CN101531991B - 红景天属植物的愈伤组织和悬浮细胞颗粒的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了红景天属植物的愈伤组织和悬浮细胞颗粒的生产方法，包括：(1)建立红景天属植物的无菌培养体系，培养得到具有根、茎和叶的无菌红景天属植物植株；(2)将无菌的根、茎或叶接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养和继代培养，得到红景天属植物不同器官起源的愈伤组织；(3)将愈伤组织接种到液体培养基中振荡培养，得到红景天属植物不同器官起源的优良悬浮细胞颗粒。本发明所获得的红景天属植物不同器官起源的优良悬浮细胞系具有生长速度快，分散性好，次生代谢物含量高(其中，红景天甙和酪醇的含量范围分别为悬浮细胞干重的1-3％和0.5-0.7％)等优点，在继代培养中非常稳定，不存在退化现象。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织或细胞的培养方法，尤其涉及红景天属(Rhodiola L.)植物不同器官起源的愈伤组织和优良悬浮细胞颗粒的规模化生产方法，属于植物组织或细胞培养领域。
背景技术
红景天为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)多年生草本或亚灌木植物，为传统的藏药和中药材入药植物，主要用于治疗肺炎、传染病和清血管热等，具有清热解毒和燥湿的功效，享有“高原人参”的美誉。几十年来，国内外对红景天属植物的研究方兴未艾，红景天不仅具有抗氧化、抗疲劳、抗缺氧、抗寒冷、抗衰老、抗微波辐射等类似适应原的作用，最近研究表明红景天还具有抑制肿瘤和肝纤维化等作用。红景天的主要有效成分是红景天甙(salidroside)、苷元酪醇(tyrosol)、酪萨维(rosavin)，除此之外，还含有许多其他活性成分，如香豆素类、多种微量元素，金属离子和有机化合物等。
红景天属植物多为天然资源，由于其生存环境恶劣，生长缓慢且年产量低，随着人们对红景天医学价值的认识导致需求量日益增大，使得原本就稀少的野生红景天严重匮乏。为此，人们试图从多种途径来解决红景天的需求问题。红景天组织培养可以克服野生资源短缺、自然繁殖率低和人工栽培烂根等棘手问题。研究表明，以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。红景天中含有大量次生代谢物，因此，建立稳定而具有高活力的红景天悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。
目前大部分的红景天属植物悬浮细胞系存在继代培养中退化，生长速度减慢，次生代谢物含量下降等问题，优良的高产红景天悬浮细胞系难以获得。目前国内对红景天属植物的研究中以高山红景天为最多，而关于大花红景天的报道较少并且仅是关于愈伤组织诱导及植株再生体系的建立的报道，而对其悬浮体系的建立和生物反应器的大规模培养没有报道。迄今为止，未见有关于长鞭红景天的组织或细胞培养的报道。
生物反应器具有工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便、不受时间和地点限制、随时随地规模化生产等诸多优点，为植物细胞培养生产次生代谢产物的商业化生产带来更大的希望。利用植物细胞或愈伤组织的大量培养生产红景天次生代谢产物，可以工业化的生产红景天甙和酪醇等化合物，是制备红景天甙和酪醇的一条有效途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种红景天属植物不同器官起源的愈伤组织之优良悬浮细胞颗粒的规模化生产方法，该方法所获得的红景天属植物优良悬浮细胞系具有生长速度快，分散性好，次生代谢物(尤其是红景天甙和酪醇)含量高等特点，所培养得到的悬浮细胞系在继代培养中非常稳定，不存在退化现象。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
红景天属植物不同器官起源的愈伤组织和优良悬浮细胞颗粒的规模化生产方法，包括以下步骤：
1、建立红景天属植物的无菌培养体系，培养得到无菌的具有根、茎和叶的红景天属植物植株；2、将无菌的根、茎或叶接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养和继代培养，得到红景天属植物不同器官起源的愈伤组织；3、将愈伤组织接种到液体培养基中振荡培养，得到红景天属植物不同器官起源的优良悬浮细胞颗粒。
为了规模化的得到红景天属植物不同器官起源的优良悬浮细胞颗粒，还可以进一步的将所得到的悬浮细胞颗粒接种到含有液体培养液的生物反应器中进行放大培养，可以实现规模化的提供红景天甙和酪醇；所述的液体培养基优选为以下(1)或(2)中的一种：(1)、MS基本培养基+蔗糖30g/L+2，4-D0.1mg/L+6-BA 3.0mg/L；(2)、MS基本培养基+蔗糖30g/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.5mg/L；
本发明中所述的红景天属植物优选为大花红景天(Rhodiola crenulata)或长鞭红景天(Rhodiola fastigiata)；
其中，步骤(1)中所述的无菌的具有根、茎和叶的红景天属植物植株可以参照以下方法培养得到：
(1)将红景天属植物的外植体消毒后接种在MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L上，培养(优选培养40天)形成幼苗，得到无菌外植体；其中，所述的外植体可以是红景天属植物的种子、根、茎、芽或叶片等；所述的红景天属植物茎和叶片的消毒方式优选如下：先用70％的乙醇漂洗10s，再用0.5％有效氯消毒液对茎、叶外植体表面灭菌25-30min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水分；
(2)将无菌外植体切成小段/块接种在固体培养基上进行芽和叶片的诱导培养；其中，对于大花红景天优选采用以下固体培养基：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L；对于长鞭红景天优选采用以下固体培养基：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 3mg/L+NAA 0.1mg/L；
