CN101524361A - 腺苷类似物的制造及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及腺苷类似物的制造及使用方法，本发明描述了天麻属相关的化合物、萃取物及医药组合物，以及治疗具有代谢失调或例如亨丁顿舞蹈症、三核苷重复症或血糖浓度异常症的医疗疾病的方法。

Description

腺苷类似物的制造及使用方法

技术领域

本发明是关于天麻属(Gastrodia spp.)相关化合物、萃取物及医药组合物，以及用于治疗具有代谢失调或如亨丁顿舞蹈症(Huntington’s disease)的疾病的患者的方法。

背景技术

亨丁顿舞蹈症(Huntington’s disease，HD)为一种非性联显性神经退化疾病，其特征为舞蹈症、痴呆及精神症状。当疾病发作时，集中力与短期记忆力会降低，且头部、躯干及肢臂的不自主运动会增加；步行、言语及吞咽能力恶化；最终会死于窒息、感染或心脏衰竭导致的并发症。

病变的成因为位于亨丁顿(Huntingtin，Htt)基因(Huntington’s DiseaseCollaborative Research Group)的外显子上CAG三核苷的延伸。正常的染色体在其N端具有35次或较少次的CAG重复，而HD为36次或以上的重复。多余的CAG重复转译成Htt蛋白质的聚谷氨酰胺片段(polyQ)。当CAG重复超过36次时，几个大脑区域(特别是在纹状体(striatum))发生特殊的退化。周边组织(包含血液细胞)、肝脏及肾脏中Htt集合体(aggregate)的形成以及全体基因表现态样的改变也被报导(Borovecki，F.et al.(2005)；Panov，et al.(2005)：Ishiguro，et al.(2001))。由不同研究室的收集证据显示，突变的Htt会形成集合体并且造成畸变的蛋白-蛋白交互作用(Bate，G.(2003))。尽管一些具有普通效果的治疗剂已经被报导，在本领域中对于HD的有效治疗仍有持续需求。

发明内容

申请人发现某些天麻(Gastrodia elata)(一种传统中药)萃取物及相关化合物在治疗亨丁顿舞蹈症及血糖过高症上具有令人讶异的成效。例如，施用天麻萃取物会延迟亨丁顿舞蹈症基因转殖小鼠模型的运动表现的进一步恶化，并延长它们的生命期(实施例2)。同样地，以天麻萃取物处理可保护细胞免于因血清缺乏诱发的细胞凋亡(实施例1)。更进一步说，以天麻萃取物投与R6/2小鼠会降低已升高的血中葡萄糖浓度(实施例4)，并且会降低肝脏中突变的Htt集合体的形成(实施例5)。更进一步说，由这些由萃取物分离的化合物会减缓这些小鼠的亨丁顿舞蹈症的几个主要症状(包含运动退化、体重减轻及生命期缩短)(实施例6)及防止PC12细胞因血清缺乏而诱发细胞凋亡(实施例5)。

在各实施态样中，本发明提供一个以下列结构式所示的化合物：

及其医药可接受盐类及其溶剂化物(solvate)。

环A除R³外是选择性经取代；

B是一选择性经取代的芳香基或杂芳香基；

C是一键结或一选择性经取代的环脂肪基、杂环基、芳香基或杂芳香基；

R¹与R²分别为一键结或一选择性经取代的烯烃基(alkylene)，例如C1～C4烯烃基；

X为-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-SO₂-、-NR^a-、-C(O)NR^a-、-NR^aC(O)-、-NR^aSO₂-或-SO₂NR^a-；

R³及R⁴分别为-OH、卤素、-CN、-NO₂、-OR^a、-R^bOR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-SR^a、-R^bSR^a、-C(S)R^a、-OC(S)R^a、-C(S)OR^a、-C(O)SR^a、-C(S)SR^a、-B(OR^a)₂、-S(O)R^a-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a或-NR^cC(O)OR^a；及

R^a-R^d各自分别为-H或一选择性经取代的脂肪基、环脂肪基、杂环基、苯甲基、芳香基、杂芳香基；或与-N(R^aR^b)一同为一选择性经取代的杂环基。

在各实施态样中，R¹及R²至少一个可为一选择性经取代的烯烃基，例如C 1～C4烯烃基。在部分实施态样中，R¹及R²各自分别为C1～C4烯烃基。

在各实施态样中，X可为-NR^a-、-C(O)NR^a、-NR^aC(O)-、-NR^aSO₂-或-SO₂NR^a-，例如，-NH-。在部分实施态样中，X可为-O-或-C(O)-。在某些实施态样中，X可为-S-，-S(O)-或-SO₂-，例如，-S-。

在各实施态样中，R³及R⁴独立为卤素、-OH、C1-C4烷醇、-SH、C1-C4烷硫醇、-CO₂H、-NO₂、-B(OH)₂、-SO₃H、-OSO₃H、-PO₃H₂或-OPO₃H₂。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-OH或-SH。在部分实施态样中，R³及R⁴为相同官能基，例如-OH。

在各实施态样中，环B可为选择性经取代的苯基、联苯基(biphenyl)、萘基、芘基、蒽基、咪唑基、异咪唑基、噻吩基、呋喃基、茀基、吡啶基、嘧啶基(pyrimidyl)、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、异噻唑基、恶唑基(oxazolyl)、异恶唑基(isoxazolyl)、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、咪唑基、噻吩基、嘧啶基、喹唑啉基、吲哚基、四唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并恶唑基、苯并异恶唑基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、嘌呤基或异吲哚基。

在各实施态样中，环C为选择性经取代的：C3～C8环烷基、恶唑啉基、噻唑啉基(thiazolinyl)、恶唑烷基(oxazolidinyl)、噻唑烷基(thiazolidinyl)、四氢呋喃基、四氢硫苯基、吗啉基(morpholino)、硫吗啉基(thiomorpholino)、吡咯烷基(pyrrolidinyl)、哌嗪基、哌啶基、噻唑烷基，呋喃糖基形式的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、异葡萄糖(gulose)、艾杜糖或太洛糖；或吡喃糖基形式的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、异葡萄糖、艾杜糖或太洛糖。

在各实施态样中，该化合物由以下结构式表示：

其中环D选择性被取代或与另一环融合。在部分实施态样中，该化合物可表示为

在某些实施态样中，该化合物可表示为

在特别的实施态样中，该化合物可表示为

在部分实施态样中，该化合物为

在各实施态样中，该化合物可表示为以下结构式：

其中B’为一选择性经取代的杂芳香基，且C’为一选择性经取代的杂环基。

在各实施态样中，B’为一选择性经取代的嘧啶基或嘌呤基。

在各实施态样中，C’与R⁴一同可为一选择性经取代的呋喃糖或吡喃糖形式的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、异葡萄糖、艾杜糖或太洛糖。

在部分实施态样中，该化合物可由以下结构式所表示：

在部分实施态样中，-NH-B’-C’-R⁴可一同为一选择性经取代的核糖核苷或脱氧核糖核苷。

在部分实施态样中，该化合物为：

在部分实施态样中，R¹与R²皆为一选择性经取代的烯烃基，例如C1～C4烯烃基。

在部分实施态样中，X不为-O-。在部分实施态样中，X不为-S-。在部分实施态样中，X不为-S-S-。在部分实施态样中，X不为-S(O)-或-SO₂-。在部分实施态样中，X不为-NR^a-。在部分实施态样中，X不为-C(O)NR^a-或-NR^aC(O)-。在部分实施态样中，X不为-NR^aSO₂-或-SO₂NR^a-。

在部分实施态样中，X为-O-。在部分实施态样中，X为-S-。在部分实施态样中，X为-S-S-。在部分实施态样中，X为-S(O)-或-SO₂-。在部分实施态样中，X为-NR^a-。在部分实施态样中，X为-C(O)NR^a-或-NR^aC(O)-。在部分实施态样中，X为-NR^aSO₂-或-SO₂NR^a-。

在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-OH。

在部分实施态样中，R³及R⁴相同。

在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为卤素。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-OH。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-CN或-NO₂。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-OR^a、-R^bOR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a或-C(O)OR^a。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-SR^a、-R^bSR^a、-C(S)R^a、-OC(S)R^a、-C(S)OR^a、-C(O)SR^a或-C(S)SR^a。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-B(OR^a)₂。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a或-OSO₃R^a。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b或-OPO₃R^aR^b。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c或-C(O)NR^aCN。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-SO₂N(R^aR^b)或-SO₂N(R^aR^b)。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个不为-NR^cC(O)R^a或-NR^cC(O)OR^a。

在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为卤素。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-CN或-NO₂。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-OR^a、-R^bOR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a或-C(O)OR^a。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-SR^a、-R^bSR^a、-C(S)R^a、-OC(S)R^a、-C(S)OR^a、-C(O)SR^a或-C(S)SR^a。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-B(OR^a)₂。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a或-OSO₃R^a。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b或-OPO₃R^aR^b。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c或-C(O)NR^aCN。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-SO₂N(R^aR^b)或-SO₂N(R^aR^b)。在部分实施态样中，R³及R⁴至少一个为-NR^cC(O)R^a或-NR^cC(O)OR^a。

在部分实施态样中，该化合物为一分离的化合物，例如，该化合物为一纯化合物、一被包含于一医药组合物中的化合物、一被包含于一天麻属(Gastrodia spp.，例如天麻(Gastrodia elata))中的化合物等。

在部分实施态样中，当R¹与R²同为甲基，B为苯基、C为一键结，且R³与R⁴两者为位于R¹及R²对位的羟基时，X不为-O-，-S-、或-S(O)-。例如，在部分实施态样中，该化合物不为双(4-羟基苯甲基)醚、双(4-羟基苯甲基)硫化物或双(4-羟基苯甲基)亚砜。

