CN101525369B - 用于生产肽的方法 - Google Patents
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本发明涉及用于形成二肽或寡肽的方法。具体地,所述方法涉及通过所谓的肽键将氨基酸连接在一起的可行的技术方案。本发明的方法遵循获得所述分子的常规方式,即保护-活化-连接。
Description
本发明涉及用于形成二肽或更大的寡肽的方法。具体地,所述方法涉及通过所谓的肽键将氨基酸或肽与预制的肽或氨基酸相连接的可行的技术方案。本发明的方法遵循获得所述分子的常规方式,即保护-活化-连接。
肽,尤其是二肽,是由至少两个氨基酸组成的化合物,所述氨基酸通过第一个氨基酸的末端羧基原子和下一个氨基酸的α-N-原子经酰胺键连接在一起。肽的形成是本领域熟知的(Bayer-Walter,Lehrbuch der or-ganischen Chemie,22.Auflage,S.Hirzel Verlag,Stuttgart,829ff.;TheChemical Synthesis of Peptides,J.Johnes,Oxford Science Publication,Clar-endron,1991)。它们是多能的化合物,可以用作用于手性合成的前体或者用于药物目的,因为它们能够呈现出生物活性的潜能。
尽管本领域熟知有多种可用于肽形成的方法(见上面的文献),但是大多数已知的方法在进行大规模应用时都会遇到使用高价的或昂贵的原材料以及复杂的技术条件的问题。
氨基酸由至少两个官能团组成:氨基和酸基。
为了氨基酸的定向偶联,必须保护第一个氨基酸的氨基并活化该氨基酸的酸基。在碱性条件下可以发生与第二个氨基酸或酯或酰胺的偶联。通过活化剩余酸基并与第三个氨基酸相偶联可以延长所形成的二肽。可以重复这一过程,直至获得所需的肽长度,用合适的试剂裂解保护基团。
用于氨基的保护基团对于本领域技术人员而言是已知的:
BOC(苄氧羰基)、Z(叔丁氧羟基)、Fmoc(芴甲氧羰基)、1,3-二羰基化合物如乙酰乙酸酯、均三甲基苯-2-磺酰基。
利用以下试剂可以实现酸基的活化:
二环己基羰二亚胺(Dicyclohexylcarbonyldiimid)、叠氮基、混合酸酐、N-羧酸酐等。(例如Advanced organic chemistry,March,Fourth Edition1992,Wiley-Interscience,p.392,420-422,980;Bayer-Walter,Lehrbuch derorganischen Chemie,22.Auflage,S.Hirzel Verlag,Stuttgart,829ff.;Organische Chemie,C.Vollhardt VCH,1990,pp.1261.;Houben-Weyl:Syntheses von Peptiden 1(15/1),1974)。
E.Dane已经开发了用1,3-二羰基化合物(如乙酰乙酸乙酯和乙酰丙酮)保护氨基酸的方法,在Angew.Chemie 1962,873以及Angew.Chemie1964,342.中描述了这种方法。此外,它描述了如何将所形成的盐在酸基活化之后与其他氨基酸和衍生物(如酯和酰胺)相连接。但是,所述的方法被证实在大规模生产肽的产率和纯度方面都是不可靠的。
因此,仍然对用于评价其他用于大规模生产肽的可行的和有利的方法存在需求。
因此,本发明的目的是提出另一种用于生产肽的方法,所述方法可以容易地适用于工业规模的生产并显示出以高度可靠的产率和纯度提供肽的优点。从经济学和/或生态学的角度看,本方法也优于现有技术。
这些目的可以通过应用本发明的方法实现。
在一项工艺中,通过实施用于生产肽的方法,其中所述方法包括:
a)在碱性条件下,使氨基酸或肽与1,3-二羰基化合物在有机溶剂中反应;
b)任选地分离并干燥产物;
c)通过与惰性溶剂中的酰基氯的反应而活化产物;
d)在适当的介质中,用氨基酸衍生物或肽接触活化的产物;
e)如果需要,任选地重复操作步骤b)-d);
f)将混合物的pH值调整为酸性pH值;
g)任选地加入水并分离所获得的水层;
h)从步骤g)的水层中分离出肽,以及任选地进一步纯化和任选地干燥所述肽,
本领域技术人员拥有了用于以非常有利的且出人意料有效的方式实现工业化规模的肽的生产的多能方法。所获得的产物常常是极纯的,可以进行进一步的加工处理,且无需进一步的昂贵的纯化过程。另外,通过本发明的方法生成肽的产率是如此之高,以至于从经济学的角度看,所述的方法是极为有利的。另一优点是起始化合物和活化化合物都是廉价的、商品化可获得的,并可重复利用。因此,本方法的方法相对于现有技术的总体优势是显而易见的。
待用作原材料的氨基酸或肽可以是本领域技术人员已知的任何氨基酸或肽(Organische Chemie,C.Vollhardt VCH,1990,pp.1261;Houben-Weyl:Syntheses von Peptiden 1(15/1),1974)。本领域技术人员可以选择步骤a)中的有机溶剂。优选地,所述有机溶剂选自醚、醇、酯、酮、芳香族溶剂、卤代烃溶剂(例如氯仿)。更优选地,使用溶剂例如醇、酯、酮、卤代烃溶剂。最优选地,将醇用作溶剂。可以在上述溶剂的混合物中实施步骤a)。
步骤a)中所必需的是碱性条件,通过添加碱性氢氧化物或碱土金属氢氧化物、碱性氧化物或碱土金属氧化物、碱性醇盐或碱土金属醇盐可以建立碱性条件。更优选地,加入碱性醇盐或碱土金属醇盐作为碱性化合物。最优选地,在方法中将NaOH或KOH用于建立碱性条件。
可以在步骤a)中使用的1,3-二羰基化合物可以是1,3-二酮(如苯甲酰丙酮和乙酰丙酮)或3-酮羧酸酯(如烷基乙酰乙酸酯)或烷基环戊酮-(3)-羧酸酯。最优选地使用乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸乙酯。
冷却反应混合物,所获得的产物常常结晶。可以采用本领域技术人员已知的手段完成结晶。要明确指出的是可以对反应混合物直接进行活化。但是,在多数情况中,分离出结晶产物是有好处的。优选通过仅过滤结晶产物完成所述分离。可以根据本领域中的方法干燥所得的产物。另一方面,所得的产物可以湿润形式进行活化反应。
根据本领域技术人员的知识可以实现步骤c)中的受保护的氨基酸盐或肽盐的活化。在一个优选的实施方式中,用如酰基氯和氯甲酸烷基酯(alkyl chloroformiates)的材料进行活化反应,所述酰基氯和氯甲酸烷基酯选自由新戊酰氯、乙酰氯、丙酰氯、苯甲酰氯和氯甲酸甲酯(methylchloroformiat)组成的组。最优选的是使用新戊酰氯。
可以在溶剂中正常地实施步骤c)的活化,所述溶剂一方面对于所涉及的反应条件是惰性的,另一方面能够溶解至少一部分所涉及的反应伴侣(reaction partners)。优选地,在步骤c)中,惰性溶剂选自极性有机溶剂如醚(例如二噁烷、THF、甲基叔丁基醚)、酯(例如乙酸乙酯)、酮(例如丙酮、甲基异丁基酮)和卤代烃溶剂(例如氯仿、二氯甲烷)。最优选的溶剂是可以溶于水的溶剂例如丙酮、二噁烷和THF。
在已经完成活化反应之后,可以在碱性条件下进行偶联。为此,在活化混合物中施用待与活化的氨基酸或肽相连接的氨基酸衍生物或肽。本领域技术人员依据其知识可以安排这些步骤。优选地,在步骤d)中先将氨基酸或肽溶解于合适的介质中,随后将其加入在步骤c)中制备的混合物中,或者反之亦然。这使得可以快速混合组分并因此具有短的反应时间。
可以连续地进行这些活化和连接步骤数次,以获得更大的肽。本领域技术人员可以完成这个过程。优选在进行新的偶联反应之前分离并纯化N末端仍受保护的肽。