(3)将步骤(2)所获得的芽或叶片转接到MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L中培养，进行芽的增殖和叶片的生产，获得无菌的红景天属植物的芽苗或叶片。
本发明红景天属植物不同器官起源的愈伤组织和悬浮细胞的培养方法中，步骤(2)中所述愈伤组织诱导培养基优选自以下(1)-(3)中的任意一种所述的培养基：(1)MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/LMS固体培养基+6-BA 1.0-3.0mg/L+2，4-D0.1-0.3mg/L；(2)1/2MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 2.0mg/L；(3)1/2MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+2，4-D 3.0mg/L；更优选的，对于长鞭红景天叶片起源的愈伤组织诱导培养基优选为：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L；对于长鞭红景天茎起源的愈伤组织诱导培养基优选为：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.3mg/L；对于大花红景天叶片起源的愈伤组织诱导培养基优选为：1/2MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 2.0mg/L；对于大花红景天茎起源的愈伤组织诱导培养基优选为：1/2 MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+2，4-D 3.0mg/L；
步骤3中所述的液体培养基优选为以下(1)或(2)中的一种：(1)、MS基本培养基+蔗糖30g/L+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 3.0mg/L；(2)、MS基本培养基+蔗糖30g/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.5mg/L；
本发明红景天属植物不同器官起源的愈伤组织和悬浮细胞的培养方法中，所述培养基消毒方式为在121℃下灭菌15min，培养基的pH值为5.8-6.0。
本发明红景天属植物不同器官起源的愈伤组织和悬浮细胞的培养方法中，各步骤中所述的培养条件优选为：培养温度25℃，光照强度为24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d。
目前大部分红景天属植物悬浮细胞系存在继代培养中退化，生长速度减慢，次生代谢物含量下降等问题，优良的高产红景天悬浮细胞系难以获得。适宜的外植体、激素水平、继代次数以及愈伤组织疏松程度是红景天细胞悬浮液培养体系建立所必需的。本发明对愈伤组织诱导培养基中的激素种类和配比进行了优化和筛选，针对不同种类的红景天植物确定了最适宜的诱导培养基，该诱导培养基可成功诱导不同种类红景天属植物不同器官产生疏松的愈伤组织，并通过这些愈伤组织建立了红景天属植物稳定的悬浮培养体系，实验结果表明这些悬浮细胞系在长期的继代培养中保持着旺盛的生长能力，其分散性好，生长速度快，从而得以进行红景天属植物不同器官起源的悬浮培养细胞颗粒的规模化生产，可以规模化的为药厂提供红景天甙和酪醇的来源，在短期内获得大量的制药原料，有效降低生产成本。
本发明方法所培养的红景天愈伤组织和悬浮细胞颗粒中有较高含量的红景天甙和酪醇等生物活性化合物。采用高效液相色谱法测定结果表明，由本发明培养方法所制备得到的红景天愈伤组织或悬浮细胞颗粒，其红景天甙和酪醇的含量范围分别为干重的1-3％和0.5-0.7％。
本发明利用组织及细胞培养生产含有较高红景天甙和酪醇的红景天愈伤组织或悬浮细胞，不仅可以节约大量的土地资源、人力资源和物力资源，保护生态环境，而且不受季节等外界条件的限制，源源不断的提供红景天甙和酪醇化合物药源。本发明方法利用生物反应器对红景天属植物不同器官起源的悬浮细胞颗粒的规模化生产，短期内可获得大量的制药原料，降低生产成本，可以与制药厂形成一体化进行规模化、工厂化生产，将对红景天产业的进一步发展、制药领域的进一步开拓具有重要的现实意义。
本发明中所涉及到的缩略术语：
TDZ：N-苯基-N’-1，2，3，-噻二唑-5-脲；
NAA：奈乙酸；
6-BA：6-苄氨基嘌呤；
2，4-D：2，4-二氯苯氧乙酸；
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
表1、MS基本培养基的配方
| 培养基成分 | MS(1962)Murashige and Skoog(mg/L) |
| MgSO4·7H2O | 370 |
| CaCl2·2H2O | 440 |
| KNO3 | 1900 |
| NH4NO3 | 1650 |
| KH2PO4 | 170 |
| FeSO4·7H2O | 27.8 |
| Na2-EDTA | 37.3 |
| MnSO4·4H2O | 22.3 |
| KI | 0.83 |
| CoCl2·6H2O | 0.025 |
| ZnSO4·7H2O | 8.6 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 |
| H3BO3 | 6.2 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| 肌醇 | 100 |
| 烟酸VB3 | 0.5 |
| 盐酸硫胺素VB1 | 0.1 |
| 盐酸吡哆醇VB6 | 0.5 |
| 甘氨酸 | 2 |
实施例1
1、以大花红景天幼嫩的茎作为外植体，自来水流水冲洗1h后，在超净工作台上先用70％的乙醇漂洗10s，再用0.5％的有效氯消毒液浸泡30min，中间更换一次消毒液，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下接种在不加生长调节剂的以下培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)。由于大花红景天叶片内生真菌的存在，需在培养基中添加1-1.5ml/L的PPM(plant preservative mixture，plant cell technology，Inc)；所述的培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；
