CN101541825A

CN101541825A - Fc融合蛋白的纯化方法

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Publication number: CN101541825A
Application number: CNA2007800319195A
Authority: CN
Inventors: A·翁-杜瓦尔; A·兰姆普罗伊
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2006-08-28
Filing date: 2007-08-27
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2027-08-27
Also published as: ZA200900836B; WO2008025747A1; EP2061802A1; AR062569A1; AU2007291282A1; AU2007291282B2; EA200970230A1; CA2661872A1; UA99263C2; IL197221A; BRPI0716139A2; IL197221A0; NZ574623A; MX2009002013A; EA017733B1; KR20090058532A; US20100267932A1; CN101541825B

Abstract

本发明涉及等电点(pI)在6.9－9.5之间的Fc－融合蛋白的纯化方法，包括蛋白A或蛋白G亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。

Description

Fc融合蛋白的纯化方法

发明领域

本发明属于蛋白质纯化领域。更具体说，本发明涉及通过蛋白A或蛋白G亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和羟基磷灰石层析纯化Fc-融合蛋白。

发明背景

蛋白质作为通常称为“生物制品”的药物在商业上日益变得重要。其最大的挑战之一是在商品化规模上开发具有成本效益和有效的蛋白质纯化方法。虽然现已有许多大规模纯化蛋白质的方法可采用，但粗制品，如细胞培养上清液不仅含有所需的产物也含有难以与所需产物分离的杂质。如果用无血清培养基培养细胞，表达重组蛋白产物细胞的细胞培养上清液含有的杂质可能较少，但是在纯化过程中仍需要去除宿主细胞的蛋白质(HCP)。另外，卫生主管当局对人用蛋白质的纯度要求标准很高。

许多纯化方法包括需要采用可能危害给定蛋白质生物学活性的低或高pH、高盐浓度或其它极端条件。因此，对于任何蛋白质而言，建立能够充分纯化同时保留该蛋白质生物学活性的纯化方法是一种挑战。

一些已知的层析系统已广泛用于蛋白质纯化。

用于分离蛋白质的离子交换层析系统主要依据电荷的差异。离子交换层析时，假如周围缓冲液提供的离子强度低，溶质表面的带电区通过被相反电荷所吸引而吸附于层析基质。通常通过提高缓冲液的离子强度(即导电率)与溶质竞争离子交换基质的带电位点来实现洗脱。改变pH因而改变溶质所带电荷是另一种实现溶质洗脱的方法。导电率或pH的这种改变可以是渐增(梯度洗脱)或分步(分步洗脱)的。

阴离子交换剂可分类为弱或强交换剂。弱阴离子交换剂上的带电基团是弱碱性基团，当处于高pH时因去质子化而丧失了所带电荷。DEAE-琼脂糖是弱阴离子交换剂的-个例子，其氨基在低于约pH9时带正电荷而在更高pH时逐渐丧失此电荷。例如，溴化甲基苯羟乙胺(DEAE)或二乙基-(2-羟基-丙基)氨基乙基(diethyl-(2-hydroxy-propyl)aminoethyl，QAE)含抗衡离子氯离子。另一方面，强阴离子交换剂含强碱基团，在离子交换层析通常所用的整个pH范围内(pH1-14)都带正电荷。Q-琼脂糖(Q表示季胺)是强阴离子交换剂的一个例子。

阳离子交换剂可分类为弱或强交换剂。强阳离子交换剂含强酸基团(如磺丙基)，在pH1-14时维持带电，而弱阳离子交换剂含弱酸基团(如羧甲基)，随pH降低到4或5以下逐渐失去电荷。例如，羧甲基(CM)和磺丙基(SP)含抗衡离子钠离子。

一种不同的层析树脂是基于不溶性羟基磷酸钙基质称为羟基磷灰石的树脂。羟基磷灰石层析是一种利用可形成基质和配体的不溶性羟基化磷酸钙(Ca₅(PO₄)₃OH)₂纯化蛋白质的方法。其功能基团包括成对带正电的钙离子(C-位点)和成簇带负电的磷酸根基团(P-位点)。羟基磷灰石与蛋白质之间的相互作用具有复杂的多重模式。在一种相互作方式中，蛋白质上带正电的氨基与(树脂)带负电的P-位点结合，蛋白质的羧基则通过与(树脂)C-位点配位络合相互作用(Shepard等，2000)。

晶体状羟基磷灰石是首先用于层析的羟基磷灰石类型。在羟基磷灰石层析中进一步开发了陶瓷羟基磷灰石(CHA)层析。与晶体状羟基磷灰石相比，陶瓷羟基磷灰石耐用性高，蛋白结合能力好，可在高流速和高压情况下使用(Vola等，1993)。

羟基磷灰石业已用于层析分离蛋白质、核酸以及抗体。在羟基磷灰石层析中，通常要以低浓度的磷酸缓冲液平衡层析柱和加载样品，然后用梯级浓度的磷酸盐缓冲液洗脱吸附的蛋白质(Giovannini等，2000)。

还有另外一种纯化蛋白质的方法是基于感兴趣蛋白质与固定在层析树脂上的另一种蛋白的亲和力。这种固定配体(蛋白)的例子是对某些免疫球蛋白的Fc部分具有特异性的细菌的细胞壁蛋白质：蛋白A和蛋白G。虽然蛋白A和蛋白G二者对IgG抗体具有强亲和力，但它们对其它类型的免疫球蛋白和其同种型亲和力不同。

蛋白A是由金黄色葡萄菌产生的一种43,000道尔顿的蛋白质，含有4个与IgG的Fc区的结合位点。蛋白G由G属链球菌产生，含有2个对IgG的Fc区的结合位点。这两种蛋白质的特性已得到广泛鉴定，它们对各种类型的免疫球蛋白具有亲和力。蛋白L是来源于消化链球菌属的另一种细菌蛋白质，能结合免疫球蛋白及其含有Ig轻链的片段(Akerstrom和Bjork，1989)。

蛋白A、蛋白G和蛋白L亲和层析已广泛用于分离和纯化免疫球蛋白。

由于蛋白A和蛋白G的结合位点位于免疫球蛋白的Fc区，蛋白A和蛋白G亲和层析也能纯化所谓的Fc-融合蛋白。

Fc-融合蛋白是含有与某种免疫球蛋白(常常是免疫球蛋白G，IgG)Fc区融合的蛋白质效应器部分(如受体结合区)的嵌合蛋白质。Fc-融合蛋白可广泛用作治疗剂，因为它们具有Fc区所赋予的优点，例如：

-能够用蛋白A或蛋白G亲和层析法纯化，亲和力视IgG同种型而不同。人的IgG₁、IgG₂和IgG₄能与蛋白A强结合，所有的人IgG包括IgG₃能强结合蛋白G；

-在循环系统中的半衰期延长，因为其Fc区结合于补救受体FcRn而保护其免遭溶酶体酶降解；

-取决于此Fc融合蛋白的医学应用，Fc区的效应器功能可能是需要的。这类效应器功能包括通过与Fc受体(FcγR)相互作用的抗体依赖细胞毒性(ADCC)、以及与补体组分1q(C1q)结合的补体依赖性细胞毒性(CDC)。IgG各亚型发挥不同水平的效应器功能。人IgG₁和IgG₃具有强效ADCC和CDC作用，而人IgG₂具有弱ADCC和CDC作用。人IgG₄显示弱ADCC作用而无CDC作用。

根据Fc-融合蛋白所预期的治疗应用，通过工程改造Fc区以提高或降低其分别与FcR、FcγR和C1q结合的能力，可改善其血清半衰期和效应器功能。

在ADCC中，抗体的Fc区结合于免疫效应细胞(如自然杀伤细胞和巨噬细胞)表面的Fc受体(FcγR)，而导致吞噬或溶解靶细胞。

在CDC中，抗体通过在细胞表面触发补体级联反应而杀伤靶细胞。IgG各亚型发挥的效应器功能水平不同，按IgG₄＜IgG₂＜IgG₁≤IgG₃顺序递增。人IgG₁显示有高度ADCC和CDC作用，最适合于对病原体和癌细胞的治疗应用。

在某些情况下，例如当消除靶细胞对机体不利时，可能需要去除或减少其效应器功能。相反，当抗体用于肿瘤治疗时，提高效应器功能可增强其治疗活性(Carter等，2006)。

通过工程改造Fc区提高或降低其与FcγR或补体因子的结合，可实现对效应器功能的修饰。

IgG与活化性FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb)和抑制性FcγR(FcγRIIb)或补体1组分(C1q)的结合取决于位于绞链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域是FcγR与补体C1q结合的关键区，在IgG₂和IgG₄中含有独特的序列。例如，用IgG₂的233-236位残基取代人IgG₁的相应残基将大大降低IgG₁的ADCC和CDC功能(Armour等，1999；和Shield等，2001)。

已在IgG的CH2结构域中制作了许多突变，体外研究了它们对ADCC和CDC的影响(Shieid等，2001；Idusogie等，2001和2002；Steurer等，1995)。具体说，报导了E333位突变成丙氨酸提高了ADCC和CDC两种功能(Idusogie等，2001和2002)。

提高治疗抗体的血清半衰期是改进其疗效，使之循环水平更高，减少给药频率和减少剂量的另一种方法。这可通过提高Fc区与新生FcR(FcRn)的结合力而实现。FcRn表达在内皮细胞表面上，以pH依赖方式结合IgG，能保护其免遭降解。业已证明位于CH2与CH3结构域之间介面上的好几种突变延长了IgG的半衰期(Hinton等，2004和Vaccaro等，2005)。

下表1概括了Fc区的一些已知突变(取自Invivogen′s website网站)。

表1

工程改造的Fc	IgG同种型	突变	性能	潜在效益	应用
工程改造的Fc	IgG同种型	突变	性能	潜在效益	应用	hIgG1e1	人IgG1	T250Q/M428L	提高血浆半衰期	改善靶定位；提高效力；减少给药剂量或频率	疫苗；治疗应用
hIgG1e2	人IgG1	M 252Y/S254T/T256E+H433K/N434F	提高血浆半衰期	改善靶定位；提高效力；减少给药剂量或频率	疫苗；治疗应用	hIgG1e1	人IgG1	T250Q/M428L	提高血浆半衰期	改善靶定位；提高效力；减少给药剂量或频率	疫苗；治疗应用
hIgG1e2	人IgG1	M 252Y/S254T/T256E+H433K/N434F	提高血浆半衰期	改善靶定位；提高效力；减少给药剂量或频率	疫苗；治疗应用	hIgG1e3	人gG1	E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S	ADCC和CDC功能降低	减少副作用	不需要消除细胞的治疗应用
hIgG1e4	人gG1	E333A	ADCC和CDC功能提高	提高效力	需要消除细胞的治疗应用	hIgG1e3	人gG1	E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S	ADCC和CDC功能降低	减少副作用	不需要消除细胞的治疗应用
hIgG1e4	人gG1	E333A	ADCC和CDC功能提高	提高效力	需要消除细胞的治疗应用	hIgG2e1	人gG2	K322A	CDC功能降低	减少副作用	疫苗；治疗应用

在具有治疗用途的某些已知Fc融合蛋白中，Fc区与属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族的某些受体的胞外结构域相融合(Locksley等，2001，Bodmer等，2002，Bossen等，2006)。TNFR家族成员的标志是其胞外结构域存在富含半胱氨酸的伪重复序列，如Naismith和Sprang1998所述的那样。