在已经完成偶联反应之后,任选地加入水,并将反应混合物的pH值调整至酸性pH值以裂解保护基团。优选地,将该混合物的pH值调整至pH 0-6,最优选调整至pH 0-4。所释放的1,3-二羰基化合物与额外的有机溶剂和组分将形成有机层。可以从反应混合物中分离出有机层,并可以根据本领域技术人员的技能,通过常规的结晶、提取或层析(例如离子交换层析)加工处理水性产物层。
尽管可以按采用等量反应伴侣的方式进行本发明的反应,但优选使用非等量摩尔比。例如,可以根据所用的产物,在步骤a)中优选地使用摩尔比为约1.0∶1.0-2.0的氨基酸或肽与1,3二羰基化合物,更优选摩尔比为1.0∶1.0-1.5,最优选摩尔比为1.0∶1.0-1.2。这同样适用于活化或偶联反应。必须通过常规试验找到合适的比例。一般而言,这些比例应当在1.0∶1.0-1.5之间,优选在1.0∶1.0-1.2之间。
另外,可以根据所用的产物,在步骤a)中优选地使用摩尔比为约1.0∶1.0-2.0的氨基酸或肽与碱性物质,更优选摩尔比为1.0∶1.0-1.5,最优选摩尔比为1.0∶1.0-1.1。
对于偶联反应d)而言,必须通过常规试验找到合适的比例。一般而言,这些比例应当在1.0∶2.0-2.5之间,优选在1.0∶2.0-2.1之间。
本领域技术人员可以选择在反应步骤a)期间所采用的温度,这同样取决于所用的产物。本领域技术人员本身一方面要求短的反应时间,另一方面还要求生成更少的副产物。优选地,在-20℃-100℃温度进行这一步骤,更优选30℃-100℃,最优选40℃-100℃,其中上限温度取决于所用的溶剂。
这同样适用于反应步骤c),其中温度被调整至-80℃-40℃,优选-40℃-30℃,最优选在-30℃和30℃之间。这些普遍性的发现也适用于步骤d)。温度可以是在-40℃到80℃的范围内,优选从-40℃到40℃,最优选从-20℃到40℃。
方法描述
将氨基酸/肽溶解于醇例如甲醇、乙醇或异丙醇,并加入氢氧化物(1.0和1.1当量之间)。可以用母液代替醇。加入乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸乙酯(1.0和1.2当量之间),并加热反应混合物直至回流。在30分钟到5小时之间的反应时间之后,容许反应混合物冷却至30℃和0℃进行分离。可以通过真空结晶或直接冷却结晶实施所述冷却过程。为提高结晶尺寸和过滤性,可以接种(seed)反应溶液和/或可以再次将产物悬浮液加热至容许溶解小结晶并在再次冷却之前形成更大结晶的温度(温度处理)。产物可以被干燥或者作为湿润产物。
母液可以直接被再使用或者在再使用之前进行浓缩。此外,如果母液被浓缩,则可以分离出母液产物。将N末端受保护的氨基酸/肽盐溶解于冷却至20℃到-40℃之间的温度的极性、但疏质子的溶剂如二噁烷、THF和丙酮中。在该温度下加入新戊酰氯(摩尔比在1.0和1.2当量之间),并搅拌溶液30分钟到5小时之间。在一个分离的反应容器中,于20℃到-15℃之间的温度下,将氢氧化钾或碳酸钾或两者的混合物(相对于氨基酸的摩尔比介于2.0和2.5当量之间)和氨基酸溶解于水中。不论添加的次序,混合两种混合物。根据所涉及的产物,将混合时间调整至1秒到5小时之间。搅拌所获得的溶液一段时间(1分钟到12小时之间)。此后,加工处理所述溶液。为此,根据产物将溶液的pH值调整至0和4之间。根据产物可以变更以下步骤的次序。加工处理过程包括溶剂的蒸馏、相分离、pH调整的步骤。
附图说明
图1:N末端受保护的氨基酸/肽盐的制备:在碱性条件下将氨基酸溶解于极性溶剂中。加入1,3-二羰基化合物,并将反应混合物加热至回流。反应完成之后,将溶液冷却至室温并通过离心或过滤进行分离。产物可以作为湿润产物使用或者可以在干燥后使用。母液可以用于下一批次或者通过标准压或真空下(取决于溶剂)的蒸馏进行浓缩。通过液体的浓缩、结晶以及产物分离和干燥可以生成母液产物。
