CN102740849A - 结合至腺苷a2a受体和腺苷转运子以预防及治疗神经退化疾病的双功能化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于预防和治疗神经退化疾病的药剂。这些药剂是协同地与腺苷A2A受体(A2AR)及平衡型核苷转运子1(ENT1)结合。

Description

结合至腺苷A2A受体和腺苷转运子以预防及治疗神经退化疾病的双功能化合物
本申请请求享有于2010年11月13日递交的美国临时专利申请61/260,932的优先权，并将其全文引用到这里作为参考。
技术领域
本发明提供一种用以治疗神经退化疾病(neurodegenerative diseases)，如亨丁顿舞蹈症(Huntington’s disease，HD)的化合物的鉴定、合成和使用。
背景技术
亨丁顿舞蹈症(HD)是一种因亨丁顿基因(Huntingtin gene，Htt)上CAG三连核苷酸扩展(CAG trinucleotide expansion)而引发的体染色体显性神经退化疾病(autosomaldominant neurodegenerative disease)，该疾病会表现出舞蹈症(chorea)、失智(dementia)和精神症状(psychiatric symptoms)。1-3虽然已有部分具和缓病征效果的药物被发表4，5，但针对亨丁顿舞蹈症的有效治疗方法仍有待研发。目前已知在基因转殖小鼠模式实验中，选择性A2A腺苷受体的兴奋剂(selective A2A adenosine receptor(A2AR)兴奋剂)，CGS21680(简称CGS)，可以舒缓亨丁顿舞蹈症的症状6，并且，这个化合物已被证实可以通过增强泛素蛋白酶系统(ubiquitin-proteasome system)的活性来解决亨丁顿舞蹈症中尿素循环缺陷的问题7。然而，除了既有的副作用外，已知CGS更会引发免疫抑制作用8，因此并不适合于临床上的运用。在另一方面，一种自天麻(Gastrodia elata Bl)中分离出来且命名为T1-11(化合物1)的腺苷类似物，也是一种A2A腺苷受体的兴奋剂，已被证实具有抑制PC12细胞的去血清所引发细胞凋亡的机转(serum-deprived apoptosis)的功效，因此可能具有治疗神经退化疾病的潜力9。
缩写：
A2AR：A2A腺苷受体。
Ac2O：乙酸酐(acetic anhydride)。
CGS：6-胺基-9-(5-乙基氨基甲酰基-3，4-二羟基-草脲胺-2-基)-2-{2-[4-(2-羧乙基)苯基]乙胺}嘌呤(6-amino-9-(5-ethylcarbamoyl-3，4-dihydroxy-oxolan-2-yl)-2-{2-[4-(2-carboxyethyl)phenyl]ethylamino}purine)。
DIEA：二异丙基乙胺(diisopropylethylamine)。
DMF：N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide)。
DML：设计的多结合标的配体(designed multiple ligands)。
ENT：平衡型核苷转运子(equilibrative nucleotide transporter)。
ESI：电喷洒离子化(eletrospray ionization)。
EtOAc：乙酸乙酯(ethyl acetate)。
HD：亨丁顿舞蹈症(Huntington’s disease)。
hENT1：人类平衡型核苷转运子1(human equilibrative nucleotide transporter 1)。
HBA：氢键受体(hydrogen bond acceptor)。
HBD：氢键给体(hydrogen bond donor)。
HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium)。
HOBt：1-羟苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole)。
HP：疏水性区域(hydrophobic)。
HPLC：高效能液相层析(high-performance liquid chromatography)。
IR：红外线光谱(infrared)。
JNK：c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase)。
MS：质谱术(mass spectrometry)。
MsCl：甲磺酰氯(methanesulfonyl chloride)。
MTT：3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二酚四唑溴化物((3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide))。
NBTI：S-(4-硝苯甲基)-6-硫肌苷(S-(4-nitrobenzyl)-6-thionosine))。
NMR：核磁共振(nuclear magnetic resonance)。
Py：吡啶(pyridine)。
PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)。
RA：芳香环(ring aromatic)。
t-BuOH：三级丁醇(tertiary butanol)。
TEMPO：2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(2，2，6，6-tetramethylpiperidinyl-1-oxy)。
THF：四氢呋喃(tetrahydrofuran)。
TLC：薄层层析(thin-layer chromatography)。
TsCl：对甲苯磺酰氯(p-toluenesulfonyl chloride)。
TsOH：对甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)。
ZM：4-(2-[7-胺基-2-{2-呋喃基}{1，2，4}三唑酮{2，3-a}{1，3，5}三嗪-5-基-胺基]乙基)酚(4-(2-[7-Amino-2-{2-furyl}{1，2，4}triazolo{2，3-a}{1，3，5}triazin-5-yl-amino]ethyl)phenol)。
发明内容
A2AR和腺苷转运子(adenosine transporter，例如，平衡型核苷转运子(ENT1))皆已被证实会定位在纹状体(striatum)10-13，即突变的亨丁顿基因聚集的地方14。抑制腺苷转运子会区域性地提高腺苷的浓度，并进而提升激活(agonizing)A2AR的效率。有趣的是，化合物1亦被认为是一种ENT1抑制剂。从另一方面来说，CGS潜在的免疫抑制作用也是A2AR讯息传递的结果，显示与A2AR具有很强的结合亲和力可能不是临床上有效药物的有利特性。
因此许多研究致力于修饰化合物1但保留它的多功能特性。此外，基于上述理由，具短暂或微弱结合能力的化合物可能较具有稳定结合能力的化合物更适合15，尤其是在结合于A2AR讯息传递系统的情况中。设计而得的多结合标的配体(designed multipleligands，DMLs)16，17与经随机筛选而得的杂乱的化合物是全然不同的概念，因为它们是经明确地设计而得以使欲呈现的特性最佳化。相较于具单一结合标的化合物(individually-targeting compounds)，科学界认为DMLs 可能于治疗具有复杂病因的疾病，如气喘(asthma)、肥胖症(obesity)、癌症(cancer)和精神疾病上具有优势16-18。一般理解，生物体内复杂联络网络的重复性与健全性可能是造成高度选择性药物无法表现出预期治疗效果的原因19。近来评估显示A2AR的药理特性确实相当复杂，因此，DMLs 可能又更适合用于结合至A2AR讯息传递系统20。然而，一来因为难以通过计算机程序正确地架构出一配体与众多标的交互作用的关系，二来考虑到化学合成的诸多限制及对化合物的物化特性的要求，因此设计多结合标的配体往往是一个极具挑战性的任务21，22。或许是因为越多的结合标的其复杂程度就越高，所以目前经报导的DMLs绝大多数为双功能配体(dual-function ligand)22。
在我们前一个美国临时申请案(美国临时申请案号：61/260,932)中提到多个经合成且对腺苷受体和转运子具有双功能的化合物。这些化合物一般而言是具有一腺苷结构骨架，且于其N6和C5’位置带有下列修饰的结构的化合物：
Figure BDA00001630717100041
