CN101543498B - 苦茶碱在制备消炎镇痛药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了苦茶碱(1，3，7，9-四甲基尿酸)在制备消炎镇痛药物中的应用。苦茶碱系从野生苦茶C.Kucha(Chang et Wang)Chang中提取得到。新鲜苦茶经杀青锅炒干燥后，以水提取，碱式醋酸铅沉淀茶多酚、氯仿萃取物经硅胶柱层析、重结晶，得到纯度为95％以上的苦茶碱。甲醛致小鼠足肿胀实验和二甲苯致小鼠耳肿胀实验显示，给予32mg/kg和64mg/kg苦茶碱时，可显著抑制小鼠足肿胀和耳肿胀。醋酸致小鼠扭体试验证明，给予8mg/kg-64mg/kg苦茶碱，均表现出显著的镇痛作用。热板法致小鼠疼痛实验显示，给药量64mg/kg时可在给药后30min产生显著的镇痛作用。以上实验结果表明苦茶碱可用于制备消炎镇痛药物。
Description
技术领域
本发明涉及天然化合物苦茶碱(1，3，7，9-四甲基尿酸)新药物用途。
背景技术
天然的苦茶碱由T.B.Johnson于1937年发现，他从数百万磅提取咖啡碱后的茶渣中分离出少量该化合物(T.B.Johnson.Purines in the plant kingdom：the discovery of a new purine intea.J.Am.Chem.Soc.，1937，59：1261-1264)。苦茶碱在茶叶中含量甚微，无法通过常规分析方法从茶叶中检出。1999年，我们在对苦茶中的嘌呤生物碱组成进行研究时发现了该化合物在苦茶中的大量存在。苦茶是张宏达教授1984年发表的新变种C.sinensis var.kucha Changet Wang(张宏达，茶叶植物资源的订正，中山大学(自然科学版)，1984，1：10-11)，后来在中国植物志他又将其转移为普洱茶的变种C.assamica var kucha Chang et Wang(张宏达，任善相.中国植物志，四十九卷第三分册：136.北京：科学出版社，1998)。2008年，我们根据苦茶具有小苞片3-4，萼片4-6mm，外面无毛，内面被白色短柔毛，外面2枚花瓣内面被白色短柔毛而不同于普洱茶，又根据其芽叶含特殊生物碱苦茶碱，不同于普洱茶，把它提升为种C.Kucha(Chang et Wang)Chang(石祥刚，郑新强，宋晓虹，王园园，叶创兴.苦茶新组合.中山大学学报(自然科学版)，2008，47(6)：129-130)。
苦茶碱在大果咖啡(Coffea liberica)中也微量存在，但是经研究发现，它只是中间代谢产物，很快转变为其它尿酸类物质，不形成积累(Baumann TW，Oechslin M，WannerH.Caffeine and methylated uric acid：chemical patterns during vegetative development of Coffealiberioa.Biochem physiol pflanzen，1976，170：217-225)。通过加入合成嘌呤碱的14C前体，如蛋氨酸、腺嘌呤，对苦茶体内嘌呤碱的生物代谢途径进行研究，发现苦茶碱最后是由咖啡碱在N-9位置上通过甲基转移酶将蛋氨酸提供的甲基键合上去，形成了苦茶碱(Zheng XQ，Ye CX，Kato M，Crozier A，Ashihara H.Theacrine(1，3，7，9-tetramethyluric acid)synthesis inleaves of a Chinese tea，kucha(Camellia assamica var.kucha).Phytochemistry，2002，60(2)：129-134)。由此可见，苦茶碱在苦茶中的积累是稳定的。
非甾体类消炎镇痛药物广泛用于治疗类风湿性关节炎、痛风、强直性脊柱炎、肿瘤疼痛等，目前用于临床的此类药物常会产生一定的毒副作用，因此，非甾体类消炎镇痛药物仍是药物开发热点，每年都有此类新药上市。
发明内容
本发明的目的在于提供天然苦茶碱在制备消炎镇痛药物中的用途。
本发明的化合物苦茶碱(1，3，7，9-四甲基尿酸)结构式如式(I)所示：
本发明的化合物苦茶碱从苦茶芽叶中提取。
本发明所用的分离原料苦茶芽叶采自野生苦茶植株。
用于药理测试的苦茶碱的分离工艺包括以下步骤：
A、苦茶碱提取液的制备：
取苦茶50g，加入20倍体积沸水保温90℃浸提30min，每隔10min振摇一次，过滤，滤渣加10倍体积沸水再浸提两次，每次20min，合并三次滤液，得苦茶碱提取液。
B、苦茶碱粗品的制备：
向苦茶碱提取液中加入饱和碱式醋酸铅水溶液至不再出现沉淀，过滤，以少量沸水洗涤滤渣，滤液浓缩至300ml，等体积氯仿萃取3次，合并氯仿层，减压浓缩，收集残物淡黄色固体，即为苦茶碱粗品。
C、苦茶碱纯品的制备：
苦茶碱粗品以200-300目硅胶为固定相，乙酸乙酯∶石油醚＝80∶20为洗脱剂，进行柱层析，收集含苦茶碱流分，同样条件再层析一次，甲醇重结晶，即得到纯度95％以上的苦茶碱。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
