CN101518551A - 一种灵芝孢子油脂肪乳剂及其质量控制方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子油脂肪乳剂及其质量控制方法与应用。其包括灵芝孢子油2～25％，乳化剂0.5～10％，等渗剂0.2～5％，余量为水；调节脂肪乳剂的最终pH为6～9。本发明的质量控制方法通过准确测定制剂中1，2－油酸－3－棕榈酸甘油三酯和甘油三油酸酯的含量，通过准确测定制剂中的麦角甾醇含量，作为该产品质量控制的方法和依据。利用指纹图谱，从色谱的整体特征面貌上把握产品的质量。本发明产品活性成分清楚，生物活性好，能用于治疗肿瘤、提高机体免疫能力，提高放疗和化疗肿瘤患者的生存质量并减轻治疗后的药物毒副反应。本发明产品特别适用于动、静脉注射，灵芝孢子油直接进入人体血液，起效快，吸收较完全，安全性高，质量可靠，毒副反应低。

Description

一种灵芝孢子油脂肪乳剂及其质量控制方法与应用

技术领域

本发明涉及灵芝孢子油技术领域，具体的说，涉及一种灵芝孢子油脂肪乳剂及其质量控制技术和药物用途。

背景技术

从八十年代开始，日本已开始对灵芝进行抗肿瘤方面的基础研究；到九十年代，美国、日本等国将灵芝应用至临床，用于癌症及AIDS(艾滋病)治疗方面，得到了国际研究学者的广泛注意。灵芝是担子菌纲多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝G.lucidum.karst和紫芝GjaponicumLloyd的总称，具有扶正固本等功效，被《本经》称为上品。灵芝孢子(Ganoderma lucidiumspore)是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，其药用价值也正日益受到重视。灵芝孢子的化学成分复杂，有以下几类：脂肪酸类、甾醇类、三萜类、生物碱类、内酯、蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、和无机离子类等。现代药理研究表明灵芝孢子油是灵芝孢子抗肿瘤的的主力。本研究组通过对灵芝孢子油研究和测试分析表明，灵芝孢子油主要成分为灵芝孢子油酯类、脂肪酸类、灵芝酸类和麦角甾醇类等多种成分组成。

现已有以灵芝孢子油为主成分的灵芝孢子油软胶囊上市，适用于肿瘤的抑制与预防，肿瘤术后恢复增强免疫力等。但它是口服剂，服后通过肠胃道吸收起作用，不能直接进入人体的血液。灵芝孢子油是非水溶性的，制备普通的注射剂是有相当难度的。通过制备灵芝孢子油脂肪乳剂可解决该问题，本申请人之前申报的名称为“灵芝孢子油脂肪乳剂”，专利号为ZL200410051661.3的中国发明专利正好解决了该问题。专利申请号为200510068335.8，名称为“灵芝孢子油静脉乳注射液及其制备方法”的中国发明专利也公开了一种灵芝孢子油静脉乳注射液。但是这两个专利所公开的灵芝孢子油脂肪乳剂均包括了脂肪油或注射用油，存在工艺复杂，活性成分不清楚，没有对注射用的灵芝孢子油的精制工艺和脂肪乳的化学成分以及质量控制方法做进一步的阐述等缺点。

关于灵芝孢子的产品越来越多，如灵芝孢子油、灵芝孢子及其它们的制剂有灵芝孢子油软胶囊、灵芝孢子油脂肪乳注射剂、灵芝孢子油脂肪乳口服剂、灵芝孢子胶囊、灵芝孢子片、灵芝孢子散剂等，但真假难辩，质量优劣难分。关于灵芝孢子油的控制质量方法已经有不少文献报道，本申请人也申请了几项关于灵芝孢子油质量控制方法的发明专利，但是关于灵芝孢子油脂肪乳剂的质量控制方法却未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有灵芝孢子油脂肪乳剂存在的不足，提供一种活性成分清楚、生理活性强的灵芝孢子油脂肪乳剂。

本发明的另一个目的是提供上述灵芝孢子油脂肪乳剂的质量控制方法。

本发明的进一步目的是提供上述灵芝孢子油脂肪乳剂在制备用于治疗肿瘤、提高免疫作用、对放化疗药物减毒作用的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种灵芝孢子油脂肪乳剂，由如下组分和重量百分数组成：