其中，n为1至3；R1是选自由(经取代的)苯((substituted)-benzene)、芳烃(polyarene)及杂环(heterocycle)所组成的群组；R2是选自由卤素、羟基、烷氧基、迭氮基(azido)、胺基、(经取代的)胺基、酰胺基、巯基(sulfanyl)、磺酰基(sulfonyl)、三唑基和氰基所组成的群组；及R3是选自由(经取代的)羰基、羧酸；(经取代的)脲基((substituted)carbamide)、氰基、(经取代的)炔基及(经取代的)四唑基所组成的群组。
优选地，在本发明的一个实施方案中，该化合物具有下列结构：
Figure BDA00001630717100042
其中，该经取代的杂环含有5元或6元环及该并合杂环(fused heterocycle)含有氮、氧或硫作为杂原子，以及该取代基是选自氢、卤素(氟、氯、溴和碘)、羟基、烷基(含1至6个碳)、三氟甲基(trifluoromethyl)和(经取代的)苯基团所组成的群组。
该杂环可以是吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、六氢吡啶(piperidine)、六氢吡(piperazine)、吲哚、苯并呋喃(benzofuran)、苯并噻吩或喹啉。
在另一个优选实施方案中，该化合物具有下列结构：
Figure BDA00001630717100043
其中，该芳香环是选自由苯、萘、蒽、菲和芘所构成的群组；当n＝1，该苯甲基团(benzyl group)可选择性地具有选自由卤素(氟、氯、溴和碘)、烷基(甲基、乙基、丙基、丁基和三氟甲基)、苯基(phenyl)、羧基、烷氧基(OR，其中R＝CH3、C2H5、C3H7或C4H9)、胺基(NRR’，其中R和R’代表H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9或苯基)、酰胺基(NHCOR，其中R＝CH3、C2H5、C3H7或C4H9)、硝基、磺酸盐(sulfonate)、烷酰基(COR，其中R＝H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9或苯基)和羧酸盐(CO2R，其中R＝H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9或苯基)所构成的群组的取代基。
优选地，该化合物具有下列结构：
其中，R3是选自由氢、烷基(含1至4个碳)和(经取代的)苯基所构成的群组，且R1如上所述。
另一优选的化合物具有下列结构：
Figure BDA00001630717100052
其中，R4是选自由氢、卤素(氟、氯、溴和碘)、羟基、烷基(含1至6个碳)、三氟甲基和(经取代的)苯基所构成的群组，且R1如上所述。
再一优选的化合物具有下列结构：
Figure BDA00001630717100053
其中，R5是选自由氢和烷基(含1至4个碳)所构成的群组，且R1如上所述。
另一优选的化合物具有下列结构：
Figure BDA00001630717100054
其中，R是选自由氢、卤素(氟、氯、溴和碘)、烷基(含1至4个碳)、三氟甲基、苯基、羟基、烷氧基(含1至4个碳)、(经取代的)胺基、(经取代的)酰胺基、硝基、磺酸盐、羰基和羧酸盐所构成的群组，且其是位于邻位、间位或对位；其中，x为1至5。
本发明的另一个实施方案提供一种神经退化疾病的治疗方法，其包含：将有效量的至少一种上述化合物施予一需要治疗的对象。该神经退化疾病可指因蛋白质错误折迭所引发的蛋白质错误折迭疾病。该蛋白质错误折迭疾病包括阿兹海默症(Alzheimer’sdisease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、肌萎缩性侧索硬化症(脊髓小脑共济失调症)、普利昂病(Prion disease)、亨丁顿舞蹈症以及脊髓小脑共济失调症(amyotrophic lateralsclerosis)。本发明的方法对于治疗亨丁顿舞蹈症特别有用。
本发明的另一个实施方案提供一种组合物，其包含有效量的至少一种上述化合物以及医药可接受的载体。
为了合理地设计适合做为亨丁顿舞蹈症的治疗药剂的双功能配体，我们首先建构了两个药效基团模型(pharmacophore model)，其中一个是A2AR兴奋剂(A2AR兴奋剂)，另一个则是ENT1抑制剂。三维的药效基团可以呈现一系列结合相同生物分子的活性区域且展现相同功能的化合物的化学功能特性的特定空间分布23，这在该结合的生物分子的结构尚无法以高分辨率的X-ray或NMR解出时，特别有用。药效基团分析已成功地运用于多种药物的研发工作24-29。虽然人类腺苷A2A受体的高解析晶体结构已经解出30，但其显示的是其与拮抗剂，ZM241385(简称ZM)结合的构型，而非兴奋剂。另一方面，人类ENT1的晶体结构则尚未明朗，目前也未能找到合适的结构作为模板以进行同源模拟(homology modeling)。
我们基于化合物1的结构骨架设计了一系列腺苷的衍生物(图1)。只要药效基团适性分析(pharmacophore fitting)预测该经修饰的化合物具有可接受的活性，该化学修饰即被采用。此外，并利用配体竞争结合试验(competitive ligand binding assay)以确定该设计的化合物确实与A2AR和ENT1具有良好的结合亲和力。最后，这些化合物经进一步测试它们是否可以避免去血清培养的PC12细胞启动凋亡机转，而这将是它们是否具有治疗神经退化疾病的潜力的关键性特征31，32。
附图说明
图1显示CGS、NBTI及其它经设计于N6-及C5’-位置修饰的腺苷衍生物的结构。
图2显示腺苷A2A受体兴奋剂的三维药效基团模型；(A)药效基团模型的结构特征，蓝色：疏水性区域(HP)，金色：芳香环(RA)，红色：氢键给体(HBD)，绿色：氢键受体(HBA)；(B)CGS与药效基团模型的吻合状况；(C)化合物1与药效基团模型的吻合状况；(D)NBTI的吻合状况；(E)化合物6的吻合状况；(F)化合物11的吻合状况。
图3显示人类平衡型核苷转运子(hENT1)抑制剂的三维药效基团模型；(A)药效基团模型的结构特征，金色：芳香环(RA)，绿色：氢键受体(HBA；HBA1与RA的距离为
Figure BDA00001630717100071
HBA2与RA的距离为(B)NBTI与药效基团模型的吻合状况；(C)化合物1的吻合状况；(D)CGS的吻合状况；(E)化合物6的吻合状况；(F)化合物11的吻合状况。
图4是一散点图，其对应显示A2A-R兴奋剂的pKi预测值和测量值；其中实心圆圈表示训练资料的化合物，而空心圆圈表示合成的化合物。
图5是一散点图，其对应显示ENT1抑制剂的pKi预测值和测量值；其中实心圆圈表示训练资料的化合物，而空心圆圈表示合成的化合物。
具体实施方式
人类腺苷A2A受体兴奋剂的药效基团模型
在双药效基团药物设计程序中，人类A2AR(hA2AR)兴奋剂的三维药效基团模型首先被建立以用于设计可供作为hA2AR兴奋剂的化合物。本说明书中选出的训练数据(training set)中包括25个具不同程度的结构变异及hA2AR活性(Ki from 1.2nM to 187μM)的化合物。具有潜力的hA2AR兴奋剂，CGS33，也包括在这个训练数据中。再利用
Figure BDA00001630717100073
公司的
Figure BDA00001630717100074
的
Figure BDA00001630717100075
模块34来建构这些配体的药效基团模型。该建构出来的药效基团是如图2A所示，其显示出四个结构特征，包括：疏水性区域(hydrophobic，HP，显示为青色)、芳香环(ring aromatic，显示为金色)、氢键给体(hydrogenbond donor，HBD，显示为红色)及氢键受体(hydrogen bond acceptor，HBA，显示为绿色)。CGS与建构的药效基团的四个特征皆能良好的吻合(图2B)。相对地，S-(4-硝苯甲基)-6-硫肌苷(S-(4-nitrobenzyl)-6-thioinosine，NBTI)35虽然展现了与腺苷转运子强力的结合力，但因为缺乏一个芳香环的吻合(图2D)而在作为hA2AR配体时，仅具弱亲和力。该设计的双功能配体1、6和11则至少吻合于A2AR兴奋剂的药效基团模型的三个特征(图2C、图2E和图2F)。
平衡型核苷转运子的抑制剂的药效基团模型
为了设计一个同时可作为hA2AR兴奋剂和hENT1抑制剂的双功能化合物，hENT1抑制剂的药效基团模型也同样被建构(图3A)。本说明书中选出的训练资料中包括25个具有不同程度的hENT1抑制活性的化合物，其IC50是在0.29nM-32μM之间。该建构的hENT1抑制剂的药效基团模型仅由三个特征组成，包括两个氢键受体及一个芳香环。该五个化合物(NBTI、1、CGS、6及11)皆可吻合这三个特征。在hA2AR兴奋剂的药效基团及hENT1抑制剂的药效基团之间不同数量的吻合特征反应出中化合物本身的特性。
仔细的检视作为hA2AR兴奋剂的测试资料组中的化合物的结构后，我们发现多数化合物，尤其是被认定具有较高潜力的化合物，包括CGS，在核苷的5’位置带有一个疏水性基团。因此，建构的药效基团被设定必定要包括这个重要的特征。相反的，在作为hENT1抑制剂的测试数据组中，几乎所有化合物的核苷的5’位置皆带有一个极性的羟基团。