在部分实施态样中，该化合物不为天麻素(gastrodin)、天麻醚苷(gastrodioside)或派立辛(parishin)。

本发明还提供一种医药可接受天麻属(Gastrodia spp.，例如天麻(Gastrodia elata))萃取物，该萃取物可以本技术领域已知的任何方法制备，例如以有机溶剂(例如：甲醇、乙醇、水/乙醇、水/甲醇、丙酮、甲基乙基酮、乙腈或其它类似溶剂)萃取。此外还提供这些萃取物的萃取分层。天麻属可为天麻属任何一物种，包含Gastrodia elata、Gastrodia cunninghamil、Gastrodia aff.sesamoides、Gastrodia sesamoides及其它，但不限于上述物种。

本发明提供一种医药组合物，该医药组合物包含一医药可接受载体或赋形剂。在部分实施态样中，该医药组合物包含该化合物。在部分实施态样中，该医药组合物包含医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))萃取物。

本发明提供一种治疗患有亨丁顿舞蹈症的患者的方法，在各实施态样中，其包含对该患者施以一有效剂量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))萃取物，或其医药组合物。

本发明提供一种治疗患有血糖浓度异常症的患者的方法，在各实施态样中，其包含对该患者施以一有效剂量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))萃取物，或其医药组合物。患者的血糖浓度异常程度会呈现出血糖过高症，且在各实施态样中，前述患者具有一种或多种疾病如亨丁顿舞蹈症、三核苷重复症(包含SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17、齿状红核苍白球肌萎缩症(dentatorubralpallidoluysian atrophy)及脊髓性肌肉萎缩症)、第一型糖尿病、第二型糖尿病、心血管疾病、X症候群、肥胖相关血糖过高症、食欲过盛相关血糖过高症或类固醇诱发的血糖过高症或其它。

本发明提供一种控制患者的A_2A受体活性的方法，在各实施态样中，其包含对该患者施以一有效剂量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))萃取物，或其医药组合物。在部分实施态样中，施用于患者的化合物、萃取物或医药组合物的剂量可有效地治疗由A_2A受体调控的疾病，其是藉由如提高A_2A受体的活性来达成。这些疾病包含例如慢性心脏衰竭、周边组织(包含肝脏、肾脏及心脏)缺血及败血症。

本发明提供一种控制患者体内环腺苷单磷酸(cyclic adenosinephosphate)浓度的方法，在各实施态样中，其包含对该患者施以一有效剂量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))萃取物，或其医药组合物。在部分实施态样中，施用于患者的化合物剂量可有效地增加患者体内(如广泛地或在局部的细胞或组织中)的环腺苷单磷酸浓度。在部分实施态样中，施用于患者的化合物、萃取物或医药组合物的剂量可有效地治疗患者的由环腺苷单磷酸调控的疾病，例如藉由增加患者体内环腺苷单磷酸的浓度来达成。此类疾病包含慢性心脏衰竭、周边组织(包含肝脏、肾脏及心脏)缺血及败血症。

在各实施态样中，该医药组合物包含一医药可接受载体与医药可接受的天麻的水/乙醇萃取物或化合物。

在包含治疗患者疾病的方法的各实施态样中，其包含对患者施用有效剂量的化合物、萃取物或医药组合物，例如治疗下列病症的医药组合物：亨丁顿舞蹈症、三核苷重复症或血中葡萄糖浓度异常、或可藉由控制患者体内A_2A受体活性或控制患者体内环腺苷单磷酸浓度来治疗的疾病。在部分实施态样中，该疾病为亨丁顿舞蹈症、三核苷重复症或血中葡萄糖浓度异常。在部分实施态样中，该疾病为亨丁顿舞蹈症。在部分实施态样中，该疾病为血糖过高症、第一型糖尿病、第二型糖尿病、心血管疾病、X症候群、肥胖相关血糖过高症、食欲过盛相关血糖过高症或类固醇诱发的血糖过高症。在部分实施态样中，该疾病为一选自包含SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17、齿状红核苍白球肌萎缩症及脊髓性肌肉萎缩症的群组中至少一种的三核苷重复症。在部分实施态样中，该疾病选自包含慢性心脏衰竭、周边组织缺血及败血症的群组中的至少一种，其中该化合物、萃取物或医药组合物会有效地增加患者A_2A受体活性或增加患者环腺苷单磷酸浓度。

本发明提供一种缓和或治疗神经退化疾病的方法，其是在有该项需求的哺乳类患者身上进行，且包含对前述患者投予一种包含一有效量的经单离或经合成的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷(T1-11)或其医药可接受盐或溶剂化物作为医药活性剂的医药组合物。本发明提供了经单离或经合成的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷(T1-11)或其医药可接受盐或溶剂化物在制备缓和或治疗神经退化疾病的医药组合物中的应用。

其中前述神经退化疾病为亨丁顿舞蹈症。

其中前述N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷为合成的化合物。

本发明提供一种调节发炎的方法，其是在有该项需求的哺乳类患者身上进行，且包含对前述患者投予一种包含一有效量的经分离(单离)或经合成的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷(T1-11)或其医药可接受盐或溶剂化物作为医药活性剂的医药组合物。本发明提供了经单离或经合成的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷(T1-11)或其医药可接受盐或溶剂化物在制备调节发炎的医药组合物中的应用。

其中前述发炎是发生在中枢神经系统(CNS)中。

其中前述发炎是发生在脑中。

其中前述发炎是与星状细胞募集及/或微胶细胞活化有关。

其中前述发炎是与神经障碍(neurological disorder)有关。

其中前述调节是指降低或抑制。

本发明提供了一种制造如下式的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷的方法，

其包含下列步骤：

d)将式I化合物

与式II所示的4-甲氧基苯甲酰基化合物

予以缩合，其中R₁表示一离去基，以制备式III化合物

e)将式III化合物还原，得式IV化合物

以及

f)将式IV化合物去保护，以制备N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷。

其中前述离去基为卤基。

其中前述离去基为氯基。

其中前述缩合步骤是在氯化溶剂(chlorinated solvent)存在的情况下进行。

其中前述氯化溶剂为亚甲基氯。

其中前述还原步骤是在氢化铝锂及C1～C4低级醇溶剂存在的情况下进行。

其中前述去保护步骤是在氢溴化物及乙腈存在的情况下进行。

本发明提供了一种制造如下式的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷的方法

其包含将式7化合物

与式6化合物

予以缩合的步骤。

其中前述式6化合物是藉由下列步骤来制备：

c)将式4化合物

转化为式5化合物

d)将式5化合物氢化，得式6化合物。

其中前述缩合步骤是在一C1～C4低级醇及一碱存在的情况下进行。

其中前述碱为二异丙基乙基胺(DIEA)。

本发明的一个或多个实施态样的细节于以下附图及具体实施方式中共同提出。本发明的其它特征、目的及优点可由实施方式、附图或请求保护范围中清楚理解。

附图说明

图1为长条图，呈现PC12细胞生存能力，其是以含血清对照组(Con)的MTT代谢量测值(最左边长条)为百分之百而以百分比来表示。缺乏血清的群组是由左算起第二个长条。缺乏血清的PC12细胞是施以甲醇萃取物(T1-1、T1-2及T1-3)24小时，其中前述甲醇萃取物含有不同剂量的天麻萃取物。^#与含血清对照组比对时，p＜0.05。

图2A为滚轮测试结果，是秒数对小鼠年龄的图表，其中R6/2小鼠从四周大起给予含有对照饮用水(CON，n＝11)或含有天麻萃取物(GE，5mg/mL，n＝12)的饮用水。

图2B为存活百分比对小鼠年龄的图表，其中R6/2小鼠从四周大起给予对照饮用水(CON，n＝11)或含有天麻萃取物(GE，5mg/mL，n＝12)的饮用水。

图3A为从四周大起给予对照饮用水的12周大R6/2小鼠身上以泛素标示的纹状体的代表图。比例尺：25μm。

图3B为四周大起给予含天麻萃取物(5mg/mL)饮用水的12周大R6/2小鼠身上以泛素标示的纹状体的代表图。比例尺：25μm。

图3C为从四周大起给予对照饮用水或含有天麻萃取物(5mg/mL)的饮用水的12周大R6/2小鼠身上有表现神经元细胞核内聚集的纹状体细胞的百分比长条图，定量方法描述于“材料与方法”中。比例尺：25μm。^**使用学生t检定，与在指示年龄施以媒剂的R6/2小鼠比较时，p＜0.01。

图4为野生小鼠对照组(WT，CON)、R6/2小鼠对照组(R6/2，CON)、以及从四周大起施以含天麻萃取物(5mg/mL)饮用水的R6/2小鼠(R6/2，GE)的血中葡萄糖浓度(mg/dL)对年龄的图表。于指示时期收集血液样品并测定血糖，其方法如“方法”所述。

图5A为从四周大起给予对照饮用水的12周大R6/2小鼠身上以泛素标示的肝脏的代表图。比例尺：25μm。

图5B为从四周大起给予含有天麻萃取物(5mg/mL)饮用水的12周大R6/2小鼠身上以泛素标示的肝脏的代表图。比例尺：25μm。

图5C为呈现从四周大起给予对照饮用水或含有天麻萃取物(5mg/mL)饮用水的12周大的R6/2小鼠身上肝脏细胞表现Htt集合体的百分比长条图，其定量方法描述于“材料与方法”中。^**使用学生t检定，与在指示年龄施以媒剂的R6/2小鼠比较时，p＜0.01。

图6为天麻萃取物的活性流析物的层析图(HPLC profile of partialpurified GE)。HPLC条件包含Merck RP-18e(250x4.6mm)管柱，动相梯度由70％至40％的水/甲醇40分钟，再由40％至20％水/甲醇5分钟，流速0.5mL/min，侦测波长270nm。两活性组成(T1-C与T1-11)的位置标示如箭头处。

