CN101566567A - 一种光纤生物传感器探头薄膜材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种光纤生物传感器探头薄膜材料及其制备方法。该材料具有催化和光敏特性,它由Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子、生物活性酶、荧光物质和溶胶-凝胶制成,生物活性酶固定在Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子上,固定化生物活性酶和荧光物质被包埋在溶胶-凝胶网格中。其制备包括:合成Fe3O4@ SiO2磁性纳米复合粒子载体;载体用戊二醛或者依次用戊二醛、牛血清白蛋白和戊二醛活化,再与生物活性酶交联反应固定酶;固定有生物酶的Fe3O4@ SiO2磁性纳米复合粒子与混合有Ru(bpy)3Cl2荧光指示剂的溶胶-凝胶液混合后,滴加在处理过的玻璃基片表面,经清洗、烘干并老化,即得到包埋生物酶和荧光指示剂的溶胶-凝胶光学生物复合传感膜。有该薄膜材料的光纤生物传感器探头特别适用于血糖、血胆固醇等的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种光纤生物传感器探头薄膜材料及其制备方法,特别涉及具有催化和光敏特性于一体的多功能复合光学生物传感膜材料及其制备方法。该光纤生物传感器探头特别适用于血糖的检测。
背景技术
光纤传感器具有很多独特的优点,代表了新一代传感器的发展趋势,在许多领域具有广泛和重要的应用前景。光纤生物传感器是光纤传感器中的一大类,其探头可以感知待测生物物质,并产生相应的光信号,再经过光电转换装置转化成电信号输出。由于光纤生物传感器具有探头直径小、信息传输容量大、能量损耗低、抗干扰能力强、响应快、成本低、使用方便、可实时在线检测等优点,近年来一直是国内外的研究热点。
很多情况下,生物体系发生生物化学反应后其光学性能发生变化,通过检测该变化可实现对生物待测量的检测。由于生物化学反应必须在特定生物酶的催化下才能发生,故基于酶催化的光纤生物传感器具有十分广泛和重要的用途。光学生物传感材料是制备光纤生物传感器的关键技术之一,其性能直接决定传感器的性能。目前基于酶催化的光纤生物传感器探头由分离的酶膜和光敏膜两部分组成,酶催化效应需通过较长距离扩散才能到达光敏膜,造成传感器响应慢、精度低、稳定性差等问题,这对生物参量浓度的在线检测非常不利,因为很难获得某一时刻待测物的准确浓度值。如文献,Desheng Jiang,Er Liu,XingChen,Huang Jun,Design and properties study on fiber optic glucose biosensor[J].Chineseoptics letter,2003,1(2):107~109.。
目前光纤生物传感器探头复合传感薄膜材料的研究也有很多的报道。而目前多功能光纤生物传感复合敏感膜材料的制备还处于初级阶段,如文献,张德庆等,新型光纤葡萄糖复合敏感膜的研究,武汉理工大学学报,2008,30(8):1~4。他们以正硅酸乙脂为主要原料,甲酰胺为控制干燥剂,采用密闭老化成膜法,研制了包埋钉化合物荧光指示剂以Ru(bpy)3Cl2和葡萄糖氧化酶(GOD)的溶胶-凝胶多功能光纤生物传感材料,设计出了荧光猝灭型光纤血糖传感器,采用锁相放大技术,该传感膜对葡萄糖溶液浓度具有较好的线性关系,线性检测范围为100~700mg/dl,响应时间小于30s。但是这种生物传感器具有局限性:(1)采用溶胶-凝胶技术仅仅对葡萄糖氧化酶进行包埋固定,酶容易渗漏。由于酶的催化性能直接影响传感器的性能,这种酶固定化方法就会大幅度降低传感器的灵敏度和精确性;(2)溶胶-凝胶传感膜中的酶活性和稳定性有待于进一步提高。(3)采用单纯包埋法固定酶,酶的数量可以保证,但酶的排列顺序是杂乱无章,这也影响酶的催化活性。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题,制备出Fe3O4@SiO2(SiO2包覆Fe3O4核壳型纳米粒子)磁性纳米复合粒子,生物酶固定在上述复合粒子表面,本发明选择与Fe3O4@SiO2纳米粒子固定化酶具有很好相容性的正硅酸乙酯-无水乙醇-催化剂体系,采用纳米复合技术制备出同时含有生物酶和光敏剂并集催化和光敏特性于一体的多功能纳米复合光学生物传感膜材料。
实现本发明目的的技术方案:
一种光纤生物传感器探头薄膜材料,该薄膜材料为具有催化和光敏特性于一体的多功能复合光学生物传感膜,其特征是,该薄膜材料由Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子、生物活性酶、荧光物质和溶胶-凝胶制成,生物活性酶固定在Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子上,固定化生物活性酶和荧光物质被包埋在溶胶-凝胶网格中,其中Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子与溶胶-凝胶的体积比为1∶1,所述的生物活性酶为葡萄糖氧化酶,所述的荧光物质为Ru(bpy)3Cl2荧光指示剂,所述的溶胶-凝胶是由正硅酸乙酯、0.05mol/L盐酸及甲酰胺按体积比为8∶4∶1混合得到的溶胶-凝胶。
本发明的一种光纤生物传感器探头薄膜材料的制备方法,包括如下步骤:
1)、载体的合成:
a.以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料合成Fe3O4纳米粒子,其平均尺寸为10±1nm,再将Fe3O4纳米粒子转移到四甲基氢氧化铵中,得磁流体待用;
b.取10ml含量为10mg/ml的磁流体,用无水乙醇清洗,然后用超声仪超声分散,将分散后的磁流体转入三颈烧瓶中,加入80ml体积浓度95%乙醇,加入氨水调节pH值为11,在室温下搅拌;然后逐滴加入正硅酸乙酯,反应12h;反应后用无水乙醇清洗,再用二次蒸馏水清洗,得到含Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子的褐色溶液,用浓度1mol/L盐酸浸泡该复合粒子,将未被包裹的Fe3O4纳米粒子除去,然后再用二次蒸馏水清洗,得到载体Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子;
2)、酶的固定:
取3ml含量为10mg/ml的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子和体积百分比浓度为3%的戊二醛的溶液4ml混合,在25℃,pH 7.3条件下反应1.5小时使载体活化,用永久磁铁使活化载体与溶液分离,水洗除去未反应的戊二醛,真空干燥,再加入浓度为2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液1ml,在25℃和pH=7.0中性条件下交联反应24h;再依次用pH值为7.0的0.1M磷酸盐缓冲液、0.1M磷酸盐和0.5M NaCl的混合溶液、二次蒸馏水洗以除去未交联的酶,冷冻干燥得到固定了生物酶的磁性纳米复合粒子;
3)、光纤生物传感器探头薄膜材料的制备:
取正硅酸乙酯、0.05mol/L盐酸、甲酰胺以体积比8∶4∶1比例混合,再向1.75ml混合液加入浓度为8mg/ml的Ru(bpy)3Cl2(钌(II)联吡啶)荧光指示剂140μl,室温下密封搅拌至混合均匀,静置得到溶胶液,在室温下不完全密封陈化2天,得溶胶-凝胶液;将固定有生物酶的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子分散在pH6.0磷酸缓冲溶液中,再与陈化好的溶胶-凝胶液按1∶1体积比充分混合后,取0.1ml溶胶液滴加在滴加在清洁干燥的玻璃基片表面(玻璃基片依次用热的浓硫酸、无水乙醇、蒸馏水清洗并烘干),即可固化成凝胶膜;再将此基片密闭于玻璃容器中,4℃温度下密闭老化后,即得到同时包埋生物酶和荧光指示剂的溶胶-凝胶光学生物复合传感膜,即为光纤生物传感器探头薄膜材料。
上述的制备方法步骤1)a中所述的Fe3O4纳米粒子,以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料采用化学沉淀法合成。
步骤1)b中所述的在室温下搅拌的速度为400r/min;步骤1)b中用浓度1mol/L盐酸浸泡Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子时间不少于7天。
步骤3)中4℃温度下密闭老化时间不少于7天。