两个观察标的药效基团之间的差异也提供了设计双功能化合物的灵感。举例来说，化合物6不能完全吻合A2A受体的药效基团模型的疏水性特征，因此它显然不若可以吻合所有特征的CGS有潜力。然而，化合物6却可以与hENT1模型中的三个特征良好的吻合。
至于化合物11，它可以与所有的特征吻合，包括A2AR药效基团模型的疏水性特征，但它仍同样良好地吻合于hENT1药效基团模型，显示ENT1药效基团模型有较高的耐受性(tolerance)。总结来说，借着比较该两个药效基团模型的特征和化合物吻合的程度，我们可以假设该hA2AR的结合袋(binding pocket)中具有一个重要的疏水性区域，而该hENT1的结合袋可能对于容纳该一系列化合物的核苷的5’位置的疏水性部分(hydrophobic moieties)较为弹性。在缺乏hENT1的结构信息的情形下，药效基团分析提供了我们于设计及了解双功能化合物上所需的信息。
腺苷衍生物的合成
一群代表性的腺苷类似物是依据该药效基团模型而建立(反应流程1)。最甲是自天麻9分离出来的化合物1可高产率地通过使6-氯嘌呤核呋喃糖苷(6-chloropurineribofuranoside)(17)与4-羟基苯甲胺(4-hydroxybenzylamine，以氯化氢盐(hydrochloric salt)的形式)在二异丙基乙胺(diisopropylethylamine)的碱性环境下进行取代反应而获得。因为无法以商业方式取得4-羟基苯甲胺，因此以两个步骤来制备：使4-羟基苯甲醛与羟基胺(hydroxylamine)通过缩合反应(condensation reaction)生成一肟类(oxime)中间产物；接着使该肟类中间产物在Pd/C及HCl的催化下进行氢化反应。类似于化合物1的制备程序，通过6-氯嘌呤核呋喃糖苷与合适的经取代的苯甲胺进行取代反应以制得一系列N6位置经取代的腺苷衍生物2-6。在N6-(3-吲哚乙基)腺苷(N6-(3-indolyethyl)adenosine)(6)的制备中，采用微波辐射来取代传统的加热方法，以缩短反应时间。
在无水丙酮中使N6-(4-甲氧苯甲基)腺苷3与2，2-二甲氧基丙烷(2，2-dimethoxypropane)反应生得相应的化合物3的丙酮缩醛化衍生物(3-acetonide)，其接着与对甲苯磺酰氯(p-toluenesulfonyl chloride)在吡啶(pyridine)存在下反应而得到一混合物，其含有上述3-acetonide的甲苯磺酸(tosylate)衍生物和氯衍生物(反应流程1)。该甲苯磺酸衍生物并不稳定，反之，该氯化合物(化合物7的丙酮缩醛化衍生物(7-acetonide))则得以借着层析法分离，再接续水解而得到化合物7。将上述混合物在未进一步分离的情况下与迭氮化钠(sodium azide)反应，并紧接着经酸催化水解，可生成具迭氮基的化合物8(azido compound 8)。另外，使化合物8的丙酮缩醛化衍生物(8-acetonide)进行施陶丁格反应(Staudinger reduction)可生成一胺类中间产物，该胺类中间产物于酸中去除其2’，3’-异亚丙基团(2’，3’-isopropylidene)后可转换为对应的乙酰胺化合物9(acetamide 9)和磺酰胺化合物10(sulfonamide 10)。
Figure BDA00001630717100091
反应流程1，N6-(4-甲氧苯甲基)腺苷(N6-(4-methoxybenzyl)adenosine)(3)的合成及其将其5’羟基分别取代为氯、迭氮基(azide)、乙酰胺(acetamide)和对甲苯磺酰胺(p-toluenesulfonamide)的反应流程。
Figure BDA00001630717100101
反应流程2，通过速配接合反应(click reaction)修饰5’位置的迭氮基团以获得三唑化合物(triazole compound)。
在另一个反应流程(反应流程2)中，使具迭氮基的化合物8与1-己炔、1-辛炔和3-苯基-1-丙炔进行Cu+催化的1，3-偶极环加成反应(1，3-dipolar cycloaddition，速配接合反应)38可获得三唑衍生物12，13和14。同样地，使化合物8的丙酮缩醛化衍生物(8-acetonide)与炔丙醇(propargyl alcohol)进行速配接合反应可生成一三唑化合物，该三唑化合物的羟基在反应过程中经活化而成为一甲磺酸(mesylate)，再进而被NaBH4还原为一甲基。再将2’，3’-异亚丙基团去除后，即可获得化合物11。
Figure BDA00001630717100102
反应流程3，甲酰胺衍生物(carboxamide derivatives)及四唑衍生物(tetrazolederivatives)的合成。
使6-氯嘌呤核呋喃糖苷的丙酮缩醛化衍生物(acetonide)在2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(2，2，6，6-tetramethylpiperidinyl-1-oxy，TEMPO)39的催化下被二乙酸碘苯((diacetoxyiodo)benzene)氧化生成一羧酸化合物18(carboxylic acid 18)。使该羧酸化合物18与乙胺和氨水进行偶和反应而分别生成酰胺化合物19和20(amide 19，amide 20)。使该化合物19的氯原子被4-羟基苯甲胺取代而丙酮缩醛被水解之后，即制得酰胺化合物15(amide 15)。另一方面，酰胺化合物20与Me2SO、草酰基(oxalyl)、氯和二异丙基乙基胺(i-Pr2Net)反应后则转换为腈化合物21(nitrile 21)40。在氯原子被4-甲氧苯甲基胺取代之后，使氰基与NaN3进行1，3-偶极环加成反应，而使C-5’位置建立出所欲的四唑部分41，再进而于酸性环境下去除2’，3’-异亚丙基团，即可获得化合物16。
N6-及C5’-修饰的腺苷衍生物的生物性评估
经由MDS药理服务中心(MDS Pharma Services)以放射性标定结合能力测试(radioligand binding assay)检测所制得的腺苷类似物的药理学性质。部分代表性的化合物的结合常数(Ki)列于表1。具潜力的A2AR兴奋剂，CGS显示缺乏抑制ENT1的活性，而ENT1抑制剂NBTI则没有与A2AR结合的能力。CGS和NBTI皆不是双功能药物。部分制得的腺苷类似物呈现对A2AR和ENT1的双重活性，尤其是，化合物1、4和6分别对于A2AR和ENT1具有于低微摩尔浓度及小于微摩尔浓度的Ki值。除了化合物11和15，C-5’位置经修饰的腺苷衍生物虽然仍保有对ENT1的高亲和力，但其结合于A2AR的能力都受到破坏。
表1：N6-及C5’-修饰的腺苷衍生物与腺苷受体及转运子的结合活性a。
Figure BDA00001630717100111
Figure BDA00001630717100121
a该放射性标定结合能力测试是由MDS药理服务中心(台北，台湾)依据标准程序进行。b人类腺苷A2A受体。c天竺鼠平衡型转运子1。
我们先前提到，自天麻的甲醇水溶液萃取物中分离得到的化合物1可抑制JNK活性而避免去血清培养的PC12的细胞凋亡机转15。在这个研究中，去血清培养的PC12细胞是以标示的剂量经该化合物处理24小时。然后以MTT测定法监测细胞存活量，并以相对于培养于血清的对照组的存活量的百分比来呈现。根据MTT测定法，在0.01μM的浓度下，化合物4和6恢复PC12细胞因为去血清而诱导的细胞凋亡机转的能力与化合物1相同。总结来说，这些化合物于活化腺苷受体及抑制腺苷转运子的双功能可能协同地提升腺苷的有效浓度，尤其是当这两个蛋白质接近时。
药效基团模型的统计评估
图4显示A2AR兴奋剂的药效基团模型的pKi实验值相对于pKi理论值的散布图。pKi实验值相对于pKi理论值的r2值为0.962，而均方根误差(root-mean-square oferror，RMSE)为0.658kcal/mol。该药效基团模型进一步经由CatScramble模块，并以费含尔随机取样法(Fisher’s randomization test)测试是否具统计显著性。该CatScramble模块随机选取该pKi值19次，以建立数种新的假设(即，药效基团模型)。19个假设中没有一个的取样数据具有低于上述假设的COST值。表2整合了图4所示的化合物吻合的特征，并呈现该化合物上吻合该特征的区域，与该药效基团模型中该特征的中心位置之间的距离偏差。从另一方面来看，表2即是图4的量化表。当一配体与一药效基团吻合，其吻合(或对应)的程度便以一“吻合值”来表示。越高的吻合值表示越高的吻合程度，而计算机是根据两个参数来计算该吻合值：该药药团特征的重要性，以及该分子上的特征与该药效基团模型中的特征的确切位置之间的邻近程度。
