CN101543766A - 一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法。该方法包括如下步骤：将质量百分比浓度为2.0～8.0％的羧甲基淀粉－对氨基苯酚接枝物水溶液与质量百分比浓度为0.02～0.20％牛血清蛋白水溶液混合，搅拌条件下，依次加入过氧化氢与辣根过氧化酶，8～12秒内发生凝胶化，经洗脱除去模板分子牛血清蛋白，即得到对牛血清蛋白具有选择性吸附特性的分子印迹水凝胶。本发明具有原料易得、快速凝胶化、反应温和、易控制、获得的分子印迹水凝胶具有较好的识别性能及优良的生物降解和生物相容性，可望在蛋白质分离得到应用。
Description
技术领域
本发明属于功能高分子水凝胶材料的技术领域，特别涉及一种酶促凝胶化快速形成蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法。
背景技术
分子印迹技术是通过模板分子在聚合物网络中形成特征识别单元的过程。近年来，基于分子印迹技术制备出的分子印迹水凝胶(MIHs)材料，不仅可发挥水凝胶柔韧性好、传质快的特性，而且可提高聚合物网络对特定分子的结合力。目前，该类功能材料已在分离、传感、催化、抗体模拟、药物传输等领域显示出广阔的应用前景。
蛋白质是一类重要的天然有机物。它是生物体内一切组织的基础物质，并在生命现象和生命过程中起决定性作用。蛋白质的结构复杂，一般由200～300个氨基酸所构成的，这给蛋白质分离、提纯带来极大困难。目前，用于蛋白质分离的方法主要有凝胶过滤、电泳和色谱法。然而，这些方法所需材料的制备耗时长、成本高、且稳定性较差(Bergmann N M，Peppas N A.Progress in Polymer Science，2008，33：271-288)。利用分子印迹水凝胶易于大量制备、性能稳定、专一识别性等优点，可望解决蛋白质识别、分离中的技术难题。
迄今为止，有关氨基酸等小分子的分子印迹技术已得到一定程度的应用，但对蛋白类生物大分子的印迹技术尚存在以下不足：首先，常用分子印迹材料制备过程中，为了实现分子识别，功能单体需先与模板分子相互作用形成某种可逆复合物，再加入引发剂和交联剂进行共聚交联，这一过程往往需数小时才能完成(中国专利CA1844174A)，从而使蛋白质活性难以保持；其次，传统分子印迹过程多在有机溶剂中进行，且有关共聚交联一般需在光照或加热等条件下进行，而这些条件又极易引起蛋白质变性失活；第三，常见MIHs制备时多采用丙烯酸、丙烯酰胺等乙烯基衍生物作为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯、N，N-亚甲基双丙烯酰胺等作为交联剂(Ohad K，Havazelet B P.Langmuir，2007，23：6329-6335)，致使所得分子印迹材料的生物降解及相容性较差，从而限制了MIHs在蛋白质分子印迹方面的应用。因此，如何在温和反应条件下、快速制备出具有良好生物相容性的MIHs材料，是当前蛋白质分子印迹技术领域的一项重要研究课题。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)将质量百分比浓度为2.0～8.0％的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物水溶液与质量百分比浓度为0.02～0.2％牛血清蛋白水溶液混合；
(2)在搅拌的条件下，依次加入占羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物总质量的0.30～0.70％的过氧化氢(H2O2)和占羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物总质量的0.01～0.04％的辣根过氧化酶(HRP)，凝胶化反应8～12s，得到凝胶化反应产物；
(3)洗脱除去模板分子牛血清蛋白，得到对牛血清蛋白具有选择性吸附特性的分子印迹水凝胶。
步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶液和牛血清蛋白溶液的质量比为1∶1。
步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶液是将羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶于水中或缓冲试剂中；所述牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于水中或缓冲试剂中。所述缓冲试剂是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或柠檬酸钠。
步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的合成方法，包括以下操作步骤：
(a)制备羧甲基淀粉：将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL异丙醇和8.0g氢氧化钠，60℃条件下搅拌，溶胀熟化1h，加入25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于40～50℃下真空干燥48h，得到羧甲基淀粉；