为提高生物酶的固载量,上述的制备方法步骤2)中将3ml含量为10mg/ml的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子依次与4ml体积百分比浓度为3%戊二醛溶液、1ml浓度为2.5mg/ml牛血清白蛋白溶液、4ml体积百分比浓度为3%戊二醛溶液反应,每次反应后均用磁铁使复合粒子与溶液分离,二次蒸馏水洗除去未反应的戊二醛或牛血清白蛋白,再加入浓度2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液1ml,在25℃和pH=7.0中性条件下交联反应24h;再依次用pH值为7.0的0.1M磷酸盐缓冲液、0.1M磷酸盐和0.5M NaCl的混合溶液、二次蒸馏水洗以除去未交联的酶,冷冻干燥后得到固定了生物酶的磁性纳米复合粒子。
本发明中所述的室温系指25℃。
本发明优点在于,采用了Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子为载体。纳米硅基颗粒具有多孔结构、比表面积大、表面活性高、突出的生物倍增修饰功效和优良的生物相容性,为提高生物分子固定化性能提供了可能性,与具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子复合后能保持Fe3O4纳米粒子的磁性能;通过硅基上的氨基化SiO2磁性纳米复合粒子,可实现与酶反应的多样化;酶的固定化可以在温和的条件下进行,避免了因反应条件较高而导致的酶的失活,所制得的固定化酶稳定性高,尤其是热稳定性大大提高;磁性纳米粒子磁化强度大,有利于固定化酶从反应体系中分离和回收,操作简便,可反复使用,大幅度降低成本。
本发明研制出同时具有催化和光敏特性的多功能纳米复合生物传感材料,其特征在于,可实现传感材料中生物酶的催化作用到光敏剂的直接传递,可对待测生物物质的弱光信号进行有效放大,显著提高光纤生物传感器的响应时间、稳定性、抗干扰能力和检测精度。
下面将结合附图和实施例对本发明做出进一步的说明。
附图说明
图1是传感器检测系统基本装置图
图2是传感头的横截面示意图
图中标号表示:1-传感头,2-测量室,3-Y型分叉光纤束,4-LED,5-参考频率,6-锁相放大器,7-PIN,8-滞后相移φ,9-激发光,10-反射光和荧光,11-复合传感膜。
具体实施方式
下面实施例中所用的Fe3O4@SiO2纳米复合磁性粒子溶液,是按前述载体的合成中的b步制得的含Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子的褐色溶液。
实施例1
取正硅酸乙酯、0.05mol/L盐酸、甲酰胺以体积比8∶4∶1比例混合,再向1.75ml混合液加入浓度为8mg/ml的Ru(bpy)3Cl2荧光指示剂140μl,室温下密封搅拌至混合均匀,静置得到溶胶液,在室温下不完全密封陈化2天,得溶胶-凝胶液。取5ml固定有葡萄糖氧化酶(GOD)的Fe3O4@SiO2纳米复合磁性粒子(该纳米复合磁性粒子浓度为10mg/ml)溶解在pH7.0磷酸缓冲溶液中,再与陈化好的溶胶-凝胶液按1∶1体积比进行充分混合后,取0.1ml混合溶胶液滴加在处理过的玻璃基片表面(玻璃基片依次用热的浓硫酸、无水乙醇、蒸馏水清洗并烘干),在空气中暴露30min后即可固化成50μm左右的凝胶膜。再将此凝胶膜密闭于玻璃容器中,4℃温度下密闭老化7天,即获得多功能光纤生物传感器探头薄膜材料。
检测过程:Y型光纤束直径为3mm(参见附图),传感膜为单层结构。取被测物放入含有磷酸缓冲液的微量检测池中,并将检测探头也插入微量检测池中,整个系统处于密闭状态,用磁力搅拌器匀速搅拌。通过自动数据采集和处理系统读取锁相放大器中的相位值,根据相位的变化来计算被测物的浓度,待测物浓度单位为mmol/L。
实施例2
在机械搅拌下,在250mL三颈烧瓶中,加入浓度10mg/ml的Fe3O4@SiO2纳米复合磁性粒子溶液3ml,80μl APS(氨基丙基三乙氧基硅烷),室温下,继续机械搅拌12h,反应液用永久磁铁和离心分离相结合进行分离,复合粒子用无水乙醇和二次蒸馏水洗涤,再超声仪超声后,用二次蒸馏水分散,得氨基化Fe3O4@SiO2纳米复合磁性粒子。取5ml浓度为10mg/ml的氨基化Fe3O4@SiO2纳米复合磁性粒子,加入体积百分比浓度3%的戊二醛水溶液4ml,室温下机械搅拌2h进行活化,然后再用浓度为0.01mol/L,pH=7.0磷酸缓冲溶液清洗3遍。将活化后的载体加入(GOD)蛋白酶溶液1ml(2mg/ml),室温下恒温摇床振荡固定24h,用磁分离去上清液,加入重量百分比浓度为4%的甘氨酸溶液2ml封闭30min,磁铁分离,所获得的固定化酶用磷酸缓冲溶液清洗3次,冷冻干燥,得固定化酶,在4℃冰箱中储存以备用。