表2：以A2A-R兴奋剂的药效基团模型的特征吻合值比较化合物的活性。
表中数字的单位为
Figure BDA00001630717100131
具潜力的A2AR兴奋剂，CGS，与建构的药效基团的四个特征皆吻合，并且其吻合特征区域距离药效基团模型上该特征确切位置的偏差也非常的小。相较于CGS，化合物1欠缺一个与该药效基团模型的特征吻合的疏水性部分，因此呈现降低的亲和力。而NBTI则缺乏一个芳香环部分，并因此失去了激发腺苷A2A受体的活性。这显示在这个药效基团模型中，芳香环特征可能较疏水性部分更重要。化合物6不吻合于药效基团模型的疏水性特征，而化合物11则展现了较高的吻合值。然而，相较之下，上述结合能力测试的结果则指出化合物6(Ki＝4.39μM)展现了高于化合物11(Ki＝41.8μM)约十倍的结合亲和力。这也可以合理解释为是因为化合物6上所有特征的位置与该特征于药效基团上的确切位置的偏差较小。
该建立的hENT1抑制剂的药效基团模型仅具有三个特征，分别是一个芳香环特征以及两个氢键受体。pKi实验值相对于pKi理论值的r2值为0.927，而RMSE为0.85kcal/mol(图5)。该药效图模型进一步经CatScrambler模块测试。该五个化合物(NBTI、1、CGS、6和11)皆可吻合于这三个特征，因此距离该特征的确切位置的偏差需要被比对(表3)。显然地，最具潜力的抑制剂，NBTI，具有最高的吻合值，且对于三个特征皆具有最小的偏差。化合物1、11和6的吻合值分别为6.61、6.4和5.86，与其测量的活性顺序一致。CGS(具有高吻合值：7.1)由于对hENT1不具有抑制活性，因此显然被排除在这个模型之外。然而，CGS是唯一具有得以吻合于核苷部分的芳香环特征的化合物(图3)。因此，谨慎地检视该吻合的官能基团是否确实相同于药效基团分析的测试数据组的化合物上定义该对应特征的官能基团是非常重要的。单单“吻合值”并不能作为合适性的考虑。
表3：以ENT1抑制剂的药效基团模型的特征吻合值比较化合物的活性。
表中数字的单位为
Figure BDA00001630717100141
Figure BDA00001630717100142
结论
我们采用双药效基团模型的方式来设计结合于A2AR讯息传递系统的双功能化合物。基于化合物1的结构骨架，我们设计并合成了一系列的腺苷衍生物，并且，如果药效基团预测修饰后之化合物具有可接受的活性，便针对腺苷进行化学修饰。该配体竞争结合试验的结果证实了设计的化合物确实皆可以适当的亲和力与A2AR和ENT1结合。根据代表性药物T1-11于小鼠的口服剂量，该设计的化合物用于治疗神经退化疾病(包括亨丁顿舞蹈症)的有效量为1.5-2.5mg/kg。此外，不论是速放剂型或是持续释放剂型，该设计的化合物优选的给药途径皆为口服。总结来说，这些化合物经证实具有避免去血清PC12细胞的细胞凋亡的能力，而这些特征关键地指出其具有治疗神经退化疾病的潜力。
实验设计
材料与方法
所有使用的试剂和溶剂皆为试剂等级(reagent grade)，并且，除非特别指明，否则在使用前并不需要额外的纯化步骤。四氢呋喃(tetrahydrofuran)和二乙醚(diethyl ether)是以钠/二苯基酮(Na/benzophenone)蒸馏而得。CH2Cl2是以CaH2蒸馏而得。所有对空气或湿气敏感的实验皆于氩气中进行。所有玻璃仪器于使用前先于烘箱中烘干超过两个小时，再于促干器(desiccators)中冷却至室温。微波反应是以聚焦单模微波仪器(focused singlemode microwave unit)(CEM Discover)进行。该仪器设有一连续聚焦的微波输送装置，该装置并设有一选择式功率输出单元。
熔点是由熔点测定仪(Yanaco micro apparatus)记录。旋光度是以数字旋光测定仪测量(Japan JASCO Co.DIP-1000)。[α]D值的单位为10-1deg cm2g-1。红外线光谱(IR)是以红外线光谱仪(Nicolet Magna 550-II)测得。NMR图谱是经核磁共振仪(Varian UnityPlus-400)(400MHz)测得，此外，化学偏移(chemical shifts，δ)是对应于CHCl3/CDCl3的δH 7.24/δC 77.0(t的中央谱线)、(CH3)2CO/(CD3)2CO的δH 2.05/δC 29.92、CH3OH/CD3OD的δH 3.31/δC 49.0及(CH3)2SO/(CD3)2SO的δH 2.49(m)/δC 39.5(m)，并以ppm来表示。该分裂信号(splitting patterns)则显示为单峰(singlet，s)、二重峰(doublet，d)、三重峰(triplet，t)、四重峰(quartet，q)、多重峰(multiplet，m)及宽峰(broad，br)。偶合常数(coupling constants，J)是以Hz为单位。电喷洒质谱(ESI-MS)实验是以高解析质谱仪(Bruker Daltonics BioTOFIII)进行。薄层层析分析实验(Analytical thin-layer chromatography，TLC)是于薄层层析板(E.Merck硅胶60F254plates，0.25mm)上进行，而化合物是以紫外光、对甲氧苯甲醛(anisaldehyde)喷剂或茚三酮(ninhydrin)喷剂显示。管柱层析法是以填充有70-230目的硅胶的管柱来进行。使用于A2A-R及ENT1测试的化合物是经HPLC纯化并于280nm的吸收波长下测定其纯度为≥95％。
药效基团模型的建立
使用
Figure BDA00001630717100151
公司所出的
Figure BDA00001630717100152
的
Figure BDA00001630717100153
模块来建立人类A2AR兴奋剂和人类ENT 1抑制剂的药效基团模型。关于测试数据组的化合物的化学结构及其与人类A2AR(或人类ENT 1)的结合亲和力的信息，是自文献中收集而得41-44。这些用来建立药效基团的化合物的活性必须涵盖至少四个数量级，而且在每一个对数级的化合物数目至少要有三个23，45。我们也建议，如同该测试数据组，选择具有大的化学变异性的化合物45。每一个化合物是预先以化学绘图软件(ChemDraw)绘制出草图，再输入Catalyst 4.11中，而后利用“Best”选项来产生构型。在软件中，使用轮询算法自所有具有低能量的结构中得到250个能量不高于最低能量结构20.0kcal/mol的结构。选择了五个分子特征，分别是：疏水性(HPh)、氢键受体(HBA)、氢键给体(HBD)、正离子性原子(positively ionizable atom，PI)、负离子性原子(negatively ionizable atom，NI)。所有的这些化合物皆会加载Catalyst软件的电子表格(spreadsheet)，并且设定预设的不准确度为3。其它设定参数则维持默认值。
N6-(4-羟基苯)腺苷(1)9
将氢氯酸羟胺(hydroxylamine hydrochloride，1.29g，18.6mmol)及醋酸钠(sodiumacetate，1.67g，20.4mmol)加入4-羟基苯甲醛(1.25g，10.2mmol)的乙醇溶液(20mL)。于室温下搅拌该反应的混合物6个小时。然后借着降低压力使乙醇排除。接着，将水加入残存物中，并以Et2O(3×)萃取。将所得的有机层以MgSO4干燥。于减压下以旋转蒸发器(rotary evaporation)使挥发物质移除后，使残存物于CH2Cl2中再结晶，便可得4-羟基苯甲醛的肟类衍生物(1.3g，93％)，C7H7NO2，其为淡黄色固体，熔点(mp)为92.0-93.6℃。
在大气压力下及10％Pd/C(80mg)存在下，使一含上述肟类衍生物的溶液(342mg，2.5mmol)及一于乙醇中的浓缩氢氯酸(1mL)进行4个小时的氢化作用(hydrogenation)。使反应混合物经硅钙石(Celite)过滤。将滤出液浓缩以产出4-羟基苯甲胺的氯化氢盐衍生物，其为淡黄色固体，且在用于下一个步骤前，不需再额外纯化。
