CN101566568B - 一种表面等离子体耦合荧光检测装置 - Google Patents

Abstract

一种表面等离子体耦合荧光检测装置，涉及一种荧光检测装置。提供一种体积小、结构简单、成本低、检测准确性高的表面等离子体耦合荧光检测装置。设有光源、光源架、旋转台、样品架、耦合器件、单色仪、检测器和控制处理器。光源设于光源架上，光源架设于旋转台上，样品架设于旋转台上，耦合器件设于样品架上，单色仪设于旋转台侧方，单色仪接受荧光信号，单色仪与检测器连接，检测器与控制处理器连接。具有结构紧凑和便于微型化的特点。可采用激光笔作为光源，体积小，能量强，结合微型单色仪即可实现仪器微型化。

Description

一种表面等离子体耦合荧光检测装置

技术领域

本发明涉及一种荧光检测装置，尤其是涉及一种表面等离子体耦合荧光检测装置。

背景技术

由于荧光技术具有灵敏度高和方法多样等优点，因此被广泛应用在各种分析表征过程，特别是在生物科学领域中，包括基因表达、药物诊断和生物危害检测等。金属表面上荧光团具有独特荧光性质，具有提高荧光强度、量子产率和光稳定性等特点。目前有许多研究方向是集中在金属与荧光团的近场相互作用，特别是表面等离子体耦合发射荧光法(SurfacePlasmon Coupled Emission，SPCE)的研究。SPCE是利用在纳米金属表面200nm内的激发态荧光团与纳米金属膜的近场相互作用。在光滑金属薄膜表面，如果以某一合适角度入射(即θ_SP)，发生表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)，入射光被吸收，其反射率急剧减少。在原理上，SPCE是SPR的逆过程。光滑金属薄膜表面的激发态荧光团与金属表面自由电子产生的表面等离子体子耦合，以荧光发射波长对应的SPCE角(即θ_SPCE)进入棱镜基体辐射。SPCE作为一种新型荧光技术展现出其独特的优点，如高度的角度定向发射、唯一的荧光发射偏振、波长可分辨性和有效的背景信号抑制等，必将在生物传感、界面分析等领域中得到广泛应用。

在以往的报道中，SPCE的光致发光体系装置主要包括激光光源、激发光纤、陷波滤光片、双台面精密旋转台、样品架、耦合器件、滤光片组、收集光纤、单色仪和检测器组成的激发光路以及荧光发射光路。其基本工作过程为：激光发出的激光束经过陷波滤光片进入激发光纤，以一定合适角度照射到耦合器件的样品膜，激发金属薄膜表面的荧光团。定向发射的荧光信号经过滤光片组、收集光纤、单色仪和检测器，最终被转换成与荧光强度成正比的电信号。为了获得表面等离子体耦合定向发射荧光信号，激发光纤和发射光纤需要分别固定于双台面精密旋转台上，方能实现分别以任意角度照射和任意角度收集。该双台面精密旋转台是特制的，两个台面为同轴中空，可以分别绕轴旋转360 °。样品架安装在旋转台中空轴心位置。该装置的不足之处是：1、体积大，功耗高。这是因为所采用的激光器为气体激光器(如Ar+离子激光器)或固体激光器，其体积大，价格昂贵，使用寿命较短，操作严格，工作时发热量大，需要强制冷却，不利于仪器的小型化。近来有些研究采用新型光源发光二极管(LightEmitting Diodes，LEDs)作为SPCE法的光源。虽然LED具有体积小、能耗低、价格便宜等优点，但是由于LED为非相干光源，其亮度低、单色性差、响应速度低，并且其光束的发散角大，易造成较大的背景噪音，因此需要一套复杂的光学准直系统和聚焦系统。2、结构复杂，操作繁琐。为了获得定向发射信号，要求两条光纤分别固定在特制复杂的双台面旋转台，分别作任意角度的旋转运动。整个装置易产生失调和离焦等问题，因此影响检测结果的准确性。3、制造成本高，不利于推广使用。光源作为荧光检测系统的关键部件，常常是该系统最昂贵的耗件之一，常规实验室不可能配置齐全各种昂贵的激光器。双台面旋转台的结构复杂，在普通光电产品制造公司购买不到，只能按照特殊规格设计在专业加工公司定制，限制SPCE方法在常规实验室的推广和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种体积小、结构简单、成本低、检测准确性高的表面等离子体耦合荧光检测装置。

本发明设有光源、光源架、旋转台、样品架、耦合器件、单色仪、检测器和控制处理器。光源设于光源架上，光源架设于旋转台上，样品架设于旋转台上，耦合器件设于样品架上，单色仪设于旋转台侧方，单色仪接受荧光信号，单色仪与检测器连接，检测器与控制处理器连接。

所述的光源可采用市售激光笔，如采用波长为405nm、473nm、532nm、593.5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm，功率为0.6～500mW的激光笔。