两种TNF受体：p55(TNFR1)和p75TNFR(TNFR2)是TNF超家族这类成员的例子。依那西普(Etanercept，TNF-α的拮抗剂)是一种含有p75TNFR可溶性部分的Fc融合蛋白(如WO91/03553，WO 94/06476)，它以商标名

销售，用于治疗子宫内膜异位、丙肝病毒感染、HIV感染、牛皮癣关节炎、牛皮癣，类风湿关节炎、哮喘、强直性脊椎炎、心力衰竭、移植物抗宿主疾病、肺纤维化、克罗恩病。来那西普(Lenercept)是一种含有人p55TNF受体胞外组分和人IgG Fc部分的融合蛋白，预期可用于治疗严重脓毒症和多发性硬化症。

OX40也是TNFR超家族的成员。已制备了OX40-IgG1和OX40-HIG4mut融合蛋白用于治疗炎症和自身免疫疾病，如克罗恩病。

BAFF-R(也称为BR3)的Fc-融合蛋白，也称作BR3-Fc，是属于BAFF(TNF家族的B细胞激活因子)抑制剂系列的一种可溶性诱饵受体，正在开发用于自身免疫疾病如类风湿关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)的潜在治疗。

BCMA是属于TNFR超家族的另一种受体。业已报导了BCMA-Ig融合蛋白可抑制自身免疫疾病(Melchers，2006)。

TNF-R超家族的另一种受体是TACI，这是一种跨膜活化剂和CAML-相互作用因子(von Bülow和Bram，1997；US 5,969,102，Gross等，2000)，其胞外结构域含有两个富含半胱氨酸的伪重复序列。TACI能结合肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的两个成员，一类配体命名为BLyS、BAFF、neutrokine-α、TALL-1、zTNF4或THANK(Moore等.，1999)，另一类配体命名为APRIL，TNFR死亡配体-1或ZTNF2(Hahne等，J Exp Med.188：1185，1998)。

对含有融合于IgG Fc区的TACI受体可溶性形式的融合蛋白已有很好了解，命名为TACI-Fc(WO 00/40716，WO 02/094852)。TACI-Fc能抑制BLyS和APRIL与B-细胞结合(Xia等，2000)。正在开发用它来治疗自身免疫疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)和血液恶性肿瘤，以及治疗多发性硬化症(MS)。除此之外，正在开发用TACI-Fc治疗多发性骨髓瘤(MM)(Novak等，2004；Moreau等，2004)和非-何杰金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。

对于Fc-融合蛋白，特别是含有TNFR超家族胞外部分的那些蛋白的治疗应用，需要适合人给药的足够量的高纯度蛋白质。

WO 02/094852描述了部分纯化TACI-Fc的方法，包括蛋白A层析然后用S-200分子大小排阻层析。

WO 03/059935公开了p75TNFR:Fc-融合蛋白的纯化方法，采用羟基磷灰石层析与蛋白A亲和层析相组合。然而，在WO 03/059935描述的方法中，Fc-融合蛋白不结合于羟基磷灰石而是含在羟基磷灰石柱的流出液中。除此之外，没提到p75 TNFR:Fc-融合蛋白纯化时采用了离子交换层析。

WO 2005/044856公开了羟基磷灰石层析制备抗体中去除高分子量凝聚物的方法，也公开了采用蛋白A、阴离子交换层析和羟基磷灰石层析的纯化方法。然而，首先，其描述的方法只用于抗体，其次，没有公开在蛋白A亲和层析与阴离子交换层析步骤之间采用阳离子交换层析步骤。

WO 94/06476提出的纯化重组可溶性TNF受体的假设方案以TNF或凝集素亲和层析、阴离子或阳离子交换层析和反向高效液相层析(RP-HPLC)为基础。此文件中没提及羟基磷灰石层析可作为可溶性TNF受体的合适纯化步骤。

US 2002/0115175描述了金属蛋白酶如TNFα转化酶的纯化方法。TACE的理论等电点约为5.4，如利用英特网上的“等电点服务EMBL WWW入口”计算的那样。TACE是一种蛋白酶，能切除膜结合(前-)TNFα的N-末端8个氨基酸，如此使细胞膜释放并激活细胞因子TNFα。US 2002/0115175公开的TACE纯化方法包括小麦胚凝集素琼脂糖步骤。此文件也描述了TACE的Fc融合蛋白，但不是纯化的。

EP 1561756公开了单用蛋白A或G为基础的层析可能不足以分离去除蛋白质中污染的DNA，为了纯化蛋白质，可采用其它步骤，如阴离子或阳离子交换层析、羟基磷灰石层析或它们的组合，但没提出这些层析步骤的特定顺序。此外，EP 1561756涉及的蛋白质是血细胞生成因子、细胞因子和抗体。EP 1561756中没提及Fc-融合蛋白。

EP 1614693描述了依据蛋白A亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层纯化抗体的方法。此文件中，专门提到先后通过阴离子交换和阳离子交换层析，或通过阳离子交换层析然后疏水层析纯化抗体。这种疏水层析可用任何其它类型层析，包括羟基磷灰石层析替代。在EP 1614693中没提及Fc-融合蛋白。

Feng等，2005描述的抗体纯化方法是基于最初用蛋白A的捕获步骤，其后的精加工步骤可以是疏水相互作用层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析，或羟基磷灰石层析。然而，Feng等只描述了抗体纯化而不是Fc-融合蛋白。此外，除最初的蛋白A亲和步骤外，没有提出系统性去除所有不良杂质如宿主细胞蛋白质(HCP)、凝聚物、DNA、污染病毒和脱落蛋白A的特定顺序。

因此，对于产生纯度适合人给药的Fc融合蛋白，仍没有能满足其充分纯化所需的方法。

发明概述

本发明是基于Fc-融合蛋白纯化方法的开发。

因此，在第一方面，本发明涉及Fc-融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

a.使含有所述Fc-融合蛋白的液体进行蛋白A或蛋白G亲和层析；

b.使步骤(a)的洗脱物进行阳离子交换层析；

c.使步骤(b)的洗脱物进行阴离子交换层析；和

d.使步骤(c)的流出液进行羟基磷灰石层析，和收集洗脱物获得纯化的Fc-融合蛋白。

此方法可用于纯化等电点(pI)范围在7.0-9.5之间的Fc-融合蛋白。此方法优选用于纯化治疗性Fc-融合蛋白，即预期用于人给药的Fc-融合蛋白。更优选用于包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的胞外部分(特别是配体结合部分和任选的抑制性胞外部分)的Fc-融合蛋白。

已令人惊奇地证明了步骤(b)适合去除所谓的游离Fc，即未与整个治疗分子(例如TNF家族成员的配体结合胞外部分)融合的免疫球蛋白重链结构域。

在第二方面，本发明涉及纯化Fc-融合蛋白，优选治疗性Fc-融合蛋白，更优选包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的胞外部分特别是配体结合胞外部分的Fc-融合蛋白，该纯化的Fc-融合蛋白所含的游离Fc蛋白低于1％或0.5％或0.2％或0.1％。

还显示步骤(a)、(c)和(d)联合显著地除去无治疗活性、对人给药不需要的Fc-融合蛋白凝聚物。

因此，第三方面，本发明涉及纯化的Fc-融合蛋白组合物，优选治疗性Fc-融合蛋白，更优选含有肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的胞外部分特别是配体结合胞外部分的Fc-融合蛋白。该纯化的Fc-融合蛋白所含Fc-融合蛋白凝聚物低于1％或低于0.5％，和/或所含游离Fc蛋白低于0.5％或低于0.2％或低于0.1％。

本发明另一方面涉及用阳离子交换层析去除Fc-融合蛋白制品中的游离Fc，所述Fc-融合蛋白制品优选治疗性Fc-融合蛋白制品，更优选包含肿瘤坏死因子受体家族成员胞外部分或配体结合部分的Fc-融合蛋白，和任选其抑制性片段。

本发明还有一方面涉及采用羟基磷灰石层析来去除Fc-融合蛋白制品中的凝聚物，所述Fc-融合蛋白制品优选治疗性Fc-融合蛋白制品，更优选包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的胞外部分的Fc-融合蛋白，或其配体结合片段。

附图的简要说明

图1.显示得自实施例2所述阳离子交换层析的逆流不同组分的非还原性银染色SDS-PAGE。泳道1：分子量标记；泳道2：纯化的TACE-Fc；泳道3：加载物；泳道4：洗涤液2；泳道5：洗脱物2；泳道6：洗涤液3；泳道7：洗脱物3；泳道8：洗涤液1；泳道9：洗脱物1；泳道10：纯化的游离Fc。

图2.显示实施例2所述的阳离子交换层析概貌。

序列表的简要说明

SEQ ID NO：1是TNFR超家族成员共同的半胱氨酸指纹序列(富含半胱氨酸的伪重复序列)；

SEQ ID NO：2是人TACI受体(如WO 98/39361中所述)的全长序列；

SEQ ID NO：3是本发明人Fc序列(如WO 02/094852中所述)的一个例子；

SEQ ID NO：4是本发明的优选Fc-融合蛋白，其含有衍生自TACI胞外部分和人IgG₁Fc部分(如WO 02/094852中所述)的序列。

SEQ ID NO：5是编码SEQ ID NO：2(如WO 02/094852中所述)多肽的聚核苷酸。

SEQ ID NO：6是编码SEQ ID NO：3(如WO 02/094852中所述)多肽的聚核苷酸。

SEQ ID NO：7是编码SEQ ID NO：4(如WO 02/094852中所述)多肽的聚核苷酸。

发明详述

本发明基于称作TACI-Fc融合蛋白的示例性治疗用Fc-融合蛋白纯化方法的开发，所述方法产生适合人给药的高纯度TACI-Fc制品。

因此本发明涉及Fc-融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

a.将包含所述Fc-融合蛋白的液体进行蛋白A或蛋白G亲和层析；

b.将步骤(a)的洗脱物进行阳离子交换层析；

c.将步骤(b)的洗脱物进行阴离子交换层析；

d.将步骤(c)的流出液进行羟基磷灰石层析，收集洗脱物以获得纯化的Fc-融合蛋白。

在本发明的一实施方式中，此纯化方法不包括凝集素亲和层析步骤，特别是不包括小麦胚凝集素琼脂糖步骤。

本发明的方法可用于纯化等电点范围6.9-9.5的Fc-融合蛋白。蛋白质的“等电点”或“pI”是该蛋白质的纯总电荷为零时的pH，即正电荷与负电荷数量相等时的pH。可按照已良好建立的技术，如等电聚焦技术，来测定任何给定蛋白质的pI。

要按本发明纯化的Fc-融合蛋白的pI可以是，例如6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45、7.5、7.55、7.6、7.65、7.7、7.75、7.8、7.85、7.9、7.95、8.0、8.05、8.1、8.15、8.2、8.25、8.3、8.35、8.4、8.45、8.5、8.55、8.6、8.65、8.7、8.75、8.8、8.85、8.9、8.95、9.0、9.05、9.1、9.15、9.2、9.25、9.3、9.35、9.4、9.45、9.5。