灵芝孢子油    2～25％；

乳化剂        0.5～10％；

等渗剂        0.2～5％；

余量为水；调节脂肪乳剂的最终pH为6～9。

在上述灵芝孢子油脂肪乳剂中，所述灵芝孢子油优选经过精制的灵芝孢子油，其精制方法为：将灵芝孢子油离心，脱去水分，加入占灵芝孢子油重量0.5％～10％的吸咐剂，搅拌均匀，加热到40～70℃，保温20～40分钟，离心，精过滤，得到精制灵芝孢子油；所述吸附剂为活性碳、硅胶、中性氧化铝、硅藻土、白土中的一种或几种混合物。

在上述灵芝孢子油脂肪乳剂中，所述乳化剂优选为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、普流罗尼、聚甘油棕榈酸二醇或海藻酸盐中的一种或几种的混合物。最佳为蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂。

在上述灵芝孢子油脂肪乳剂中，所述等渗剂优选为甘油、葡萄糖、木糖醇、麦芽糖或山梨醇中的一种或几种的混合物，最佳是甘油。等渗剂的作用是使制剂的渗透压接近于人体的生理渗透压。

上述灵芝孢子油脂肪乳剂的第一种质量控制方法，采用高效液相色谱法测定其产品中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯和/或甘油三油酸酯的含量，每1g灵芝孢子油脂肪乳剂中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯的量为2mg～62.5mg和/或含甘油三油酸酯的量为1.6mg～50.0mg；

所述的高效液相色谱法是按下述色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈、异丙醇、二氯甲烷三种溶剂以任意比例的二元或三元组成的混合液为流动相，流动相的流速为0.5～2.0ml/min；用蒸发光散射检测器或差示折光率检测器检测；理论板数按1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰计算，均应不低于2000；色谱柱温为10～50℃。

上述灵芝孢子油脂肪乳剂的第二种质量控制方法，采用高效液相色谱法测定其产品中麦角甾醇的含量，每1g的灵芝孢子油脂肪乳剂中含麦角甾醇的量为0.04mg～7.5mg；麦角甾醇类是菌类植物中特有成分，灵芝孢子油是目前所了解的唯一的菌类植物油，因此麦角甾醇可以作为灵芝孢子油区别于其它植物油的特征成分。

所述色谱条件为：用十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇、乙醇、乙腈、甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液为流动相，或以甲醇、乙醇、乙腈与水的三元或四元组成混合液为流动相，或以四氢呋喃和水的混合液为流动相，四氢呋喃和水的体积比为75：25；检测波长为280±2nm；理论板数按麦角甾醇峰计算，应不低于2000。

上述灵芝孢子油脂肪乳剂的第三种质量控制方法，采用高效液相的方法，通过比较若干批灵芝孢子油脂肪乳剂色谱图，由其共有特征峰构成的灵芝孢子油脂肪乳剂标准指纹图谱。所述高效液相的色谱条件优选为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-异丙醇，体积配比为53：47；蒸发光散射检测器；参照物：取甘油三油酸酯对照品；

所述灵芝孢子油脂肪乳剂指纹图谱中，共有峰有15个，其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个，以甘油三油酸酯的色谱峰的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间并计算相对峰面积，上述4个指纹峰分别是9号峰平均相对保留时间RT为0.778，相对峰面积范围为9.54～15.36％；10号峰的平均RT为0.832，相对峰面积范围5.76～9.43％；11号峰甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000，相对峰面积范围为22.29～27.80％；12号峰的平均RT为1.075，相对峰面积范围为26.82～37.76％。

本发明所述灵芝孢子油乳的pH值可以在制备过程中使用氢氧化钠或磷酸盐缓冲溶液来调节。最终pH值在6～9之间。

所述灵芝孢子油乳的其它常规质量指标还可以通过本领域已知的方法进行测定，其中：乳粒的粒径平均分布在100～500nm之间；大于1mm的乳粒数不得过1％，并不得检出大于5mm的乳粒。

过氧化值：低于2mmol/kg。

细菌内毒素每1ml脂肪乳中含内毒素的量应小于0.5EU。

本发明的灵芝孢子油脂肪乳剂具有很好的药物活性，能单独或与其他药物混合，制备用于治疗肿瘤、提高免疫作用、对放化疗药物减毒作用的药物。本发明的灵芝孢子油脂肪乳剂特别适用于动、静脉注射，灵芝孢子油直接进入人体血液。最佳剂型为注射用乳剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的灵芝孢子油脂肪乳剂活性成分清楚，具有很好的生物活性，能单独使用或与其他抗肿瘤药物联合应用，用于治疗肿瘤、提高机体免疫能力，对于进行放疗和化疗的肿瘤患者，可提高其生存质量并减轻治疗后的药物毒副反应。