所述的光源架最好设有可调节高度和仰度的调节件。

所述的光源架可为激光笔套，激光笔套通过紧固件固于旋转台。

所述的旋转台最好为绕其轴心转动的旋转台。

所述的样品架可为塑料固定架，塑料固定架通过紧固件固于旋转台。

所述的耦合器件包括棱镜、纳米级金属薄膜和样品膜，棱镜设于样品架上，在棱镜上可设有基底，纳米级金属薄膜附于基底表面，基底最好为石英或玻璃基底，样品膜为荧光传感膜，荧光传感膜附于纳米级金属薄膜表面。

所述的单色仪可为单光栅式单色仪，如北京卓立汉光仪器有限公司的SSM301、SAP301单色仪。

所述的检测器可根据需要选择市购，如滨松光子技术股份有限公司的1P28、R928或CR131等的光电倍增管或CCD检测器。

由于本发明所采用的光源为激光光源，具有输出功率稳定、单色性强、聚光效率高(光斑的直径约为1mm)及平行性好等特点，因此适用于界面荧光分析的点光源要求，可有效地减少背景杂散光干扰，可采用激光笔，价格仅为几元或几十元人民币，方便易购。目前激光笔的输出波长几乎覆盖了可见光至红外光的各个波段，近紫外的激光笔也已投入市场，可以方便地选择不同波长的激光笔以适应成熟的各种荧光探针，更好地满足荧光检测的不同要求。而且激光笔的结构简单、体积小(仅为50mm×Φ13mm)，非常适于微型化的荧光检测系统。由于光源可以随旋转台任意旋转，并可进行高度和仰度调节，因此可控制光束以垂直角度或其它所需角度照射到附于金属薄膜表面的样品膜上，从而激发金属薄膜表面的荧光团，构成激发光路。激发光路可以随着旋转台实现360°旋转，这样一来，单色仪就可接受定向发射的荧光信号，荧光信号可以一定角度选择性地通过单色仪而进入检测器，最终被转换成与荧光强度成正比的电信号，从而获得表面等离子体耦合定向发射荧光信号。控制处理器可对信号进行调控，达到所需检测要求，而且现有的控制处理器已经十分成熟，其检测准确性较高。

由此可见，与现有表面等离子体耦合荧光检测装置比较，本发明具有以下突出优点和显著效果：

具有结构紧凑和便于微型化的特点。可采用激光笔作为光源，体积小，能量强，结合微型单色仪即可实现仪器微型化。旋转平台上的负载小，可以采用体积小的电动旋转台实现快速全自动操作。结构简单，易于制造。除旋转台做旋转运动外，其它部件均不动，可有效防止部件位置偏移而引起信号改变。若要替换不同波长的光源，也十分方便。本装置采用价廉的激光笔和简易的旋转台，成本低，有利推广SPCE新型荧光法。

附图说明

图1为本发明实施例的结构组成示意图。

图2为图1中的光源架结构示意图。

图3为图2的横截面结构示意图。

图4为罗丹明样品膜(RB-PVA膜)荧光发射光谱。在图4中，横坐标为波长Wavelength/nm，纵坐标为相对荧光强度Fluorescence Intensity。

图5为在激发波长为532nm，发射波长为590nm状态下的荧光强度角分布极坐标图。在图5中，横坐标为荧光检测角度，纵坐标为相对荧光强度Fluorescence Intensity，图中Exc.表示激发波长(532nm)；检测角度θ_F为51°。

图6为罗丹明样品膜(RB-PVA膜)在不同偏振激发和不同偏振发射下的荧光光谱图。在图6中，横坐标为波长Wavelength/nm，纵坐标为相对荧光强度Fluorescence Intensity；在谱图中，曲线a为在水平偏振激发和水平偏振发射下的光谱图；曲线b为在垂直偏振激发和水平偏振发射下的光谱图；曲线c为在水平偏振激发和垂直偏振发射下的光谱图；曲线d为在垂直偏振激发和垂直偏振发射下的光谱图。

图7为罗丹明样品膜(RB-PVA膜)的SPCE信号稳定性检测图。在图7中，横坐标为时间Time/s，纵坐标为相对荧光强度Fluorescence lntensity。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

如图1所示，本发明设有激光笔1(光源)、光源架2、旋转台3、样品架4、耦合器件(由棱镜5、纳米级光滑金属薄膜6和样品膜7构成)、单色仪8、检测器9和控制处理器10。图2和3中的其余标号表示：11为激光笔套管，12为2个固定螺丝，13为2个高度调节螺丝，14为2个支架螺丝。

参见图1～3，激光笔1安装于光源架2上，光源架2设于旋转台3上，样品架4设于旋转台3上，耦合器件设有半圆棒式棱镜5、纳米级光滑金属薄膜6和样品膜7，棱镜5设于样品架4上，纳米级光滑金属薄膜6附于玻璃基底表面，基底设于棱镜5上，通过光学常数匹配的溶液(如甘油)粘附在棱镜5，样品膜7为荧光传感膜，荧光传感膜7附于纳米级光滑金属薄膜6表面。

单色仪8位于旋转台3侧方，可接受荧光信号，单色仪8与检测器9连接，检测器9与控制处理器10电连接。

光源1采用市售波长为532nm、功率为5mW的激光笔，(也可采用波长为405nm、473nm、593.5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm，功率为0.6mW～500mW的激光笔)。