将4-羟基苯甲胺(395mg，以该氯化氢盐的形式)、6-氯嘌呤核苷(6-chloropurineriboside，143mg，0.5mmol)及于1-丙醇中的二异丙基乙胺(DIEA，2mL，12mmol)混合为一混合物，并将该混合物于70℃加热6个小时。接着，降低压力使该混合物浓缩后，再加水研制形成白色沉淀。该白色沉淀经过滤后便可得到标题所述的化合物1(151mg，81％)。经搭载Inertsil ODS-3管柱(4.6×250mm，5μm)的HPLC测定该产物的纯度为＞99％。此外，该产物(C17H19N5O5)为白色粉末，熔点为208.7-209.2℃(文献9记载为216-219℃)；[α]20 D＝-64.5(DMSO，c＝1)(文献9记载[α]25 D＝-87(MeOH，c＝0.1))；TLC(MeOH/EtOAc(1∶9))Rf＝0.3；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ9.22(1H，s)，8.34(1H，s)，8.30(1H，br s)，8.18(1H，s)，7.12(2H，d，J＝8.0Hz)，6.65(2H，d，J＝8.0Hz)，5.86(1H，d，J＝5.6Hz)，5.41(2H，m)，5.18(1H，d，J＝5.6Hz)，4.60(2H，m)，4.13(1H，q，J ＝4.6，7.4Hz)，3.95(1H，q，J ＝3.4，6.2Hz)，3.66(1H，m)，3.53(1H，m)；13C NMR(DMSO-d6，400MHz)δ155.3，153.6，151.6，147.6，139.1，129.5，127.9(2×)，119.2，114.4(2×)，87.6，85.6，73.3，70.5，61.5，42.4；以ESI-HRMS计算质荷比为374.1412[M+H]+(C17H20N5O5理论值为：374.1459)。
N6-(3-吲哚乙基)腺苷(6)
将一6-氯嘌呤脱氧核苷(6-chloropurine ribonucleoside)溶液(71mg，0.25mmol)，及于乙醇(3mL)中的色胺(tryptamine，101mg，0.63mmol)和二异丙基乙胺(0.24mL，2.88mmol)置于一圆底烧瓶中。将该烧瓶置于一聚焦单模微波仪器的槽室中，并以150W的强度照射处理10分钟以使乙醇回流(refluxing)。接着以旋转蒸发器浓缩该混合物，并借着快速层析仪(flash chromatography；硅胶，MeOH/EtOAc(1∶9))纯化残存物，即可获得化合物6(85mg，83％)。经搭载HC-C18管柱(Agilent，4.6×250mm，5μm)的HPLC(液相采用溶离梯度为30-60％的CH3CN水溶液)测定该产物的纯度为＞99％。此外，该产物(C20H22N6O4)为白色粉末，熔点为187.0-187.2℃；[α]20 D＝-55.7(CH3OH，c＝1.0)；TLC(MeOH/EtOAc(1∶9))Rf＝0.41；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ10.78(1H，s)，8.33(1H，s)，8.25(1H，s)，7.96(1H，br s)，7.61(1H，d，J＝7.2Hz)，7.32(1H，d，J＝9.2Hz)，7.18(1H，s)，7.05(1H，t，J＝8.0Hz)，5.80(1H，d，J＝6.0Hz)，5.47-5.44(2H，m)，5.20(1H，d，J＝4.4Hz)，4.61(1H，d，J＝5.6Hz)，4.14(1H，d，J＝2.8Hz)，3.96(1H，d，J＝3.2Hz)，3.77(1H，br s)，3.69-3.52(2H，m)，3.01(2H，t，J＝7.2Hz)；13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ154.3，152.2，148.0，139.5，136.0，127.1，122.4，120.8，119.6，118.3，118.1，111.7，111.2，87.9，85.8，73.4，70.6，61.6，40.5，25.1；以ESI-HRMS计算质荷比为411.1750[M+H]+(C20H23N6O4理论值为：411.1775)。
5’-迭氮基-5’-脱氧-2’，3’-O-异亚丙基-N6-(4-甲氧苯甲基)腺苷(化合物8的丙酮缩醛化衍生物)
以注射器将于无水吡啶(6.0mL)中的对甲苯磺酰氯(6.3g，34.6mmol)逐滴地加入于无水吡啶(36mL)中的环状缩醛化的N6-(4-甲氧苯甲基)腺苷(环状缩醛化的化合物3，2.96g，6.9mmol)中。于室温下搅拌该混合物6个小时。然后借着减压使吡啶移除，再以CH2Cl2和H2O萃取残存物。接着，使有机层经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩而获得一磺酸盐衍生物和氯衍生物的混合物(5∶1)，如同1H NMR图谱所示。
将上述制得的混合物溶解于无水DMF(70mL)中，并加入迭氮化钠(1.34g，20.6mmol)。再将该混合物于80℃下搅拌6个小时，然后减压以将其浓缩。接着，以CH2Cl2和H2O萃取残存物，再使有机层经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩以获得一淡黄色油状物。该淡黄色油状物进一步经快速层析法(硅胶；CH2Cl2/MeOH(100∶1))纯化而获得化合物8的丙酮缩醛化衍生物(8-acetonide，653mg，总产率：21％)。该产物(C21H24N8O4)为无色油状物；TLC(EtOAc/Hexane(6∶4))Rf＝0.39；[α]23 D＝+5.0(EtOAc，c＝1.0)；IRvmax(neat)3280，2987，2931，2101，1618，1512，1478，1375，1330，1296，1248，1211，1154，1091cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.38(1H，br s)，7.72(1H，br s)，7.26(2H，d，J ＝8.8Hz)，6.84(2H，d，J＝8.8Hz)，6.37(1H，br s)，6.06(1H，d，J＝2.0Hz)，5.46-5.44(1H，m)，5.07-5.05(1H，m)，4.77(2H，br s)，4.38-4.35(1H，m)，3.77(3H，s)，3.51-3.62(2H，m)，1.61(3H，s)，1.39(3H，s)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ158.7，154.5，153.1，147.9，139.0，130.2，128.8(2×)，120.1，114.4，113.8(2×)，90.4，85.6，83.9，82.0，55.2，52.2，43.7，29.7，27.1，25.3；以ESI-HRMS计算质荷比为453.1999[M+H]+(C21H24N8O4理论值为：453.1999)。
5’-乙酰胺-5’-脱氧-N6-(4-甲氧苯甲基)腺苷(9)
在室温下，使含迭氮基的化合物8的丙酮缩醛化衍生物(95mg，0.21mmol)与三苯膦(triphenylphosphine，66mg，0.24mmol)于THF/H2O(10∶1，2mL)中搅拌4.5个小时。接着，减压使该混合物浓缩。以CH2Cl2和H2O萃取(taken up)残存物，再以氯化氢溶液(HCl)使之酸化至pH＝2。然后，将水层分离，以饱和NaHCO3水溶液中和后，再以CH2Cl2进行萃取。接着，使有机萃取物经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩以获得一粗制胺类产物。
使该粗制胺类产物与乙酸酐(98.6μm，1.05mmol)于无水吡啶(0.2mL)中反应。于室温下搅拌该混合物1.5个小时，再减压使其浓缩。接着，以CH2Cl2和H2O萃取残存物，再使有机层经MgSO4干燥、经过滤、经浓缩、再经快速层析法(硅胶；CH2Cl2/MeOH(98∶2))纯化，而获得化合物9的丙酮缩醛化衍生物(56mg，两步骤的产率为57％)。经搭载HC-C18管柱(Agilent，4.6×250mm，5μm)的HPLC(液相采用溶离梯度为30-60％的CH3CN水溶液)测定该产物的纯度为＞99％。该产物(C23H28N6O5)为一无色油状物；TLC(CH2Cl2/MeOH(98∶2))Rf＝0.2；[α]25 D＝-146.6(CHCl3，c＝1.0)；IRvmax(neat)3280，3062，2989，2930，2835，2358，1667，1620，1513，1376，1336，1296，1246，1215，1096，1034cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.36-8.38(2H，m)，7.73(1H，s)，7.28(2H，d，J＝8.8Hz)，6.86(2H，d，J＝8.8Hz)，6.15(1H，br s)，5.77(1H，d，J＝4.8Hz)，5.26(1H，t，J＝4.8Hz)，4.81(1H，dd，J＝4.0，2.4Hz)，4.76(2H，br s)，4.47-4.48(1H，m)，4.11-4.17(1H，m)，3.79(3H，s)，3.24(1H，d，J＝14.4Hz)，2.15(3H，s)，1.61(3H，s)，1.34(3H，s)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ170.5，158.8，154.8，152.7，147.7，139.7，130.0，128.9(2×)，121.1，114.6，113.9(2×)，92.5，83.3，82.2，81.3，55.3，43.9，41.1，27.6，25.4，23.2；以ESI-HRMS计算质荷比为469.2193[M+H]+(C23H28N6O5理论值为：469.2190)。
