换：环(Asp-Lys)戊酰基-Asp-(4-MeO-Apc)-D-Phe-Arg-Lys-NH2 1∶1乙酸盐
Figure A20078004947400312
将环MC-4TFA盐收集物(pool)转化为冻干的乙酸盐
设备：
5.0×25cm Vydak C4，1-μm，
Figure A20078004947400313
预填充柱
双泵制备系统，配备可调节波长的检测器(相当于Varian Prostar系统，配备Model 210上样泵、Model 215洗脱泵和Model 320检测器)。
流动相：
A：10％乙腈/去离子H2O，20mM NH4OAc
B：70％乙腈/去离子H2O，20mM NH4OAc
收集物制备：
合并的纯化收集物流分采用去离子H2O按1∶1稀释(至～25％乙腈)。
收集物上样：
以25mL/min的速度将约10g环MC-4(～8L，以～1.25g/L的浓度)上样至柱。这需要～5h。
洗脱：
采用～5N的NH4Oac冲洗柱，洗脱产物。
流速50mL/min，于280nm检测。
  时间(min)   ％A   ％B   注释
  0   100   0
  49   100   0
  50   0   100   产物洗脱
  80   0   100
  81   100   0
  100   100   0
收集产物峰10分钟，总体积500mL，分装于4个净重的500mL广口瓶中。收集4个瓶中的固体产物。
重量＝10.49g
实施例8
盐交换：环(Asp-Lys)戊酰基-Asp-(4-MeO-Apc)-D-Ph e-Arg-Lys-NH21∶1乳酸盐
Figure A20078004947400321
乳酸，外消旋物，U.S.P.Spectrum chemical Mfg.Corp.目录号L1010，CAS50-21-5，分析88.0-92.0％
制备0.1N乳酸溶液
将5.0g环(Asp-Lys)戊酰基-Asp-(4-MeO-Apc)-D-Phe-Arg-Lys-NH21∶1乙酸盐溶于最小体积的1/1乙腈/H2O中；向40-50mL(ACN/H2O)中加入45.154mL的0.1N乳酸溶液。将该溶液进一步稀释直到出现轻微浑浊，然后冰冷并冻干。(一旦在真空下残留固体粉末，则减少存在的乙酸的量)。2.0mg的冻干粉末在DMSO-D6中通过NMR进行分析，比较δ1.16的峰(乳酸的甲基)和δ0.82的峰(戊酰基的末端CH3)，其比例应为1∶1(可以mm测定，获得比例)。如果比例偏离，可以通过加入乙酸盐(如果过高)或再加入0.1N乳酸盐溶液加以调整。(由于装置大小的限制，5.0g为能够实施的最大批量，采用375μL的88.0-92.0％的乳酸盐也可以完成两个5.0g批次，1stNMR显示67-69％的乳酸盐。加入200μL的88.0-92.0％乳酸盐后，经低压升华干燥，最终获得比例为1.0-1.09的乳酸盐。)

Claims (13)

1.制备环肽的方法，该方法包括下列步骤：
在树脂上制备二肽片段，该二肽片段包含含有第一个侧链的酸性氨基酸残基；
自树脂上裂解第一个肽片段；
在树脂上制备第二个肽片段，该第二个肽包含具有第二个侧链的氨基酸残基；
使得所述二肽片段的羧基末端与第二个肽片段的氨基末端偶合，从而形成第三个肽；和
通过所述二肽部分的第一个侧链与第二个肽部分的第二个侧链共价偶合使得第三个肽环化。
2.权利要求1的方法，其中所述二肽片段包含羧基-末端非天然氨基酸。
3.权利要求1的方法，其中所述二肽片段包含氨基-末端天冬氨酸残基。
4.权利要求3的方法，其中所述二肽片段包含权利要求10的式I的天冬氨酸二肽。
5.权利要求1的方法，其中所述第二个肽包含四肽。
6.权利要求1的方法，其中所述第二个肽包含氨基-末端D-氨基酸残基。
7.权利要求6的方法，其中所述第二个肽包含氨基-末端D-苯基丙氨酸残基。
8.权利要求1的方法，其中所述第二个肽的碱性氨基酸残基包括赖氨酸残基。
9.权利要求1的方法，该方法包括将第三个肽自树脂上裂解的步骤，该步骤在环化步骤之前进行。
10.式I的天冬氨酸二肽：
Figure A2007800494740003C1
其中：
R1为烷基保护基团；
X为
Figure A2007800494740003C2
R2、R3和R4独立为氢或具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，其中当R3为烷氧基时，R2和R4均为氢，R9为氢、具有1-3个碳原子的直链或支链烷基、具有1-3个碳原子的直链或支链烷氧基或未取代的苯氧基，R11为环己基、环庚基或具有3-8个碳原子的支链烷基，
R12为具有1-5个碳原子的烷基、具有2-5个碳原子的链烯基或具有2-5个碳原子的炔基；和
R10为H或卤素。
11.制备环状黑皮质素-4受体激动剂肽的方法，该方法包括下列步骤：
在树脂上合成权利要求10的式I的天冬氨酸二肽；
自树脂上裂解天冬氨酸二肽；
提供第二个肽片段，该片段包含序列：D-Phe-Arg-Trp-Lys，其中所述第二个肽片段与树脂连接；
将所述二肽的羧基末端与上述第二个肽片段的氨基末端偶合，从而形成具有序列为[式I]-D-Phe-Arg-Trp-Lys的肽；
通过天冬氨酸残基的侧链与赖氨酸残基的侧链偶合使得[式I]-D-Phe-Arg-Trp-Lys肽环化。
12.权利要求3的方法，其中所述二肽片段包含式I的天冬氨酸二肽：
Figure A2007800494740004C1
其中：
R1为烷基保护基团；
X为：
R2、R3和R4独立为氢或具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，其中当R3为烷氧基时，R2和R4均为氢，R9为氢、具有1-3个碳原子的直链或支链烷基、具有1-3个碳原子的直链或支链烷氧基或未取代的苯氧基，R11为环己基、环庚基或具有3-8个碳原子的支链烷基，
R12为具有1-5个碳原子的烷基、具有2-5个碳原子的链烯基或具有2-5个碳原子的炔基；和
R10为H或卤素。
13.如上文中所述的本发明。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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