2.本发明的灵芝孢子油脂肪乳剂特别适用于动、静脉注射，灵芝孢子油直接进入人体血液，起效快，吸收较完全。

3.本发明的灵芝孢子油注射脂肪乳是安全性高、质量可靠，毒副反应低的产品。

4.制备本发明的灵芝孢子油脂肪乳剂的原料易得，工艺简单，可用常规的生产设备和工艺制备，适合于具GMP生产注射剂的药厂大规模地投入批量生产。

5.本发明的质量控制方法通过准确测定制剂中1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯和甘油三油酸酯的含量，作为该产品质量控制的方法和依据，方法简便，可操作性强，重现性高。

6.本发明的质量控制方法通过准确测定制剂中的麦角甾醇的含量，作为该产品质量控制的方法和依据，可操作性强，重现性高，特异强。

7.本发明的质量控制方法利用指纹图谱，方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子油脂肪乳剂的品种和质量情况，为灵芝孢子油脂肪乳剂的质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。

附图说明

图1为甘油三酸脂对照品0～60分钟的高效液相图；

图2为灵芝孢子油脂肪乳的0～60分钟的标准指纹图谱；

图3为10批灵芝孢子油脂肪乳0～60分钟的指纹图谱。

具体实施方式

实施例1～6

灵芝孢子油的精制：将灵芝孢子油离心，脱去水分，加入占灵芝孢子油重量5％的活性碳，搅拌均匀，加热到50℃，保温30分钟，离心，精过滤，得到精制灵芝孢子油。

制备方法：在通氮气的条件下，将乳化剂加入到精制灵芝孢子油中，高速捣碎至乳化剂完全溶解；在恒温水浴50℃和高速分散乳化12000rpm的条件下，将油相缓缓加入等渗剂水溶液中，至混合均匀；用氢氧化钠调节pH6～9；立即将制好的初乳投入匀质机中，调节均质压力60Mpa、均质次数8次、均质温度60℃，均质后用微孔滤膜滤过，灌装于输液瓶中，通入氮气，加丁基胶塞，铝盖密封；灭菌，即得。制得产品符合上述各项质检规定，并符合药典相关制剂标准。

参照上述制备方法，实施例1～6的配方如表1所示，表1中所述重量百分数为重量百分数。

表1 实施例1～6的配方

 

	精制灵芝孢子油	乳化剂	等渗剂	水	pH
						实施例1	2％	蛋黄卵磷脂3％	甘油5％	90％	6.5
实施例2	25％	普流罗尼5％	麦芽糖0.2％	69.8％	8.5
						实施例3	20％	大豆卵磷脂1.5％	甘露醇2％	76.5％	8.1
实施例4	15％	蛋黄卵磷脂0.8％大豆卵磷脂2％	甘油1.6％	80.6％	7.5
						实施例5	7％	聚甘油棕榈酸二醇8％	葡萄糖2％甘油2％	81％	7.0
实施例6	18％	海藻酸盐1％蛋黄卵磷脂2％	山梨醇1％	78％	7.9

实施例7 灵芝孢子油脂肪乳剂中1，2—油酸—3—棕榈酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量测定

用高效液相色谱法测定：

色谱条件用十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱：KromasilC18，4.6mm×250mm，5um柱；柱温：30℃；流动相：乙腈：异丙醇的体积比为40:60；蒸发光散射检测器检测；流速：0.5ml/min。理论板数按1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰计算，均大于2000；

对照品溶液的制备：取1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯、甘油三油酸酯对照品2.98mg、2.67mg，置25ml的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1ml分别含0.119mg、0.107mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称取灵芝孢子油脂肪乳剂(实施例1)1.025g，加入0.2g无水硫酸钠，于水浴上加热使乳剂破裂，转移至分液漏斗中，以乙醚萃取3次，每次2.0ml，合并乙醚液，蒸干，加流动相：乙腈:异丙醇(40:60)溶解，转移至100ml量瓶中，并定容至刻度，即得供试品溶液；

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，取对数计算，即得。每1g乳剂中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯、甘油三油酸酯分别为4.21mg、3.43mg。