优选地，要按本发明纯化的Fc-融合蛋白的pI为8-9或8.0-9.0，更优选为8.3-8.6。

本发明方法优选用于纯化治疗性Fc-融合蛋白，即预期用于治疗或预防动物疾病或优选用于治疗人的Fc-融合蛋白。本发明方法更优选用于纯化含有肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员胞外部分的Fc-融合蛋白。该胞外部分优选是各自受体胞外部分或结构域的配体结合片段。可按本发明纯化的优选的Fc-融合蛋白能结合配体，抑制或阻断配体的功能，例如受体激活功能。

本说明书所用术语“Fc-融合蛋白”含义指包括蛋白质，特别是含有从免疫球蛋白衍生的部分(本说明书称作“Fc-部分”)和从第二种非免疫球蛋白衍生的部分(本说明书称作“治疗性部分”)的蛋白质，不论是否预期用于治疗疾病。

本说明书所用术语“游离Fc”含义指拟按本发明方法纯化的Fc-融合蛋白的任何部分，它衍生自Fc-融合蛋白的免疫球蛋白部分但不含有该Fc-融合蛋白显著的治疗性部分。因此，游离Fc可包括由IgG绞链区、CH2和CH3区组成的但不连接或结合于显著的治疗部分的二聚体，其对应于例如用木瓜蛋白酶切割产生的Fc-部分。游离的Fc组分中也可含衍生自Fc-部分的单体。已知道此种游离的Fc也可含有来自治疗部分的一些氨基酸残基，例如与该Fc部分融合的属于治疗部分的1-10个(如2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸。

此Fc-部分可衍生自人或动物的免疫球蛋白(Ig)，优选IgG。所述IgG可以是IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄。也优选此Fc-部分衍生自免疫球蛋白(优选IgG)的重链。更优选此Fc-部分含有例如免疫球蛋白重链恒定区部分。这种Ig恒定区优选包含至少一个选自绞链区、CH2区、CH3区的Ig恒定区，或它们的任何组合。优选此Fc-部分至少包含CH2和CH3区。更优选此Fc-部分包含IgG绞链区、CH2和CH3区。

本发明的Fc-融合蛋白可以是单体或二聚体。此Fc-融合蛋白也可以是“伪-二聚体”，包含二聚的Fc-部分(如由两个二硫键连接的绞链-CH2-CH3结构组成的二聚体)，其中一个(单体)融合于治疗部分。

此Fc-融合蛋白可以是包含两个不同治疗部分的异质二聚体，或包含一种治疗部分两个拷贝的同质二聚体。

按照本发明，也可修饰此Fc-部分以调节其效应器功能。例如，如果此Fc-部分衍生自IgG₁，可按照EU索引位置(Kabat et al，1991)引入以下Fc突变：

T250Q/M428L

M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F

E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S

E333A；K322A

其它Fc突变可以是例如选自330、331、234或235的EU索引位置上的取代，或它们的组合。也可将位于CH2区中EU索引位置297的任何氨基酸取代引入本发明的Fc-部分中，以去除潜在的N-连接糖基附着位点。EU索引位置220处的半胱氨酸残基也可用丝氨酸残基取代以去除通常可与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的半胱氨酸残基。

按照本发明，优选此Fc-部分包含SEQ ID NO：3或由其组成，或由含SEQ ID NO：6的聚核苷酸编码。

本发明的治疗部分可以衍生自例如EPO、TPO、生长激素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、PDGF-β、VEGF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18、IL-18结合蛋白、TGF-β、TNF-α或TNF-β。

本发明的治疗部分也可以衍生自受体，例如跨膜受体，优选是或衍生自受体的胞外结构域，特别是某给定受体胞外部分或结构域的配体结合片段和任选的抑制片段。治疗上感兴趣受体的例子是CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80、CD86、CD147、CD164、IL-2受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-12受体、IL-18受体亚基(IL-18R-α、IL-18R-β)、EGF受体、VEGF受体、整联蛋白-α410β7、整联蛋白VLA4、B2整联蛋白、TRAIL受体1、2、3和4、RANK、RANK配体、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、细胞间粘附分子-3(ICAM-3)、CTLA4(一种细胞毒性T淋巴细胞相关抗原)、Fc-γ-1受体、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、L-选择蛋白。

高度优选的是，本发明的治疗部分衍生自属于TNFR超家族的受体。此治疗部分可以是或衍生自TNFR1(p55)、TNFR2(p75)、OX40、骨保护素(Osteoprotegerin)、CD27、CD30、CD40、RANK、DR3、Fas配体、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TAIL-R4、NGFR、AITR、BAFFR、BCMA、TACI的胞外结构域。

按照本发明，衍生自TNFR超家族成员的治疗部分包含该TNFR成员的全部或部分胞外结构域或由其组成，更优选包含此TNFR成员的配体结合片段和任选的抑制性片段。

下表5列出了本发明治疗部分可从中衍生的TNFR超家族成员和它们各自配体的名单。本领域技术人员不难用例如简单的体外试验检测给定受体的蛋白片段与各自配体之间的结合，来确定TNFR家族成员的“配体结合片段”。这类试验可以是例如简单的体外RIA-或ELISA夹心试验，其中将一种蛋白质如受体片段固定在载体(如ELISA平板)上并培育，然后用第二种蛋白如配体适当封闭载体上的蛋白结合位点。培育后，例如利用放射活性标记的配体检测配体的结合情况，经适当洗涤后在闪烁计数器中测定结合的放射活性。配体的结合也可用标记抗体测定，或用配体特异性第一抗体和抗第一抗体恒定区的标记第二抗体进行测定。根据所用标记如颜色反应，不难测定配体的结合。可用适当的细胞试验检测配体结合功能的阻断或抑制。

本发明的方法优选用于纯化包含选自表5所列TNFR超家庭成员所衍生的治疗部分的Fc-融合蛋白。

表5：TNFR超家族(根据Locksley等，2001和Bossen等，2006)

TNFR超家族的成员	配体
TNFR超家族的成员	配体	NGFR	NGF
EDAR	EDA-AI	NGFR	NGF
EDAR	EDA-AI	XEDAR	EDA-A2
CD40	CD40L	XEDAR	EDA-A2
CD40	CD40L	Fas	FasL
Ox40	OX40L	Fas	FasL
Ox40	OX40L	AITR	AITRL
GITR	GITRL	AITR	AITRL
GITR	GITRL	CD30	CD30L
CD40	CD40L	CD30	CD30L
CD40	CD40L	HveA	LIGHT，LT-α
4-1BB	4-1BBL	HveA	LIGHT，LT-α
4-1BB	4-1BBL	TNFR2	TNF-α、LT-α、LT-α-β
LT-βR	LIGHT、LT-α、LT-α-β	TNFR2	TNF-α、LT-α、LT-α-β
LT-βR	LIGHT、LT-α、LT-α-β	DR3	TL1A
CD27	CD27L	DR3	TL1A
CD27	CD27L	TNFR1	TNF-α、LT-α、LT-α-β
LTBR	LT-β	TNFR1	TNF-α、LT-α、LT-α-β
LTBR	LT-β	RANK	RANKL
TACI	BlyS、APRIL	RANK	RANKL
TACI	BlyS、APRIL	BCMA	BlyS、APRIL

BAFF-R	BAFF(＝BlyS)
BAFF-R	BAFF(＝BlyS)	TRAILR1	TRAIL
TRAILR2	TRAIL	TRAILR1	TRAIL
TRAILR2	TRAIL	TRAILR3	TRAIL
TRAILR4	TRAIL	TRAILR3	TRAIL
TRAILR4	TRAIL	Fn14	TWEAK
OPG	RANKL、TRAIL	Fn14	TWEAK
OPG	RANKL、TRAIL	DR4	TRAIL
DR5	TRAIL	DR4	TRAIL
DR5	TRAIL	DcR1	TRAIL
DcR2	TRAIL	DcR1	TRAIL
DcR2	TRAIL	DcR3	FasL、LIGHT、TL1A

在一优选的实施方式中，Fc-融合蛋白包含选自TNFR1、TNFR2胞外结构域，或其TNF结合片段和任选的抑制性片段的治疗部分。

在另一优选实施方式中，Fc-融合蛋白包含的治疗部分选自BAFF-R、BCMA或TACI的胞外结构域，或其至少能结合Blys或APRIL之一的片段。

例如在Hymowitz等，2006中描述了检测与Blys或APRIL结合能力的试验。

TACI优选人的TACI。SEQ ID NO：2对应于全长人TACI受体(也见SwissProt entry O14836)的氨基酸序列。更优选此治疗部分包含TACI的可溶性部分，优选衍生自TACI的胞外结构域。此TACI-衍生的治疗部分优选包含SEQ ID NO：2的至少氨基酸33-67，和/或SEQ ID NO：2的氨基酸70-104。在一优选实施方式中，按照本发明的治疗部分所包括的TACI胞外域包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-166，或SEQ ID NO：2的氨基酸30-166，或SEQID NO：2的氨基酸30-119，或SEQ ID NO：2的氨基酸30-110，或由它们组成。对于要用本发明方法纯化的Fc-融合蛋白制品，优选所有这些治疗部分，将其与以上详述的Fc-部分组合，特别是与含有SEQ ID NO：3或由其组成的Fc-部分组合。待用本发明方法纯化的Fc-融合蛋白高度优选包含SEQ IDNO：4或由其组成，或由SEQ ID NO：7的聚核苷酸所编码。

因此，此Fc-融合蛋白高度优选包含选自以下的多肽：

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸34-66；

(b)SEQ ID NO：2的氨基酸71-104；

(c)SEQ ID NO：2的氨基酸34-104；

(d)SEQ ID NO：2的氨基酸30-110；

(e)SEQ ID NO：3：

(f)SEQ ID NO：4：

(g)能在高严谨条件下与SEQ ID NO：5或6或7的互补物杂交的聚核苷酸编码的多肽；

(h)与(c)、(d)、(e)或(f)所述多肽具有至少80％或85％或90％或95％序列相同性的(c)、(d)、(e)或(f)之一所述的突变蛋白；其中所述多肽能结合至少Blys或APRIL之一种。

在另一优选实施方式中，此Fc-融合蛋白包含球蛋白的重链恒定区，更优选人的恒定区。在本发明一实施方式中，所述免疫球蛋白是IgG₁。还优选所述恒定区包含绞链区、CH2和CH3区。

在另一实施方式中，所述治疗部分SEQ ID NO：1的富含半胱氨酸的伪重复序列。

按照本发明，先使含有Fc-融合蛋白的液体通过蛋白A或蛋白G亲和层析柱。所述液体优选细胞培养物，如溶解的细胞，更优选细胞培养上清液。本说明书所用术语“细胞培养上清液”指培养细胞的培养液，其含有细胞分泌的蛋白质，此蛋白质含有适当的细胞信号，即所谓的信号肽。优选在无血清培养条件下培养此Fc-融合蛋白表达细胞。因此，细胞培养上清液优选不含动物血清成分。此种细胞培养液最优选是化学成分明确的培养液。

亲和层析所用的蛋白A可以是重组的。也可加以修饰以改进其性能(如可从GE Healthcare商品化购得的称为MabSelect SuRe的树脂)。在一优选实施方式中，步骤(a)在含有用重组蛋白A修饰的交联琼脂糖树脂上进行。以商品名MabSelect Xtra(产自GE Healthcare)购得的层析柱是特别适合本方法步骤(a)的亲和树脂例子。