2、将步骤1所培养得到的无菌的幼嫩叶片，接种到以下培养基进行不定芽的诱导培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+TDZ 0.5mg/L+NAA0.5mg/L；培养40d之后在以下培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L；此后每30d继代培养一次；
3、将步骤2所得到的不定芽长出的无菌叶片剪成0.5cm2方块，接种到以下愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养：1/2MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 2.0mg/L(该愈伤组织诱导培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；初代培养40d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4、上述步骤3中继代5-6次的松散的愈伤组织，接种在不加琼脂的以下液体培养基中振荡培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+TDZ 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L(该液体培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min。)；旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。初代培养15d，连续继代3次，继代周期10d，获得大量松散的悬浮细胞颗粒；培养10d后收集悬浮细胞颗粒；其中所述培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；吸干悬浮细胞颗粒水分，称取鲜重、干重；用高效液相色谱分别测定悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量，测定结果为：悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量分别为悬浮细胞干重的3wt％和0.7wt％。
实施例2
1、以大花红景天种子作为外植体，自来水流水冲洗浸泡1h后，在超净工作台上先用70％的乙醇漂洗30s，灭菌去离子水冲洗5次；1.5％NaClO灭菌7-10min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下接种在不加生长调节剂的培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(该培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；所述的培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；接种后胚开始萌发，一周后成完整小苗，30d后苗高可达3-4cm；
2、将步骤1得到的1个月龄的无菌幼苗，剪掉胚根、子叶，将幼茎剪成1cm左右带芽小段接种到以下培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L；接种后芽开始分化、顶芽、腋芽长出、叶片也逐渐增多，面积增加，60d的芽苗高可达3-4cm；
3、将步骤2所得到的茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到以下愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养：1/2MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+2，4-D 3.0mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；初代培养40d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4、上述步骤3中继代5-6次的松散的愈伤组织，接种在以下不加琼脂的液体培养基中振荡培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+TDZ 0.5mg/L+NAA0.5mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)，旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。初代培养15d，连续继代3次，继代周期10d，获得大量松散的悬浮细胞颗粒；培养10d后收集悬浮细胞颗粒；其中培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；吸干悬浮细胞水分称取鲜重、干重，用高效液相色谱分别测定悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量，测定结果为：红景天甙和酪醇的含量为悬浮细胞干重的2.8wt％和0.6wt％。
实施例3
1、以大花红景天种子作为外植体，自来水流水冲洗浸泡1h后，在超净工作台上先用70％的乙醇漂洗30s，灭菌去离子水冲洗5次；1.5％NaClO灭菌7-10min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下接种在以下培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；所述的培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；接种后胚开始萌发，一周后成完整小苗，30d后苗高可达3-4cm；
