CN1971251A - 用于检测肾上腺素的光纤生物传感器及复合敏感膜的制备 - Google Patents

Abstract

用于检测肾上腺素的光纤生物传感器及复合敏感膜的制备：本发明主要包括生物传感器及氧敏感膜的制备，直流稳压电源3和直流稳压电源4，通过导线分别连接光学发射装置1和光学接收装置2，光学发射装置1发射出的蓝光通过Y型光纤束7的一端传送到传感器探头9，并照射在氧敏感膜11上，氧敏感膜11由氧敏感指示剂的高分子层，将固定化酶通过共价结合的方式固定在氧敏感膜的表面上，在检测探头底部沿横截面方向有一细槽，用来放置敏感材料11，被检测液体可以与敏感材料完全接触，检测过程：取被测物放入含有缓冲液的微量检测池8中，并将检测探头9也插入微量检测池8中，整个系统处于密闭状态，并在磁力搅拌器上匀速搅拌。通过数据处理电脑6自动采集锁相放大器5的相位值，采集过程结束，根据相位的变化来计算被测物的浓度。

Description

用于检测肾上腺素的光纤生物传感器及复合敏感膜的制备

技术领域

本发明涉及一种生物传感器及其复合敏感膜的制备，特别是用于肾上腺素的检测。

背景技术

传统的肾上腺素检测法包括荧光法，分光光度法，高效液相色谱法，电化学分析法等。这些方法各有其特点，但都普遍存在样品前处理复杂，检测限过高等缺点，而且在灵敏度、特异度和检测速度等方面也还不能非常好地满足临床疾病诊断和基础研究的需要。作者ZhuYexiang，Ran Yong，Xu Shunqing在International Conference on Sensor Technology(国际传感器大会会议文集)ISTC 2001(4414)：137-140，撰文“Optic-fiber evanescent wave biosensor ofcatecholamine neurotransmitter(检测儿茶酚胺神经递质的光纤消失波传感器)”。该文介绍了一种测量肾上腺素的光纤传感器。该原理是用3-氨基丙基三乙氧基硅烷-戊二醛法将漆酶固定到光纤上作为工作光纤，漆酶光纤和参照光纤交列在一起，通过密封微量检测池(3ml)后，固定化漆酶催化肾上腺素生成肾上腺素红，后者在480nm处有吸收峰，将与光纤消失波发生吸收作用，通过光电倍增管和数据处理系统检测光纤输出端的光强变化，从而确定肾上腺素的量，线性范围为：2.73×10^-7～1.37×10^-6mol/L。但是这种光纤传感器有它的局限性：(1)该系统监测的光强变化很容易受到外界光源的影响从而产生较大误差。(2)检测灵敏度和检测时间还远远不能满足临床检测的需要。(3)为了保证一定的光强，光纤探头必须做到较大直径，致使该传感器无法微型化而插入人体进行实时在线检测。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，利用氧敏感膜的荧光猝灭原理，基于漆酶与肾上腺素反应所产生的耗氧效应，通过测量溶液中氧浓度的变化从而间接的测量肾上腺素的含量，制作成一台能够对人体体液中肾上腺素浓度快速准确检测的光纤生物传感器。

技术方案：本发明生物传感器包括：光学发射装置1、光学接收装置2、电源3，电源4，Y型光纤束7，微量检测池8，传感器探头9，检测装置5，数据处理装置6，搅拌磁子10、氧敏感膜11。其特征为：电源3、和电源4通过导线分别连接到光学发射装置1和光学接收装置2，光学发射装置1发出的光信号耦合到Y型光纤束7的一支臂端中，传感器探头通过螺丝固定在Y型光纤束7共同端的末端，光信号在探头处被检测物调制后反向传输到Y型光纤束7的另一支臂端中被光学接收装置所接收，最后由检测装置5和数据处理装置6进行信号放大、收集和显示。

本发明的实现在于氧敏感膜和固定化漆酶的制备，所述敏感材料由吸附氧指示剂的高分子敏感膜与固定化漆酶纳米复合粒子复合而成。氧指示剂高分子层通常采用三钌联吡啶(Tris(2，2’-bipyridyl)ruthenium(II)chloride Hexahydrate)，或者是邻菲咯啉钌(Ru(4，7-diphenyl-1，10-phen)₃Cl₂)。高分子膜材料为醋酸纤维素。制备方法如下：称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.2mL一定浓度的指示剂溶液，再密闭搅拌4h；将搅拌均匀的混合液倾倒入直径Ф60mm的玻璃生化培养皿中，用保鲜膜将皿封好，在保鲜膜上扎适当大小及数量的孔，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可。