符合每1g灵芝孢子油脂肪乳剂中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯的量为2mg～62.5mg和/或含甘油三油酸酯的量为1.6mg～50.0mg；

这说明实施例1的脂肪乳剂质量符合要求。

实施例8 灵芝孢子中1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量测定

用高效液相色谱法测定：

色谱条件用十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱：KromasilC18，4.6mm×250mm，5um柱；柱温：室温；流动相：乙腈：二氯甲烷(59:41)，蒸发光散射检测器检测；流速：1.0ml/min。理论板数按1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰计算，均大于2000；

对照品溶液的制备：取1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯、甘油三油酸酯对照品2.98mg、2.67mg，置25ml的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1ml分别含0.119mg、0.107mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称取灵芝孢子油脂肪乳剂(实施例2)302.45mg，置索氏提取器中，加入乙醚30ml，冷浸过夜，再加入乙醚50ml，于水浴加热提取8小时，提取液回收乙醚至尽，残渣以流动相：乙腈:二氯甲烷(59:41)溶解，转移至50ml量瓶中，并定溶至刻度，即得供试品溶液；

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，取对数计算，即得。每1g灵芝孢子中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯、甘油三油酸酯为59.28mg、46.52mg。

符合每1g灵芝孢子油脂肪乳剂中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯的量为2mg～62.5mg和/或含甘油三油酸酯的量为1.6mg～50.0mg；

这说明实施例2的脂肪乳剂质量符合要求。

实施例9 灵芝孢子油乳剂中麦角甾醇的含量测定

用高效液相色谱法测定：

色谱条件与波长选择用十八烷基键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相；检测波长为280nm。理论板数按麦角甾醇峰计算，应不低于2000；

对照品溶液的制备：取麦角甾醇对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.08mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称取含灵芝孢子油脂肪乳剂(实施例1)10g，加入2g无水硫酸钠，于水浴上加热使乳剂破裂，转移至分液漏斗中，以乙醚萃取3次，每次20ml，合乙醚液，蒸干，以石油醚10ml溶解，加于已处理好的硅胶柱(100～200目，10g，内径15mm)上，用石油醚：乙酸乙酯(90：10)120ml洗脱，弃去洗脱液，再用石油醚：乙酸乙酯(80：20)120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，计算，即得。每1g乳剂中含麦角甾醇0.6mg。

符合每1g的灵芝孢子油脂肪乳剂中含麦角甾醇的量为0.004mg～7.5mg，这说明实施例1的脂肪乳剂质量符合要求。

实施例10 灵芝孢子油脂肪乳剂HPLC标准指纹图谱

参照物溶液的制备：选用甘油三油酸酯为参照物，取甘油三油酸酯对照品适量，用流动相稀释，制成每1ml中含甘油三油酸酯0.15mg的溶液，作为参照物溶液。

供试品溶液制备：精密称取灵芝孢子油脂肪乳剂(实施例4)0.533g，加入0.2g无水硫酸钠，于水浴上加热使乳剂破裂，转移至分液漏斗中，以乙醚萃取3次，每次2.0ml，合并乙醚液，蒸干，加流动相：乙腈：异丙醇(40:60)溶解，转移至100ml量瓶中，并定容至刻度，即得供试品溶液；

分别取参照物溶液及灵芝孢子油乳供试品溶液各10μl进样，照高效液相色谱法测定，记录60分钟的色谱图，见图1、2和图3。以甘油三油酸酯的色谱峰(S峰)的相对保留时间和相对峰面积为1计算其它色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