光源架2通过2个调节螺丝13可调节激光笔1的高度和仰角，2个调节螺丝13穿过光源架2，其上端定在激光笔底部，旋转螺丝13可使激光笔上下移动或左右摆动，从而实现调节激光笔1的高度和仰度。

所述的光源架2为激光笔套，激光笔套2通过两个紧固螺丝14固于旋转台3。激光笔套2用于激光笔1安装。

所述的旋转台3为绕轴心转动的旋转台。

所述的样品架4为自制塑料固定架，样品架4通过紧固螺丝固于旋转台3上。

所述的单色仪8为单光栅式单色仪，如北京卓立汉光仪器有限公司的SSM301、SAP301单色仪。

所述的检测器9为市购的滨松光子技术股份有限公司的R928光电倍增管(也可为其他市购的光电倍增管，如型号为1P28、CR131等的光电倍增管，或者CCD检测器。

所述的控制处理器10由控制器、信号放大与积分模块、A/D转换卡和计算机构成。

可通过蒸汽沉积、化学镀膜、化学气相沉积、光还原、真空溅射等方法在玻璃载波片上镀上纳米级光滑金属薄膜6。上述的金属薄膜6可以是金、银、铝、铜等金属，厚度控制在50nm左右。本实施例中采用真空溅射法得到50nm光滑金属薄膜6。

上述的样品膜7为可采用滴涂法、旋涂法、化学键合法或LB法等方法在金属表面形成的荧光传感膜。本实施例中采用旋涂法，在光滑金属薄膜旋转镀膜6上含有罗丹明B的PVA膜。

该系统首先将镀有样品膜7的载波片用光学常数匹配的溶液(如甘油)粘附在半圆柱棱镜5上，然后固定在样品架4上。将激光笔1作为激发光源固定在旋转台3，其光束直接照射到样品膜7上，激发金属薄膜6上的荧光团。通过转动旋转台3，使得检测器9能够以不同检测角度选择性地收集定向荧光信号。激光笔1的激发光束，以垂直角度照射到达样品的玻璃基底表面，玻璃基底的表面上溅射有Au膜，Au膜上固定有荧光层。入射光束激发荧光团，激发态的荧光团与Au膜上的表面等离子体发生耦合共振现象，以表面等离子角度定向发射荧光信号，信号进入单色仪8，经检测器9的光电转化器件将光信号转变为电信号，电信号发送至控制处理器10。

本发明利用罗丹明样品膜(RB-PVA膜)为标样评价了该检测装置，通过考察其信号角度分布和荧光偏振性，在检测角度为51°测得其角度高度定向、唯一的p偏振SPCE稳定信号。证明了该装置可以实现SPCE检测，完全能够满足一般的测试要求。图4给出罗丹明样品膜(RB-PVA膜)荧光发射光谱，图5给出在激发波长为532nm，发射波长为590nm状态下的荧光强度角分布极坐标图，激发波长为532nm，检测角度θ_F为51°。图6给出罗丹明样品膜(RB-PVA膜)在不同偏振激发和不同偏振发射下的荧光光谱图，在谱图中，曲线a为在水平偏振激发和水平偏振发射下的光谱图；曲线b为在垂直偏振激发和水平偏振发射下的光谱图；曲线c为在水平偏振激发和垂直偏振发射下的光谱图；曲线d为在垂直偏振激发和垂直偏振发射下的光谱图。图7给出罗丹明样品膜(RB-PVA膜)的SPCE信号稳定性检测图。

Claims (8)

1.一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于设有光源、光源架、旋转台、样品架、耦合器件、单色仪、检测器和控制处理器，光源设于光源架上，光源架设于旋转台上，样品架设于旋转台上，耦合器件设于样品架上，单色仪设于旋转台侧方，单色仪接受荧光信号，单色仪与检测器连接，检测器与控制处理器连接；

所述的光源采用激光笔，所述激光笔选用波长为405nm、473nm、532nm、593.5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm，功率为0.6～500mW的激光笔；

所述的光源架设有可调节高度和仰度的调节件。

2.如权利要求1所述的一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于所述的光源架为激光笔套，激光笔套通过紧固件固于旋转台。

3.如权利要求1所述的一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于所述的旋转台为绕其轴心转动的旋转台。

4.如权利要求1所述的一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于所述的样品架为自制的塑料固定架，塑料固定架通过紧固件固于旋转台。

5.如权利要求1所述的一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于所述的耦合器件包括棱镜、纳米级金属薄膜和样品膜，棱镜设于样品架上，在棱镜上设有基底，纳米级金属薄膜附于基底表面，样品膜为荧光传感膜，荧光传感膜附于纳米级金属薄膜表面。

6.如权利要求1所述的一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于所述的单色仪为单光栅式单色仪。

7.如权利要求1所述的一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于所述的检测器为光电倍增管或CCD检测器。

8.如权利要求1所述的一种表面等离子体耦合荧光检测装置，其特征在于所述的控制处理器包括控制器、信号放大与积分模块、A/D转换卡和计算机。

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