图7A为对血清抽离后的PC12细胞施以T1-C或T1-11后的细胞存活率，其是以PC12细胞对照组的MTT代谢作为百分之百而以百分比来表示。血清抽离后的PC12细胞是以目标剂量的指定药物或不以指定药物处理24小时。细胞存活率是以MTT测定法来测量，且以含血清组所测得的MTT活性作为百分之百而以百分比来表示。数据点代表至少三个独立实验的平均值±SEM(n＝3～6)。

图7B为ST14A细胞对照组、以及在室温下分别施以CGS21680(CGS，10μM)、T1-C(10μM)或T1-11(26.8μM)20分钟后的ST14A细胞的细胞cAMP含量长条图。细胞cAMP含量的测量如说明书所述。

图8A是呈现从四周大起给予对照饮用水(CON，1％DMSO，n＝8)、含有T1-C(0.5mg/mL，溶于1％DMSO，n＝7)的饮用水、或含有T1-11(0.05mg/mL，溶于1％DMSO，n＝8)的饮用水的R6/2小鼠滚轮测试结果图表。

图8B是呈现从四周大起给予对照饮用水(CON，1％DMSO，n＝8)、含有T1-C(0.5mg/mL，溶于1％DMSO，n＝7)的饮用水、或含有T1-11(0.05mg/mL，溶于1％DMSO，n＝8)的饮用水的R6/2小鼠体重图表。

图8C是呈现从四周大起给予对照饮用水(CON，1％DMSO，n＝8)、含有T1-C(0.5mg/mL，溶于1％DMSO，n＝7)的饮用水、或含有T1-11(0.05mg/mL，溶于1％DMSO，n＝8)的饮用水的R6/2小鼠存活百分比图表。

图9是呈现T1-11会有效地抑制LPS所诱发的发炎。从野生型(WT，A)或R6/2小鼠(B)收下来的初代星状细胞(30DIV)是在指定浓度的T1-11存在的情况下以LPS(0.5μg/mL)处理48小时(A，B)或72小时(C)。利用蛋白质印迹(西方墨点)分析来测量全细胞溶胞产物(一行为20μg)中的iNOS蛋白量(A，B)。使用Griess法测量在对应条件下的NO产量，其是以在对照条件(未处理)下的野生型星状细胞所得的信号为百分之百的百分比来表示。^*先后使用t检定及Mann-Whitney排序和检定(Mann-Whitneyrank sum test)，与野生型溶胞产物比较时，p＜0.01。

图10是呈现T1-11会减少BV2细胞中由LPS所引起的iNOS诱导及NO的产生。BV2细胞是在指定浓度的T1-11存在的情况下以LPS(0.5μg/mL)处理72小时(C)。利用蛋白质印迹分析来测量全细胞溶胞产物(20μg/行)中的iNOS蛋白量(A，B)。使用Griess法测量在对应条件下的NO产量，其是以在对照细胞(未处理)所得的信号为百分之百的百分比来表示。

图11为化合物1的¹H NMR图谱(CD₃OD，400MHz)。

图12为化合物1的¹³C NMR图谱(CD₃OD，400MHz)。

图13为化合物2的¹H NMR图谱(DMSO-d₆，400MHz)。

图14为化合物2的¹³C NMR图谱(DMSO-d₆，400MHz)。

图15为化合物5的¹H NMR图谱(DMSO-d₆，400MHz)。

图16为化合物5的¹³C NMR图谱(DMSO-d₆，400MHz)。

具体实施方式

本发明的新颖性的各个特征已指明，特别是在为本发明揭露内容一部分的请求保护范围中指明。为了更加理解本发明及其在操作上的优点、以及本发明要施用的特定对象，应参考描绘及描述了本发明的具体实施例的附图及发明说明。

天麻(Gastrodia elata)在亚洲为一被广泛使用至少1500年的中药，传统是用来治疗头痛、头晕、肢体麻木及痉挛，尤其是抽筋疾病，例如癫痫及破伤风。基于其使用来治疗癫痫疾病的有效医疗用途，许多的研究是被执行来探讨其在预防神经伤害的角色。例如，已发现天麻素(一种天麻(Gastrodiaelata)中的组成分)会改变沙鼠海马区(gerbil hippocampus)中的GABA代谢(An，et al.(2003))。更进一步说，在沙鼠局部缺血模型及施以藻氨酸(kainic-acid)处理的小鼠模型中，天麻的甲醇萃取物的醚流析物(etherfraction)对海马区神经元伤害具有保护效果(Kim，et al.(2001)；Kim，etal.(2003))。而天麻的乙醚流析物能显著地降低β-淀粉样蛋白(β-amyloid)诱发的神经元细胞死亡(Kim，et al.(2003))。同样地，藉由利用一施以藻氨酸处理的小鼠模型，Hsieh与其同僚证明投与天麻萃取物不仅可显著地降低了抽筋的次数，并且也延迟了开始的时间(Hsieh，et al(2001))。天麻出现这种抗抽筋的效果，是藉由调节其自由基清除活性来达成(Hsieh，et al.(2000))。此外，一种天麻的甲醇萃取物会藉由抑制JNK活性来防止PC12细胞发生血清抽离的细胞凋亡(serum-deprived apoptosis)(Huang，et al.(2004))。在本研究中，证明于小鼠的饮用水添加部分纯化的天麻萃取物或两种由天麻纯化出来的新颖化合物可以在R6/2基因转殖HD小鼠模型身上显著地改善有HD的主要症状(Mangiarini，et.Al.(1996))。

申请人也发现，某些天麻(一种传统中药)萃取物及其相关化合物在治疗如亨丁顿舞蹈症及血糖过高症具有令人讶异的成效。举例来说，施用天麻萃取物会延迟亨丁顿舞蹈症基因转殖小鼠的运动表现的进一步恶化，并改善它们的生命期(实施例2)。同样地，以天麻萃取物治疗可保护细胞免于因血清缺乏所诱发的细胞凋亡(实施例1)。更进一步说，以天麻萃取物治疗R6/2小鼠会降低已升高的血中葡萄糖浓度(实施例4)，并减少其肝脏中突变Htt集合体的形成(实施例5)。更进一步说，由这些萃取物分离的化合物会延迟这些小鼠身上亨丁顿舞蹈症的几个主要症状(包含运动退化、体重消瘦及缩短生命)(实施例6)、并预防PC12细胞因血清抽离所导致的细胞凋亡(实施例5)。

本发明所使用的合适的保护基是提供在合成及反应条件中用来保护与去保护(如在化成物合成时用于保护R³及R⁴基)，其是为本技术领域所知悉的，例如，在Greene及Wuts(1991)。举例来说，合适的羟基保护基的特殊实施例包含烷基醚类(例如：甲基、乙基)，烷氧基烷基醚类(例如：甲氧基甲基)，硅烷醚类(例如：三甲基硅烷基)及其它类似保护基，但不限于此。

本发明所使用的“单离(isolated)”一词是指一化合物是由一反应混合物或生物资源(例如天麻)至少经部分纯化。举例来说，一部分纯化或单离的化合物是由一反应混合物或由天麻中藉由一个或多个步骤的萃取、层析分离、再结晶、亲和纯化或其它本技术领域知悉的手段所纯化。例如在特别的实施态样中，其揭露的化合物是利用高压液相层析仪纯化。

本发明所使用的脂肪基为一直链状、分支(支链)状或环状非芳香族碳氢化合物，其为完全饱和或者包含一个或多个不饱和单元。一烷基为一饱和脂肪基。一般来说，直链或分支脂肪基具有1至10个碳原子，较佳具有1至约4个碳原子，而一环状脂肪基(例如以B或C表示的环脂肪基)具有3至约10个碳原子，较佳具有3至约8个碳原子。一脂肪基较佳为一直链或分支烷基，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、己基、庚基或辛基，或一具有3至约8个碳原子的环烷基。C1～C4直链或分支烷基或烷氧基或一C3～C8环烷基或环烷氧基也被记为“低级烷基”或“低级烷氧基”。此类官能基经-F、-Cl、-Br或-I取代者为“低级卤烷基”或“低级卤烷氧基”；“低级羟基烷基”为低级烷基经-OH取代；或其它类似者。

本发明所使用的确“烯烃基(alkylene)”(例如，以R¹及R²表示的烯烃基)为一以-(CH₂)_n-表示的连结烷基链，其中n为1至10的整数，较佳为1至4。

本发明所使用术语“芳香基”(例如以B或C表示的芳香基)表示C6～C14碳环芳香基，例如苯基、联苯基及其它类似者。芳香基也包含融合的多环芳香环系统，其中一碳环芳香环会与其它芳香基、环烷基或环脂肪环融合，例如萘基、芘基、蒽基及其它类似者。

本发明所使用的术语“杂芳香基”(例如以B或C表示的杂芳香基)是指5～14元的杂芳香环，其具有一个或多个O、S或N杂原子。杂芳香基的实例包含咪唑基、异咪唑基、噻吩基、呋喃基、茀基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、异噻唑基、恶唑基、异恶唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、咪唑基、噻吩基、嘧啶基、喹唑啉基、吲哚基、四唑基或其它类似物。杂芳香基也包含融合的多环芳香环系统，其中一碳环芳香环或杂芳香环会与一个或多个其它芳香环融合。实例包含苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并恶唑基、苯并异恶唑基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、嘌呤基及异吲哚基。杂环基的特别实例包含杂芳香基核碱基(nucleobase)，例如嘌呤基衍生物(例如：2-胺基-1H-嘌呤-6(9H)-酮、6-胺基-(9H)-嘌呤，或其它类似物)及嘧啶基衍生物(例如4-胺基嘧啶-2(1H)-酮、5-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮、嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮，或其它类似物)。