共有峰确定：

通过10批灵芝孢子乳指纹图谱测定，所得到的灵芝孢子油乳指纹图谱，可通过HPLC色谱图进行比较，确定其共有特征峰，得到了由其共有特征峰构成的灵芝孢子油乳的HPLC标准指纹图谱。该标准指纹图谱有15个特征峰，各峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于2％。其中1号峰的平均RT为0.133，RSD为0.31％，相对峰面积范围为0.10～2.40％；2号峰的平均RT为0.152，RSD为0.32％，相对峰面积范围为0.31～17.51％；3号峰的平均RT为0.239，RSD为1.18％，相对峰面积范围为0.14～1.20％；4号峰的平均RT为0.285，RSD为0.11％，相对峰面积范围为0.10～2.16％；5号峰的平均RT为0.296，RSD为0.71％，相对峰面积范围为0.19～2.05％；6号峰的平均RT为0.479，RSD为0.12％，相对峰面积范围为0.47～3.56％；7号峰的平均RT为0.608，RSD为0.11％，相对峰面积范围为1.70～4.06％；8号峰的平均RT为0.648，RSD为0.11％，相对峰面积范围为0.34～1.80％；9号峰的平均RT为0.778，RSD为0.12％，相对峰面积范围为9.54～15.36％；10号峰的平均RT为0.832，RSD为0.10％，相对峰面积范围为5.76～9.43％；11号峰甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000，相对峰面积范围为22.29～27.80％；12号峰的平均RT为1.075，RSD为0.10％，相对峰面积范围为26.82～37.76％；13号峰的平均RT为1.158，RSD为0.21％，相对峰面积范围为1.31～2.03％；14号峰的平均RT为1.370，RSD为0.13％，相对峰面积范围为1.22～1.72％；15号峰的平均RT为1.479，RSD为0.15％，相对峰面积范围为0.54～1.03％。

实施例11.灵芝孢子油乳稳定性试验：

对实施例4样品进行6个月的加速试验，考察条件：放置温度37℃，相对湿度90％。(内毒素检查和无菌检查方法按中国药典2005年版有关规定进行)试验结果见表2：

表2 6个月加速试验考察结果

 

实施例4样品	0月	1月	2月	3月	6月
						pH值	7.5	7.4	7.5	7.3	7.4
平均粒径	280nm	290nm	285nm	298nm	290nm
						过氧化值	1.22meq/kg	1.13meq/kg	1.25meq/kg	1.28meq/kg	1.26meq/kg
1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯	31.8mg/g	31.1mg/g	31.6mg/g	31.7mg/g	31.2mg/g
						甘油三油酸酯含量	22.4mg/g	21.9mg/g	21.7mg/g	22.1mg/g	21.9mg/g
麦角甾醇含量	1.53m/g	1.52m/g	1.50m/g	1.51m/g	1.49m/g
						内毒素试验	符合规定	符合规定	符合规定	符合规定	符合规定
无菌检查	符合规定	符合规定	符合规定	符合规定	符合规定

试验结果表明，本发明的试验样品在加速考察期内质量基本稳定。

实施例12.灵芝孢子油乳安全性试验

1.豚鼠全身主动过敏试验(ASA)：试验用Hartley豚鼠24只，按性别和体重随机分为4组，每组雌雄各3只。设阴性对照组、阳性对照组、受试物低、高剂量组。腹腔注射给药，给药体积为0.5mL/只，隔日一次，连续五次。各组动物分别于末次腹腔注射后第12天激发，给药体积2.0mL/只，并观察动物的反应，根据过敏反应发生率和发生程度判断其全身主动过敏性。结果：阴性对照组1例豚鼠出现排尿现象(判断为生理性的排尿)，余下5例豚鼠均未见异常，所以阴性对照组过敏反应发生率为0；阳性对照组豚鼠全部死亡，过敏反应发生率为100％；受试物低、高剂量组各有1例豚鼠出现排尿或排粪现象(判断为生理性的排尿或排粪)，余下豚鼠均未见异常，所以受试物低、高剂量组的过敏反应发生率均为0；提示在本试验条件下，灵芝孢子油注射乳低、高剂量组(62.5、125.0mg/kg·bw)对Hartley豚鼠进行的全身主动过敏性试验未见明显过敏反应。

2.大鼠被动皮肤过敏试验(PCA)：试验用SPF级SD大鼠24只，按性别和体重随机分为4组，每组雌雄各3只。设阴性对照组、阳性对照组、受试物组低、高剂量组(分别为125和250mg/kg·bw，按等效剂量折算约分别相当于临床拟用剂量10g的0.14和0.28倍)。腹腔注射给药，隔日一次，连续五次，末次致敏后第10天采血，制备抗血清。另取SPF级SD大鼠24只，分组和组别设置与上述制备抗体的方法相同，各组动物分别皮内注射各对应组的抗血清0.1mL，被动致敏48小时后进行激发，结果阴性对照组和受试物低、高剂量组大鼠背部皮肤内层均未见蓝斑，阳性对照组可见明显蓝斑。提示在本试验条件下，灵芝孢子油注射乳对SD大鼠进行被动皮肤过敏试验未见明显过敏反应。