在室温下使该化合物9的丙酮缩醛化衍生物(17.2mg，0.037mmol)于3M HCl/THF(1∶1，0.1mL)中搅拌14个小时，然后再以饱和NaHCO3水溶液中和。接着减压使该混合物浓缩，再以CH2Cl2和H2O萃取残存物。接着，使有机层经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩而获得标题所示的化合物9(11mg，70％)。经搭载HC-C18管柱(Agilent，4.6×250mm，5μm)的HPLC(液相采用20分钟内溶离梯度为30-60％的CH3CN水溶液)测定该产物的纯度为＞99％。该产物(C20H24N6O5)为白色粉末；熔点为121.1-121.6℃；TLC(CH2C12/MeOH(9∶1))Rf＝0.5；[α]25 D＝-108.7(THF，c＝0.89)；IR vmax(neat)3275，3071，2923，2852，2360，1621，1512，1375，1339，1297，1245，1175，1126，1076cm-1；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ8.76(1H，s)，8.27(1H，s)，7.24(2H，d，J＝8.4Hz)，6.81(2H，d，J＝8.4Hz)，6.54(1H，s)，5.70(1H，d，J＝5.6Hz)，4.72(3H，d，J＝5.6Hz)，4.23(1H，s)，4.18(1H，s)，3.98-4.03(1H，m)，3.75(3H，s)，3.13(1H，d，J ＝14.0Hz)，2.02(3H，s)；13C NMR(DMSO，100MHz)δ169.4，157.9，154.3，152.3，148.3，140.2，131.8，128.4(2×)，119.8，113.5(2×)，8/.9，83.6，72.6，/1.3，55.1，42.4，41.1，22.7；以ESI-HRMS计算质荷比为427.1727[M+H]+(C20H24N6O5理论值为：427.1730)。
5’-脱氧-5’-(4-甲基-1，2，3-三唑-1-基)N6-(4-甲氧苯甲基)腺苷(11)
在室温下将含迭氮基的化合物8的丙酮缩醛化衍生物(313mg，0.69mmol)、CuSO4·5H2O(24.9mg)、抗坏血酸钠(sodium ascorbate，61.4mg)和炔丙醇于H2O/t-BuOH(1∶1，7mL)中搅拌12个小时以成为一混合物，然后减压使该混合物浓缩。接着，以CH2Cl2和H2O萃取残存物。接着，使有机层经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩而产出一丙酮缩醛化的三唑化合物(triazole acetonide，～220mg)，其为一无色油状物；TLC(CH2Cl2/MeOH(9∶1))Rf＝0.5；以ESI-HRMS计算质荷比为509.2267[M+H]+(C24H28N8O5理论值为：509.2261)。
在室温下将前面制得的三唑化合物与三乙胺(triethylamine，0.15mL，1.08mmol)和甲磺酰氯(methylsulfonyl chloride，0.08mL，1.08mmol)于无水CH2Cl2(4.3mL)中搅拌两个小时。接着减压使该混合物浓缩，再以CH2Cl2和H2O萃取残存物。接着，使有机层经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩而产出一甲磺酸化合物(C25H30N8O7SNa)，其为无色油状物；TLC(EtOAc/Hex(4∶1))Rf＝0.45；以ESI-HRMS计算质荷比为609.1876[M+H]+(C25H30N8O7SNa理论值为：609.1856)。
在0℃下使上述甲磺酸化合物与NaBH4(24.5mg，0.65mmol)于DMF中反应，然后于60℃下加热6个小时。接着减压使该混合物浓缩，再以CH2Cl2和H2O萃取残存物。接着，使有机层经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩而产出一化合物11的丙酮缩醛化衍生物，其为无色油状物；TLC(EtOAc/Hex(4∶1))Rf＝0.25；以ESI-HRMS计算质荷比为493.2312[M+H]+(C24H28N8O4理论值为：493.2312)。
于室温下将上述化合物11的丙酮缩醛化衍生物于3M的HCl/THF (1∶1，0.33mL)中搅拌14个小时，然后以饱和NaHCO3水溶液将其中和。接着减压使该混合物浓缩，再将残存物溶解于THF之后，经过滤、浓缩而得到标题所示的化合物11(48.1mg，整体产率为25％)。经搭载HC-C18管柱(Agilent，4.6×250mm，5μm)的HPLC(液相采用溶离梯度为30-60％的CH3CN水溶液)测定该产物的纯度为98％。该产物(C21H24N8O4)为白色粉末；熔点为183.0-183.2℃；TLC(CH2Cl2/MeOH(9∶1))Rf＝0.12；[α]27 D＝+20.3(CH3OH，c＝0.45)；IRvmax(neat)3217，2921，2850，2685，1620，1513，1470，1337，1297，1244，1176，1111，1058cm-1；1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.22(1H，s)，7.99(1H，s)，7.45(1H，s)，7.31(2H，d，J＝8.8Hz)，6.87(2H，d，J＝8.8Hz)，5.96(1H，d，J＝4.0Hz)，4.82-4.68(5H，m)，4.46(1H，t，J＝4.0Hz)，4.34(1H，q，J＝4.0Hz)，3.77(3H，s)，2.15(3H，s)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ158.7，154.2，152.9，148.0，142.8，138.8，130.1，128.8(2×)，123.1，119.6，113.8(2×)，89.3，82.2，73.4，70.8，55.2，50.9，43.9，10.5；以ESI-HRMS(负离子扫描)计算质荷比为451.1843[M-H]-(C21H24N8O4理论值为：451.1842)。
3，4-二羟基-5-[6-(4-羟基苯甲基胺基)-嘌呤-9-基]-四氢呋喃-2-羧酸酰乙胺(15)
在40℃下，使6-氯嘌呤核呋喃糖苷的丙酮缩醛化衍生物(化合物17的丙酮缩醛化衍生物，158mg，0.48mmol)与PhI(OAc)2(509mg，1.56mmol)及2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO，15.4mg，0.1mmol)于除气(degassed)的CH3CN/H2O溶液(1∶1，2.6mL)中搅拌4个小时。接着减压使该混合物浓缩而产出粗制的酸性化合物18。
于室温下，使该粗制的酸性化合物与乙胺(117mg，以氯化氢盐的形式)、邻-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸(O-(benzotriazol-1-yl)-N，N，N’，N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate；HBTU，375mg，0.72mmol)及二异丙基乙胺(0.5ml，2.89mmol)于无水DMF(11.6mL)中反应14个小时。接着，减压使该混合物浓缩后，以CH2Cl2和H2O萃取残存物，并使有机层经MgSO4干燥、经过滤、经浓缩、再经快速层析法(硅胶；EtOAc/hexane(1∶1))纯化，便获得一无色油状的酰胺产物19。