醋酸致小鼠扭体试验显示，小鼠的扭体次数随着苦茶碱给药剂量的增加而减少，苦茶碱8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg剂量组对冰醋酸致小鼠疼痛的镇痛率分别为30.4％、32.3％、36.6％和61.5％；阳性药消炎痛的镇痛率为41.6％。热板法致小鼠疼痛实验显示，给予苦茶碱8mg/kg-64mg/kg后30min至120min，小鼠舔后足的时间呈现不同程度的延长，其中64mg/kg组小鼠给药30min和60min时的痛阈值明显提高。由此提示，苦茶碱给药量64mg/kg时可在给药后30min产生镇痛作用。甲醛致小鼠足肿胀实验显示，给予苦茶碱8mg/kg-64mg/kg后，小鼠足肿胀度随着给药剂量的增加而降低，其中32mg/kg和64mg/kg组小鼠的肿胀度与同期空白对照组相比，具有显著性差异。二甲苯致小鼠耳肿胀实验显示，给予苦茶碱32mg/kg、64mg/kg时，对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制率分别为47.2％和48.4％；阳性药消炎痛的抑制率为66.6％。以上实验结果表明化合物苦茶碱可用于制备镇痛消炎药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：苦茶碱的分离纯化
A、苦茶碱提取液的制备：
取苦茶50g，加入20倍体积沸水保温90℃浸提30min，每隔10min振摇一次，过滤，滤渣加10倍体积沸水再浸提两次，每次20min，合并三次滤液，得苦茶碱提取液。
B、苦茶碱粗品的制备：
向苦茶碱提取液中加入饱和碱式醋酸铅水溶液至不再出现沉淀，滤过，少量沸水洗涤滤渣，滤液浓缩至300ml，等体积氯仿萃取3次，合并氯仿层，减压浓缩，收集残物淡黄色固体，即为苦茶碱粗品。
C、苦茶碱纯品的制备：
苦茶碱粗品以200-300目硅胶为固定相，乙酸乙酯∶石油醚＝80∶20为洗脱剂，进行柱层析，收集含苦茶碱流分，同样条件再层析一次，甲醇重结晶，即得到纯度95％以上的苦茶碱。
实施例2：苦茶碱对醋酸致小鼠扭体实验
选取健康NIH雄性小鼠60只，体重18-22g，动物检疫合格后，随机分成6组，分别是空白对照组、苦茶碱4个剂量组和消炎痛对照组，每组10只小鼠。实验前各组小鼠先灌胃给药，空白对照组小鼠每日给予等体积的纯净水；连续给药3天；阳性药消炎痛于实验结束前给药一次，给药剂量为10mg/kg，相当于70kg成人日服用175mg(含辅料)的1倍。
腹腔注射样品，给药后1h每鼠腹腔注射1.44％冰醋酸0.2ml/20g，记录注射致痛剂20min后内各鼠扭体次数，比较组间差异，然后计算药物镇痛百分率。
镇痛率％＝(空白组扭体次数-给药组扭体次数)÷空白组扭体次数×100％
苦茶碱对冰醋酸致小鼠扭体实验结果见表1。
表1 苦茶碱对冰醋酸致小鼠扭体实验结果(x±SD，n＝10)
注：与同期空白对照组比较***P＜0.001，ΔP＞0.05(标志略)；t检验。
由以上实验结果可得，苦茶碱8mg/kg-64mg/kg剂量组小鼠的扭体次数随着给药剂量的增加而减少，对冰醋酸致小鼠疼痛的镇痛率分别为30.4％、32.3％、36.6％和61.5％；与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01、P＜0.001)。阳性药消炎痛组小鼠的扭体次数与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01)，镇痛率为41.6％，与其临床适应症相符合。由此提示，苦茶碱具有一定的对抗外周神经痛的作用。
实施例3：苦茶碱对热板法致小鼠疼痛实验
选取健康NIH雌性小鼠60只，体重18-22g，动物检疫合格后，随机分成6组，分别是空白对照组、苦茶碱4个剂量组和消炎痛对照组，每组10只小鼠。实验前各组小鼠先灌胃给药，空白对照组小鼠每日给予等体积的纯净水；连续给药3天；阳性药消炎痛于实验结束前给药一次，给药剂量为10mg/kg，相当于70kg成人日服用75mg(含辅料)的1倍。
把小鼠放于预先加热到55℃的GJ-8402型热板测痛仪上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间(秒)作为该鼠的痛阈值。给药前先测定每只小鼠的痛阈(不超过30秒者为合格)。给药后30、60、90、120、180min测定一次，如痛阈值超过60秒，即停止测试而按60秒计算。实验结束，按所测之痛阈平均值计算痛阈提高百分率。
痛阈提高百分率％＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)÷用药前平均痛阈值×100％。
苦茶碱对热板法致小鼠疼痛实验结果见表2。
表2 苦茶碱对热板法致小鼠疼痛的实验结果(x±SD，n＝10)
注：与同期空白对照组比较*P＜0.05，ΔP＞0.05(标志略)；t检验。