蛋白A或蛋白G亲和层析优选用作捕获步骤，从而用于纯化Fc-融合蛋白，特别是去除宿主蛋白质和Fc-融合蛋白的凝聚物，及浓缩Fc-融合蛋白制品。

本说明书所用术语“凝聚物”指蛋白凝聚物，它包括待纯化Fc-融合蛋白中的多聚体(如二聚体、四聚体或更大的凝聚物)，可导致产生例如高分子量的凝聚物。

此亲和层析的另一优点是可减少凝聚物水平2-4倍。

采用蛋白A或蛋白G亲和层析，宿主细胞蛋白质水平可降低100-300倍。

在本发明的一优选实施方式中，在pH范围2.8-4.5，优选3.0-4.2，更优选3.5、3.55、3.6、3.65、3.7、3.75、3.8、3.85、3.9、3.95、4.0、4.05、4.1或4,15时，进行步骤(a)的洗脱。步骤(a)的洗脱也可用梯度pH，优选pH4.5-2.8的梯度进行。

在另一优选实施方式中，步骤(a)的洗脱用选自乙酸钠或柠檬酸钠的缓冲液进行。合适的缓冲液浓度选自例如选自50mM或100mM或150mM或200mM或250mM。

按照本发明，将蛋白A或蛋白G层析后的洗脱物进行阳离子交换层析。阳离子交换层析可在任何合适的阳离子交换树脂(如以上发明背景中所述的弱或强阳离子交换剂)上进行。

优选在强阳离子交换树脂上进行步骤(b)。更优选此阳离子交换材料含有以SO₃ ^-基团修饰的交联异丁烯酸酯。以商品名Fractogel EMD SO₃ ^-(产自Merck)购得的层析柱是特别适合本方法步骤(b)的阳离子交换树脂的例子。

优选将蛋白A的洗脱物直接加载到该阳离子交换柱上。优选在至少低于待纯化Fc-融合蛋白pI一个单位的pH下进行此加载。

还优选在加载后，用导电率6-10mS/cm例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8或9.9mS/cm的缓冲液洗涤。更优选此导电率的范围为7.6-9.2，即8.4±0.8mS/cm。洗涤步骤宜在pH5.5-7.5、优选6.0-7.0下进行。

在另一优选实施方式中，在pH范围7.0-8.5，优选在pH7.25或7.3或7.35或7.4或7.45或7.5或7.55或7.6或7.65或7.7或7.7或7.75或7.8或7.85或7.9或7.95或8.0或8.05或8.1或8.15或8.2或8.25或8.3或8.35或8.4或8.45或8.5下，洗脱阳离子交换层析柱。

宜用导电率范围在15-22mS/cm的缓冲液进行洗脱。例如，所述导电率可选自16、17、18、19、20、21或22mS/cm。优选的洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液。

在一高度优选实施方式中，步骤(b)还包括以下步骤：

b1.用pH6.0-7.0及导电率6-10mS/cm的缓冲液洗涤阳离子交换树脂；和

b2.用pH7.0-8.5及导电率15-22mS/cm的缓冲液洗脱该层析柱。

步骤(b1)的优选缓冲液是75-125mM的磷酸钠缓冲液。

在本发明框架中令人惊奇地发现步骤(b)能有效去除游离的Fc。因此，按照本发明，阳离子交换层析可优选用于去除或降低游离Fc约5-15倍。

本发明方法的步骤(b)的优点是还能降低Fc-融合蛋白制品中的宿主细胞蛋白浓度，例如1-2倍，因而对清除宿主细胞蛋白(HCP)有显著贡献。

按照本发明，使阳离子交换步骤后的洗脱物通过阴离子交换层析柱。阴离子交换层析可在任何合适的阴离子交换树脂(如以上发明背景中所述的弱或强阴离子交换剂)上进行。优选在强阴离子交换树脂上进行步骤(c)。更优选此阴离子交换树脂含有带N⁺(CH₃)₃基团修饰的聚苯乙烯/二乙烯基苯。以商品名Source 30Q(产自GE Healthcare)购得的层析柱是特别适合本方法步骤(C)的阴离子交换树脂的例子。

步骤(b)的洗脱物在加载到阴离子交换柱前宜用适当的加载缓冲液先稀释或透析。此阴离子交换柱也宜先用该加载缓冲液平衡。

加载缓冲液的pH宜低于pI一个单位。合适的pH值范围为6.0-8.5，优选7.0-8.0，例如7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45、7.5、7.55、7,6、7.65、7.7、7.75、7.8、7.85、7.9、7.95或8.0。加载缓冲液的优选导电率范围为3.0-4.6mS/cm。

合适的平衡/加载缓冲液可以是例如浓度范围5-35mM、优选20-30mM的磷酸钠溶液。缓冲液的浓度可以是例如10、15、20、25、30mM。本发明的框架中，收集含感兴趣Fc-融合蛋白的阴离子交换层析流出液(也称为流穿液)。

本发明方法的步骤(c)可进一步减少凝聚物3-5倍，减少宿主细胞蛋白质30-70倍。

按照本发明，将步骤(c)阴离子交换层析的流出液用羟基磷灰石层析柱进一步纯化。本发明方法的步骤(d)可采用任何羟基磷灰石树脂进行。在一优选实施方式中，在陶瓷羟基磷灰石树脂如I型或II型羟基磷灰石树脂上进行步骤(d)。羟基磷灰石树脂可以是任何粒度如20、40或80μm的颗粒。在一较为优选的实施方式中，此种陶瓷羟基磷灰石树脂为40μm粒度的颗粒。特别适合本方法步骤(d)的羟基磷灰石树脂是以商品名CHT CeramicHydroxyapatite I型(40μm)购得的层析柱。

在一优选实施方式中，将步骤(c)的流出液直接加载到羟基磷灰石树脂上，即无须事先用合适的加载缓冲液稀释或透析。加载宜在pH 6.5-7.5，例如6.6、6.7、6.8、6.9、7.1、7.2、7.3或7.4，优选7.0下进行。

在另一优选实施方式中，在2-10mM磷酸钠存在下，优选1.75-5.25mM，例如2、2,25、2.5、2,75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4,5、4.75、5mM，进行步骤(d)的洗脱。

在还有一优选实施方式中，在pH6.0-7.0范围例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9下进行步骤(d)的洗脱。

在另一优选实施方式中，在0.4-1M氯化钾存在下，优选0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95M，最优选0.6M，进行步骤(d)的洗脱。

按照本发明，收集步骤(d)的洗脱物，其含有最终纯化的Fc-融合蛋白制品。

与本发明有关可使用的步骤(a)至(c)中所用层析树脂的合适基质材料即载体材料，可以是例如琼脂糖((sepharose，superose)、葡聚糖(sephadex)、聚丙烯、异丁烯酸酯纤维素、聚苯乙烯/二乙烯基苯等。根据具体用途，树脂材料可以各种交联形式存在。

所用层析柱中的树脂体积、柱的长度和直径，以及动态容量和流速，取决于几种参数，例如拟处理液体的体积，要实施本发明方法的液体中蛋白质的浓度等等。测定各步骤中的这些参数的方法是本领域普通技术人员熟知的。

在本发明纯化方法的一个优选实施方式中，进行一步或多步超滤。超滤用于去除先前层析步骤所得洗脱物中的小有机分子和盐，用大量缓冲液平衡Fc-融合蛋白，或浓缩Fc-融合蛋白到所需浓度。这种超滤可在孔径能允许去除分子量低于5、10、15、20、25、30kDa或更大kDa的成分的超滤膜上进行。

优选在步骤(b)与(c)之间，和/或在步骤(d)后进行超滤。更优选进行两次超滤，一次在步骤(b)与(c)之间，一次在步骤(d)后。

如果按本发明方法纯化的蛋白是用于人给药的，此方法中宜包括一步或多步病毒去除。较佳为在步骤(d)后进行病毒过滤去除步骤。更佳为病毒过滤去除步骤是纳米过滤步骤，其中所用滤膜的标称孔径为20nm。本发明方法和具体步骤(a)、(c)、(d)与纳米过滤联用能有效去除病毒载量至总LRV(对数减少值)不高于约15-25。

为了有利于贮存或运输，例如，可在本发明纯化步骤之前和/或之后冻融这种材料。

按照本发明，可用真核表达系统，如酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞生产重组Fc-融合蛋白，以产生糖基化的Fc-融合蛋白。

按照本发明，最优选在哺乳动物细胞如动物细胞系或人细胞系中表达Fc-融合蛋白。中国仑鼠卵巢细胞(CHO)或小鼠骨髓瘤细胞系NS0是特别适合表达待纯化Fc-融合蛋白的细胞系例子。也优选用人细胞系，如人纤维肉瘤HT1080细胞系、人视网膜母细胞瘤细胞系PERC6、或人胚肾细胞系293，或EP 1230354中描述的恒定的羊水细胞系来生产Fc-融合蛋白。

如果待纯化的Fc-融合蛋白用哺乳动物细胞分泌表达，本发明纯化方法的起始材料为细胞培养上清液，也称为收获液或粗制收获液。如果用含动物血清的培养液培养细胞，这种细胞培养上清液仍含有血清蛋白杂质。

宜在无血清条件下培养表达和分泌Fc-融合蛋白的细胞。也可用化学成分明确的培养液产生Fc-融合蛋白。此时，本发明纯化方法的起始材料是主要含宿主细胞蛋白杂质的无血清细胞培养上清液。例如，如果在此细胞培养液中加入生长因子如胰岛素，纯化过程中也将需要去除这些蛋白质。

为了产生可溶的分泌性Fc-融合蛋白使其释放到细胞培养上清液中，可利用Fc-融合蛋白治疗部分的天然信号肽，或优选异源信号肽，即在所用的特定表达系统中有效的源自另一种分泌蛋白的信号肽，例如牛或人的生长激素信号肽，或免疫球蛋白信号肽。

如上所述，待用本发明方法纯化的优选Fc-融合蛋白是具有衍生自人TACI(SEQ ID NO：2)的治疗部分、特别是具有衍生自其胞外结构域(SEQ IDNO：2的氨基酸1-165)片段的融合蛋白。一种优选的片段包含SEQ ID NO：2的氨基酸30-110。在下文中，衍生自TACI胞外域的治疗部分将称为“可溶性TACI”或“sTACI”。一种优选的Fc-部分包含SEQ ID NO：3，其可产生SEQID NO：4的Fc-融合蛋白，在下文中称“TACI-Fc”。

本说明书所用的术语TACI-Fc也包括TACI-Fc的突变蛋白。

本说明书所用的术语“突变蛋白”指sTACI或TACI-Fc的同类物，其中sTACI或TACI-Fc的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换，或缺失，或在sTACI或TACI-Fc的原始序列中加入了一个或多个氨基酸残基，与原始sTACI或TACI-Fc相比，不会显著改变所得产物的活性。可用已知的合成技术和/或定点诱变技术，或任何其它已知的适合技术，来制备这些突变蛋白。

本发明的突变蛋白包括由能在严谨条件下与编码SEQ ID NO：2或4之一所示sTACI或TACI-Fc的DNA或RNA的互补物杂交的核酸(如DNA或RNA)编码的蛋白质。编码TACI-Fc的DNA序列例子是SEQ ID NO：7。