本发明所使用的非芳香杂环基(例如：以B或C表示的杂环基)为非芳香碳环，其包含一个或多个例如N、O或S杂原子在环中。这些环可以是五元、六元、七元或八元环，实例包含：恶唑啉基、噻唑啉基、恶唑烷基、噻唑烷基、四氢呋喃基、四氢硫苯基、吗啉基、硫吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、噻唑烷基，环糖类(例如：吡喃糖或呋喃糖形式的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、异葡萄糖、艾杜糖或太洛糖或其它类似者)及其它类似者。

对烷基、环烷基、脂肪基、环脂肪基、杂环基、苯甲基、芳香基或杂芳香基中的可取代原子来说，合适的选择性取代基是指不会实质上影响被揭露化合物的医药活性的取代基。“可取代原子”是指一原子具有一价或多价或电荷可与一取代基形成一个或多个对应共价键或离子键。例如，具有一价的碳原子(例如-C(-H)＝)可与一烷基形成一单键(例如-C(-烷基)＝)，具有二价的碳原子(例如：-C(H₂))可形成一或二个单键而连接至一或二个取代基上(例如：-C(烷基)(H)-，-C(烷基)(Br)-)、或形成一双键而连接到一取代基上(例如-C(＝O)-)，及其类似物。本发明考虑的取代基只包含那些可形成稳定化合物的取代基。

例如，具有可取代碳原子的合适的选择性取代基(例如以R¹、R²、B的选择性取代基来表示的取代基)包含-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-SR^a、-C(S)R^a、-OC(S)R^a、-C(S)OR^a、-C(O)SR^a、-C(S)SR^a、-B(OR^a)₂、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a、-NR^cC(O)N(R^aR^b)、-C(NR^c)-N(R^aR^b)、-NR^d-C(NR^c)-N(R^aR^b)、-NR^aN(R^aR^b)、-CR^c＝CR^aR^b、-C≡CR^a、＝O、＝S、＝CR^aR^b、＝NR^a、＝NOR^a、＝NNR^a、选择性经取代的烷基、选择性经取代的环烷基、选择性经取代的脂肪基、选择性经取代的环脂肪基、选择性经取代的杂环基、选择性经取代的苯甲基、选择性经取代的芳香基，及选择性经取代的杂芳香基，其中R^a-R^d各自独立为-H或一选择性经取代的脂肪基、选择性经取代的环脂肪基、选择性经取代的杂环基、选择性经取代的苯甲基、选择性经取代的芳香基或选择性经取代的杂芳香基，或与-N(R^aR^b)一同为一选择性经取代的杂环基。

与其它原子具有两个共价键的氮原子(例如以R³、R⁴及X表示的官能基中的氮原子，或以B及C表示的杂芳香基或杂环基中的环氮原子)的合适取代基包含；如选择性经取代的烷基、选择性经取代的环烷基、选择性经取代的脂肪基、选择性取代的环脂肪基、选择性经取代的杂环基、选择性经取代的苯甲基、选择性经取代的芳香基、选择性经取代的杂芳香基、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-SR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a、-NR^cC(O)N(R^aR^b)，及其它类似者。

一含氮杂芳香基或一非芳香杂环可以氧取代而形成一N-氧化物(N-oxide)。例如：吡啶基N-氧化物、哌啶基N-氧化物，或其它类似物。举例来说：在各实施态样中，在一含氮杂环基或杂芳香基中的环氮原子可被取代以形成N-氧化物。

本发明也包含该揭露化合物的医药可接受盐类。这些化合物可具有一个或多个足够酸性的质子，使其可与一合适的有机或无机碱反应形成一碱加成盐类。举例来说，当一化合物具有一氢原子键结至一氧原子、氮原子或硫原子时，即可预期该化合物也包含其盐类，因为当该氢原子会与一合适的有机或无机碱反应形成一碱加成盐。碱加成盐类包含那些衍生自无机碱及有机碱者，其中无机碱例如铵或碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐(bicarbonate)，及其它类似物，而有机碱例如烷氧化物、烷酰胺、烷基与芳香基胺，及其它类似物。这类用于制备本发明的盐类的碱包含氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾，及其它类似物。

举例来说，医药可接受盐类包含那些本发明揭露的化合物与一当量合适碱产生反应所形成的单价盐(即化合物具有单一负电荷，可被一医药可接受的相对阳离子(例如单价阳离子)平衡掉)、或其与二当量合适碱产生反应所形成的二价盐(意即化合物具有二个负电荷可被两个医药可接受相对阳离子(例如两个医药可接受单价阳离子或单个医药可接受二价阳离子)平衡掉)。实例包含Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺及NR₄ ⁺，其中每个R是个别地为氢、一选择性经取代的脂肪基(例如：一羟基烷基、胺基烷基或铵烷基)或选择性经取代的芳香基；或者，二个R基一同形成一选择性经取代的非芳香杂环，其是选择性与一芳香环融合。一般来说，医药可接受阳离子为Li⁺、Na⁺、K⁺、NH₃(C₂H₅OH)⁺或N(CH₃)₃(C₂H₅OH)⁺。

本文所揭示的化合物具有一足够碱性的官能基，例如胺基，其形成是藉由揭示化合物与一有机酸或无机酸反应形成酸加成盐类。一般用来由具有碱基的化合物形成酸加成盐类的酸包含无机酸以及有机酸，其中无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸，或其它类似物；而有机酸例如对甲苯磺酸、甲烷磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、醋酸，或其它类似物。此类盐类的实施例包含硫酸盐类、焦硫酸盐类、硫酸氢盐类(bisulfate)、亚硫酸盐类、亚硫酸氢盐类(bisulfite)、磷酸盐类、单氢磷酸盐类、双氢磷酸盐类、偏磷酸盐类、焦磷酸盐类(pyrophosphate)、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐类、丙酸盐类、癸酸盐类、辛酸盐类、丙烯酸盐类、甲酸盐类、异丁酸盐类、己酸盐类、庚酸盐类、丙炔酸盐类、草酸盐类、丙二酸盐类、琥珀酸盐类、辛二酸盐类、泌脂酸盐类、反丁烯二酸盐类、顺丁烯二酸盐类、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基醋酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐，或其它类似物。

本发明也包含医药可接受溶剂化物(solvates)。本发明所使用术语“溶剂化物”是指本发明的一化合物或其一盐类可进一步包含一化学计量或非化学计量的溶剂(例水或有机溶剂)，其是藉由非共价分子间力来结合。

本发明也包括一包含所揭示的化合物的医药组合物。一“医药组合物”包含一揭示的化合物与一作为医药组合物的一部分的可接受医药载体结合，而施用于患者。被施用的化合物的配方会根据施用途径的选择而改变(例如：口服(例如锭剂、胶囊、药片、溶液或其它类似物)、血管内、腹腔内、肌肉内、皮下、非经口、口颊、头盖骨内或脑脊髓、眼球(例如溶液、软膏、或包含在植入物或隐形镜片中者)、鼻(例如溶液、喷雾、气溶胶或其它类似物)、咽喉、肺(例如气溶胶)、阴道内、肛门、作为植入物或贮积剂(depot)的制剂、作为一植入医药装置的表面披覆层、作为一局部施用的溶液、乳胶、胶囊、乳膏、软膏或其它类似物)。合适的医药载体可包含不会与该化合物反应的惰性成分。可使用例如描述于Remington’s Pharmaceutical Science(2005)的标准医药配方技术。作为非经口施用的合适医药载体包含，例如：无菌水、生理实验水、抗菌食盐水(食盐水中含有大约0.9％mg/mL苯甲醇)、磷酸缓冲食盐水、Hank氏溶液、乳酸林格氏液(Ringers-lactate)及其它类似物。将组合物装入胶囊的方法(例如包在一硬明胶或环葡萄聚糖的包衣内)为本技术领域所知悉(Baker，et al.(1986))。

当可轻易理解的是，某些本发明揭露的化合物可以不同的立体异构物(例如：非掌性异构物(diastereomer)及对掌异构物(enantiomer))形式获得，而本发明包含所有被揭示化合物的异构物形式以及变旋混合物(racemicmixture)，以及施以纯异构物及其混合物(包含变旋混合物)两者来治疗患者的方法。立体异构物可利用任何合适的方法来分离与单离，例如层析法。

在各实施态样中，治疗患有亨丁顿舞蹈症患者的方法包含对该患者施用一有效量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))萃取物，或其医药可接受组合物。

在各实施态样中，治疗患有血中葡萄糖浓度异常患者的方法，包含对该患者施用一有效量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodiaelata))的萃取物，或其医药可接受组合物。患有血中葡萄糖糖浓度异常的患者可表现出血糖过高症，以及在各实施态样中可具有一种或多种疾病，例如亨丁顿舞蹈症、第一型糖尿病、第二型糖尿病、心血管疾病、X症候群、肥胖相关血糖过高症、食欲过盛相关血糖过高症或类固醇诱发的血糖过高症或其它类似病症。

在各实施态样中，控制患者A_2A受体活性的方法，包含对该患者施用一有效量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))的萃取物，或其医药可接受组合物。在部分实施态样中，对患者施用的化合物、萃取物或医药组合物的剂量是可有效地治疗患者身上由A_2A受体调控的疾病，例如，藉由增加A_2A受体的活性来达成。

在各实施态样中，调控患者环单磷酸腺苷浓度的方法，包含对该患者施用一有效量的化合物及/或医药可接受天麻属(例如天麻(Gastrodia elata))的萃取物，或其医药可接受组合物。在部分实施态样中，对患者施用的化合物剂量是广泛地或局部地在特殊细胞或组织中有效地增加患者环单磷酸腺苷的浓度。在部分实施态样中，施用于患者的化合物、萃取物或医药组合物的剂量能有效地治疗患者身上因环单磷酸腺苷所致的疾病，例如，藉由增加患者环单磷酸腺苷的浓度来达成。