(b)制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物：取5.0g步骤(a)所得羧甲基淀粉溶于60mL二甲基亚砜(DMSO)中，100℃条件下搅拌溶胀1h；冷却至室温，在搅拌条件下，加入0.3～1.0gN，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、0.15～0.50gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.30～2.0g的对氨基苯酚进行酰胺化反应；在搅拌条件下反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，洗涤、干燥后得到羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物。
步骤(2)所述过氧化氢制成质量百分比浓度为0.5～2.0％的水溶液；所述辣根过氧化酶制成质量体积浓度为0.30～1.0mg/mL的水溶液，该辣根过氧化酶的活性为200～250U/mg。
步骤(3)所述洗脱除去牛血清蛋白的方法为：将步骤(2)所得凝胶化反应产物用质量百分含量为2.0～8.0％的十二烷基磺酸钠的乙酸/水混合溶液洗涤至其在紫外278nm处没有吸收。
所述乙酸/水是体积比为1∶9～2∶8的乙酸和水的混合物。
将步骤(3)所得蛋白质分子印迹水凝胶用水洗涤至中性，除去残余的十二烷基磺酸钠和乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。
上述方法所得蛋白质分子印迹水凝胶的选择性吸附特性测定方法为：称取两份质量为0.10g的分子印迹干胶并浸入蒸馏水中充分溶胀，再分别置于5.0mL浓度均为1.0mg/mL的牛血清蛋白和干酪素水溶液中，吸附4h后，用紫外分光光度法测定吸附量(牛血清和干酪素的测定波长分别为278nm和288nm)，并计算出分离因子(α)和印迹效率(β)。
本发明的原理是：以具有良好生物降解和生物相容性的天然多糖为基本原材料，首先合成了羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物，再采用酶促凝胶化法在水溶液中快速形成蛋白质分子印迹水凝胶；本发明通过控制羧甲基淀粉与对氨基苯酚接枝物的取代度及其与牛血清蛋白的投料比，以过氧化氢和辣根过氧化酶为催化剂，引发凝胶化反应，于室温条件下，制备系列可生物降解且具有良好生物相容性的蛋白质印迹水凝胶。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：(1)酶促凝胶化法制备蛋白质印迹水凝胶，不涉及其它化学交联剂与引发剂，制备工艺简单，且容易控制；(2)反应条件温和，在室温下瞬时形成，凝胶化速度快，可有效避免蛋白质变性；(3)凝胶化过程在水介质中进行；(4)分子印迹凝胶的强度可通过羧甲基淀粉与对氨基苯酚接枝物的浓度及取代度进行调控；(5)由本发明的方法制得的分子印迹水凝胶性能稳定，可长期保存；(6)所采用的主要原料为淀粉，原料来源广泛，所形成的分子印迹水凝胶具有良好的生物降解性及生物相容性。
附图说明
图1为本发明牛血清蛋白分子印迹干凝胶模板分子洗脱前与洗脱后的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)制备羧甲基淀粉：将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL异丙醇、8.0g氢氧化钠，60℃条件下磁力搅拌，溶胀熟化1h，加入25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于40℃真空干燥48h，即得到羧甲基淀粉，采用酸碱滴定法测得该羧甲基淀粉的取代度为0.20；
(2)制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物：取5.0g羧甲基淀粉置于150mL圆底烧瓶中，并加入60mL二甲基亚砜(DMSO)，100℃条件下搅拌溶胀1h；冷却至室温，磁力搅拌条件下，加入0.30g的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.15g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，然后加入0.30g的对氨基苯酚进行酰胺化反应；搅拌反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，经洗涤、干燥得羧甲基淀粉与对氨基苯酚接枝物，用紫外光谱法测得该接枝物的对氨基苯酚的取代度为0.03；
(3)将2.0g质量百分比浓度为4.0％，取代度为0.03的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物水溶液与2.0g质量百分比浓度为0.08％牛血清蛋白水溶液充分混合；
(4)磁力搅拌条件下，依次加入0.50mg的H2O2(H2O2制成质量百分比浓度为0.5％的水溶液)是与0.03mg的辣根过氧化酶(辣根过氧化酶制成质量体积浓度为0.30mg/mL的水溶液，该辣根过氧化酶的活性为200U/mg)，凝胶化反应8s，得到凝胶化产物；