3.兔血管刺激性试验：试验用4只健康新西兰兔，采用同体左右侧耳朵自身对比法，左侧耳缘静眿注射受试药物(100mg/mL，约相当于临床静眿滴注拟用浓度)，右耳给予等体积的0.9％氯化钠注射液作对照，每天一次，连续7天。末次给药后48小时剖检2只动物，余下2只动物在末次给药后14天进行剖检。肉眼和镜检结果：给药侧与对照侧兔耳兔耳缘静脉血管及周围组织均未见病理改变。提示在本试验条件下，灵芝孢子油注射乳对兔耳缘静脉及周围组织未见明显刺激性反应。

4.兔肌肉刺激性试验：试验用4只健康新西兰兔，采用同体左右侧肌肉股四头肌自身对比法，左侧给予受试物(100mg/mL，约相当于临床静脉滴注拟用浓度)，右侧给予等体积0.9％氯化钠注射液作对照，1.0mL/侧，单次给药。给药后48小时剖检2只动物，余下2只动物在给药后14天进行剖检。肉眼观察4只兔的各侧注射部位肌肉均未见明显异常。镜检结果：给药后48小时剖检的1只动物和14天进行剖检的2只动物左右侧注射部位肌肉肌纤维排列整齐，均未见异常变化。余下一只兔在末次给药后48小时，右侧局部肌肉组织出现肌纤维小灶性轻度变性，病灶肌纤维间质可见大量炎细胞浸润，左侧局部肌肉组织出现肌纤维片状变性、坏死甚至消失，病灶及肌纤维间有大量炎细胞浸润，局部可见少量红细胞。根据右侧为阴性对照侧，亦出现轻度机械性刺激，结合肉眼观察结果，左侧局部肌肉组织出现的刺激可能是机械性刺激。提示在本试验条件下，灵芝孢子油注射乳对兔的股四头肌未见明显刺激性反应。

5.体外溶血试验：向盛有2％红血球混悬液的各支药液管中分别加入不等量的灵芝孢子油注射乳(100mg/mL，约相当于临床静眿滴注拟用浓度)，灵芝孢子油注射乳的各支药液管在3小时内均未见溶血或红细胞凝集现象。提示在本试验条件下，三个批号的灵芝孢子油注射乳体外溶血性试验为阴性。

实施例13 灵芝孢子油Beagle犬急性毒性试验

试验设4、6、8、12、16g/kg.bw(分别相当人临床拟用量的24、36、48、72、96倍)5个剂量，每个剂量用Beagle犬一只，单次静脉给药。试验结果表明：Beagle犬单次给药后，其心电图、血液学及尿液检查未见明显异常，血液生化学发生一些改变，剂量越大持续时间越长；在给药剂量达到12、16g/kg.bw时，动物出现安静、活动减少、食欲下降等症状。灵芝孢子油乳单次静脉滴注对Beagle犬的无毒反应剂量为4g/kg.bw，耐受量大于16g/kg.bw。

实施例14 灵芝孢子油注射乳iv给药对小鼠H₂₂肝癌的实验治疗作用

选用生长良好的7～11天的H₂₂瘤种，接种于小鼠右侧腋部皮下，约4.5～5×10⁶细胞/只，接种24小时后随机分笼，静脉给药。给药期间每天测定体重，第8天处死动物，称瘤重，计算各组平均瘤重，求出肿瘤抑制率并进行t检验。

表3.灵芝孢子油注射乳iv给药对小鼠H22肝癌的肿瘤生长抑制作用(X±SD)

d1、d8：接种后第1、8天；

^**P<0.05，与空白乳组比较。

由表3的数据表明，灵芝孢子油注射乳能抑制小鼠移植瘤H₂₂(肝癌)的肿瘤生长。

实施例15 灵芝孢子油注射乳iv对人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤的实验治疗作用

取生长旺盛期的人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100—300mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周3次，每次测量同时还需称鼠重。实验组静脉给药，隔天1次；阳性对照药为泰素(TAX)10mg/kg，隔天1次；阴性对照组为给等体积的空白乳。以相对肿瘤抑制率T/C(％)来评价药物对肿瘤的生长抑制作用。试验结果为：