取正硅酸乙酯、0.05mol/L盐酸、甲酰胺以体积比8∶4∶1比例混合,再向1.75ml混合液加入浓度8mg/ml的荧光指示剂(Ru(bpy)3Cl2)140μl,室温下密封搅拌至混合均匀,静置得到溶胶液,在室温下不完全密封陈化2天,得溶胶-凝胶液。取5ml浓度为10mg/ml固定有葡萄糖氧化酶(GOD)的Fe3O4@SiO2纳米复合磁性粒子溶解在pH7.0磷酸缓冲溶液中,再与陈化好的溶胶-凝胶液按1∶1体积比进行充分混合后,取0.1ml混合溶胶液滴加在处理过的玻璃基片表面,在空气中暴露30min后,即固化成50μm左右的凝胶膜。再将此凝胶膜密闭于玻璃容器中,4℃温度下密闭老化7天,即获得多功能光纤生物传感器探头薄膜材料。
检测过程:Y型光纤束直径为3mm,传感膜为单层结构。取被测物放入含有磷酸缓冲液的微量检测池中,并将检测探头也插入微量检测池中,整个系统处于密闭状态,用磁力搅拌器匀速搅拌。通过自动数据采集和处理系统读取锁相放大器中的相位值,根据相位的变化来计算被测物的浓度,待测物浓度单位为mmol/L。
实施例3
制备的Fe3O4利用四甲基氢氧化铵分散,得到Fe3O4磁流体。将环己烷、正己醇和表面活性剂Triton X-100按质量比9∶1∶2混合均匀,向60ml混合物中加入1.5ml二次蒸溜水做分散相,搅拌5min后,得到透明状且性质稳定油包水的微乳液。在微乳液中,加入磁流体2ml(10mg/ml),搅拌1h后加入1ml氨水,再加入体积比为3∶1的正硅酸乙酯和氨基化试剂(TEOS和EPTES),总体积为500μl,连续搅拌反应24h后,通过TEOS和EPTES共同水解聚合,分离制得表面氨基化的SiO2磁性纳米复合粒子。硅壳磁性纳米复合粒子跟戊二醛反应,生成一个C=N键。这样就在纳米复合粒子表面引入了醛基,醛基就可以和葡萄糖氧化酶分子中氨基反应使酶分子共价键连接在材料上。
取正硅酸乙酯、0.05mol/L盐酸、甲酰胺以体积比8∶4∶1比例混合,再向1.75ml混合液加入浓度为8mg/ml的Ru(bpy)3Cl2荧光指示剂140μl,室温下密封搅拌至混合均匀,静置得到溶胶液,在室温下不完全密封陈化2天,得溶胶-凝胶液。取5ml浓度为10mg/ml固定有葡萄糖氧化酶(GOD)的Fe3O4@SiO2纳米复合磁性粒子溶解在pH7.0磷酸缓冲溶液中,再与陈化好的溶胶-凝胶液按1∶1体积比进行充分混合后,取0.1ml混合溶胶液滴加在处理过的玻璃基片表面,在空气中暴露30min后即固化成50μm左右的凝胶膜。再将此凝胶膜密闭于玻璃容器中,4℃温度下密闭老化7天,即获得多功能光纤生物传感器探头薄膜材料。
检测过程:Y型光纤束直径为3mm,氧传感膜为单层结构。取被测物放入含有磷酸缓冲液的微量检测池中,并将检测探头也插入微量检测池中,整个系统处于密闭状态,用磁力搅拌器匀速搅拌。通过自动数据采集和处理系统读取锁相放大器中的相位值,根据相位的变化来计算被测物的浓度,待测物浓度单位为mmol/L。
实施例4
除对荧光指示剂进行了处理外,其他实施方法同以上各例。
荧光指示剂的处理:将环己烷、表面活性剂TritonX-100和正己醇按质量比9∶2∶1混合均匀,向60ml混合物中加入1.5ml二次蒸溜水,搅拌5min后,形成透明状且性质稳定的油包水的微乳液,再向微乳液中加入2μg的亲水性的荧光指示剂(Ru(bpy)3Cl2),保证所有的水分子都被束缚在表面活性剂分子的亲水基团中,室温下搅拌0.5h,完成荧光指示剂的成核,再将TEOS和氨水按1∶2体积比加入到微乳液体系中,连续搅拌24h,TEOS发生水解反应得到二氧化硅荧光纳米颗粒,反应后加入丙酮破乳,离心分离收集纳米颗粒。收集的颗粒分别用无水乙醇、二次蒸馏水洗涤5次,悬浮于磷酸缓冲液(PBS)中备用,用此处理过的荧光指示剂制备多功能光纤生物传感器探头薄膜材料,可有效防止荧光指示剂泄露。
Claims (7)
1、一种光纤生物传感器探头薄膜材料,其特征是,该薄膜材料由Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子、生物活性酶、荧光物质和溶胶-凝胶制成,生物活性酶固定在Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子上,固定化生物活性酶和荧光物质被包埋在溶胶-凝胶网格中,其中Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子与溶胶-凝胶的体积比为1∶1,所述的生物活性酶为葡萄糖氧化酶,所述的荧光物质为Ru(bpy)3Cl2荧光指示剂,所述的溶胶-凝胶是由正硅酸乙酯、0.05mol/L盐酸及甲酰胺按体积比为8∶4∶1混合得到的溶胶-凝胶。