实施例

材料与方法

制备天麻萃取物

天麻(Gastrodia elata B 1.)的地下茎是向中国台北当地的中药店购买。将天麻薄片以乙醇水溶液萃取隔夜(60℃)。粗萃取物以一真空回旋浓缩机减压浓缩。干燥的样品导入离子管柱层析仪(

HP20，HP21、Mitsubishi Chemical，Tokyo，Japan)并以水转换至甲醇的梯度冲提。各流析物(fractions)的筛选是以其保护PC12细胞免于因缺乏血清而诱发的程序性死亡中的活性来进行。具有此活性的流析物被结合后以

LH-20管柱(Pharmacia LKB，Biotechnology AB，Uppsala Sweden)纯化。以甲醇重复冲提获得二个记为T1-C及T1-11活性成分。高压液相层析是使用：Merck

RP-18e(Merck KGaA Life Science&Analytics，Darmstadt，Germany)，(250x4.6mm)管柱，UV 270-nm侦测器，以流速0.5mL/min，70％至40％水/甲醇的动相梯度冲提40分钟，再以40％至20％水/甲醇冲提5分钟，观察不同批次的化学剖面。

细胞培养

PC 12细胞是向American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA，USA)订购，并存活于补充10％马血清及5％胎牛血清的Dulbecco’sModified Eagle Medium(DMEM)中，并且在37℃的二氧化碳(5％)培养箱中培养。Striatal Progenitor细胞株(ST14A)是向Dr.E.Cattaneo(UniversityofMilano，Italy)取得，并于33℃，10％二氧化碳-90％空气的培养槽中培养，如先前文献所述(Ehrlich，et al.(2001))。

MTT分析

PC12细胞以磷酸缓冲食盐水(PBS)清洗三次抽离血清后，重新悬浮于DMEM中，悬浮的细胞置入96-多孔板(每孔1×10⁴个细胞)，而后施以指定药剂。在施以21小时后，取溴化3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓盐(MTT)加入培养基(0.5mg/mL)中，再于37℃培养3小时。将培养基移除后，在每个孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)来溶解甲臜(formazan)结晶，之后以微型酶标记免疫吸附测定(micro-enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)读取仪量测每个孔在570nm及630nm的吸收值。

动物与药物施用

雄性R6/2小鼠及同窝出生的对照组与雌性对照鼠(B6CBAF1/J)交配。实验鼠是由Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA购入。其后代是通过由尾部组织取得的基因体DNA进行PCR基因型鉴定技术来鉴定，其是利用位于转殖基因的引物(5’-CCGCTCAGGTTCTG CTTTTA-3’及5’-GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’)来确认CAG重复的次数保持在约150。全部共有67只R6/2基因转殖小鼠被使用于本研究。这些动物以12小时日照/黑暗的周期储养于Institute of Biomedical Science Animal Care Facility中。指定药剂的每日注射是在13:00至18:00间进行，小鼠体重的量测是于每天喂食前记录一次，动物实验的操作是依照Academia Sinica Institutional Animal Care andUtilization Committee，Taiwan。

滚轮测试(roadrod performance)

运动协调是利用滚轮装置(UGO BASILE，Comerio，Italy)在一恒定速度(12rpm)下进行超过2分钟(Carter，et al.(1999))来评估。所有的小鼠在六周大的时候训练两天，使它们知悉该滚轮装置。这些动物在7～12周大时每周测试三次。每次测试中，在启动转动前将动物置于装置中。因延迟而落下会被自动地记录。每只小鼠会进行三次测试，每次测试最长为两分钟。

免疫化学计量及定量

含有纹状体的大脑(双耳(interaural)5.34mm/前囱(bregma)1.54mm至双耳3.7mm/前囱-0.1mm)切片(30μm)与肝切片(20μm)是用来进行化学计量分析。使用现有技术(Wu，et al.(1998))中所描述的卵白素-生物素-过氧化酶错合物法(ABC法)来操作单一抗原免疫染色。一般来说，稀释1∶2000时可用于多株抗体的抗泛素抗血清(polyclonal anti-ubiquitin antiserum)(DakoCytomation Denmark A/S，Glostrup，Denmark)。同一大脑的三种不同的切片以抗泛素抗血清加以标示，并以甲基绿复染，定量。总计每个测试里有六只小鼠在12周大时进行分析，每只小鼠至少计数1200及300个细胞，以确定纹状体细胞及肝细胞分别有表现泛素化Htt集合体。图3A是从四周大起给予对照饮用水的12周大R6/2小鼠身上以泛素标示的纹状体的代表图。比例尺：25μm。图3B是四周大起给予含天麻萃取物(5mg/mL)饮用水的12周大R6/2小鼠身上以泛素标示的纹状体的代表图。比例尺：25μm。图3C是从四周大起给予对照饮用水或含有天麻萃取物(5mg/mL)的饮用水的12周大R6/2小鼠身上有表现神经元细胞核内聚集(neuronal intranuclearinclusions，NIIs)的纹状体细胞的百分比长条图，定量方法是描述于“材料与方法”中。比例尺：25μm。^**使用学生t检定，与在指示年龄施以媒剂(vehicle)的R6/2小鼠比较时，p＜0.01。

血中葡萄糖浓度量测

小鼠断颈方式牺牲，以EDTA血液试管收集每只小鼠的血液样品(1～1.5mL)，血糖浓度即利用ABBOTT Alcyon 300i分析仪(ABBOTT Labs，Abbott Park，IL，USA)量测。

串接质谱仪筛选血液中氨基酸

样品的搜集是藉由使10.5周大的R6/2小鼠的尾巴静脉的血液(25μl)渗入滤纸中(S&S 903；Schleicher&Shuell，Dassel，Germany)。在进行分析前，血液是先由滤纸流析出来，然后利用一串接质谱仪(Qyatro Micro；Micromass，Beverly，MA，USA)以现有文献中的描述(Wu，et al.(2004))来侦测氨基酸的浓度。

实施例1：施用天麻萃取物会保护细胞免于因缺乏血清所诱发的细胞凋亡

发明人先前发现A_2A-R-特有致效剂特别改善几个HD的主要症状(Chou，et al.(2005))。此外，天麻萃取物不但呈现防止PC12细胞因血清抽离所诱发的细胞凋亡而且活化A_2A-R(Huang，et al.(2004))。在本研究中，首先如“方法”所述，操作天麻的不同流析物的部分纯化。天麻萃取物的水/乙醇萃取物接着导入

HP-20管柱层析，并以水至甲醇的梯度冲提。如图1所示，甲醇萃取的多个流析物(T1-1，T1-2及T1-3)呈现保护PC12免于血清抽离所诱发细胞凋亡的活性。最有效的流析物是T1-3流析物。

实施例2：施以天麻萃取物促进R6/2小鼠的运动协调与生命期

在此讨论T1-3流析物对R6/2小鼠的治疗效果。小鼠在4周至12周间被施以T1-3流析物(加入饮用水5mg/mL)。如图2A所示，R6/2HD鼠完成滚轮测试全部流程(120s)的能力在10周大时降低。在饮用水中添加T1-3流析物会减少R6/2小鼠以滚轮测试其运动协调上的进一步恶化。图2B呈现R6/2小鼠的生命周期因慢性地施以T1-3流析物而适度地延长。由观测到的一般动物的行为或表现来推测在本研究中施用的T1-3流析物并无毒性影响。

实施例3：施以天麻萃取物降低R6/2小鼠神经元细胞核内聚集

T1-3流析物被用来讨论其对神经元细胞核内聚集(NIIs)形成的效应。由于在R6/2小鼠的大脑中观测到的NII2是皆泛素化(ubiquitinated)(Meade，et al.(2002))，被施以慢性T1-3治疗的12周大R6/2小鼠的脑部切片被以抗泛素抗体染色，之后再以甲基绿复染。图3A至图3C呈现补充T1-3会使R6/2小鼠的纹状体细胞表现NIIs百分比明显地降低。推测天麻的施用延迟HD鼠中NIIs的形成。而野生型小鼠的大脑中并未发现NII(Chou，et al.(2005)JNeurochem 93，310-20)。

实施例4：施以天麻萃取物会使R6/2小鼠血中已升高的葡萄糖浓度降低

由各个实验室，包括发明人自己所展示的研究，HD病患与HD小鼠都有血糖过高症(Chou，et al.(2005)；Podolsky，et al.(1972)；Duan，et al.(2003))。因为血糖过高症的抑制已经证明与HD患者神经元不足方面的改善有关(Duan et al.)，本发明讨论是否慢性地施以T1-3可使R6/2小鼠的血中葡萄糖浓度正常化。与一早期文献(Hurlbert，et al.(1999))相同的是，与野生型小鼠相较之下，R6/2小鼠在六周大时的血中葡萄糖浓度约增加一倍。此处增加的血中葡萄糖浓度比观察到移动协调缺陷的HD晚期要更为明显(图2A)。图4呈现施以T1-3流析物降低了R6/2小鼠中异常过高的血中葡萄糖浓度，展示T1-3流析物会改善葡萄糖调控与能量代谢。

实施例5：施以天麻萃取物会减少HD鼠肝脏中的Htt集合体

表一、R6/2小鼠与野生型小鼠的血中氨基酸浓度

血液组成分	WT(CON)N＝20	R6/2(CON)N＝24	R6/2(RG)N＝14
Arg	31.30±3.24＊＊	78.60±6.41	49.87±9.96
				Ala	258.39±25.76＊	383.30±24.23	303.75±54.31
Cit	22.51±3.46＊	41.38±4.79	37.49±8.70
				Orn	12.02±2.05＊	24.25±5.02	27.88±4.99
Gln	253.92±29.10＊	471.71±70.86	570.44±110.31
				Glu	153.24±15.22＊	230.80±17.18	164.92±28.22＊
Gly	187.99±14.54＊	309.86±20.52	274.04±45.02
				His	4.23±0.66	3.27±0.38	3.36±0.64
Met	13.79±1.33＊	28.55±1.79	26.92±5.04
				Phe	75.09±6.63＊	97.28±3.03	70.40±10.03＊
Pro	738.22±99.42	812.81±52.68	546.90±87.47＊
				Ser	30.87±2.75＊＊	60.31±3.60	41.20±4.62＊＊
Thr	65.38±7.00	74.07±5.27	53.45±6.77＊
				Trp	32.65±3.18＊	46.49±4.35	31.46±5.68＊
Tyr	47.09±4.12＊＊	75.82±4.82	48.85±7.01＊＊
				Val	153.54±16.43	192.61±13.99	131.33±20.17＊
Asp	72.81±23.06	54.95±6.99	141.04±26.00＊

