CN101555277A - 一种甲状腺球蛋白和红芸豆植物红血球凝集素快速联合纯化方法 - Google Patents
一种甲状腺球蛋白和红芸豆植物红血球凝集素快速联合纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，它是将红芸豆中提取物植物红血球凝集素粗提液与甲状腺球蛋白粗提液混合，采用共沉淀法提取、纯化、分离，分别得红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。本发明直接从红芸豆中提取植物凝集素而且能够得到植物红血球凝集素，不需要先提取植物凝集素再提取植物红血球凝集素，简化了纯化工艺，使用的材料价廉，来源广泛，原料易得、生产成本低廉、操作简单、产量高，符合工业化大生产需要。本发明提取植物红血球凝集素不仅活力高、产量高而且成本低、周期短，在得到红血球凝集素单体的同时又得到了甲状腺球蛋白，产品经济价值高、便于推广，具有较高的经济和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种使用共沉淀法从红芸豆中提取植物红血球凝集素单体，同时纯化得到甲状腺球蛋白的新技术，属于生物工程技术领域。
背景技术
甲状腺球蛋白是一种糖蛋白，主要存在于哺乳动物的甲状腺组织中。由于可以同凝集素或糖蛋白可逆结合.因此甲状腺球蛋白在生物技术领域常常用作配体偶联到Sepharose 4B等载体，用于亲和层析分离纯化糖蛋白。甲状腺球蛋白分子量巨大(660kD)，目前文献报道主要由分子筛方法纯化。如：NubuoU等(Nubuo U.and Osamu T.，J Biochem.1961，50(6)：508-518)和曾仲奎吴洽庆等(曾仲奎吴洽庆，四川大学学报(自然科学版)1993)用硫酸铵和分子筛的方法分离出甲状腺球蛋白。这些方法耗时长，产率低，不适合工业化大生产，因此，目前甲状腺球蛋白市场价格昂贵。
植物凝集素(lectin)是植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结合的蛋白质，在细胞识别和粘着反应中起重要作用。凝集素具有一个以上同糖结合的位点，因此能够参与细胞的识别和粘着，将不同的细胞联系起来，具有刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂，促进免疫反应，使细胞凝聚，肿瘤细胞失活，以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性。植物红血球凝集素(Phytohemagglutinin植物红血球凝集素)是凝集素中的一种，具备单一的凝血活性，能特异性的识别特殊糖链，因而在免疫诊断方面较凝集素更具优势单体，纯化的植物红血球凝集素可作为糖专一性探针，研究癌变细胞膜糖链结构和细胞变异的工具，目前提取植物红血球凝集素主要是从植物凝集素中分离得到的，且是利用亲和层析。如：Kimiko ohtani等(Kimiko ohtani，Satoakishibata，Akira misaki.Purfication and characterization ofTora-bean(Phaseolusvulgaris)lectin[J].Biochem，1980，87：407-416)和丁邦裕等(丁邦裕，戴美红，余健.江苏菜豆同工凝集素的分离纯化及性质研究.生物化学志[J].1991，7(1)：25-27)利用盐析和离子交换树脂结合来进行凝集素的纯化，Tamao Endo等(Tamao Endo.Fractionation of glycoprotein-derivedoligosaccharides by affinity chromatography using immobilized lectin columns[J].Journal of ChromatographyA，1996，720：251-26)和R.Reynoso-Camacho等(R.Reynoso-Camacho，E.Gonzalez de Mejia，G.Loarca-Pina.Purification and acutetoxicity of a lectin extracted from tepary bean(Phaseolus acutifolius)[J].Food andChemical Toxicology，2003，41：21-27)利用亲和层析纯化凝集素。红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究，成都医学院学报，2008年6月”，其中公开的红血球凝集素单体的提取方法，具体方法为：制备植物凝集素初提取物，再经GM-Sepharose层析、DEAE-Sepharose层析、Sephadex G 100层析，制备植物凝集素单体；但是这些方法不能直接从原料中提取植物红血球凝集素，而且由于采用多步层析耗时长，生产成本高，不利于大规模生产。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种通过共沉淀法从红芸豆中提取甲状腺球蛋白和红芸豆植物红血球凝集素单体。
本发明提供了一种分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，它是将红芸豆中提取物植物红血球凝集素粗提液与甲状腺球蛋白粗提液混合，采用共沉淀法提取、纯化、分离，得红血球凝集素单体。
具体地，包括如下步骤：
a、制备红芸豆植物红血球凝素粗提液；
b、制备甲状腺球蛋白粗提液；
c、将红芸豆植物红血球凝素粗提液与甲状腺球蛋白粗提液按体积比为：0.5∶1-2∶1混合，离心，取沉淀；
d、沉淀溶解：将沉淀溶解于pH3.0～pH4.0，浓度为40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液，并对缓冲液透析，将透析后的液体于低温下离心，取上清液；
e、纯化：将上清液通过超滤、强酸型阳离子交换层析或者分子筛分离得到植物红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。