(5)将制得的凝胶化产物用质量百分含量为2.0％的十二烷基磺酸钠的乙酸/水混合溶液(乙酸和水的体积比为1：9)洗涤至紫外278nm处没有吸收为止，得蛋白质分子印迹水凝胶；洗脱后的分子印迹水凝胶再用大量蒸馏水洗涤至中性，除去残余的十二烷基磺酸钠及乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。
将步骤(5)中洗脱前后的蛋白质分子印迹水凝胶进行红外光谱测定，如图1所示，图1(A)为牛血清蛋白质分子印迹水凝胶模板分子洗脱前的红外光谱图，与图1(B)为牛血清蛋白质分子印迹水凝胶模板分子洗脱后的红外光谱图。图1A在1316、710cm-1处出现了牛血清蛋白的特征吸收峰，这表明牛血清蛋白已成功印迹到水凝胶网络结构中，而对比图1A、B发现，图1B在该位置没有吸收峰，这表面蛋白质洗脱较完全。进一步比较图1A、B两红外谱图发现，图1A中羧基的特征吸收峰出现在1609、1424cm-1处，而图1B中羧基的特征吸收峰是在1645和1398cm-1处；另外，洗脱前后葡萄糖单元环上的C—OH不对称伸缩振动峰也由1040cm-1变为和1010cm-1。这些吸收峰的偏移是由于羧甲基淀粉上的羧基、羟基与牛血清蛋白分子间存在较强的氢键作用。
测定本实施例制得的牛血清蛋白分子印迹水凝胶的分离因子(α)为1.61，印迹效率(β)为1.70。
实施例2
(1)制备羧甲基淀粉：将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL异丙醇、8.0g氢氧化钠，60℃条件下磁力搅拌，溶胀熟化1h，加入25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于45℃真空干燥48h，即得到羧甲基淀粉，采用酸碱滴定法测得该羧甲基淀粉的取代度为0.20；
(2)制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物：取5.0g羧甲基淀粉置于150mL圆底烧瓶中，并加入60mL二甲基亚砜(DMSO)，100℃条件下搅拌溶胀1h。冷却至室温，磁力搅拌条件下，加入0.50g的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.25g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，然后加入0.60g的对氨基苯酚进行酰胺化反应；搅拌反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，经洗涤、干燥得羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物，用紫外光谱法测得该接枝物的对氨基苯酚的取代度为0.06；
(3)将2.0g质量百分比浓度为2.0％，取代度为0.06的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的碳酸钠溶液与2.0g质量百分比浓度为0.02％牛血清蛋白碳酸氢钠溶液混合；
(4)磁力搅拌条件下，依次加入0.12mg的H2O2(H2O2制成质量百分比浓度为1.0％的水溶液)与0.016mg的辣根过氧化酶(辣根过氧化酶制成质量体积浓度为0.5mg/mL的水溶液，该辣根过氧化酶的活性为250U/mg)，凝胶化反应10s，得到凝胶化产物；
(5)将制得的凝胶化产物用十二烷基磺酸钠质量百分含量为4.0％的乙酸/水混合溶液(乙酸和水的体积比为1：8)洗涤至紫外278nm处没有吸收为止，得蛋白质分子印迹水凝胶；洗脱后的蛋白质分子印迹水凝胶再用大量蒸馏水洗涤至中性，除去残余的十二烷基磺酸钠及乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。
测定本实施例制得的牛血清蛋白分子印迹水凝胶的的分离因子(α)为1.73，印迹效率(β)为1.81。
实施例3
(1)制备羧甲基淀粉：将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL异丙醇、8.0g氢氧化钠，60℃条件下磁力搅拌，溶胀熟化1h，加入25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于50℃真空干燥48h，即得到羧甲基淀粉，采用酸碱滴定法测得该羧甲基淀粉的取代度为0.20；
(2)制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物：取5.0g羧甲基淀粉置于150mL圆底烧瓶中，并加入60mL二甲基亚砜(DMSO)，100℃条件下搅拌溶胀1h。冷却至室温，磁力搅拌条件下，加入1.0g的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.50g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，然后加入2.0g的对氨基苯酚进行酰胺化反应。搅拌反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，经洗涤、干燥得羧甲基淀粉与对氨基苯酚接枝物，用紫外光谱法测得该羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的对氨基苯酚的取代度为0.10；