图2:肽的形成:将N末端受保护的氨基酸/肽盐溶解于溶剂中,并用酰基氯进行活化。平行地,在碱性条件下将氨基酸溶解于水中。混合两种混合物进行偶联。通过调整pH值、相分离和蒸馏加工处理该混合物,以获得水性的产物溶液。
实施例:
N末端受保护的氨基酸盐的制备物(EMOP-Ala-ONa=N-(3-乙氧基-1-甲基-
3-氧-丙烯基)-Ala-ONa)
在反应容器中混合2500ml甲醇、220g氢氧化钠、500ml乙酰乙酸乙酯和300g丙氨酸,并加热至回流。在回流温度下再搅拌溶液5小时。将溶液冷却至20℃。通过过滤分离出产物并干燥(产率为92%)。
在真空下将母液浓缩至50%,并再使用。
二肽的制备物(Ala-Val)
在反应容器中将1250ml丙酮冷却至-10℃。加入160ml新戊酰氯和280g EMOP-Ala-ONa。在第二个有1000ml水的容器中,将170g氢氧化钾冷却至-10℃。向该水溶液中加入230g缬氨酸。在搅拌该Dane盐溶液3小时之后,混合两个混合物并再搅拌2小时。将该溶液的pH值调整至4,在真空下蒸馏掉600ml溶剂。分层,并分离出水性产物层。
Claims (7)
1.用于生产肽的方法,其中
a)在碱性条件下,在40℃到100℃的温度下,使氨基酸或肽与1,3-二羰基化合物在有机溶剂中反应,其中所述1,3-二羰基化合物选自烷基乙酰乙酸酯,且所述氨基酸或肽与1,3-二羰基化合物的摩尔比为1.0:1.0-2.0,其中所述烷基乙酰乙酸酯为乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸乙酯;
b)任选地分离并干燥产物;
c)在-30℃到30℃的温度下,通过与惰性溶剂中的酰基氯反应而活化产物,其中所述酰基氯选自由新戊酰氯、乙酰氯和丙酰氯组成的组,所述氨基酸或肽与酰基氯的摩尔比为1.0:1.0-1.2;
d)在适当的介质中,在-20℃到40℃的温度下,用氨基酸衍生物或肽接触活化的产物,其中所述氨基酸衍生物或肽与所述活化的产物的摩尔比为1.0:2.0-2.1;
e)如果需要,任选地重复操作步骤b)-d);
f)将混合物的pH值调整为酸性pH值;
g)任选地加入水并分离所获得的水层;
h)从步骤g)的水层中分离出肽,以及任选地进一步纯化和任选地干燥所述肽。
2.权利要求1的方法,其中步骤a)中的溶剂选自醚、醇、酯、酮、芳香族溶剂和卤代烃溶剂。
3.权利要求1的方法,其中在步骤a)中,通过添加碱性氢氧化物或碱土金属氢氧化物、碱性氧化物或碱土金属氧化物、碱性醇盐或碱土金属醇盐建立碱性条件。
4.权利要求1的方法,其中在步骤b)中,通过过滤或离心进行分离。
5.权利要求1的方法,其中在步骤c)中,惰性溶剂选自由以下组成的组中的极性有机溶剂:二噁烷、THF、甲基叔丁基醚、丙酮、甲基异丁基酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。
6.权利要求1的方法,其中在步骤d)中先将氨基酸或肽溶解于合适的介质中,随后再将其加入在步骤c)中制备的混合物中,或者反之亦然。
7.权利要求1的方法,其中将所述混合物的pH值调整至pH0-4。
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RGD三肽液相合成的研究;张倩等;《四川大学学报(工程科学版)》;20011130;第33卷(第6期);78-81 * |
张倩等.RGD三肽液相合成的研究.《四川大学学报(工程科学版)》.2001,第33卷(第6期),78-81. |
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