术语“严谨条件”指杂交和随后的洗涤条件，该领域普通技术人员常规称作“严谨条件”。参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)。非限制的严谨条件的例子包括在计算出的所述杂交Tm之下12-20℃的洗涤条件，例如用2xSSC和0.5％SDS洗涤5分钟，用2x SSC和0.1％SDS洗涤15分钟；用0.1xSSC和0.5％SDS于37℃洗涤30-60分钟，然后用0.1xSSC和0.5％SDS于68℃洗涤30-60分钟。本领域普通技术人员知道严谨条件也取决于DNA序列、寡核苷酸探针的长度(如10-40个碱基)或混合寡核苷酸探针的长度。如果采用混合探针，宜用氯化四甲铵代替SSC。参见Ausubel，同上。

在另一实施方式中，任何此种突变蛋白至少有50％、至少有60％、至少有75％、至少有80％、至少有85％、至少有90％、或至少有95％的相同性或同源性。

相同性反映通过序列比较确定的两个或多个多肽序列之间或两个或多个聚核苷酸序列之间的关系。一般说，相同性指两条聚核苷酸或两条多肽序列在所比较的序列长度上，核苷酸与核苷酸、或氨基酸与氨基酸精确相对应。

对于并非精确对应的序列，可测定“相同性百分比％”。一般说，将要比较的两条序列进行排列对比，得出两个序列之间的最大相关性。这可能包括在一条或两条序列中插入“空格”以提高排列对比程度。可测定要比较的各序列全长的相同性百分比％(所谓总体序列对比)，这特别适合长度相同或非常相似，或较短而长度明确的序列(所谓局部序列对比)，更适合长度不相等的序列。

比较两条或多条序列相同性和同源性的方法是本领域熟知的。例如，可采用Wisconsin序列分析包9.1版(Devereux J等，1984)中的程序，例如BESTFIT和GAP程序，来测定两条聚核苷酸之间的相同性％和两条多肽序列之间的相同性％及同源性％。BESTFIT采用Smith和Waterman(1981)的“局部同源性”算法，寻找两个序列之间相似性最佳的一个区域。其它测定序列之间相同性和/或相似性的程序是本领域知道的，例如通过www.ncbi.nlm.nih.gov的NCBI主页进入得到BLAST(Altschul S F等，1990，Altschul S F等，1997)和FASTA(Pearson W R，1990)家族程序。

任何这类突变蛋白最好具有充分复制的sTACI或TACI-Fc序列的氨基酸序列，从而具有与SEQ ID NO：2或4基本相似的配体结合活性。例如，TACI的一种活性是能结合Blys或APRIL(Hymowitz等，2006)。只要这种突变蛋白具有基本的APRIL或Blys结合活性，即可视为具有与TACI基本相似的活性。因此，本领域技术人员通过常规实验不难测定任何给定的突变蛋白是否具有与SEQ ID NO：2或4蛋白基本相同的活性。

本发明突变蛋白优选的改变是称为“保守性”取代的改变。sTACI或TACI-Fc的保守性氨基酸取代可包括具有充分相似理化性质的一组氨基酸成员中的同义氨基酸取代，将保留该分子的生物学功能(Grantham，1974)。已清楚可在上述序列中进行氨基酸插入和缺失而不会改变它们的功能，特别是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸，如30个以下、20个以下、或优选10个以下，且不去除或取代对功能构型关键性的氨基酸，如半胱氨酸残基。这种缺失和/或插入产生的蛋白和突变蛋白落入本发明范围内。

保守性氨基酸分组优选表2所列的那些。同义氨基酸分组更优选表3所列的那些，同义氨基酸分组最优选表4所列的那些。

表2优选的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser，Thr，Gly，Asn

Arg Arg，Gln，Lys，Glu，His

Leu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu

Pro Gly，Ala，Thr，Pro

Thr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr

Ala Gly，Thr，Pro，Ala

Val Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val

Gly Ala，Thr，Pro，Ser，Gly

Ile Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile

Phe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe

Tyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr

Cys Ser，Thr，Cys

His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His

Gln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln

Asn Gln，Asp，Ser，Asn

Lys Glu，Gln，His，Arg，Lys

Asp Glu，Asn，Asp

Glu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu

Met Phe，Ile，Val，Leu，Met

Trp Trp

表3更优选的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg His，Lys，Arg

Leu Leu，Ile，Phe，Met

Pro Ala，Pro

Thr Thr

Ala Pro，Ala

Val Val，Met，Ile

Gly Gly

Ile Ile，Met，Phe，Val，Leu

Phe Met，Tyr，Ile，Leu，Phe

Tyr Phe，Tyr

Cys Cys，Ser

His His，Gln，Arg

Gln Glu，Gln，His

Asn Asp，Asn

Lys Lys，Arg

Asp Asp，Asn

Glu Glu，Gln

Met Met，Phe，Ile，Val，Leu

Trp Trp

表4最优选的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu，Ile，Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile，Met，Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys，Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met，Ile，Leu

Trp Met

从按照本发明纯化的Fc-融合蛋白可制备其功能衍生物。本说明书所用的“功能衍生物”覆盖拟按本发明方法纯化的Fc-融合蛋白的衍生物，用本领域已知的方法可从残基的侧链功能基团或N-或C-末端基团制备此衍生物，只要它们仍为药学上可接受的，即它们的蛋白质活性没有破坏，仍基本上类似于上述未经修饰的Fc-融合蛋白的活性，以及不会使含它们的组合物产生毒性，就都包括在本发明中。

Fc-融合蛋白的功能衍生物可例如偶联于聚合物以改善其蛋白性能，如稳定性、半衰期、生物利用度、人体的耐受性或免疫原性。为实现此目的，可将TACI-Fc连接于例如聚乙二醇(PEG)。PEG化可用已知方法例如WO92/13095中描述的方法进行。

例如，此种功能衍生物也可包括羧基的脂肪族酯，羧基与氨或伯胺或仲胺反应形成的酰胺，氨基酸残基的游离氨基与酰基(如烷酰基或环碳芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基形成的O-酰基衍生物。

第三方面，本发明涉及用本发明纯化方法纯化的蛋白质。在下文中，这种蛋白质也称为“纯化的Fc-融合蛋白”。

这种纯化的Fc-融合蛋白较佳为高度纯化的Fc-融合蛋白。例如，在每条泳道加载2mcg蛋白作非还原性SDS-PAGE凝胶电泳银染色，以只存在一条带来确定Fc-融合蛋白的高纯度。也可利用在HPLC中洗脱物只有一个峰来确定纯化的Fc-融合蛋白。

从本发明纯化方法获得的Fc-融合蛋白制品可含有低于20％的杂质，较佳为低于10％、5％、3％、2％或1％的杂质，或可以纯化至匀质，即用上述银染色SDS-PAGE或HPLC检测没有任何可检测到的污染蛋白。

纯化的Fc-融合蛋白预期可用于治疗，特别是给予病人。如果将纯化的Fc-融合蛋白给予病人，宜全身给药，较佳为皮下或肌肉内，或局部给药。根据纯化Fc-融合蛋白的具体医学用途，直肠内或鞘膜内给药可能也是适合的。

为此目的，在本发明的一优选实施方式中，可将纯化的Fc-融合蛋白配制成药物组合物，即与药学上可接受的载体、赋形剂等一起配制。

“药学上可接受的”其定义意在包括不干扰活性成分生物学活性的有效性和对给药宿主无毒的任何载体。例如，对于胃肠道外给药，可将活性蛋白用载体如盐水、葡聚糖溶液、血清白蛋白和林格液配制成注射用单位剂型。

本发明药物组合物的活性成分可经各种途径给予个体。给药途径包括：皮内、透皮(如缓释制剂)肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下途径，口服、颅内、硬膜外、局部、直肠内和鼻内途径。任何其它治疗上有效的给药途径均可使用，例如通过上皮或内皮组织吸收，或基因治疗，其中给予病人编码活性药物的DNA分子(如通过载体)导致活性药物在体内表达和分泌。此外，本发明的蛋白质可与其它生物学活性药物组分，如药学上可接受的表面活性剂、辅料、载体、稀释剂等一起给予。

对于胃肠道外(如静脉内、皮下、肌肉内)给药，可将活性蛋白质与药学上可接受的胃肠道外载体(如水、盐水、葡萄糖溶液)和维持等渗性(如甘露醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲剂)的添加剂联合配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。通过常用技术将此制剂灭菌。

活性蛋白的治疗有效量可能是许多变量的函数，这些变量包括Fc-融合蛋白的类型、Fc-融合蛋白对其配体的亲和力、给药途径、病人的临床状况。

如以上所述和特别参见上面的表5，“治疗有效量”是Fc-融合蛋白给药后导致对Fc-融合蛋白治疗性部分的配体产生抑制作用的量。

以单剂量或多剂量给予个体的剂量，将视各种因素而不同，包括Fc-融合蛋白的药代动力学性质、给药途径、病人状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、身体大小)、症状程度、同时进行的治疗、治疗频率和需要的效果。调整和操纵已制定的剂量范围属于本领域技术人员的能力范围，在个体上测定治疗部分天然配体抑制作用的体内外方法也是如此。

纯化Fc-融合蛋白的用量为每公斤体重0.001-100mg，或0.01-10mg，或0.1-5mg，或1-3mg，或2mg。

在其它优选实施方式中，每日或每隔一日，或每周三次或每周一次给予纯化的Fc-融合蛋白。

每日剂量通常以可有效获得所需结果的分剂量或持续释放形式给予。可以与最初或先前给予个体的剂量相同的、较少的或较多的剂量进行第二次或随后的给药。可在疾病发作期间或之前进行第二次或随后的给药。

本发明还涉及用以上详述的本发明方法获得的包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员胞外部分的纯化的Fc-融合蛋白组合物，其中，所述组合物包含的蛋白凝聚物少于2％、或少于1.5％、或少于1％、或少于0.7％、或少于0.6％、或优选少于0.5％。本发明的组合物较佳为包含全长的完整Fc-融合蛋白，其N-或C-末端缺失不多于1或2个氨基酸，更优选其N-或C-末端不缺失任何氨基酸。

本发明还涉及用本发明方法获得的包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员胞外部分的纯化的Fc-融合蛋白组合物，其中，所述组合物包含的上述游离Fc少于1％、或少于0.8％、或少于0.5％。

这种Fc-融合蛋白可以例如衍生自TNFR超家族成员OX40。这种OX40-功能蛋白，如OX40-IgG₁和OX40-hIG₄mut，可优选用于治疗和/或预防炎症和自身免疫性疾病，如克罗恩病。

此种包含治疗部分的Fc-融合蛋白较佳为选自TNFR1、TNFR2的胞外结构域，或其TNF结合片段。

在一优选实施方式中，这种Fc-融合蛋白是依那西普(Etanercept)，一种含有p75TNFR的可溶性部分的Fc-融合蛋白(如WO9l/03553，WO94/06476)。按照本发明纯化的依那西普可用于例如治疗和/或预防子宫内膜移位症、丙肝病毒感染、HIV感染、牛皮癣关节炎、牛皮癣，类风湿关节炎、哮喘、强直性脊椎炎、心力衰竭、移植物抗宿主疾病、肺纤维化、克罗恩病。来那西普(Lenercept)是一种含有人p55TNF受体胞外组分和人IgG Fc部分的融合蛋白，预期可用于治疗严重脓毒症和多发性硬化症。