其中，a步骤所述的红芸豆植物红血球凝素粗提液的制备方法为：称去一定质量红芸豆，粉碎后过60目筛。向粉末中加入其8～10倍量(体积质量比，v/m)的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0～pH6.0，15mmol/L～35mmol/L，含0.14mol/L NaCl)，4℃浸泡过夜，用四层纱布过滤，收集滤液。将滤液在4℃下10000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其终浓度25％～32％(质量体积比，m/v)。在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，即得植物红血球凝集素粗提液。
其中，b步骤所述的甲状腺球蛋白粗提液的制备方法为：取猪的新鲜甲状腺去结缔组织，称重后，加入6～8倍量(体积质量比)的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0～pH6.0，15mmol/L～35mmol/L，0.14mol/L NaCl)粉碎，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其浓度为15％-25％(质量体积比，m/v)在4℃下10000rpm离心15min，取上清液，即得甲状腺球蛋白粗提液。
其中，e步骤所述的超滤为：上清液加到20-50kD的超滤管中，离心，再用纯水进行脱盐收集上清液和滤液，上清液冻干为甲状腺球蛋白；再将滤液加到5-15kD的超滤管中，离心，收集上清液，冻干为植物红血球凝集素单体。
其中，e步骤所述离子交换上清液上柱吸附，用pH3.0～pH4.0，40mmol/L～60mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液进得平衡至基线稳定，用含0-1mol/LNaCl pH3.0～pH4.0，40mmol/L～60mmol/L，甘氨酸-盐酸的缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，分别收集活性峰，装入透析带中，4℃冰箱中PEG浓缩，用纯水透析除盐后，冻干，即得到植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白。
其中，e步骤所述分子筛上清液上柱吸附，用pH3.0～pH4.0，40mmol/L～60mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液进得洗脱.，流速为1ml/min，分别收集活性峰，装入透析带中，4℃冰箱中PEG浓缩，用纯水透析除盐后，冻干，即得到植物红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。
本发明直接从红芸豆中提取植物凝集素而且能够得到植物红血球凝集素，不用先提取植物凝集素再提取植物红血球凝集素，简化了纯化工艺，使用的材料价廉，来源广泛，原料易得、生产成本低廉、操作简单、产量高，符合工业化大生产需要。本发明所提取植物红血球凝集素不仅活力高、产量高而且成本低、周期短，在得到红血球凝集素单体的同时又得到了甲状腺球蛋白，产品经济价值高、便于推广，具有较高的经济和实用价值。
下面通过若干实例的具体实施方式，再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的分离纯化方法
1.植物红血球凝集素粗提液制备将红芸豆粉碎，称取50g红芸豆粉末，用500ml醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0，35mmol/L，0.14mol/L NaCl)，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其终浓度为26％(质量体积比，m/v)，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，即得植物红血球凝集素粗提液。
2.甲状腺球蛋白的粗提取取50g甲状腺去结缔组织加入450ml醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0，35mmol/L，0.14mol/L NaCl)粉碎，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其浓度为17％(质量体积比，m/v)在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，即得甲状腺球蛋白粗提液。
3.植物红血球凝集素与甲状腺球蛋白的共沉淀取植物红血球凝集素与甲状腺球蛋白的粗提取液按1∶1混合，将植物红血球凝集素粗提液缓慢加入甲状腺球蛋白粗提液中。将混合溶液于4℃下10,000rpm离心15min取沉淀。
4.沉淀的溶解将沉淀溶于pH3.5，40mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液，并对pH3.5，40mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液透析。将透析后的液体于4℃下10,000rpm离15min取上清液
5.强酸性阳离子层析取强酸性阳离子层析柱用pH3.5，40mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液进得平衡至基线稳定，将4中获得的上清液上柱吸附，用pH3.5，40mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液进得平衡至基线稳定，用含0-1mol/L NaClpH3.5，40mmol/L，甘氨酸-盐酸的缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，分别收集活性峰(第一个主峰为甲状腺球蛋白，第二个主峰为植物红血球凝集素单体)，装入透析带中，4℃冰箱中PEG浓缩，用纯水透析除盐后，冻干，即得到植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白。得到植物红血球凝集素的凝血活力为4μg/ml，纯度达到电泳纯。100g的甲状腺可以得到40mg的甲状腺球蛋白，纯度达到电泳纯。