由于代谢的不正常可能促成HD的病变，本发明进一步分析血中氨基酸的浓度。如表一所示，在R6/2小鼠中的17个经过检验的氨基酸中有12个显著地高于野生型。补充T1-3流析物将会使R6/2小鼠中浓度增高的氨基酸当中的7个正常化。由于不正常氨基酸代谢可能造成肝脏官能障碍(Holm，etal.(1999))，本发明研究肝脏中Htt集合体(Htt aggregate)的形成。与先前报导(Tanaka，et al.2004)相同的是，在R6/2小鼠的肝脏中可观察到Htt集合体(图5A、图5C)。慢性补充可减少HD鼠肝脏中的Htt集合体(图5B)。此保护效果与先前在局部缺血诱发的神经元伤害及阿兹海默症(Alzheimer’sdisease)(Kim，et al.(2001)；Kim，et al.(2003)Phytother Res；Kim，et al.(2003)J Ethnopharmacol；Hsieh，et al.(2001))当中显示的天麻的神经保护效果一致。

实施例6：活性天麻萃取物的单离组成分保护PC12细胞免于细胞凋亡与其作用可能如A2A-R的致效剂

将活性T1-3流析物混合后，经过分馏，并以Sephadex LH-20管柱层析纯化(图6)。14个已知的化合物(包含天麻素、派立辛、4-羟基苯甲醇、4，4’-二羟基苯甲基亚砜、4-羟基苯基甲烷、双(4-羟基苯甲基)醚、4-羟基苯甲基乙醚、四羟基苯甲基-甲醚、三甲基柠檬酸盐(trimethylcitrate)、4-羟基苯甲醛、尿苷、腺苷、5-(羟基甲基)-2-呋喃醛及T1-C(Taguchi，et al.(1981)；Lin，et al(1996)Phytochemistry 42，549-551；Hayashi，et al.(2002)；Huang，et al.(2005)，Xiao，et al.(2002)))，及一先前未曾被分离的组成(T1-11)被鉴定出来。测试这些单离的流析物防止缺乏血清所诱发的细胞凋亡的能力。在15个化合物中，有两个化合物(T1-C及T1-11)具有保护PC12细胞免于程序性死亡的活性(图7A)。T1-C及T1-11在T1-3流析物中大约分别占5％及0.2％。尽管其为一相对少量的组成，T1-11在保护PC12细胞免于细胞凋亡上比T1-C更具潜力。有趣的是，对于ST14A细胞(Ehrlich，et al.(2001))不论施以T1-C或T1-11都增高细胞内cAMP的量，如同施以A_2A-R选择性致效剂CGS2168一般。此外，cAMP的反应可被A_2A-R-依赖性拮抗剂(CSC，图7B)抑制。因此，相信T1-C与T1-11的功能如同A_2A-R的致效剂。

实施例7：活性天麻萃取物的单离组成分会保持R6/2小鼠的运动表现、降低体重减轻及延长生命期

由四周大起，不论在饮用水中施以T1-C(0.5gm/mL)或T1-11(0.05mg/mL)，都使R6/2小鼠由滚轮测试所估计的运动协调显著地延缓进一步恶化(图8A)。此外，两种化合物改善R6/2小鼠的体重下降(图8B)及延长生命期。对照组、T1-C及T1-11治疗小鼠的平均存活时间分别为94.9±2.5、106.7±4.6及104.9±5.2天(平均值±SEM，n＝7～8；图8C)。

实施例8：活性天麻萃取物的单离组成分的结构与性质

这两种活性组成分(T1-C及T1-11)的构造是由光谱数据，特别是1D及2D核磁共振谱数据进行解析。高效能液相层析仪是用来监测不同批次活性流析物的化学剖面。活性流析物的层析图谱显示活性组成分的分离，其滞留时间T1-C为40.91分钟，以及T1-11为22.03分钟。

单离后的T1-C为无色针状，由高解析离子化质谱(HREIMS)在m/z247.0751(M⁺+H)及¹³C的NMR图谱数据获得其分子式为C₁₄H₁₄O₂S，有八个氢不足度(eight-hydrogen deficiency，IHD)。红外光谱图呈现羟基(3285cm^-1)及芳香基(1604及1600cm^-1)吸收。核磁共振谱与质谱分析揭示了T1-C的结构为一对称化合物，¹HNMR图谱指出一1，4-二取代苯基[δ7.09及6.72(4H each，d，J＝8.5Hz)]以及二个苯甲基硫亚甲基质子(benzylicthiomethylene proton)[δ3.53(4H，s)]。¹³C NMR、DEPT及HMQC分析揭示两个氧化合的sp²芳香碳原子[δ157.4(s)]，六个芳香碳原子中两个完全取代sp²碳原子，以及两个硫亚甲基碳原子。T1-C的HMBC光谱揭示由H-7至C-1，C-2(6)；由H-2(6)至C-1，C-3(5)与C-4的交迭波峰(cross peaks)。由上述结果推测T1-C化合物应建构为4，4’-二羟基苯甲基硫化物：

T1-C：mp 126～128℃；IR(KBr)max：3285，1604，1600，1509，1214，1089，841，815cm-1；¹H NMR(CD₃OD).3.53(4H，s，H-7)，6.72and 7.09(4H each，d，J＝8.5Hz，H-3(5)and H-2(6))；¹³C NMR(CD₃OD.)δ35.9(t，C-7)，116.1(d，C-3(5))，130.5(s，C-1)，131.1(d，C-2(6))，157.4(s，C-4)；EIMS m/z(％)246(M+，35)，200(15)，107(100).HREIMS m/z 246.0717(calcd for C₁₄H₁₄O₂S：246.0715).

与T1-C具有相同结构的化合物已经在一较早的天麻萃取物的化学分析文献揭露(Xiao，et al.(2002))，相反地，T1-11在以前并未被鉴定出来，由其HRFABMS在m/z 374.1361(M⁺+H)及¹³C NMR图谱数据鉴定为具有分子式C₁₇H₁₉O₅N₅的无色无晶型粉末。其IR图谱指出它具有羟基(3327、1125、1065cm^-1)，及一芳香系统(1630、1610、1585cm^-1)。¹H及¹³C NMR图谱呈现一类似腺苷的模式，但有因对-羟基苯甲基胺基基团取代T-11的一胺基产生的讯号[δ_H 4.60(2H，t，J＝6.0Hz)，6.65及7.12(2H each，d，J＝8.5Hz，H-3”(5”)及H-2”(6”))；δ_C 42.4(t，H-7”)，114.9(d，C-3”(5”))，128.6(d，C-2”(6”))，130.8(s，C-1”)]。对-羟基苯甲胺基的连结可进一步由HMBC的H-7”及C-1”，C-2”(6”)及C-6的相关来确定。T1-11的结构(2-(6-(4-羟基苯甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3，4-二醇)结构如下：

T1-11：mp 216～218℃；IR(KBr)max：3327，3164，2927，1630，1514，1125，1065，815cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆)δ3.54and 3.64(1H each，m，H-5’)，3.95(1H，t，J＝1.8Hz，H-4’)，4.13(1H，m，H-3’)，4.60(3H，m，H-2’，-7”)，5.87(1H，d，J＝5.5Hz，H-1’)，6.65and 7.12(2H each，d，J＝8.5Hz，H-3”(5”)and H-2”(6”))，8.19and8.33(1H each，s，H-2and H-8)，8.28，9.19(1H each，br s，OH and NH)；¹³CNMR(DMSO-d₆)42.4(t，C-7”)，61.7(t，C-5’)，70.7(d，C-3’)，73.5(d，C-2’)，85.9(d，C-4’)，88.0(d，C-1’)，114.9(d，C-3”(5”))，120.4(s，C-5)，128.6(d，C-2”(6”))，130.8(s，C-1”)，139.8(d，C-8)，148.4(s，C-4)，152.3(d，C-2)，154.5(s，C-6)，156.1(s，C-4”)；FABMS m/z(％)374(M++1，28)，242(15)，154(95)，136(83)，56(100)；HRFABMS m/z 374.1361(calcd for C₁₇H₁₉O₅N₅：374.1388).