2、将步骤1得到的1个月龄的无菌幼苗，剪下嫩茎，接种到以下愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养：1/2MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+2，4-D 3.0mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；初代培养40d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
3、上述步骤3中继代5-6次的松散的愈伤组织，接种在以下不加琼脂的液体培养基中振荡培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+TDZ 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)，旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。初代培养15d，连续继代3次，继代周期10d，获得大量松散的悬浮细胞颗粒；培养10d后收集悬浮细胞颗粒；其中培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；吸干悬浮细胞水分称取鲜重、干重，用高效液相色谱分别测定悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量，测定结果为：红景天甙和酪醇的含量为悬浮细胞干重的2.8wt％和0.6wt％。
实施例4
1、以长鞭红景天幼嫩的茎段作为外植体，自来水流水冲洗1h后，在超净工作台上先用70％的乙醇漂洗10s，再用0.5％有效氯消毒液浸泡30min，中间更换一次消毒液，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下接种在不加调节剂的培养基上培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(该培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；
2、将步骤1培养得到的无菌的幼嫩叶片接种到以下培养基进行不定芽的诱导培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+3mg/L BA+0.1mg/LNAA；培养40d后在以下培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L；此后每30d继代培养一次；
3、将步骤2所得到的不定芽长出的无菌叶片剪成0.5cm2方块，接种到以下愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；初代培养40d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4、上述步骤3中继代5-6次的松散的愈伤组织，接种在以下不加琼脂的液体培养基中振荡培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min。)；旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。初代培养15d，连续继代3次，继代周期10d，获得大量松散的悬浮细胞颗粒；培养10d后收集悬浮细胞颗粒；其中培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；；吸干悬浮细胞颗粒水分称取鲜重、干重，用高效液相色谱分别测定悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量，测定结果分别为：悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量为悬浮细胞干重的1.04wt％和0.51wt％。
实施例5
1、以长鞭红景天种子作为外植体，自来水流水冲洗浸泡1h后，在超净工作台上先用70％的乙醇漂洗30s，灭菌去离子水冲洗5次；1.5％NaClO灭菌7-10min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下接种在不加调节剂的培养基上培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L MS基本培养基(该培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；所述的培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；接种后胚开始萌发，一周后成完整小苗，30d后苗高可达3-4cm；
2.将步骤1所培养得到的1个月龄的无菌幼苗，剪掉胚根、子叶，将幼茎剪成1cm左右带芽小段接种到以下培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L；接种后芽开始分化、顶芽、腋芽长出、叶片也逐渐增多，面积增加，60d的芽苗高可达3-4cm；
3.将步骤2所得到的茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到以下愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L；(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；初代培养40d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4.上述步骤3中继代5-6次的松散的愈伤组织，接种在以下不加琼脂的液体培养基中振荡培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min。)；旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。初代培养15d，连续继代3次，继代周期10d，获得大量松散的悬浮细胞颗粒；培养10d后收集悬浮细胞颗粒；其中培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；吸干悬浮细胞水分，称取鲜重、干重，分别用高效液相色谱测定悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量，测定结果为：悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量分别为悬浮细胞干重的1.15wt％和0.61wt％。