由以上实验结果可得，致炎前各给药组小鼠对热板的阈值与空白对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)；给药后30min至120min，苦茶碱各剂量组小鼠舔后足的时间呈现不同程度的延长，其中64mg/kg组小鼠的给药30min和60min时的痛阈值明显提高，与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01、P＜0.001)；当致炎后120min时，8mg/kg和16mg/kg组小鼠的痛阈值达峰值，与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05、P＜0.001)；而64mg/kg组小鼠的痛阈值呈现回落。消炎痛对照组小鼠在给药后30min至180min内，与同期空白对照组相比，均无显著性差异(P＞0.05)，与其对中枢神经系统的镇痛效果不佳有关。由此提示，苦茶碱高浓度时可在给药后30min时产生镇痛作用，而苦茶碱低浓度时的镇痛作用时间呈现延长，可能与其对中枢神经系统的抑制作用有关。
实施例4：苦茶碱对二甲苯致小鼠耳肿胀实验
选取健康NIH雄性小鼠60只，体重18-22g，动物检疫合格后，随机分成6组，分别是空白对照组、苦茶碱4个剂量组和消炎痛对照组，每组10只小鼠。实验前各组小鼠先灌胃给药，空白对照组小鼠每日给予等体积的纯净水；连续给药3天；阳性药消炎痛于实验结束时前给药一次，给药剂量为10mg/kg，相当于70kg成人日服用75mg(含辅料)的1倍。
实验开始前各组小鼠分别给药，30min后开始进行致炎作用。将二甲苯0.03ml滴于小鼠的右耳，以左耳作为对照。滴加致炎剂后30min后将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径6mm的打孔器分别在左右两耳同一部位打下圆耳片，称重，求左、右耳片重量之差作为肿胀度，比较组间差异。
肿胀度(mg)＝左耳片重量-右耳片重量
抑制率％＝(空白组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)÷空白组平均肿胀度×100％
苦茶碱对二甲苯致小鼠耳肿胀实验结果见表3所示。
表3 苦茶碱对二甲苯致小鼠耳肿胀实验结果(x±SD，n＝10)
注：与同期空白对照组比较***P＜0.001，ΔP＞0.05(标志略)；t检验。
由以上实验结果可得，苦茶碱8mg/kg-64mg/kg剂量组小鼠的肿胀度随着给药剂量的增加而降低，对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制率分别为10.0％、10.3％、47.2％和48.4％；其中32mg/kg和64mg/kg组小鼠的耳肿胀度与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.001)。阳性药消炎痛组小鼠的肿胀度最小，与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.001)，抑制率为66.6％，与其临床适应症相符合。由此提示，苦茶碱高浓度时具有一定的抗炎作用。
实施例5：苦茶碱对甲醛致小鼠足肿胀实验
选取健康NIH雄性小鼠120只，体重18-22g，动物检疫合格后，随机分成9组，分别是空白对照组、苦茶碱7个剂量组和地西泮片对照组，其中空白对照组包括预实验40只小鼠，其余各组10只小鼠。实验前各组小鼠先灌胃给药，空白对照组小鼠每日给予等体积的纯净水；连续给药3天；阳性药消炎痛于实验结束时前给药一次，给药剂量为10mg/kg，相当于70kg成人日服用75mg(含辅料)的1倍。
实验开始时，分别用足体积测量仪测定小鼠的足体积，先取得致炎前小鼠足部数据，然后进行给药，30min后于小鼠同一部位(右后足)足底注射2％的甲醛生理盐水注射液20μl/只，分别在注射致炎剂后0.5h、1h、1.5h、2h时，测量小鼠的足体积值，分别计算肿胀度和抑制率。进行统计学处理并比较组间差异。
肿胀度(ml)＝致炎后足体积值-致炎前足体积值
抑制率％＝(空白组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)÷空白组平均肿胀度×100％
苦茶碱对注射甲醛致小鼠足肿胀的实验结果见表4。
表4 苦茶碱对注射甲醛致小鼠足肿胀的实验结果(x±SD，n＝10)
注：与同期空白对照组比较*P＜0.05，ΔP＞0.05(标志略)；t检验。
由以上实验结果可得，致炎前各给药组小鼠足体积与空白对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)；致炎后30min至90min，苦茶碱各剂量组的肿胀度随着给药剂量的增加而降低，其中32mg/kg和64mg/kg组小鼠的肿胀度与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05、P＜0.01)；当致炎后120min时，各组小鼠的肿胀度呈现回升，与同期空白对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。消炎痛对照组小鼠肿胀度自致炎后30min至90min内，与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01)，2小时后仍可保持；与其临床效果相符合。由此提示，苦茶碱高浓度时具有一定的抗炎作用。
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