有机-无机纳米复合粒子固定化漆酶的制备方法如下：用液相法制得的0.97g Fe₃O₄纳米粒子，其平均尺寸为10nm左右，用蒸馏水将Fe₃O₄纳米粒子洗至中性再转移到合适的有机溶剂中，超声分散。在搅拌条件下将用DMF充分溶解的0.03g MTAPc(氨基金属酞菁)缓慢加入到的Fe₃O₄纳米粒子中，室温下搅拌使有机溶剂挥发，置于45℃的真空干燥箱中干燥得固体粒子。用DMF(N，N-Dimethyl formamide)洗涤固体粒子，洗出液近似无色，表明未复合的MTAPc非常少，加入的MTAPc几乎全部与Fe₃O₄纳米粒子复合。将处理后的粒子在45℃真空干燥即得MTAPc-Fe₃O₄复合粒子(M为Cu，Zn，Co中的一种金属，MTAPc的重量百分含量约为3％)。

将一定量的MTAPc-Fe₃O₄纳米复合粒子依次与一定浓度戊二醛、牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛溶液反应，每次反应后均用磁铁使粒子与溶液分离，水洗除去未反应的戊二醛或BSA，再加入漆酶溶液，在4℃和中性条件下交联反应24h。再依次用pH值为7.00的0.1M磷酸盐缓冲液、0.1M磷酸盐和0.5M NaCl的混合溶液、双蒸水除去未交联的漆酶，冷冻干燥得磁性固定化酶。

本发明的工作原理是：在敏感膜上的复合粒子存在下列化学反应：

肾上腺素    醌式肾上腺素    肾上腺素红    (a)

O₂+4H⁺+4e^-——→2H₂O     (b)

其中：(a)为传感探头上的反应，(b)为测量溶液中的反应。

本发明的光纤氧传感器是利用荧光的动态猝灭原理，通过测量溶液中氧气的浓度的变化从而间接的测量出肾上腺素的含量。氧分子是最普遍存在的荧光猝灭剂。在气态或液态环境中，荧光物质分子M和O₂分子相互碰撞而引起猝灭。其过程包括：吸收光子过程、荧光发射过程和荧光猝灭过程。在溶液中，氧分子的荧光猝灭较为复杂，目前通过激光闪光光谱技术证实的荧光猝灭机理是：激发单重态荧光试剂分子¹M^*和氧遭遇时形成复合物，大大增强了¹M^*内S₁→T₁的体系间窜跃过程。而激发的三重态³M^*不仅可能被溶解氧和其它杂质所碰撞而猝灭，也可能发生如下的反应导致三重态的猝灭：

³M^*+³M^*——→¹M^*+M

³M^*+M——→³(M^*M)——→M+M+T

被测溶液中氧气的浓度既可以改变荧光辐射的强度，也可以改变荧光辐射的寿命，因此，检测方法也就相应的分为两种，一种是测量荧光辐射的强度，另外一种是测量荧光辐射寿命。

被测量物质与荧光物质的发生相互作用，可导致荧光强度的降低以及荧光寿命的缩短，其荧光辐射可以用Stern-Volmer方程来描述；

$\frac{I_0}{I}=\frac{{\mathrm{\τ}}_0}{\mathrm{\τ}}=1+K\left[Q\right]---\left(1\right)$

式中I₀，I，τ₀，τ分别为无氧气和有氧气条件下的荧光强度和寿命，[Q]为氧气的浓度，K为Stem-Volmer常数，对于特定的猝灭剂其值是固定的。从此式可以看出，无论测量荧光强度还是测量荧光寿命，都可以得到被测量的浓度信息。由于物质的荧光强度易受外界因素的影响，而荧光寿命的测量虽然比荧光强度的测量复杂，但由于荧光物质的荧光寿命值是其本身的本征参量，因此，荧光寿命测量不受外界因素(如光源光强等)变化的影响，具有很好的抗干扰能力。