实施例6
1、以长鞭红景天幼嫩的茎段作为外植体，自来水流水冲洗1h后，在超净工作台上先用70％的乙醇漂洗10s，再用0.5％有效氯消毒液浸泡30min，中间更换一次消毒液，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下接种在不加调节剂的培养基上培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(该培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；
2、将步骤1培养得到的无菌的幼嫩叶片接种到以下培养基进行不定芽的诱导培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+3mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA；培养40d后再于以下培养基上进行培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，此后每30d继代培养一次；
3、将步骤2所得到的不定芽长出的无菌叶片剪成0.5cm2方块，接种到以下愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；培养条件为温度25℃，光强24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d；初代培养40d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4、上述步骤3中继代5-6次的松散的愈伤组织，接种在以下不加琼脂的液体培养基中振荡培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min。)；旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。初代培养15d，连续继代3次，继代周期10d，获得大量松散的悬浮细胞颗粒。
5、上述步骤4中得到的液体悬浮细胞颗粒，接种在以下不加琼脂的以下液体培养基中于7L气升式或14L气升搅拌式两种生物反应器中进行放大悬浮培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 3.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L(培养基pH值5.8-6.0，培养基在121℃下灭菌15min)；气升式生物反应器通气量1L/min；气升搅拌式生物反应器通气量0.7L/min，搅拌叶转速90转/min；接种量98g/L悬浮细胞颗粒鲜重，pH控制在5.9-6.0，温度25℃-26℃，溶氧量DO值80％，光周期16h/d，光照强度为24μmol m-2s-1。培养10d，取出悬浮细胞，吸干悬浮细胞颗粒水分，称取鲜重、干重；用高效液相色谱分别测定悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量，测定结果为：悬浮细胞颗粒鲜重220g/L，干重12g/L；悬浮细胞中红景天甙和酪醇的含量分别为悬浮细胞干重的3wt％和0.7wt％。
Claims (4)
1.一种红景天属(Rhodiola L.)植物大花红景天(Rhodiola crenulata)的悬浮细胞颗粒的培养方法，包括以下步骤：
(1)、建立红景天属植物大花红景天(Rhodiola crenulata)的无菌培养体系，培养得到具有茎和叶的无菌红景天属植物大花红景天植株；(2)、将无菌的茎或叶接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养和继代培养，得到红景天属植物大花红景天不同器官起源的愈伤组织；其中，对于大花红景天叶片起源的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 2.0mg/L；对于大花红景天茎起源的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+6-BA 0.1mg/L+2，4-D 3.0mg/L；(3)、将愈伤组织接种到液体培养基中振荡培养，得到红景天属植物大花红景天不同器官起源的细胞系悬浮颗粒。
2.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：还包括将所得到的细胞系悬浮颗粒接种到含有液体培养基的生物反应器中进行放大培养；其中，所述的液体培养基的组成为：MS基本培养基+蔗糖30g/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.5mg/L。
3.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述的无菌的具有茎和叶的红景天属植物大花红景天(Rhodiola crenulata)植株按照以下方法培养得到：
(1)、将红景天属植物大花红景天(Rhodiola crenulata)的外植体消毒后接种到以下培养基上培养得到无菌外植体：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L；
(2)、将无菌外植体切成小段或块接种在以下培养基上进行芽和叶片的诱导培养：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+TDZ0.5mg/L+NAA 0.5mg/L；
(3)、将步骤(2)所获得的芽或叶片转接到以下培养基中进行芽的增殖和叶片的生产获得无菌的红景天属植物大花红景天的芽苗或叶片：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L。
4.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：各步骤中所述的培养条件为：培养温度25℃，光照强度为24μmol m-2s-1，光照周期为16h/d。
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