实施例9：化合物的合成流程图

本发明所描述的化合物也可通过标准化学合成方法，由容易取得的起始材料来获得。一作为实施例的合成流程呈现如下。在一耦合步骤中，起始物与前驱官能基(precursor group)X¹及X²耦合形成连结X：

举例来说，化合物的X为-O-时，其可藉由下列方式形成：选择一对等价的X¹/X²(例如羟基与卤素或金属氧化物与卤素)，在合适形成醚类的反应条件下形成(例如：Larock，R.C.(1999，page 890-895)。同样的，化合物的X为-S-时，可藉由选择X¹/X²价数(例如硫醇或硫酯(thioolate))与一离去基(例如卤素)；此化合物可进一步氧化，转换-S-成为-S(O)-或-SO₂-。X为-C(O)NR^a-、-NR^aC(O)-、-NR^aSO₂-或-SO₂NR^a-的化合物可由X¹与X²其中一个为胺、且另一个为胺-反应性羰基或磺酰基的衍生物的起始材料来制备。举例来说，酸化卤(acid halide)、磺酰卤化物(sulfonyl halide)或其它类似物，且在适合酰胺或磺酰胺形成的条件下反应(例如：Larock，R.C.(1999，page1953-1954))。X为二硫化物(disulfide)的化合物可在当X¹/X²皆为-SH时经由还原与纯化来制备。X为-NR^a-的化合物可藉由选择X¹/X²价数(如胺基与卤素)在适合胺的烷基化或芳香化的反应条件下形成(例如：Larock，R.C.(1999，page 779-784)。

依据反应条件，R³与R⁴基可藉由未经修饰的反应、或可选择性地被保护，而形成PG-R³与PG-R⁴，其中每个PG为一适当的保护基。例如，当R³与R⁴为-OH时，保护基包含烷基醚、烷氧基烷基醚、硅烷基醚或其它类似物。

可用标准反应将取代基(例如R³及R⁴)从容易取得的价(value)(例如卤素、羟基或其它类似物)转换成或其它价。可参考如Larock，1999。

实施例10：T1-C的合成途径

将(4-甲氧基苯基)甲烷硫醇在乙醇与氢氧化钠当中搅拌，形成(4-甲氧基苯基)甲烷硫醇钠(sodium(4-methoxyphenyl)methanethiolate)。将一当量的1-(氯甲基)-4-甲氧基苯加入混合物中搅拌隔夜。之后于此反应混合物加入稀释的酸来终止反应，所得产物双(4-甲氧基苯甲基)硫化物。接着将双(4-甲氧基苯甲基)硫化物与溴化氢在乙腈中反应，移除甲氧基保护基，接着中和与纯化产物双(4-甲氧基苯甲基)硫化物。

实施例11：T1-11的合成途径

腺嘌呤核糖核苷(2-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-3，4-二醇)与4-甲氧基苯甲酰氯在二氯甲烷中反应隔夜。接着反应完成后，使苯甲酰酮的部分在微过量的氢化铝锂的乙醇溶液中还原成亚甲基(methylene)。所得化合物以溴化氢在乙腈中去保护，以形成产物2-(6-(4-羟基苯甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-3，4-二醇(T1-11)。

实施例12：T1-11在发炎方面的功效

材料与方法

细胞培养

从新生(1～2天大)R6/2HD小鼠脑中纯化出初代星状细胞(astrocyte)(参见Mangiarini，L.，et al.Exon 1of the HD gene with an expanded CAGrepeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenicmice.Cell 87，493-506(1996))，并以其同窝小鼠作为WT对照组。简言之，将皮质小心地移出，以0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Grand Island，NY，USA)于37℃消化10分钟，之后以吸量管温和地吸放，使之产生物理性的分离，并通过70μm孔洞的尼龙网目。之后将细胞置于有聚-L-赖氨酸(离氨酸)涂覆的培养盘，并在添加10％v/v热去活化胎牛血清(FBS)及1％青霉素/链霉素的DMEM培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium；Gibco)于37℃及含5％CO₂的加湿大气中生长。藉由PCR为基础的基因型鉴定技术，利用小鼠尾巴抽取的基因体DNA及Jackson Laboratory的引物对(5’-CCGCTCAGGTTCTGCTTTTA-3’及5’-GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’)来鉴定子代。变异Htt的表现则是用小鼠的抗-人类Htt单株抗体(EM48)(1∶200稀释液，Chemicon International，Temecula，CA，USA)来进行测量。初代星状细胞培养物的纯度则是使用免疫组织染色来测定，其是使用抗星状细胞特异性标记的抗体(GFAP，1∶1000稀释液，Sigma，St.Louis，MO，USA)或抗微胶细胞(microglia)特异性标记的抗体(抗-CD11b，1∶200稀释液，Serotec，Oxford，UK)。在30DIV时，99％初代培养细胞均为GFAP阳性，且未发现CD11b阳细细胞(即微胶细胞)(数据未显示)。国立成功大学(中国台湾台南)SF Tzeng博士慷慨馈赠的微胶细胞株(BV2细胞，参见Mazzolla，R.，et al.Enhanced resistance to Cryptococcus neoformans infection induced bychloroquine in a murine model of meningoencephalitis.Antimicrob AgentsChemother 41，802-807(1997))是在添加10％FBS(Hy-Clone)的DMEM/F12培养基(Gibco，CA，USA)维持于37℃的培养箱中，其中培养箱内的气体带有5％CO₂及95％空气。

十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹法

以Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)来测定蛋白浓度。将样本装填到8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，并将之分离。电泳结束后，将凝胶转印到硝基纤维素膜上，并以溶于PBS的3％BSA溶液进行封阻(block)，再以指定抗体于4℃作用隔夜。之后将膜及一与过氧化酶共轭结合的二级抗体在室温共同培养1小时，并以TBST(0.2MTris-base、1.37M NaCl及0.1％Tween 20)清洗三次。产生免疫反应的条带(band)之后以非放射活性的发光方法(ECL，得自Fujifilm，Tokyo，Japan)来呈色。在蛋白质印迹分析中，本发明使用了1∶1000的抗iNOS(BDBioscience，CA，USA)稀释液。

一氧化氮(NO)的测量

在测量NO产量时，细胞(5×10⁵个细胞/盘孔)是在目标药物存在的情况下以脂多糖(LPS，0.5μg/mL)处理72小时。至于NO的产量，则是在一种使用了改质Griess试剂(Sigma，MO，USA)的介质中，依照制造商的指示，以NO2-(NO形成过程的稳定终产物)的累积量来进行评估。介质是与等量的1×改质Griess试剂混合15分钟。之后监测540nm的吸收值。NO产量会以同盘孔的蛋白量来正规化(normalize)，其是以对照(未处理)条件下WT星状细胞的信号为百分之百的百分比来表示。

结果与讨论

发炎会参与多种创伤及神经退化疾病(包括亨丁顿舞蹈症)的病理(参见Calabrese，V.，Boyd-Kimball，D.，Scapagnini，G.&Butterfield，D.A.Nitricoxide and cellular stress response in brain aging and neurodegenerative disorders：the role of vitagenes.In Vivo 18，245-267(2004)；Deckel，A.W.Nitric oxide andnitric oxide synthase in Huntington′s disease.JNeurosci Res 64，99-107(2001))，因此，神经发炎机制是许多退化疾病的重要药物标的(Sastre，M.，Klockgether，T.&Heneka，M.T.Contribution of inflammatory processes to Alzheimer′sdisease：molecular mechanisms.Int J Dev Neurosci 24，167-176(2006)；Blanco，A.M.&Guerri，C.Ethanol intake enhances inflammatory mediators in brain：roleof glial cells and TLR4/IL-1RI receptors.Front Biosci 12，2616-2630(2007)；Marchetti，B.，et al.Glucocorticoid receptor-nitric oxide crosstalk andvulnerability to experimental parkinsonism：pivotal role for glia-neuroninteractions.Brain Res Brain Res Rev 48，302-321(2005)；Barbeito，L H.，et al.Arole for astrocytes in motor neuron loss in amyotrophic lateral sclerosis.Brain ResBrain Res Rev 47，263-274(2004)；以及Beattie，M.S.Inflammation andapoptosis：linked therapeutic targets in spinal cord injury.Trends Mol Med 10，580-583(2004))。

脑中主要负责发炎反应的细胞类型是星状细胞和微胶细胞。因此，本发明测试T1-11在发炎方面的效应时，是使用从野生型(WT)及R6/2-J2小鼠(一种亨丁顿舞蹈症的小鼠模型)纯化出来的初代星状细胞、以及一微胶细胞株(BV2)。诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表现量及一氧化氮(NO)的产量则如其它文献的提议，用作发炎标记(参见Barbeito，LH.，et al.A role for astrocytes in motor neuron loss in amyotrophiclateral sclerosis.Brain Res Brain Res Rev 47，263-274(2004))。

在数种病理性发炎过程(如败血性休克、多重器官衰竭、及慢性酒精中毒)中，NO会产生一些毒性因子，如过氧亚硝酸盐(peroxynitrite)，所以扮演了关键性的角色(参见Blanco，A.M.&Guerri，C.Ethanol intake enhancesinflammatory mediators in brain：role of glial cells and TLR4/IL-1RI receptors.Front Biosci 12，2616-2630(2007)；Chandra，A.，Enkhbaatar，P.，Nakano，Y.，Traber，L.D.&Traber，D.L.Sepsis：emerging role of nitric oxide and selectins.Clinics 61，71-76(2006))。

如图9所示，低浓度的细菌毒素(脂多糖，LPS)会使星状细胞中iNOS的表现及NO的产量有明显的增加。从R6/2-J2小鼠收下来的初代星状细胞的iNOS表现及NO产量会比野生小鼠高，这与HD会发生慢性发炎的假设是一致的。最重要的是，T1-11会有效地抑制LPS所引起的发炎(图9)。同样地，T1-11也会减少BV2细胞中由LPS所引起的iNOS诱导(iNOSinduction)及NO的产生(图10)。由于发炎反应与星状细胞募集(astrocyterecruitment)及/或微胶细胞活化有关，且涉及许多退化性疾病(如阿兹海默症、帕金森氏症(Parkinson’s diseases)、脊索创伤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis))，本发明的发现建议T1-11可以在与发炎有关的神经元疾病/创伤以及其它系统性疾病(如败血症)上产生有益的成效。