表4 灵芝孢子油注射乳iv给药对人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤的实验治疗作(X±SD)

d₉：分笼给药时间

由表4的数据表明，灵芝孢子油注射乳对人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤具有抑制作用。

实施例16 灵芝孢子油注射乳iv对H₂₂荷瘤小鼠特异性细胞免疫功能的影响

取ICR小鼠50只，按移植性肿瘤研究法接种H₂₂实体型瘤(在无菌操作下取瘤块，称重，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放人无菌容器内，加生理盐水稀释成1∶3的细胞悬液，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml)。次日按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半，实验设：静注对照组(20ml/kg，空白组)，灵芝孢子油注射乳剂高、中、低剂量组(1、0.5、0.25g/kg)iv给药，迈普新注射液组(0.42mg/kg)Sc给药；除迈普新为隔日给药一次外，其余各组每天给药一次，共给药7次，给药第1天每鼠腹部去毛，范围为3×3cm²；给药第2天，将1％DNFB均匀涂抹于小鼠腹部(DNFB为一种半抗原，与皮肤蛋白结合成全抗原后可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞)。末次给药后半小时，将1％DNFB均匀涂抹于小鼠右耳进行攻击，使局部产生迟发型变态反应(水肿)，攻击后24h，脱颈椎处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左右耳片重量之差作为肿胀度，并计算肿胀抑制率，比较各组的差别。

表5 灵芝孢子油注射乳剂iv对H₂₂荷瘤小鼠延迟性超敏反应的影响(X±SD，n＝10)

^*P<0.05，^**P<0.01与H₂₂荷瘤空白乳对照组比较

由表5的数据表明，灵芝孢子油注射乳高、中剂量组可显著提高小鼠的肿胀度和肿胀率(P<0.05)。即灵芝孢子油注射乳可增强H₂₂荷瘤小鼠的特异性细胞免疫功能。

实施例17 灵芝孢子油注射乳iv给药对H₂₂荷瘤小鼠网状内皮系统(RES)吞噬功能的影响

实验方法：取ICR小鼠50只，接种H₂₂实体型瘤，次日按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半，实验设：静注对照组(20ml/kg，空白乳)，灵芝孢子油注射乳高、中、低剂量组(1、0.5、0.25g/kg)iv给药，阳性对照药迈普新注射液组(0.42mg/kg)Sc给药。除迈普新为隔日给药一次外，其余各组每天给药一次，共给药11次。于末次iv、ig给药后24h，尾静脉注射印度墨水(1:3稀释)0.1ml/10g，于注入墨水后1分钟及5分钟时用定量采血管从小鼠眼眶后静脉丛取血20μl，立刻吹入0.1％Na₂CO₃液2ml中，于680nm处比色，于5min采血后立即处死小鼠，并取肝、脾、胸腺称重，按下式计算廓清指数K及吞噬系数α值；肝脏系数和脾脏系数。所得数据进行统计学处理(t检验)。

表6.灵芝孢子油注射乳iv给药对H₂₂荷瘤小鼠网状内皮系统(RES)吞噬功能的影响(X±SD，n＝10)

^*P<0.05，^**P<0.01与H₂₂荷瘤空白乳对照组比较

由表6的数据表明，灵芝孢子油注射乳可显著提高H₂₂荷瘤小鼠的廓清指数K、吞噬系数α和脾脏系数，可增强H₂₂荷瘤小鼠网状内皮系统(RES)吞噬功能。

实施例18 灵芝孢子油注射乳iv给药对H22荷瘤小鼠环磷酰胺(Cy)化疗的减毒作用

实验方法：取上述规格ICR小鼠60只，接种H₂₂实体瘤，接种后24小时称鼠重，并随机分为6组，每组10只，雌雄各半，实验设：空白对照组，静注对照组(20ml/kg，空白乳)，灵芝孢子油注射乳高、中、低剂量组(1、0.5、0.25g/kg)iv给药，阳性对照药迈普新注射液组(0.42mg/kg)Sc给药。除迈普新为隔日给药一次外，其余各组每天给药一次，共给药7次，于给药第4、5天除空白对照组外，其余各组开始ip Cy(100mg/kg)，连续2d，于停药后24h处死动物，处死前称重，并由眼眶静脉取血，镜检外周血白细胞总数，同时摘取一侧完整股骨，分别测定骨髓有核细胞数，并取胸腺、脾称重，计算胸腺、脾脏器系数，并进行统计学处理(t检验)。