按照理想情况假定在t＝0时，激励消失。荧光寿命τ的一般性定义如下：

$\mathrm{\τ}=\frac{\underset{0}{\overset{\∞}{\∫}}t\·I_{\mathrm{fl}}\mathrm{dt}}{\underset{0}{\overset{\∞}{\∫}}{I}_{\mathrm{fl}}\mathrm{dt}}---\left(2\right)$

I_fl为按时间变化的荧光强度信号，实际上它近似于单一指数衰减函数，可用下式描述：

I_fl＝I₀·exp(-t/τ_c)                   (3)

τ_c是指数衰减的时间常数

本发明研究的光纤氧传感器采用相移法来测量荧光的寿命，相移法所用的激发光源是经过正弦调制后按正弦规律变化的光源。由于荧光相对于调制光有一滞后相移φs，这一滞后相移φs与荧光寿命τ有如下关系：

tanφ_s＝ω·τ                         (4)

其中ω为正弦调制信号的角速度：ω＝2πf；因为典型的荧光寿命为1～20ns，相应的正弦调制信号频率一般选在1～200kHz之间，并且激励光产生的荧光相对于激励光本身有一定的时间差，在频域分析中，这可以看作是在某一频率下二者之间有一确定的滞后相移，而这一确定的滞后相移与荧光寿命成某一确定关系，因此，可以通过测量激励光和产生的荧光之间的滞后相移来实现对荧光的测量。

由于检测的荧光信号非常微弱，无法直接用光功率计测量，而且噪声信号混杂在其中，使得用通常的信号放大系统无法实现对该荧光信号的检测。本发明采用锁相放大技术来对所需的弱荧光信号进行锁定和放大。

锁相放大技术是一种可以用于光纤气敏传感器信号检测的相敏检测技术，它只提取被测信号的幅值及它与参考信号之间的相位差，不对被测信号的频率进行测量，有很高的分析速度。它的基础是相关理论，它通过信号的相关性来实现对确定频率信号的选择与拾取。这样，锁相放大器的窄带性使得它具有优异的弱信号检测能力。它主要有三个部分：信号通道，参考通道和相敏检波。信号通道对混有噪声的初始信号进行选频放大，对噪声信号作初步的窄带滤波；参考通道通过锁相和移相提供一个与被测信号同频同相的参考信号；相敏检波由乘法器和低通滤波组成，得到直流输出分量，它与输入信号和参考信号的相位差成比例关系。

由于氧分子对荧光的猝灭效应，当溶解氧的浓度越大时，氧的猝灭作用使得荧光的寿命就越短，那么输出荧光信号相对激励光信号的滞后相移φs的值也就越小。由Stem-Volmer方程和公式(4)可以推导出：

tanФs₀/tanФs＝1+k_c[O₂]                (5)

式中K_C为Stem-Volmer方程的特征常数；φs₀为气态氧或溶解氧浓度为0％时的荧光与激励光的滞后相移，因此时无荧光猝灭剂存在，荧光寿命最长，故滞后相移|φs₀|也最大；φ_s为在某一溶解氧浓度下荧光与激励光的滞后相移。

在测试过程中，首先用不含荧光指示剂的膜(以下称为空白膜)做空白实验，在锁相放大器上读出激励光所对应的相移φ₀(以下称为系统相移)，然后用包埋有荧光指示剂的高分子敏感膜(以下简称敏感膜)对不同浓度的溶解氧进行测量，从锁相放大器显示屏上读出相应的相移φ，将所得到相移φ与激发光的滞后相移φ₀相减就可以得到溶解氧浓度的滞后相移φ_s(φ_s＝φ-φ₀)，分别与氧气浓度为0％时的滞后相移φs₀＝(φ_0％-φ₀)(φ_0％为氧气浓度为0％时的相移)正切值相比(tanφs₀/tanφs)，就可以测出溶解氧的浓度。由于溶解氧浓度的变化来源于肾上腺素在漆酶存在下的催化氧化，因此再由标准中肾上腺素浓度与溶解氧消耗量的线性关系，就可成功测出未知样中肾上腺素的浓度。其中所有数据计算和结果显示均可由计算机按照拟定的程序完成。