实施例13，T1-11的合成与定性

之前已从中药草天麻(Gastrodia elata)中纯化出有两种活性化合物T1-C(1)及T1-11(2)并加以定性，说明它们具有神经保护的效果(参见Huang，N.K.，Lin，Y.L.，Cheng，J.J.&Lai，W.L.Gastrodia  elata prevents  ratpheochromocytoma cells from serum-deprived apoptosis：the role of the MAPKfamily.Life Sci 75，1649-1657(2004)以及Huang，N.K.，et al.Neuroprotectiveprinciples from Gastrodia elata.JNat Prod 70，571-574(2007))。传统中医使用天麻的地下茎来改善记忆力、缓和睡眠障碍、以及保护心脏功能。有些研究人员提出，天麻在几种条件下可预防神经元受损(参见An，S.J.，et al.Gastrodin decreases immunoreactivities of gamma-aminobutyric acid shuntenzymes in the hippocampus of seizure-sensitive gerbils.J Neurosci Res 71，534-543(2003)；Kim，H.J.，Moon，K.D.，Oh，S.Y.，Kim，S.P.&Lee，S.R.Etherfraction of methanol extracts of Gastrodia elata，a traditional medicinal herb，protects against kainic acid-induced neuronal damage in the mouse hippocampus.Neurosci Lett 314，65-68(2001))；Kim，H.J.，Lee，S.R.&Moon，K.D.Etherfraction of methanol extracts of Gastrodia elata，medicinal herb protects againstneuronal cell damage after transient global ischemia in gerbils.Phytother Res 17，909-912(2003)；Kim，H.J.，Moon，K.D.，Lee，D.S.&Lee，S.H.Ethyl etherfraction of Gastrodia elata Blume protects amyloid beta peptide-induced celldeath.J Ethnopharmacol 84，95-98(2003)；Hsieh，C.L.，et al.Anticonvulsive andfree radical scavenging activities of Gastrodia elata Bl.in kainic acid-treated rats.Am J Chin Med 29，331-341(2001)；Hsieh，C.L.，et al.Anticonvulsive and freeradical scavenging activities of vanillyl alcohol in ferric chloride-inducedepileptic seizures in Sprague-Dawley rats.Life Sci 67，1185-1195(2000))。

由于T1-11在植物来源当中的含量有限(干燥植物材料的～0.001％)，本发明利用有机合成法作为获取后续生物评量的足量T1-11的必要手段。

如后续流程图所示，腺苷类似物T1-11(化合物2)是在二异丙基乙基胺(DIEA)存在的情况下以4-羟基苯甲基胺盐酸盐(6)进行6-氯嘌呤核糖核苷(6-chloropurine ribonucleoside)(7)的取代反应而合成，产率很高。由于胺的盐酸盐6并无市售产品，故是由4-羟基苯甲醛的两阶段反应得出，其中间产物为对应的肟5。因此，前述的肟会在10％Pd/C的催化下被氢化，得出胺的盐酸盐6。化合物1、2及5的¹H和¹³C NMR图谱如图11至图16所示。以上所合成的T1-11与得自自然来源的样本是一样的(参见Calabrese，V.，Boyd-Kimball，D.，Scapagnini，G.&Butterfield，D.A.Nitric oxide and cellularstress response in brain aging and neurodegenerative disorders：the role ofvitagenes.In Vivo 18，245-267(2004))。

T1-11(N⁶-(4-二羟基苯甲基)胺基嘌呤核糖核苷，

N⁶-(4-dihydroxybenzyl)aminopurine riboside)的合成流程图

以下是根据上述流程图合成T1-11的特殊实施例。

除非另外标明，否则所有试剂及溶剂均为试剂等级，且在没有进一步纯化的情况下使用。THF及二乙基醚是由Na/二苯基酮(benzophenone)馏出，而CH₂Cl-₂则是由CaH₂馏出。

用Perkin Elmer Lamda 35UV-Vis分光光度计测量溶液的吸收值。用AMINCO.Bowman Series2分光光度计测量荧光光谱。用Yanaco微量测定仪记录熔点。用Nicolet Magna 550-II记录红外光(IR)光谱。用Varian UnityPlus-400(400MZz)得出NMR图谱，其中化学位移值(δ)是相对于下列各值加以记录，单位为ppm(parts per million)：在CHCl₃/CDCl₃为δ_H 7.24/δ_C 77.0(t的中线)、在(CH₃)₂CO/(CD₃)₂CO为δ_H 2.05/δ_C 29.92、在CH₃OH/CD₃OD为δ_H 3.31/δ_C 49.0、在(CH₃)₂SO/(CD₃)₂SO为δ_H 2.49(m)/δ_C 39.5(m)。有多重峰的图谱(splitting pattern)可报告为s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)。偶合常数(J)是以Hz来表示。ESI-MS实验是在Bruker Daltonics BioTOF III高分辨率质谱仪上进行。分析性薄层层析(TLC)则是在E.Merck silica gel 60F₂₅₄板(0.25mm)上进行。利用UV、大茴香醛(anisaldehyde)或茚三酮(ninhydrin)喷雾来使化合物显像。管柱层析则使用填有70-230目硅胶的管柱来进行。

对空气或水气敏感的实验均在氩气环境下进行。所有玻璃均在烘箱中干燥2小时以上，使用前在干燥器中降至室温。

N⁶-(4-二羟基苯甲基)腺苷(2)(参见Trivedi，B.K.B.，C.J.；Bristol，J.A.；Hamilton，H.W.；Patt，W.C.；Kramer，W.J.；Johnson，S.A.；Bruns，R.F.；Cohen，D.M.；Ryan，M.J.N6-Substituted adenosine receptor agonists：potentialantihypertensive agents.J.Med.Chem 34，1043-1049(1991)；Golisade，A.W.，J.；Herforth，C.；Jomaab，H.；Linka，A.Bioorg..Anti-malarial activity ofN6-substituted adenosine derivatives.Part I.Med.Chem.10，769-777(2002))

将在1-丙醇(25mL)中的4-羟基苯甲基胺盐酸盐6(395mg，2.5mmol)、6-氯-嘌呤核糖核苷7(143mg，0.5mmol)及二异丙基乙基胺(2mL，12mmol)加热至70℃6小时。将混合物减压浓缩，并与水一同研磨，得出白色沉淀物，并将之过滤，得出目标腺苷2(151mg，81％)。C₁₇H₁₉N₅O₅；白色粉末，mp 208.7-209.2℃；[α]²⁰ _D＝-64.5(DMSO，l＝10cm)；TLC(MeOH/EtOAc(1∶9))R_f＝0.3；¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ9.22(1H，s)，8.34(1H，s)，8.30(1H，br s)，8.18(1H，s)，7.12(2H，d，J＝8.0Hz)，6.65(2H，d，J＝8.0Hz)，5.86(1H，d，J＝5.6Hz)，5.41(2H，m)，5.18(1H，d，J＝5.6Hz)，4.60(2H，m)，4.13(1H，q，J＝4.6，7.4Hz)，3.95(1H，q，J＝3.4，6.2Hz)，3.66(1H，m)，3.53(1H，m)；¹³C NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ155.3，153.6，151.6，147.6，139.1，129.5，127.9(2×)，119.2，114.4(2×)，87.6，85.6，73.3，70.5，61.5，42.4；ESI-MS calcdfor C₁₇H₂₀N₅O₅：374.1459，found：m/z 374.1412(M⁺+H).

本发明中所记载的每份文件全文整合为参考文献。

本发明一系列的实施态样已揭示如上，然而当可轻易理解的是可在不背离本发明的精神与范围内进行各种修饰。其它实施态样是由请求保护范围所界定。

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Claims (20)

1.一种缓和或治疗神经退化疾病的方法，其是在有该项需求的哺乳类患者身上进行，且包含对前述患者投予一种包含一有效量的经单离或经合成的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷或其医药可接受盐或溶剂化物作为医药活性剂的医药组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中前述神经退化疾病为亨丁顿舞蹈症。

3.如权利要求1所述的方法，其中前述N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷为合成的化合物。

4.一种调节发炎的方法，其是在有该项需求的哺乳类患者身上进行，且包含对前述患者投予一种包含一有效量的经分离或经合成的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷或其医药可接受盐或溶剂化物作为医药活性剂的医药组合物。

5.如权利要求4所述的方法，其中前述发炎是发生在中枢神经系统中。

6.如权利要求4所述的方法，其中前述发炎是发生在脑中。

7.如权利要求4所述的方法，其中前述发炎是与星状细胞募集及/或微胶细胞活化有关。

8.如权利要求4所述的方法，其中前述发炎是与神经障碍有关。

9.如权利要求4所述的方法，其中前述调节是指降低或抑制。

10.一种制造如下式的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷的方法，

其包含下列步骤：

a)将式I化合物

I

与式II所示的4-甲氧基苯甲酰基化合物

II

予以缩合，其中R₁表示一离去基，以制备式III化合物

III；

b)将式III化合物还原，得式IV化合物

IV；

以及

c)将式IV化合物去保护，以制备N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷。

11.如权利要求10所述的方法，其中前述离去基为卤基。

12.如权利要求10所述的方法，其中前述离去基为氯基。

13.如权利要求10所述的方法，其中前述缩合步骤是在氯化溶剂存在的情况下进行。

14.如权利要求10所述的方法，其中前述氯化溶剂为亚甲基氯。

15.如权利要求10所述的方法，其中前述还原步骤是在氢化铝锂及一C1～C4低级醇溶剂存在的情况下进行。

16.如权利要求10所述的方法，其中前述去保护步骤是在氢溴化物及乙腈存在的情况下进行。

17.一种制造如下式的N⁶-(4-羟基苯甲基)腺苷的方法

其包含将式7化合物

与式6化合物

予以缩合的步骤。

18.如权利要求17所述的方法，其中前述式6化合物是藉由下列步骤来制备：

a)将式4化合物

转化为式5化合物

b)将式5化合物氢化，得式6化合物。

19.如权利要求17所述的方法，其中前述缩合步骤是在一C1～C4低级醇及一碱存在的情况下进行。

20.如权利要求19所述的方法，其中前述碱为二异丙基乙基胺。

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