其中，所述的植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的检测方法为：
甲状腺球蛋白的检测方法
将制得的甲状腺球蛋白进行SDS-PAGE电泳(分离胶为3％，浓缩胶为7.5％)以sigma标准品作为对照
凝集素活性的检测方法
在微量V型血凝板上进行，用生理盐水倍比稀释凝集素，每孔含稀释液40μl，加入2％兔红细胞悬液40μl，振荡混合，在25℃下放置2h，肉眼观察结果，凝集活力以50％兔红细胞凝集所需凝集素的质量数(μg)表示。无凝集时血球沉于“V”型孔底部，呈一小圆点；凝集时血球相互聚集形成一片网络状，血球不下沉。不同的凝集程度用数字表示如下：0(不凝集)：血球全部沉积于“V”型孔底部，呈边缘清晰的小圆点；1(少许凝集)：沉积范围比半凝集大，未遍及全孔；2(半凝集)：部分沉积中部，周围有浑浊带，约占孔面积的50％；3(大部分凝集)：少许沉积于孔中心，沉积点边缘模糊；4(全凝集)：血球相互聚集形成一片网络，血球不下沉。凝集效价的判定以“2”作为终点。
实施例2本发明红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的分离纯化方法
1.植物红血球凝集素粗提液制备称取100g红芸豆粉末，用1000ml醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5，30mmol/L，0.14mol/L NaCl)，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其终浓度为30％(质量体积比，m/v)，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，即得植物红血球凝集素粗提液。
2.甲状腺球蛋白的粗提取取100g甲状腺去结缔组织加入800ml醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5，30mmol/L，0.14mol/L NaCl)粉碎，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其浓度为19％(质量体积比，m/v)在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，即得甲状腺球蛋白粗提液。
3.植物红血球凝集素与甲状腺球蛋白的共沉淀取植物红血球凝集素与甲状腺球蛋白的粗提取液按0.5∶1混合，将植物红血球凝集素粗提液缓慢加入甲状腺球蛋白粗提液中。将混合溶液于4℃下10,000rpm离心15min取沉淀。
4.沉淀的溶解将沉淀溶于pH4，55mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液，并对pH4，55mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液透析。将透析后的液体于4℃下10000rpm离15min取上清液
5.G-100凝胶过滤用pH4，55mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液进得平衡至基线稳定，将4中获得的上清液上柱吸附，用pH4，55mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液进得洗脱.，流速为1ml/min，分别收集活性峰(第一个主峰为甲状腺球蛋白，第二个主峰为植物红血球凝集素单体)，装入透析带中，4℃冰箱中PEG浓缩，用纯水透析除盐后，分别冻干，即得到植物红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。得到植物红血球凝集素单体的凝血活力为4μg/ml，纯度达到电泳纯。100g的甲状腺可以得到40mg的甲状腺你球蛋白，纯度达到电泳纯。
实施例3本发明红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的分离纯化方法
1.植物红血球凝集素粗提液制备称取150g红芸豆粉末，用1200ml醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5，25mmol/L，0.14mol/L NaCl)，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其终浓度为25％(质量体积比，m/v)，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，即得植物红血球凝集素粗提液。
2.甲状腺球蛋白的粗提取取150g甲状腺去结缔组织加入1000ml醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5，25mmol/L，0.14mol/L NaCl)粉碎，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其终浓度为20％(质量体积比，m/v)在4℃下10,000rpm离心15min，取上清液，即得甲状腺球蛋白粗提液。
3.植物红血球凝集素与甲状腺球蛋白的共沉淀取植物红血球凝集素与甲状腺球蛋白的粗提取液按2∶1混合，将植物红血球凝集素粗提液缓慢加入甲状腺球蛋白粗提液中。将混合溶液于4℃下10,000rpm离心15min取沉淀。
4.沉淀的溶解将沉淀溶于pH3.6，60mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液，并对pH3.6，60mmol/L，甘氨酸-盐酸缓冲液透析。将透析后的液体于4℃下10000rpm离15min取上清液
5.超滤将4中获得的上清液加到30kD的超滤管中，6000rpm离心15min，再用纯水进行脱盐收集上清和滤液.再将滤液加到10kD的超滤管中，6000rpm离心15min，收集滤液，分别冻干，即得到植物红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。得到植物红血球凝集素单体的凝血活力为4μg/ml，纯度达到电泳纯。100g的甲状腺可以得到40mg的甲状腺你球蛋白，纯度达到电泳纯。