在另一优选实施方式中，Fc-融合蛋白包含选自BAFF-R、BCMA或TACI胞外结构域的治疗部分，或其能与Blys或APRIL中至少一种结合的片段。

按照本发明方法纯化的衍生自BAFF-R的Fc-融合蛋白优选用于治疗和/或预防自身免疫性疾病，如类风湿关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)。

按照本发明方法纯化的BCMA-Ig融合蛋白优选用于治疗和/或预防自身免疫性疾病。

衍生自TACI的Fc-融合蛋白(TACI-Fc)优选包含选自以下的多肽：

a.SEQ ID NO：2的氨基酸34-66；

b.SEQ ID NO：2的氨基酸71-104；

c.SEQ ID NO：2的氨基酸34-104；

d.SEQ ID NO：2的氨基酸30-110；

e.SEQ ID NO：3：

f.SEQ ID NO：4：

g.能在高严谨条件下与SEQ ID NO：5或6或7的互补物杂交的聚核苷酸编码的多肽；

h.与(c)、(d)、(e)或(f)所述多肽具有至少80％或85％或90％或95％序列相同性的(c)、(d)、(e)或(f)之一的突变蛋白；其中所述多肽能结合Blys或APRIL中至少一种。

纯化的TACI-Fc可优选用于制备治疗和/或预防多种疾病或病患的药物。这类疾病或病患宜选自自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)，及治疗多发性硬化症(MS)。纯化的TACI-Fc也可用于治疗癌症，例如血液恶性肿瘤如多发性骨髓瘤(MM)和/或非何杰金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。

现已全面描述了本发明，本领域技术人员会理解，在广泛的同等参数、浓度和条件范围内，不背离本发明的思路和范围的范围，也无须过多实验，可以实施本发明的方法。

本发明已结合具体实施方式加以描述，可以理解本发明能作进一步的修改。本申请旨在覆盖基本上按照本发明的原理对本发明所作的任何更改、利用或适应性修改，包括背离本说明书公开的内容，而这些更改、利用或适应性修改属于本发明所属领域已知或常规实践原理范围内，以及如下所附权利要求阐述的可适应于上文所述的基本特征。

本说明书引用的所有参考文献，包括杂志中的文章或摘要，出版或未出版的美国或外国专利申请、已发布的美国或外国专利或任何其它参考文献都整体纳入本说明书作为参考，包括参考文献中的所有数据、表格、附图和文本。此外，本说明书引用的参考文献中的参考文献目录也全部纳入本说明书作参考。

参考已知的方法步骤、常规方法的步骤、已知方法或常规方法，并不以任何方式承认在相关领域中公开、教导和提示了本发明的任何方面内容、说明或实施方式。

以上具体实施方式的描述完全揭示了本发明总的性质，他人可通过应用本技术领域的知识(包括本说明书引用参考文献的内容)无须过多实验和不背离本发明的总体概念而不难修饰和/或改编这些具体实施方式以供各种应用。因此，这些依据本说明书提供的教导和指引作出的适应性修改和修饰属于所公开的实施方式等同物的范围。也应理解，本说明书所用的措词或术语是为了说明而非限制的目的，因此本说明书的术语或措词可由本领域技术人员凭借本说明书提供的教导和指引，结合本领域普通技术人员的知识予以解释。

实施例：从无血清CHO细胞上清液中纯化重组人TACI-Fc

词汇表

BV：柱床体积

CHO：中国仑鼠卵巢

DSP：下游工艺

EDTA：乙二胺四乙酸

ELISA：酶联免疫吸附试验

HAC：羟基磷灰石层析

HCP：宿主蛋白

HPLC：高效液相色谱

id：内径

K：钾

kD：千道尔顿

MES：2-吗啉基乙磺酸

Na：钠

NaAc：乙酸钠

n/d：未测定

PA-SE-HPLC：蛋白A分子大小排阻高效液相色谱

ppm：百万分率

RO：逆向渗透

RT：室温

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳

SE-HPLC：分子大小排阻高效液相色谱

T℃：温度

TMAC：氯化四甲铵

UV：紫外线

WFI：注射用水

WRO 逆向渗透水

实施例1：捕获步骤：蛋白A亲和纯化

起始材料是在无血清条件下培养的表达TACI-Fc的CHO细胞克隆澄清收集液，冰冻贮存至使用。

按以下方案在MabSelect Xtra^TM柱(GE Healthcare 17-5269-03)上进行此捕获步骤，此柱的床高17cm。所有操作在室温下进行，除了加载溶液保持在15℃以下。记录280nm的UV信号。

清洁

用至少3BV的0.1M乙酸+20％乙醇，以250cm/h的逆流速清洁此柱。停止流动1小时。

洗涤步骤

用至少2BV的RO水，以250cm/h的逆流速洗涤此柱。

平衡

用至少5BV的25mM磷酸钠+150mM的NaCl液pH7.0(单位导电率和pH参数在特定范围内：pH7.0±0.1，导电率18±2mS/cm)以450cm/h的向下流速平衡此柱。

加载

以350cm/h的流速加载保持在15℃以下的收集澄清液到此柱上，用Biacore试验测定每ml填充树脂的加载容量不高于15mg总TACI-Fc蛋白。

洗涤步骤

用至少2BV的平衡缓冲液，以350cm/h流速洗涤此柱，然后用至少4BV的平衡缓冲液，以450cm/h流速洗涤此柱(直到UV信号回到基线)。

洗脱

用表1所示的不同洗脱缓冲液，以350cm/h流速洗脱此材料。当UV信号开始上升至洗脱至6.0±0.5BV时，收集洗脱组分。在pH4.1以下(如果需要，加入柠檬酸液调节)室温培育洗脱物1小时，然后加入32％NaOH液调节pH至5.0±0.1。

再生

用至少3BV的50mM NaOH+1M NaCl液，以450cm/h逆向流速再生此柱，停止流动15分钟，然后用至少3BV的液体重新开始，流速450cm/h(直到UV信号返回到基线)。

从此步骤起，用逆流方式操作此柱。

洗涤步骤

用至少2BV的RO水，以450cm/h流速洗涤此柱。

清洁

用至少3BV的清洁缓冲液，以250cm/h流速清洁此柱，停止流动培育此柱60分钟。

最后的洗涤步骤

用至少1BV的RO水以250cm/h流速，然后用至少3BV的平衡缓冲液以250cm/h流速，最后用至少2BV的RO水以250cm/h流速洗涤此柱。

最后，在用3BV的20％乙醇以250cm/h流速洗涤后将柱储存。

结果

表I：采用不同洗脱缓冲液的结果

操作#	洗脱缓冲液	TACl-Fc产量(％)	凝聚物(％)	HCPs(ppm)
操作#	洗脱缓冲液	TACl-Fc产量(％)	凝聚物(％)	HCPs(ppm)	1234	50mM NaAc pH3.7100mM NaAc pH3.8200mM NaAc pH3.8100mM NaAc pH3.7	47.755.758.068	30.325.228.230.0	5558n/dn/dn/d
567891011121314	0.2M NaAc+150mM NaClpH4100mM NaAc pH3.7250mM NaAc pH3.7100mM柠檬酸钠pH3.7250mM柠檬酸钠pH3.7100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75100mM NaAc pH3.85100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.65	75.184.682.879.271.982.866.683.381.075.1	3.82218.78.8238.59.015.09.114.6	n/d34913318471023471576664n/d34902580	1234		47.755.758.068	30.325.228.230.0	5558n/dn/dn/d
567891011121314		75.184.682.879.271.982.866.683.381.075.1	3.82218.78.8238.59.015.09.114.6	n/d34913318471023471576664n/d34902580	141617	100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75	44.747.150.7	18.415.89.4	378332172349
1819	100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75	58.067.1	10.428.7	25502372	141617	100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75	44.747.150.7	18.415.89.4	378332172349

操作#	洗脱缓冲液	TACI-Fc产量(％)	凝聚物(％)	HCPs(ppm)
操作#	洗脱缓冲液	TACI-Fc产量(％)	凝聚物(％)	HCPs(ppm)	20	100mM柠檬酸钠pH3.75	65.6	17.5	2353
21222324	100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.75	75.657.151.958	19.420.718.411.5	1807246520301746	20	100mM柠檬酸钠pH3.75	65.6	17.5	2353
21222324		75.657.151.958	19.420.718.411.5	1807246520301746	25262728	100mM柠檬酸钠pH3.75100mM柠檬酸钠pH3.9100mM柠檬酸钠pH3.9100mM Na Ac pH4.1	41.839.431.028.3	22.96.08.825.0	3029242429363311
29303132	100mM柠檬酸钠pH3.9100mM NaAc pH4.1100mM柠檬酸钠pH3.75100mM NaAc pH4.2	46.442.857.538.1	9.113.426.510.1	n/dn/dn/dn/d	25262728		41.839.431.028.3	22.96.08.825.0	3029242429363311
29303132		46.442.857.538.1	9.113.426.510.1	n/dn/dn/dn/d	33	100mM Na citrate pH3.9	43.3	8.3	2011
343536373839	100mM柠檬酸钠pH3.9100mM柠檬酸钠pH3.9100mM柠檬酸钠pH3.9100mM柠檬酸钠pH3.9100mM柠檬酸钠pH3.9100mM柠檬酸钠pH3.9	63.665.762.761.660.664.6	6.67.37.47.47.48.0	174916891609147916231497	33	100mM Na citrate pH3.9	43.3	8.3	2011

结论

澄清收集液中的TACI-Fc5被直接捕获在MabSelect Xtra柱上，当流速为350cm/h时每升充填树脂的动态容量为15g总TACI-Fc5蛋白。优化洗脱条件，尤其是pH，能最大回收产物同时显著减少凝聚物水平。选择0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.9)，使澄清收集液中的凝聚物水平从起初的约25-40％降低到约5-10％，未观察到混浊。HCP水平通常为1500-2000ppm。用多克隆抗体ELISA测定HCP水平。制备了针对非转染CHO细胞的澄清和浓缩细胞培养上清液中宿主细胞蛋白质的抗体混合物。

实施例2：阳离子交换层析

将蛋白A捕获步骤得到的洗脱物用适当的加载缓冲液透析后用作阳离子交换层析的起始材料。

此步采用床高10cm的Fractogel EMD SO₃ ^-柱(Merck 1.16882.0010)。也可采用床高15cm的Fractogel EMD SO₃ ^-柱。后者的动态容量和流速可能需要改造，这属于本领域技术人员的常规知识。