2、权利要求1所述的光纤生物传感器探头薄膜材料的制备方法,其特征是,包括如下步骤:
1).载体的合成:
a.以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料合成Fe3O4纳米粒子,其平均尺寸为10±1nm,再将Fe3O4纳米粒子转移到四甲基氢氧化铵中,得磁流体待用;
b.取10ml含量为10mg/ml的磁流体,用无水乙醇清洗,然后用超声仪超声分散,将分散后的磁流体转入三颈烧瓶中,加入80ml体积浓度95%乙醇,加入氨水调节pH值为11,在室温下搅拌;然后逐滴加入正硅酸乙酯,反应12h;反应后用无水乙醇清洗,再用二次蒸馏水清洗,得到含Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子的褐色溶液,用浓度1mol/L盐酸浸泡该复合粒子,将未被包裹的Fe3O4纳米粒子除去,然后再用二次蒸馏水清洗,得到载体Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子;
2).酶的固定:
取3ml含量为10mg/ml的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子和体积百分比浓度为3%的戊二醛的溶液4ml混合,在25℃,pH 7.3条件下反应1.5小时使载体活化,用永久磁铁使活化载体与溶液分离,水洗除去未反应的戊二醛,真空干燥,再加入浓度为2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液1ml,在25℃和pH=7.0中性条件下交联反应24h;再依次用pH值为7.0的0.1M磷酸盐缓冲液、0.1M磷酸盐和0.5MNaCl的混合溶液、二次蒸馏水洗以除去未交联的酶,冷冻干燥得到固定了生物酶的磁性纳米复合粒子;
3)光纤生物传感器探头薄膜材料的制备:
取正硅酸乙酯、0.05mol/L盐酸及甲酰胺以体积比8∶4∶1比例混合,向1.75ml混合液中加入浓度为8mg/ml的Ru(bpy)3Cl2荧光指示剂140μl,室温下密封搅拌至混合均匀,静置,得到溶胶液,在室温下不完全密封陈化2天,得溶胶-凝胶液;将固定有生物酶的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子分散在pH6.0磷酸缓冲溶液中,再与陈化好的溶胶-凝胶液按体积比1∶1充分混合后,取0.1ml溶胶液滴加在清洁干燥的玻璃基片表面,即可固化成凝胶膜:将此有凝胶膜的基片密闭于玻璃容器中,4℃温度下密闭老化后,即得到同时包埋生物酶和荧光指示剂的溶胶-凝胶光学生物复合传感膜,即为光纤生物传感器探头薄膜材料。
3、如权利要求2所述的光纤生物传感器探头薄膜材料的制备方法,其特征是,步骤1)a中所述的Fe3O4纳米粒子,以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料采用化学沉淀法合成。
4、如权利要求2所述的光纤生物传感器探头薄膜材料的制备方法,其特征是,步骤1)b中所述的在室温下搅拌的速度为400r/min。
5、如权利要求2所述的光纤生物传感器探头薄膜材料的制备方法,其特征是,步骤1)b中用浓度1mol/L盐酸浸泡Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子时间不少于7天。
6、如权利要求2所述的光纤生物传感器探头薄膜材料的制备方法,其特征是,在步骤2)中将3ml含量为10mg/ml的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子依次与4ml体积百分比浓度为3%戊二醛溶液、1ml浓度为2.5mg/ml牛血清白蛋白溶液、4ml体积百分比浓度为3%戊二醛溶液反应,每次反应后均用磁铁使复合粒子与溶液分离,二次蒸馏水洗除去未反应的戊二醛或牛血清白蛋白,再加入浓度2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液1ml,在25℃和pH=7.0中性条件下交联反应24h;再依次用pH值为7.0的0.1M磷酸盐缓冲液、0.1M磷酸盐和0.5M NaCl的混合溶液、二次蒸馏水洗以除去未交联的酶,冷冻干燥后得到固定了生物酶的磁性纳米复合粒子。
7、如权利要求2所述的光纤生物传感器探头薄膜材料的制备方法,其特征是,步骤3)中4℃温度下密闭老化时间不少于7天。
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