上述实施例说明，本发明方法利用的是甲状腺球蛋白和凝集素单体能够特异结合，形成了一个大分子复合物，这种复合物的分子量超过了甲状腺球蛋白和凝集素单体，因此能够在一定浓度的盐溶液中沉淀下来，但是这个盐浓度下又不会使得单独的甲状腺球蛋白和凝集素单体以及其他杂质蛋白沉淀下来，从而达到纯化的目的；沉淀下来的蛋白复合物在一定pH溶液中可以解离开，从而得到两种纯度高的蛋白质。
综上所述，采用本发明方法共沉淀法从红芸豆中提取甲状腺球蛋白和红芸豆植物红血球凝集素单体，工艺简化，使用的材料价廉，来源广泛，原料易得、生产成本低廉、操作简单、产量高，符合工业化大生产需要且制备的本发明所提取植物红血球凝集素不仅活力高、产量高而且成本低、周期短，在得到红血球凝集素单体的同时又得到了甲状腺球蛋白，制备的甲状腺球蛋白纯度很高，质量超过了常规工艺，产品经济价值高、便于推广，具有较高的经济和实用价值。
Claims (9)
1、一种分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：它是将红芸豆中提取物植物红血球凝集素粗提液与甲状腺球蛋白粗提液混合，采用共沉淀法提取、纯化、分离，分别得红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。
2、根据权利要求1所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、制备红芸豆植物红血球凝素粗提液；
b、制备甲状腺球蛋白粗提液；
c、将红芸豆植物红血球凝素粗提液与甲状腺球蛋白粗提液按体积比为：0.5∶1-2∶1混合，离心，取沉淀；
d、沉淀溶解：将沉淀溶解于pH 3.0～pH 4.0，浓度为40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液，并对缓冲液透析，将透析后的液体于低温下离心，取上清液；
e、纯化：将上清液通过超滤、强酸型阳离子交换层析或者分子筛分离得到植物红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。
3、根据权利要求2所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：a步骤所述的红芸豆植物红血球凝素粗提液的制备方法为：称取红芸豆，粉碎后过60目筛，加入8～10倍量的pH 4.0～pH 6.0，浓度为15mmol/L～35mmol/L，含浓度为0.14mol/LNaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液，浸泡过夜，用四层纱布过滤，收集滤液；将滤液在低温离心，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其终浓度25％～32％m/v；低温离心，取上清液，即得植物红血球凝集素粗提液。
4、根据权利要求2所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：b步骤所述的甲状腺球蛋白粗提液的制备方法为：取猪的新鲜甲状腺去结缔组织，称重后，加入6～8倍量的pH 4.0～pH 6.0，浓度为15mmol/L～35mmol/L，含浓度为0.14mol/LNaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液粉碎，浸泡过夜，后用四层纱布过滤，收集滤液，低温离心，取上清液，向上清液中加入硫酸铵固体粉末，使其浓度为15％-25％m/v低温离心，取上清液，即得甲状腺球蛋白粗提液。
5、根据权利要求2所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：c步骤所述的红芸豆植物红血球凝素粗提液与甲状腺球蛋白粗提液的体积比为：1∶1。
6、根据权利要求2所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：e步骤所述的超滤为：上清液加到20-50kD的超滤管中，离心，再用纯水进行脱盐收集上清液和滤液，上清液冻干为甲状腺球蛋白；再将滤液加到5-15kD的超滤管中，离心，收集上清液，冻干为植物红血球凝集素单体。
7、根据权利要求2所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：e步骤所述离子交换是将上清液上柱吸附，用pH3.0～pH4.0，浓度为40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液进得平衡至基线稳定，用含有NaCl浓度为0-1mol/L，pH3.0～pH4.0，浓度为40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸-盐酸的缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，分别收集活性峰，装入透析带中，低温PEG浓缩，用纯水透析除盐后，分别冻干，即得到植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白。
8、根据权利要求2所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：e步骤所述分子筛分离法是将上清液上柱吸附，用pH3.0～pH4.0，浓度为40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液进得洗脱.，流速为1ml/min，分别收集活性峰，装入透析带中，低温PEG浓缩，用纯水透析除盐后，分别冻干，即得到植物红血球凝集素单体和甲状腺球蛋白。
9、根据权利要求2-8任意一项所述的分离纯化红芸豆植物红血球凝集素和甲状腺球蛋白的方法，其特征在于：所述的低温是低于4℃。
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