所有操作在室温下进行，流速恒定保持在150cm/h。记录所有时间段的280nmUV信号。

洗涤步骤

用至少1BV的WRO(逆向渗透水)洗涤此柱。

清洁

然后，用至少3BV的0.5M NaOH+1.5M NaCl液以向上流动方式清洁此柱。

淋洗

用至少4BV的WRO以向下流动方式淋洗此柱。

平衡

用至少4BV的100mM柠檬酸钠液(pH5.0)平衡此柱(或直到达到导电率为12±1mS/cm和pH 5.0±0.1的目标)。

加载

用pH5.0(pH 5.0±0.1，导电率12±1mS/cm)的后捕获材料加载此柱，用SE-HPLC试验测得每ml充填树脂的容量不超过50mg TACI-Fc。

洗涤步骤

然后用至少5BV的100mM磷酸钠液(pH6.5)洗涤此柱。

洗脱

用下表II-IV报告的不同缓冲液在不同条件下洗脱此柱。

再生和清洁

用4BV的0.5M NaOH+1.5M NaCl液以向上流动方式再生和清洁此柱。然后停止流动30分钟。

淋洗

用至少4BV的WRO淋洗此柱。

储存

将此柱储存在至少3BV的20％乙醇中。

结果

表II：洗脱液pH和导电率的作用

加载液中的HCP水平：189ppm

pH	导电率(mS/cm)	TACI-Fc回收率	HCPs(ppm)	HCP清除(x)
pH	导电率(mS/cm)	TACI-Fc回收率	HCPs(ppm)	HCP清除(x)	6.57.38.07.37.37.37.37.36.3	15.022.515.022.533.022.522.512.022.5	25％100％95％100％98％96％97％54％83％	11850345613345537947	1.63.85.53.41.44.23.62.44.1

pH	导电率(mS/cm)	TACI-Fc回收率	HCPs(ppm)	HCP清除(x)
pH	导电率(mS/cm)	TACI-Fc回收率	HCPs(ppm)	HCP清除(x)	8.08.26.57.37.3	30.022.530.022.522.5	96％97％91％93％95％	108461164840	1.84.21.63.94.8

表III显示了每ml树脂的加载容量为10和32mg TACI-Fc且用导电率12-33mS/cm的磷酸缓冲液洗脱时TACI-Fc的回收率和HCP的清除率。从洗脱液UV开始上升起收集蛋白峰组分，共收集10±0.5BV。

表III：优化洗脱液的pH和导电率对加载容量的作用

加载液中的HCP水平：201ppm。

加载量(mg/ml)	pH	导电率(mS/cm)	TACI-Fc回收率	HCPs(ppm)	HCP清除率(x)
加载量(mg/ml)	pH	导电率(mS/cm)	TACI-Fc回收率	HCPs(ppm)	HCP清除率(x)	10	8.0	15.020.7	91％93％	6761	3.03.3
32	8.0	20.7	88％	54	3.7	10	8.0	15.020.7	91％93％	6761	3.03.3

表IV显示采用50或100或150mM磷酸钠液(pH6.5)的洗涤步骤对TACI-Fc回收和HCP清除效率的影响。

表IV：洗涤步骤条件对层析柱效能的影响

加载液中的HCP水平：190ppm，凝聚物水平：2.0％

第二次洗涤所用的缓冲液含100mM磷酸钠，pH6.5，导电率8.4mS/cm。

图1显示用表IV所示三步洗涤实验条件清除游离Fc的实验中得到的样品的银染色非还原性SDS-PAGE凝胶。

图2显示用不同浓度磷酸钠液洗涤实验步骤的相互重叠色谱图。

用提高磷酸钠浓度(从50mM提高到150mM)使洗涤步骤优化于pH6.5。如图1所见，150mM浓度的洗涤缓冲液(洗涤3，泳道6)导致TACI-Fc的丢失。50mM浓度的洗涤缓冲液(洗涤1，泳道8)产生了一个纯TACI-Fc蛋白峰，然而洗脱物中含有微量游离Fc。用100mM磷酸钠液(pH6.5)的洗涤步骤导致洗脱物主峰中的回收率为98％，洗涤液中只丢失了2％(图2)。HCP清除了3.2倍。洗涤液和洗脱物组分的SDS-PAGE分析显示，用100mM或以上浓度的缓冲液，此洗涤步骤洗涤液含游离Fc和一些完整的TACI-Fc蛋白(图1，泳道4和6)。100mM或更高的浓度是完全去除洗脱物组分中游离Fc所必须的(图1，泳道5和6)。

结论

开发了阳离子交换步骤作为捕获步骤后的第二步纯化步骤。捕获的洗脱物pH低(5.0)，导电率低，可直接加到阳离子交换柱上。选择加载容量为50mg/ml的Fractogel EMD SO₃ ^-树脂。洗涤步骤中采用0.1M磷酸钠液(pH6.5)能有效去除无生物学活性的降解产物游离Fc。优化洗脱条件实现了HCP的最佳清除和TACI-Fc的高回收(179mM磷酸钠液，pH8.0，导电率20.7mS/cm)。

另外，当280nm吸光度开始升高时，用10BV的20mM磷酸钠和180mMNaCl液(pH8.0)进行洗脱。

实施例3：阴离子交换层析

此纯化步骤所用的起始材料是Fractogel SO₃ ^-(参见实施例2)阳离子交换步骤得到的洗脱物，用合适的加载缓冲液透析或稀释。

在10cm柱床高的SOURCE 30Q层析柱(GE Healthcare 17-1275-01)上进行此步阴离子交换层析。此步也可采用柱床高15cm的SOURCE 30Q层析柱。后者的动态容量和流速可能需要作适应性改变，这属于本领域技术人员的常规知识。

所有操作在室温下进行，记录280nmUV的信号。以150或200cm/h流速进行此步骤。

淋洗

先用至少1BV的RO水，以150cm/h流速淋洗此柱。

清洁

然后用至少3BV的0.5M NaOH+1.5M NaCl清洁此柱。

洗涤步骤

用至少3BV，优选4-10BV的0.5M磷酸钠液(pH7.5)，以200cm/h流速洗涤此柱。

平衡

用至少5BV的10、15、20、25或30mM磷酸钠液(pH7.5)平衡此柱。任选用3BV的0.5M磷酸钠液(pH7.5)预平衡此柱、

加载、洗涤和随后收集流出液中的TACI-Fc蛋白

将阳离子交换层析后所得材料稀释到磷酸钠浓度为10-30mM(pH7.5后)，加到此柱上，用SE-HPLC测定每ml充填树脂的TACI-Fc容量不到50mg，用4±0.5BV平衡缓冲液洗涤，收集从UV开始升高到洗涤步骤结束时的流出液。

再生/清洁

用至少3BV的0.5M NaOH+1.5M NaCl液，以150cm/h流速逆向流动方式(直到UV信号返回到基线)再生和清洁此柱。再生结束时，停止泵工作30分钟。

洗涤步骤

用至少3BV的RO水，以200cm/h流速洗涤此柱。

储存

将此柱储存于至少150cm/h流速的3BV 20％乙醇(v/v)中。

结果

以下表V小结了用上述纯化方法获得的结果。

表V：磷酸钠加载液浓度的影响

加载液的pH	加载液中磷酸钠的浓度(mM)	加载液中TACI-Fc的浓度(mg/L)	加载量(mg/ml)	TACI-Fc回收率	凝聚物	HCP(ppm)
加载液的pH	加载液中磷酸钠的浓度(mM)	加载液中TACI-Fc的浓度(mg/L)	加载量(mg/ml)	TACI-Fc回收率	凝聚物	HCP(ppm)	7.57.57.57.57.5	3025201510	773639651437283	39394946n./d.	94％90％90％88％82％	10.4％6.9％5.6％3.4％2.8％	82.850.443.945.026.3

结论

优化了以流穿方式在Source 30Q柱上的阴离子交换层析步骤，从而最大程度清除了HCP和凝聚物。用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)稀释或透析加载的阳离子交换层析得到的洗脱物，得到了在产物回收率(90％)、HCP清除率(从约2000ppm降低至44ppm)和凝聚物清除(从约25％降低至5.6％)之间的最佳折衷结果。采用150-200cm/h流速时，每ml充填树脂的TACI-Fc蛋白动态容量为50mg。

实施例4：羟基磷灰石层析

此纯化步骤所用的起始材料是阴离子层析的流穿物(见实施例3)。

采用柱床高10cm的CHT I型陶瓷羟基磷灰石40微米(颗粒)柱(Biorad157-0040)。

所有操作在室温下进行，流速恒定保持在175cm/h。记录280nmUV信号。所有溶液过滤除菌，仪器用前以氢氧化钠液作清洁处理。此柱不用时储存在0.5M NaOH溶液中。

最初的洗涤步骤(淋洗和预平衡)

用至少1BV的20mM磷酸钠(pH7.5)缓冲液，然后用至少3BV的0.5M磷酸钠pH7.5缓冲液洗涤此柱以降低其pH。

平衡

用至少5BV的20mM磷酸钠pH7.5缓冲液平衡此柱(或直到达到导电率3.0±0.3mS/cm和pH 7.5±0.1的目标)。

加载

取SOURCE 30Q层析柱的流出液加0.5M氯化钙贮存液至氯化钙终浓度0.1mM，加入85％的正磷酸液调节pH至7.0，以按SE-HPLC试验测得每ml充填树脂的TACI-Fc蛋白容量为NMT 50mg的量加载于柱上。也可不用氯化钙，将pH调节至7.0的SOURCE 30Q流出液加载到羟基磷灰石柱上。

洗涤步骤

用至少4BV的3、4或5mM磷酸钠、10mM MES、0.1mM CaCl₂pH6.5缓冲液洗涤此柱。在这些步骤中，也可采用不含氯化钙的相同缓冲液。

洗脱

采用不同BV(见表VI和VII)从UV升高开始，用5、4、3或2mM磷酸钠(见表VI)、10mM MES、0.1mM CaCl₂和0.6、0.7、0.8或0.9M KCl pH6.5缓冲液(见表VII)洗脱。也可采用不含氯化钙的相同缓冲液洗脱。

淋洗

依次用以下缓冲液淋洗此柱：

-至少1BV的20mM磷酸钠pH7.5缓冲液；

-至少3BV的0.5M磷酸钠pH7.5缓冲液；和

-至少1BV的20mM磷酸钠pH7.5缓冲液。

保存

将柱保存在至少3BV的0.5M NaOH液中。

结果

表VI显示洗脱缓冲液的磷酸钠浓度(2-5mM)对去除凝聚物和产物回收的影响。合并洗脱峰组分，用SE-HPLC分析TACI-Fc浓度和凝聚物水平。

表VI：洗脱缓冲液的磷酸钠浓度的影响

缓冲液的磷酸钠浓度(mM)	洗脱液的BV	TACI-Fc得率	凝聚物
缓冲液的磷酸钠浓度(mM)	洗脱液的BV	TACI-Fc得率	凝聚物	5	12131415161718	73％74％68％77％77％70％76％	0.49％0.52％0.65％0.67％0.70％0.73％0.85％

4	12131415161718	68％67％66％67％66％66％66％	0.34％0.29％0.36％0.39％0.38％0.32％0.40％
4	12131415161718	68％67％66％67％66％66％66％	0.34％0.29％0.36％0.39％0.38％0.32％0.40％	3	12131415161718	70％76％73％71％69％69％70％	0.46％0.42％0.51％0.52％0.55％0.50％0.53％
2	12131415161718	65％66％66％68％66％71％65％	0.19％0.00％0.18％0.14％0.17％0.19％0.16％	3	12131415161718	70％76％73％71％69％69％70％	0.46％0.42％0.51％0.52％0.55％0.50％0.53％