接着，于70℃下，使该酰胺产物与4-羟基苯甲胺(385mg，2.4mmol，以氯化氢盐的形式)及二异丙基乙胺(2.8mL，16.9mmol)于1-丙醇(28mL)中反应2个小时。然后，减压使该混合物浓缩后，以CH2Cl2和H2O萃取残存物，并使有机层经MgSO4干燥、经过滤、经浓缩、再经快速层析法(硅胶；CH2Cl2/MeOH(97∶3))纯化，而获得化合物15的丙酮缩醛化衍生物(179mg，82％)。该产物(C23H28N6O5)为无色油状物；TLC(EtOAc/hexane(4∶1))Rf＝0.13；[α]22 D＝-32.0(EtOAc，c＝1.0)；IRvmax(neat)3347，3103，2982，2933，1732，1667，1615，1516，1479，1461，1376，1332，1295，1245，1212，1154，1088cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ9.01(1H，br s)，8.35(1H，br s)，7.81(1H，s)，7.14(1H，br s)，7.04(2H，d，J＝8.0Hz)，6.68(2H，d，J＝8.0Hz)，6.49(1H，t，4.8Hz)，6.03(1H，d，J＝2.4Hz)，5.33-5.38(2H，m)，4.70(3H，s)，3.09-3.16(2H，m)，1.62(3H，s)，1.37(3H，s)，0.90(3H，t，J＝7.2Hz)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ168.7，155.8，154.2，153.1，147.7，139.1，128.8(3×)，119.6，115.4(2×)，114.3，91.6，85.6，83.3，82.4，43.9，34.0，27.0，25.1，14.2；以ESI-HRMS计算质荷比为455.2037[M+H]+(C22H26N6O5理论值为：455.2043)。
于室温下，使该化合物15的丙酮缩醛化衍生物(26mg，0.057mmol)于1MHCl/THF(1∶1，0.3mL)中搅拌16个小时，然后以饱和的NaHCO3水溶液进行中和。于浓缩后，使该残存物与水研制(triturated)而得到标题所示的化合物15。该化合物15接着经MeOH(14.65mg，62％)再结晶。该产物(C19H22N6O5)为白色粉末，熔点为179.7-180.5℃；TLC(EtOAc)Rf＝0.04；[α]23 D＝-27.7(MeOH，c＝1.0)；IRvmax(neat)3256，2688，2360，1618，1515，1335，1294，1232，1128，1052cm-1；1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.29(1H，s)，8.22(1H，s)，7.20(2H，d，J＝8.4Hz)，6.73(2H，d，J＝8.4Hz)，6.00(1H，d，J＝7.6Hz)，4.76-4.73(1H，m)，4.70(2H，br s)，4.46(1H，s)，4.30-4.31(1H，m)，3.36(2H，q，7.2Hz)，1.21(3H，t，7.2Hz)；13C NMR(CD3OD，100MHz)δ171.8，157.5，155.8，153.6，149.1，141.9，130.5，129.9(2×)，121.3，116.2(2×)，90.5，86.3，74.9，73.4，44.9，35.2，15.3；以ESI-HRMS计算质荷比为413.1573[M-H]+(C19H21N6O5理论值为：413.1573)；元素分析的结果为：C，52.88；H，5.40；N，19.44(C19H22N6O5·H2O理论值：C，52.77；H，5.59；N，19.43)。
2-[6-(4-甲氧苯甲基胺基)-嘌呤-9-基]-5-(1H-四唑-5-基)-四氢呋喃-3，4-二醇(16)
在50℃下，将化合物17的丙酮缩醛化衍生物(ca.3.98mmol)经PhI(OAc)2/TEMPO氧化而得的粗制酸性化合物18于无水DMF((40mL)中与氯化铵(426mg，7.96mmol)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexa-fluorophosphate；PyBOP，3.07g，5.97mmol)、羟苯并三唑(hydroxybenzotriazole，HOBt，807mg，5.97mmol)及二异丙基乙胺(2.5mL，15.9mmol)反应14个小时。接着，减压使该混合物浓缩后，以CH2Cl2和H2O萃取残存物，并使有机层经MgSO4干燥、经过滤、经浓缩、再经快速层析法(硅胶；EtOAc/hexane(1∶1至4∶1))纯化，而获得一无色油状的酰胺产物20。
在-78℃下，将一溶于CH2Cl2(10mL)的二甲基亚砜溶液(0.85mL，11.9mmol)加入一溶于CH2Cl2(10mL)的草酰氯溶液(0.7mL，7.96mmol)中。搅拌该混合物30分钟，然后加入一溶于CH2Cl2(20mL)的酰胺化合物20(ca.3.98mmol)。再于-78℃下搅拌该混合物30分钟，然后加入二异丙基乙胺(2.6mL，15.9mmol)。于搅拌1个小时之后，经由TLC试验检测出腈类化合物21的形成。以CH2Cl2和H2O萃取该混合物，并使有机层经MgSO4干燥、经过滤、经浓缩、再经快速层析法(硅胶；EtOAc/hexane(2∶3))纯化，而产出一无色油状的腈类化合物21(863mg)，该腈类化合物21并混杂有些许的HOBt。
于70℃下，将上述制得的腈类化合物(863mg，2.68mmol)与4-甲氧苯甲基胺(1.84g，13.4mmol)及二异丙基乙胺(15.5mL)于1-丙醇(26mL)中反应4个小时。然后，减压使该混合物浓缩后，以CH2Cl2和H2O萃取残存物，并使有机层经MgSO4干燥、经过滤、经浓缩、再经快速层析法(硅胶；CH2Cl2/MeOH(300∶1至150∶1))纯化，而获得化合物22(905mg，整体产率为54％)。该产物(C21H22N6O4)为无色油状物；TLC(EtOAc/hexane(4∶1))Rf＝0.55；[α]26 D＝+25.8(EtOAc，c＝1.0)；IRvmax(neat)3373，3282，2990，2925，2853，1679，1618，1512，1465，1376，1331，1295，1249，1212，1135，1086cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.39(1H，br s)，7.64(1H，br s)，7.26(2H，d，J＝10.4Hz)，6.83(2H，d，J＝10.4Hz)，6.54(1H，t，J＝5.6Hz)，6.13(1H，s)，5.77(1H，d，J＝4.0Hz)，5.68(1H，dd，J＝1.6，4.0Hz)，4.95(1H，d，J ＝1.6Hz)，4.75(2H，br s)，3.79(3H，s)，1.57(3H，s)，1.42(3H，s)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ158.8，154.5，153.2，148.2，138.9，130.2，128.9(2×)，119.7，115.9，114.5，113.9(2×)，91.6，84.6，83.9，75.1，55.3，44.0，26.6，25.1；以ESI-HRMS(负离子扫描)计算质荷比为421.1612[M-H]-(C21H22N6O4理论值为：421.1624)。
将于DMF(20mL)中的腈类化合物22溶液(905mg，2.14mmol)以及NH4Cl(429mg，8.04mmol)冷却至0℃后，加入NaN3(523mg，8.04mmol)。接着，将冰浴移除，使该混合物于40℃加热1个小时，然后再缓慢地增温至90℃，并维持于90℃下搅拌该混合物9个小时。接着，将该混合物冷却，并借着减压使之浓缩。接着，使其溶解于EtOAc后，经NaHCO3水溶液(pH＝8)萃取，然后添加HCl溶液(1M)至水层以将其酸化至pH＝2后，再以CH2Cl2萃取。接着，使有机层经MgSO4干燥、经过滤、再经浓缩而得到一个实质上无杂质的四唑产物，即化合物16的丙酮缩醛化衍生物。该产物(C21H23N9O4)为无色油状物(460mg，产率为46％)；TLC(CH2Cl2/MeOH(9∶1))Rf＝0.25；[α]27 D＝+13.2(EtOAc，c＝1.0)；IRvmax(neat)3361，2926，2852，1613，1513，1481，1375，1333，1293，1249，1210，1176，1154，1101，1034cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.90(1H，br s)，7.68(1H，br s)，7.35(2H，d，J＝8.4Hz)，6.86(2H，d，J＝8.4Hz)，6.83(1H，br s)，6.18(1H，s)，5.85(1H，s)，5.73(1H，d，J＝6.0Hz)，5.49(1H，d，J＝6.0Hz)，4.92(1H，dd，J＝6.8，7.6Hz)，4.39(1H，dd，J＝4.0，10.4Hz)，3.77(3H，s)，1.69(3H，s)，1.43(3H，s)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ158.4，154.9，152.9，152.6，146.2，138.5，129.5，129.2(2×)，118.4，114.2，113.7(2×)，93.4，85.9，83.7，82.3，55.4，44.1，27.1，25.2；以ESI-HRMS(负离子扫描)计算质荷比(C21H23N9O4理论值为：464.1795)为464.1786[M-H]-。