有益效应：本发明与现有技术相比，其显著优点是：本传感器应用了当今在医疗、环境检测等领域广泛应用的光纤生物传感技术，它具有灵敏度高、响应快、操作简便、易于微型化等优点。目前临床中光纤传感器可对体液中电解质血气进行检测，已广泛运用在ICU病房监视器中。利用光导纤维传输光信号损失少，失真率低和几乎不受干扰等特点，将传感探头上荧光猝灭相位信息经计算机分析处理并作为可视化反馈，以期达到：在对体液不经前期处理的前提下，快速(整个过程数分钟内完成)、准确、直观的确定其肾上腺素的含量，检测下限达到10^-9数量级，从而满足临床疾病早期诊断的要求。全部过程方便快捷，操作简单，对人体无毒无创，实现机械化，集成化和智能化。

附图说明：

图1为传感器及检测装置示意图；

图2位传感器探头结构示意图；

1-光学发射装置、2-光学接收装置、3-电源、4-电源、5-检测装置、6-数据处理装置7-Y型光纤束、8-微量检测池、9-传感器探头10-搅拌磁子、11-氧敏感膜。

下面对照附图1、和图2对本发明进一步说明

如图1，图2所示，本发明主要包括：光学发射装置1、光学接收装置2、直流稳压电源3和4、锁相放大仪5、数据处理电脑6、Y型光纤束7、微量检测池8、检测探头9、搅拌磁子10及氧敏感膜11。直流稳压电源3和4通过导线分别连接光学发射装置1和光学接收装置2，光学发射装置1发射出的蓝光通过Y型光纤束7的一端传送到检测探头9照射在氧敏感膜11上，光信号被检测物调制后反向沿Y型光纤束7传输到另一端被光学接收装置2所接收，然后由锁相放大器5和数据处理电脑6进行光电转换和信号进一步处理。两个电源均为直流稳压电源，为光学发射装置1和光学接收装置2分别提供9V和11V直流电压。光学发射装置主要由一个超亮的蓝光发光二极管构成，中心波长为416nm。光学接收装置主要有一个光电转换管构成。Y型光纤束的共同端末端用圆柱型铜管制成，小于或等于3mm。传感器探头由比光纤束共同端稍粗的中空圆柱型铜管制成，用螺纹与光纤束共同端固定。传感器探头直径约为4mm，在探头底部沿横截面方向有一细槽，槽厚约1mm，用来放置敏感材料11，敏感材料11与光纤束的共同端末端面有约为0.5mm的间隙，被检测液体可以与敏感材料完全接触。

敏感膜的制备：氧敏感膜为两层结构。第一层为修饰了氧敏感指示剂的高分子层，氧指示剂为三钌联吡啶(Tris(2，2’-bipyridyl)ruthenium(II)chloride Hexahydrate)或者是邻菲咯啉钌(Ru(4，7-diphenyl-1，10-phen)₃Cl₂)。高分子膜材料为醋酸纤维素。制备方法如下：称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.2mL一定浓度的指示剂溶液，再密闭搅拌4h；将搅拌均匀的混合液倾倒入直径Ф60mm的玻璃生化培养皿中，用保鲜膜将皿封好，在保鲜膜上扎适当大小及数量的孔，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可。

第二层为纳米复合粒子固定化漆酶，有机-无机纳米复合粒子固定化漆酶的制备方法如下：用液相法制得的0.97g Fe₃O₄纳米粒子，其平均尺寸为10nm左右，用蒸馏水将Fe₃O₄纳米粒子洗至中性再转移到合适的有机溶剂中，超声分散。在搅拌条件下将用DMF(N，N-Dimethyl formamide)充分溶解的0.03gMTAPc(氨基金属酞菁)缓慢加入到的Fe₃O₄纳米粒子中，室温下搅拌使有机溶剂挥发，置于45℃的真空干燥箱中干燥得固体粒子。用DMF洗涤固体粒子，洗出液近似无色，表明未复合的MTAPc非常少，加入的MTAPc几乎全部与Fe₃O₄纳米粒子复合。将处理后的粒子在45℃真空干燥即得MTAPc-Fe₃O₄复合粒子(M为Cu，Zn，Co中的一种金属，MTAPc的重量百分含量约为3％)。