表VII显示洗脱缓冲液的KCl浓度对凝聚物清楚和产物回收率的影响。研究了两种磷酸钠浓度：2mM和3mM。合并洗脱峰组分用SE-HPLC分析TACI-Fc浓度和凝聚物水平。

表VII：洗脱缓冲液氯化钾浓度的效应

磷酸盐浓度(mM)	KCl浓度(M)	洗脱液的BV	TACI-Fc得率	凝聚物
磷酸盐浓度(mM)	KCl浓度(M)	洗脱液的BV	TACI-Fc得率	凝聚物	3	0.6	1011121314	102％109％106％105％103％	0.48％0.46％0.43％0.42％0.43％
3	0.7	1011121314	96％97％98％96％96％	0.42％0.40％0.41％0.40％0.43％	3	0.6	1011121314	102％109％106％105％103％	0.48％0.46％0.43％0.42％0.43％
3	0.7	1011121314	96％97％98％96％96％	0.42％0.40％0.41％0.40％0.43％	3	0.8	1011121314	106％110％112％101％110％	0.58％0.55％0.57％0.59％0.57％
2	0.6	1011121314	71％79％80％80％81％	0.29％0.28％0.29％0.29％0.26％	3	0.8	1011121314	106％110％112％101％110％	0.58％0.55％0.57％0.59％0.57％
2	0.6	1011121314	71％79％80％80％81％	0.29％0.28％0.29％0.29％0.26％	2	0.9	1011121314	64％72％73％70％66％	0.27％0.25％0.29％0.33％0.24％

结论

羟基磷灰石层析提供了降低TACI-Fc凝聚物水平的可靠有效方法。从阴离子交换层析纯化的材料(见实施例3)开始时凝聚物水平约为5-8％，羟基磷灰石层析可使这些水平降低至0.8％以下而TACI-Fc回收率为85-90％。

总结果

我们开发的TACI-Fc四步纯化方法产生了高纯度的TACI-Fc(融合蛋白)，其中凝聚物水平总体降低到1％以下(0.2-0.8％，5次实验)。HCP水平总体降低到约5-10ppm，游离Fc水平总体降低到0.5％以下(0.2和0.1％，两次实验)。

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50.von Bülow和Bram，Science 228：138(1997)

51.Xia等，J.Exp.Med.2000，137-143。

序列表

<110>阿雷斯贸易股份有限公司

<120>Fc-融合蛋白的纯化方法

<130>1143WO/PCT

<150>EP06119610.1

<151>2006-08-28

<150>US60/842，682

<151>2006-09-06

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>40

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<221>来源

<223>/注译＝人造序列说明：共有序列，其中3、12、14、15、18、21、25、34和38位的特定氨基酸用任何氨基酸隔开

<220>

<221>变体

<222>(1)..(2)，(4)..(11)，13，(16)..(17)，

(19)..(20)，(22)..(24)，(26)..(33)，(35)..(37)和(39)..(40)

<223<Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400>1

Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Leu Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa

35 40

<210>2

<211>293

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp

1 5 10 15

Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg

20 25 30

Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met

35 40 45

Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His GlnSer Gln Arg Thr Cys Ala Ala

50 55 60

Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp

65 70 75 80

His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His

85 90 95

Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val

100 105 110

Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn

115 120 125

Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser

130 135 140

Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gln Val

145 150 155 160

Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val Leu Cys

165 170 175

Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro

180 185 190

Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala Lys Ser

195 200 205

Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr Ser Pro

210 215 220

Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro

225 230 235 240

Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala

245 250 255

Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro Cys Pro

260 265 270

His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala Gln Glu

275 280 285

Gly Gly Pro Gly Ala

290

<210>3

<211>251

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<221>来源

<223>/注译＝人造序列的说明：这是人免疫球蛋白的重链部分

<400>3

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

20 25 30

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

35 40 45

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

50 55 60

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

65 70 75 80

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

85 90 95

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

100 105 110

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

115 120 125

Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

130 135 140

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

145 150 155 160

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

165 170 175

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

180 185 190

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

195 200 205

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

210 215 220

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

225 230 235 240

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

245 250

<210>4

<211>348

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<221>来源

<223>/注译＝人造序列的说明：这是含有人TACI受体部分和人免疫球蛋白重链序列的融合蛋白序列

<400>4

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg

20 25 30

Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro

35 40 45

Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser

50 55 60

Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu

65 70 75 80

Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala

85 90 95

Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn

100 105 110

Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

225 230 235 240

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

245 250 255

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

<210>5

<211>879

<212>DNA

<213>智人

<400>5

atgagtggcc tgggccggag caggcgaggt ggccggagcc gtgtggacca ggaggagcgc 60

tttccacagg gcctgtggac gggggtggct atgagatcct gccccgaaga gcagtactgg 120

gatcctctgc tgggtacctg catgtcctgc aaaaccattt gcaaccatca gagccagcgc 180

acctgtgcag ccttctgcag gtcactcagc tgccgcaagg agcaaggcaa gttctatgac 240

catctcctga gggactgcat cagctgtgcc tccatctgtg gacagcaccc taagcaatgt 300

gcatacttct gtgagaacaa gctcaggagc ccagtgaacc ttccaccaga gctcaggaga 360

cagcggagtg gagaagttga aaacaattca gacaactcgg gaaggtacca aggattggag 420

cacagaggct cagaagcaag tccagctctc ccggggctga agctgagtgc agatcaggtg 480

gccctggtct acagcacgct ggggctctgc ctgtgtgccg tcctctgctg cttcctggtg 540

gcggtggcct gcttcctcaa gaagaggggg gatccctgct cctgccagcc ccgctcaagg 600

ccccgtcaaa gtccggccaa gtcttcccag gatcacgcga tggaagccgg cagccctgtg 660

agcacatccc ccgagccagt ggagacctgc agcttctgct tccctgagtg cagggcgccc 720

acgcaggaga gcgcagtcac gcctgggacc cccgacccca cttgtgctgg aaggtggggg 780

tgccacacca ggaccacagt cctgcagcct tgcccacaca tcccagacag tggccttggc 840

attgtgtgtg tgcctgccca ggaggggggc ccaggtgca 879

<210>6

<211>753

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<221>来源

<223>/注译＝人造序列的说明：编码SEQ ID NO：3所示蛋白的DNA

<400>6

atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatgggt cctgtccgag 60

cccaaatctt cagacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgagggg 120

gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 180

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 240

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 300

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 360

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccat cctccatcga gaaaaccatc 420

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 480

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 540

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 600

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 660

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 720

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 753

<210>7

<211>1044

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<221>来源

<223>/注译＝人造序列的说明：编码SEQ ID NO：4所示蛋白的DNA

<400>7

atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggcgc cgtcttcgtt 60

tcgctcagcc aggaaatcca tgccgagttg agacgcttcc gtagagctat gagatcctgc 120

cccgaagagc agtactggga tcctctgctg ggtacctgca tgtcctgcaa aaccatttgc 180

aaccatcaga gccagcgcac ctgtgcagcc ttctgcaggt cactcagctg ccgcaaggag 240

caaggcaagt tctatgacca tctcctgagg gactgcatca gctgtgcctc catctgtgga 300

cagcacccta agcaatgtgc atacttctgt gagaacaagc tcaggagcga gcccaaatct 360

tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgaggg ggcaccgtca 420

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 480

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 540

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 600

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 660

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 720

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 780

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 840

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 900

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 960

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1020

agcctctccc tgtctccggg taaa 1044

Claims

1.一种纯化等电点(pI)6.9-9.5的Fc-融合蛋白的方法，包括以下步骤：

a.将含有所述Fc-融合蛋白的液体进行蛋白A或蛋白G亲和层析；

b.将步骤(a)的洗脱物进行阳离子交换层析；

c.将步骤(b)的洗脱物进行阴离子交换层析；和

d.将步骤(c)的流出液进行羟基磷灰石层析，收集洗脱物获得纯化的Fc-融合蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的洗脱在pH 2.8-4.5范围进行。

3.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(b)还包括：

b1.用pH6-7、导电率6-10mS/cm的缓冲液洗涤阳离子交换树脂；和

b2.用pH7.3-8.2、导电率15-22mS/cm的缓冲液洗脱该层析柱。

4.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(c)的平衡和加载用导电率3-4.6mS/cm、pH低于Fc-融合蛋白pI值一个单位的缓冲液进行。

5.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(d)的洗脱在3-10mM浓度磷酸钠存在下进行。

6.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(d)的洗脱在0.4-1M浓度氯化钾存在下进行。

7.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(d)的洗脱在pH 6-7下进行。

8.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(a)在含有以重组蛋白A或蛋白G修饰的交联琼脂糖的树脂上进行。

9.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(b)在强阳离子交换树脂上进行。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述树脂包括用SO₃ ^-基团修饰的交联异丁酸酯树脂。

11.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(c)在强阴离子交换树脂上进行。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述树脂包括以N⁺(CH₃)₃.修饰的聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂。

13.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中步骤(d)在陶瓷羟基磷灰石树脂上进行。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述陶瓷羟基磷灰石树脂包含粒度40微米的颗粒。

15.如以上任何一项权利要求所述的方法，所述方法还包括至少一步超滤步骤。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述超滤步骤在步骤(b)与(c)之间和/或步骤(d)之后进行。

17.如以上任何一项权利要求所述的方法，所述方法还包括将Fc-融合蛋白配制到药物组合物中。

18.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白的等电点(pI)在8-9之间。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白的等电点(pI)在8.3-8.6之间。

20.如以上权利要求任何一项所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的配体结合部分。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述配体结合部分选自TNFR1、TNFR2的胞外结构域，或其TNF结合片段。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述配体结合部分选自BAFF-R、BCMA或TACI的胞外结构域，或其能至少结合Blys或APRIL之一的片段。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包括选自以下的多肽：

(a).SEQ ID NO：2的氨基酸34-66；

(b).SEQ ID NO：2的氨基酸71-104；

(c).SEQ ID NO：2的氨基酸34-104；

(d).SEQ ID NO：2的氨基酸30-110；

(e).SEQ ID NO：3：

(f).SEQ ID NO：4：

(g).能在高严谨条件下与SEQ ID NO：5或6或7的互补物杂交的聚核苷酸编码的多肽；

(h).与(c)、(d)、(e)或(f)所述多肽具有至少80％或85％或90％或95％序列相同性的(c)、(d)、(e)或(f)之一所述的突变蛋白；

其中所述多肽能结合至少Blys或APRIL之一种。

24.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包括免疫球蛋白的重链恒定区。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述恒定区是人免疫球蛋白的恒定区。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG₁。

27.如权利要求23-25任何一项所述的方法，其中所述恒定区包含绞链区、CH2和CH3区。

28.用以上任何一项权利要求所述方法获得的纯化Fc-融合蛋白组合物，其特征在于，所述Fc-融合蛋白包含选自以下的多肽：

(a).SEQ ID NO：2的氨基酸34-66；

(b).SEQ ID NO：2的氨基酸71-104；

(c).SEQ ID NO：2的氨基酸34-104；

(d).SEQ ID NO：2的氨基酸30-110；

(e).SEQ ID NO：3：

(f).SEQ ID NO：4：

其中所述多肽能结合至少Blys或APRIL之一种，和

其中所述组合物含有的蛋白凝聚物少于1％或少于0.5％，和

其中所述组合物含有的游离Fc蛋白少于1％或少于0.5％或少于0.1％。