(3)将1.0g质量百分比浓度为6.0％，取代度为0.10的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的磷酸氢二钠溶液与1.0g质量百分比浓度为0.1％牛血清蛋白的磷酸二氢钠溶液混合；
(4)磁力搅拌条件下，依次加入0.24mg的H2O2(H2O2制成质量百分比浓度为1.5％的水溶液)与0.012mg的辣根过氧化酶(辣根过氧化酶制成质量体积浓度为0.6mg/mL的水溶液，该辣根过氧化酶的活性为220U/mg)，凝胶化反应12s，得到凝胶化产物；
(5)将制得的凝胶化产物用十二烷基磺酸钠质量百分含量为6.0％的乙酸/水混合溶液(乙酸和水的体积比为1∶5)洗涤至紫外278nm处没有吸收为止，得蛋白质分子印迹水凝胶；洗脱后的分子印迹水凝胶再用大量蒸馏水洗涤至中性，除去残余的十二烷基磺酸钠及乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。
测定本实施例制得的牛血清蛋白分子印迹水凝胶的的分离因子(α)为2.09，印迹效率(β)为2.13。
实施例4
(1)制备羧甲基淀粉：将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL异丙醇、8.0g氢氧化钠，60℃条件下磁力搅拌，溶胀熟化1h，加入25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于47℃真空干燥48h，即得到羧甲基淀粉，采用酸碱滴定法测得该羧甲基淀粉的取代度为0.20；
(2)制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物：取5.0g羧甲基淀粉置于150mL圆底烧瓶中，并加入60mL二甲基亚砜(DMSO)，100℃条件下搅拌溶胀1h。冷却至室温，磁力搅拌条件下，加入0.50g的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.25g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，然后加入0.60g的对氨基苯酚进行酰胺化反应。搅拌反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，经洗涤、干燥得羧甲基淀粉与对氨基苯酚接枝物，用紫外光谱法测得该羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的对氨基苯酚的取代度为0.06。
(3)将2.0g质量百分比浓度为8.0％，取代度为0.06的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物水溶液与2.0g质量百分比浓度为0.04％牛血清蛋白柠檬酸钠溶液混合；
(4)磁力搅拌下，磁力搅拌条件下，依次加入0.96mg的H2O2(H2O2制成质量百分比浓度为2.0％的水溶液)与0.016mg的辣根过氧化酶(辣根过氧化酶制成质量体积浓度为0.8mg/mL的水溶液，该辣根过氧化酶的活性为230U/mg)，凝胶化反应11s，得到凝胶化产物；
(5)将制得的蛋白质分子印迹水凝胶用十二烷基磺酸钠质量百分含量为8.0％的乙酸/混合水溶液(乙酸和水的体积比为2：9)洗涤至紫外278nm处没有吸收为止，得蛋白质分子印迹水凝胶；洗脱后的分子印迹水凝胶再用大量蒸馏水洗涤至中性，除去残余的十二烷基磺酸钠及乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。
测定本实施例制得的牛血清蛋白分子印迹水凝胶的的分离因子(α)为1.41，印迹效率(β)为1.55。
实施例5
(1)制备羧甲基淀粉：将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL异丙醇、8.0g氢氧化钠，60℃条件下磁力搅拌，溶胀熟化1h，加入25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于43℃真空干燥48h，即得到羧甲基淀粉，采用酸碱滴定法测得该羧甲基淀粉的取代度为0.20；
(2)制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物：取5.0g羧甲基淀粉置于150mL圆底烧瓶中，并加入60mL二甲基亚砜(DMSO)，100℃条件下搅拌溶胀1h。冷却至室温，磁力搅拌条件下，加入0.50g的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.25g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，然后加入0.60g的对氨基苯酚进行酰胺化反应。搅拌反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，经洗涤、干燥得羧甲基淀粉与对氨基苯酚接枝物，用紫外光谱法测得该羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的对氨基苯酚的取代度为0.06。
(3)将1.0g质量百分比浓度为8.0％，取代度为0.06的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的柠檬酸钠溶液与1.0g质量百分比浓度为0.16％牛血清蛋白水溶液混合：