将一定量的MTAPc-Fe₃O₄纳米复合粒子依次与一定浓度戊二醛、牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛溶液反应，每次反应后均用磁铁使粒子与溶液分离，水洗除去未反应的戊二醛或BSA，再加入漆酶溶液，在4℃和中性条件下交联反应24h。再依次用pH值为7.00的0.1M磷酸盐缓冲液、0.1M磷酸盐和0.5M NaCl的混合溶液、双蒸水除去未交联的漆酶，冷冻干燥得磁性固定化酶。将固定化酶通过共价结合的方式固定在氧敏感膜的表面。检测过程：取被测物放入含有缓冲液的微量检测池8中，并将检测探头9也插入微量检测池8中，整个系统处于密闭状态，并在磁力搅拌器上匀速搅拌。通过数据处理电脑6自动采集锁相放大器5所示的相位值，6分钟后采集过程结束，根据相位的变化来计算被测物的浓度，待测物浓度单位为1×10^-9mol/L。

Claims (6)

1、用于检测肾上腺素的光纤生物传感器，传感器由光学发射装置(1)、光学接收装置(2)、直流稳压电源(3)、直流稳压电源(4)、锁相放大仪(5)、数据处理电脑(6)、Y型光纤束(7)、微量检测池(8)、传感器探头(9)、搅拌磁子(10)及氧敏感膜(11)组成，其特征在于直流稳压电源(3)和直流稳压电源(4)通过导线分别连接光学发射装置(1)和光学接收装置(2)，光学发射装置(1)发射出的蓝光信号偶合到Y型光纤束(7)的一端，传感器探头(9)通过螺丝固定在Y型光纤束(7)共同端的末端、传感器探头(9)底部沿横截面方向有一细槽，槽厚约1mm，用来放置敏感材料(11)，敏感材料(11)与Y型光纤束(7)的共同端末端面有约为0.5mm的间隙，被检测液体可以与敏感材料完全接触，取被测物放入含有缓冲液的微量检测池(8)中，并将检测探头(9)也插入微量检测池(8)中，整个系统处于密闭状态，并用搅拌磁子(10)匀速搅拌，光信号被检测物调制后反向沿Y型光纤束(7)传输到另一端被光学接收装置(2)所接收，然后由锁相放大器(5)和数据处理(6)进行信号放大、收集和显示。

2、用于检测肾上腺素的光纤生物传感器敏感膜的制备，其特征在于氧敏感膜为两层结构，第一层为修饰了氧敏感指示剂的高分子层，高分子层为三钉联吡啶(Tris(2，2’-bipyridyl)ruthenium(II)chloride Hexahydrate)或者是邻菲咯啉钌(Ru(4，7-diphenyl-1，10-phen)₃Cl₂)，高分子膜材料为醋酸纤维素，制备方法如下：称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.2mL一定浓度的指示剂溶液，再密闭搅拌4h；将搅拌均匀的混合液倾倒入直径Φ60mm的玻璃生化培养皿中，用保鲜膜将皿封好，在保鲜膜上扎适当大小及数量的孔，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可，第二层为纳米复合粒子固定化漆酶，有机-无机纳米复合粒子固定化漆酶的制备方法如下：用液相法制得的0.97gFe₃O₄纳米粒子，其平均尺寸为10nm左右，用蒸馏水将Fe₃O₄纳米粒子洗至中性再转移到合适的有机溶剂中，超声分散，在搅拌条件下将用DMF充分溶解的0.03gMTAPc(氨基金属酞菁，M为Cu，Zn，Co中的一种)缓慢加入到的Fe₃O₄纳米粒子中，室温下搅拌使有机溶剂挥发，置于45℃的真空干燥箱中干燥得固体粒子，用DMF(N，N-Dimethyl formamide)洗涤固体粒子，洗出液近似无色，第二层为纳米复合粒子固定化漆酶、将固定化酶通过共价结合的方式固定在氧敏感膜的表面。

3根据权利要求1所述的用于检测肾上腺素的光纤生物传感器，其特征在于两个电源均为直流稳压电源，为光学发射装置(1)和光学接收装置(2)分别9V和11V直流电压。

4、根据权利要求1所述的用于检测肾上腺素的光纤生物传感器，其特征在光学发射装置主要由一个超亮的蓝光发光二极管构成，中心波长为416nm。

5、根据权利要求1所述的用于检测肾上腺素的光纤生物传感器其特征在于Y型光纤束(7)的共同末端用圆柱型铜管制成，小于或等于3mm。

6、根据权利要求1所述的用于检测肾上腺素的光纤生物传感器其特征在于传感器探头直径约为4mm。