于室温下使化合物16的丙酮缩醛化衍生物(460mg，0.99mmol)于3M的HCl/THF(1∶1，0.1mL)中搅拌14个小时，然后以饱和的NaHCO3水溶液进行中和。接着，减压使该混合物浓缩后，以THF萃取(taken up)残存物，再使其过滤、浓缩而得到标题所示的化合物16(320mg，76％)。经搭载HC-C18管柱(Agilent，4.6×250mm，5μm)的HPLC(液相采用20分钟内溶离梯度为30-60％的CH3CN水溶液)测定该产物的纯度为99％。该产物(C18H19N9O4)为白色粉末；熔点为210.0-210.6℃；TLC(CH2Cl2/MeOH(9∶1))Rf＝0.05；[α]26 D＝-25.8(THF，c＝1.0)；IR vmax(neat)3397，2841，2692，1623，1511，1475，1419，1339，1302，1236，1180，1124，1045cm-1；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ8.82(1H，s)，8.30(1H，br s)，8.20(1H，s)，7.26(2H，d，J＝8.0Hz)，6.83(2H，d，J＝8.0Hz)，6.08(1H，d，J＝5.6Hz)，5.53(1H，d，J＝6.0Hz)，5.46(1H，d，J＝2.8Hz)，5.18(1H，s)，4.91(1H，d，J＝5.2Hz)，4.62(2H，br s)，4.20(1H，s)，3.69(3H，d，J＝2.0Hz)；13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ159.9，157.4，153.7，151.9，138.8，131.5，127.9(2×)，113.1(2×)，85.9，79.1，75.4，74.3，54.6，41.9；以ESI-HRMS(负离子扫描)计算质荷比为427.1727[M-H]-(C18H19N9O4理论值为：427.1730)。
放射性标定结合测试
放射性标定结合测试是经由MDS药理服务中心(MDS Pharma Services)以放射性标定结合能力测试(radioligand binding assay)进行。在A2A受体的结合能力测试中46，将过量表现人类A2A受体的HEK293细胞的膜蛋白收集于25℃的含有3H-CGS21680(50nM)的反应缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 7.4)，10mM MgCl2，1mM EDTA，和2U/mL腺苷去胺酶]中处理90分钟。添加50μM的腺苷-5′-N-乙基羧基酰胺(NECA)以评估非特异性结合的状况。
腺苷转运子的结合能力测试则以前面所述的方式进行47。将邓肯-哈特利豚鼠(Duncan Hartley derived guinea pig)大脑皮质的膜质部分与3H-标定的NBTI(0.5nM)共同培养于25℃的含有50mM Tris-HCl(pH 7.4)的缓冲液中30分钟。添加5μM NBTI以评估非特异性结合的状况，NBTI在0.5nM的浓度下仅会对ENT1产生抑制效果，因此对于平衡型核苷转运子1(ENT1)是具有高亲和力的抑制剂48。该反应可经GF/B玻璃纤维过滤及相同的缓冲液清洗后终止。
MTT代谢分析
购买自ATCC(Manassas，VA，USA)的PC12细胞是以含10％的马血清及5％的胎牛血清的DMEM培养液(Dulbecco′s modified Eagle′s me dium)维持，并培养于37℃的CO2培养箱(5％)。存活量是如公知地以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二酚四唑溴化物(MTT)代谢分析进行49，50。简要地说，先将培养于150-mm培养盘中的细胞以PBS清洗三遍，然后在使其再悬浮于DMEM中。接着，将悬浮中的细胞接种于96孔盘中(每个培养孔含1×104个细胞)，并经或不经指定的试剂处理。培养24个小时之后，将MTT(0.5mg/mL)加入培养基中，并再培养3个小时。接着，去除培养基后，以DMSO溶解每个培养孔中四唑环经活细胞的粒腺体分裂产出的沉淀物(formazan crystals)。然后通过酵素免疫微盘分析仪(micro-enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)reader)于波长570/630nm下测量每一个培养孔的吸光值。
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Claims (16)

1.一种化合物，其具有一腺苷结构骨架，该腺苷结构骨架于C-6及C-5’位置具有如以下所示的修饰：
其中，n为1至3，R1选自由(经取代的)苯、芳烃及杂环所组成的群组；R2选自由卤素、羟基、烷氧基、迭氮基、胺基、(经取代的)胺基、酰胺基、巯基、磺酰基、三唑基和氰基所组成的群组；及R3选自由(经取代的)羰基、羧酸；(经取代的)脲基、氰基、(经取代的)炔基及(经取代的)四唑基所组成的群组。
2.如权利要求1所述的化合物，其具有以下结构：
Figure FDA00001630717000012
其中，该经取代的杂环含有5元或6元环及该并合杂环含有氮、氧或硫作为杂原子，以及该取代基是选自氢、卤素(氟、氯、溴和碘)、羟基、烷基(含1至6个碳)、三氟甲基和(经取代的)苯基团所组成的群组。
3.如权利要求2所述的化合物，其中上述杂环是选自由吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、六氢吡啶、六氢吡、吲哚、苯并呋喃、苯并塞吩和喹啉所组成的群组。
4.如权利要求1所述的化合物，其具有以下结构：
其中，该芳香环是选自由苯、萘、蒽、菲和芘所构成的群组；当n＝1，该苯甲基团可选择性地具有选自由卤素(氟、氯、溴和碘)、烷基(甲基、乙基、丙基、丁基和三氟甲基)、苯基、羟基、烷氧基(OR，其中R＝CH3、C2H5、C3H7或C4H9)、胺基(NRR’，其中R和R’代表H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9或苯基)、酰胺基(NHCOR，其中R＝CH3、C2H5、C3H7或C4H9)、硝基、磺酸盐、烷酰基(COR，其中R＝H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9或苯基)和羧酸盐(CO2R，其中R＝H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9或苯基)所构成的群组的取代基。
5.如权利要求1所述的化合物，其具有以下结构：
Figure FDA00001630717000021
其中，R3是选自由氢、烷基(含1至4个碳)和(经取代的)苯基所构成的群组。
6.如权利要求1项所述的化合物，其具有以下结构：
Figure FDA00001630717000022
其中，R4是选自由氢、卤素(氟、氯、溴和碘)、羟基、烷基(含1至6个碳)、三氟甲基和(经取代的)苯基所构成的群组。
7.如权利要求1所述的化合物，其具有以下结构：
Figure FDA00001630717000023
其中，R5是选自由氢和烷基(含1至4个碳)所构成的群组。
8.如权利要求4所述的化合物，其具有以下结构：
Figure FDA00001630717000031
其中，R是选自由氢、卤素(氟、氯、溴和碘)、烷基(含1至4个碳)、三氟甲基、苯基、羟基、烷氧基(含1至4个碳)、(经取代的)胺基、(经取代的)酰胺基、硝基、磺酸盐、羰基和羧酸盐所构成的群组，且其是位于邻位、间位或对位；其中，x为1至5。
9.一种治疗神经退化疾病的方法，其包含施予需要治疗的对象一有效量的至少一种权利要求1所述的化合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述神经退化疾病是一种蛋白质错误折迭疾病。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述神经退化疾病是亨丁顿舞蹈症。
12.一种组合物，其包含如权利要求1所述的化合物及一医药可接受的载体。
13.一种化合物，其具有下列结构：
14.一种治疗神经退化疾病的方法，其包含施予需要治疗的对象一有效量的至少一种权利要求13所述的化合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述神经退化疾病是一种蛋白质错误折迭疾病。
16.如权利要求14所述的方法，其中，所述神经退化疾病是亨丁顿舞蹈症。
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