(4)磁力搅拌下，磁力搅拌条件下，依次加入0.4mg的H2O2(H2O2制成质量百分比浓度为1.8％的水溶液)与0.024mg的辣根过氧化酶(辣根过氧化酶制成质量体积浓度为1.0mg/mL的水溶液，该辣根过氧化酶的活性为200U/mg)，凝胶化反应9s，得到凝胶化产物；
(5)将制得的蛋白质分子印迹水凝胶用十二烷基磺酸钠质量百分含量为5.0％的乙酸/水混合溶液(乙酸和水的体积比为2：8)洗涤至紫外278nm处没有吸收为止，得蛋白质分子印迹水凝胶；洗脱后的分子印迹水凝胶再用大量蒸馏水洗涤至中性，除去残余的十二烷基磺酸钠及乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。
测定本实施例制得的牛血清蛋白分子印迹水凝胶的的分离因子(α)为1.73，印迹效率(β)为1.90。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1、一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)将质量百分比浓度为2.0～8.0％的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶液与质量百分比浓度为0.02～0.2％牛血清蛋白溶液混合；
(2)在搅拌的条件下，依次加入占羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物总质量的0.30～0.70％的过氧化氢和占羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物总质量的0.01～0.04％的辣根过氧化酶，反应8～12s，得到凝胶化反应产物；
(3)洗脱除去牛血清蛋白，得到蛋白质分子印迹水凝胶。
2、根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶液和牛血清蛋白溶液的质量比为1：1。
3、根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶液是将羧甲基淀粉—对氨基苯酚接枝物溶于水中或缓冲试剂中；所述牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于水中或缓冲试剂中。
4、根据权利要求3所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：所述缓冲试剂是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或柠檬酸钠。
5、根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的合成方法包括以下操作步骤：
(a)制备羧甲基淀粉：将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL异丙醇和8.0g氢氧化钠，60℃条件下搅拌，溶胀熟化1h，加入25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于40～50℃下真空干燥48h，得到羧甲基淀粉；
(b)制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物：取5.0g步骤(a)所得羧甲基淀粉溶于60mL二甲基亚砜中，100℃条件下搅拌溶胀1h；冷却至室温，在搅拌条件下，加入0.3～1.0gN，N-二环己基碳二亚胺、0.15～0.50gN-羟基琥珀酰亚胺和0.30～2.0g的对氨基苯酚进行酰胺化反应；在搅拌条件下反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，洗涤、干燥后得到羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物。
6、根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述过氧化氢制成质量百分比浓度为0.5～2.0％的水溶液；所述辣根过氧化酶制成质量体积浓度为0.30～1.0mg/mL的水溶液，该辣根过氧化酶的活性为200～250U/mg。
7、根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述洗脱除去牛血清蛋白的方法为：将步骤(2)所得凝胶化反应产物用质量百分含量为2.0～8.0％的十二烷基磺酸钠的乙酸/水混合溶液洗涤至其在紫外278nm处没有吸收。
8、根据权利要求7所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：所述乙酸/水是体积比为1：9～2：8的乙酸和水的混合物。
9、根据权利要求1～8任一项所述的一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：将步骤(3)所得蛋白质分子印迹水凝胶用水洗涤至中性，除去残余的十二烷基磺酸钠和乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。
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