实验结果：结果表明，与H₂₂荷瘤空白对照组相比，空白乳+Cy模型(100mg/kg，ip)组的外周血白细胞、骨髓有核细胞数；胸腺、脾系数均明显下降(P<0.01)。与环磷酰胺(Cy)模型组相比，灵芝孢子油注射乳高剂量组及迈普新注射液组皆可显著对抗由Cy造成的H₂₂荷瘤小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞数、胸腺系数和脾脏系数的下降(P<0.05，P<0.01)。结果见表7。

表7.灵芝孢子油注射乳iv给药对H₂₂荷瘤小鼠化疗的减毒作用(X±SD，n＝10)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白乳+Cy组比较

由表7的数据表明，灵芝孢子油注射乳对H22荷瘤小鼠环磷酰胺(Cy)化疗具有减毒作用。

实施例19 灵芝孢子油注射乳iv给药对正常小鼠化疗(Cy)的减毒作用

实验方法：取上述规格ICR小鼠60只，按体重随机分为6组，每组10只，雌雄各半，实验设：空白对照组，静注对照组(20ml/kg，空白乳)，灵芝孢子有注射乳高、中、低剂量组(1、0.5、0.25g/kg)iv给药，阳性对照药迈普新注射液组(0.42mg/kg)Sc给药。除迈普新为隔日给药一次外，其余各组每天给药一次，共给药7次。于给药第4、5天除空白对照组外，其余各组开始ip Cy(100mg/kg)，连续2d，于停药后24h处死动物，处死前称重，并由眼眶静脉取血，镜检外周血白细胞总数，同时摘取一侧完整股骨，分别测定骨髓有核细胞数，并取胸腺、脾称重，计算胸腺、脾脏器系数，并进行统计学处理(t检验)。

实验结果：结果表明，与空白对照组相比，空白乳+Cy模型(100mg/kg，ip)组的外周血白细胞、骨髓有核细胞数，胸腺、脾系数均明显下降(P<0.01)。与空白乳+Cy组相比，灵芝孢子油注射乳高剂量组及迈普新注射液组皆可显著对抗由Cy造成的正常小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞数和脾脏系数的下降(P<0.05)，灵芝孢子油注射乳中剂量组可显著对抗由Cy造成的正常小鼠骨髓有核细胞数和脾脏系数的下降(P<0.05)，结果见表8。

表8.灵芝孢子油注射乳iv给药对正常小鼠化疗的减毒作用(X±SD，n＝10)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白乳+Cy组比较

由表8的数据表明，灵芝孢子油注射乳对正常小鼠环磷酰胺(Cy)化疗具有减毒作用。

实施例20.灵芝孢子油注射乳iv给药对H₂₂荷瘤小鼠⁶⁰Co放疗的减毒作用

实验方法：取上述规格ICR小鼠60只，按移植性肿瘤研究法接种H₂₂实体瘤，于接种后24h，除空白对照组10只动物外，其余50只小鼠进行⁶⁰Co照射，剂量为500rad；⁶⁰Co照射后动物按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半，实验设：空白对照组，静注对照组(20ml/kg，空白乳)，灵芝孢子油注射乳高、中、低剂量组(1、0.5、0.25g/kg)iv给药，阳性对照药迈普新注射液组(0.42mg/kg)Sc给药。各组动物于接种后24h给药，除迈普新为隔日给药一次外，其余各组均为每天给药一次，共给药7次，并于停药后24h处死动物，处死前称重，并由眼眶静脉取血，镜检外周血白细胞总数，同时摘取脾脏、胸腺和一侧完整股骨，分别测定骨髓有核细胞数，称脾脏、胸腺重，计算脾脏指数和胸腺指数，并进行统计学处理(t检验)。

实验结果：结果表明，与H₂₂荷瘤空白对照组相比，空白乳+⁶⁰Co模型(500rad)组的外周血白细胞、骨髓有核细胞数、胸腺、脾系数均明显下降(P<0.01)。与⁶⁰Co模型组相比，迈普新注射液组可显著地对抗由⁶⁰Co造成的H₂₂荷瘤小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞数、脾脏和胸腺系数的下降(P<0.05)，灵芝孢子油注射乳iv给药高剂量组可显著对抗由⁶⁰Co造成的H₂₂荷瘤小鼠外周血白细胞数、骨髓有核细胞数和脾脏系数的下降(P<0.05)，灵芝孢子油注射乳iv给药中剂量组可显著对抗由⁶⁰Co造成的H₂₂荷瘤小鼠外周血白细胞数的下降(P<0.05)。结果见表9。

表9 灵芝孢子油注射乳iv给药对H₂₂荷瘤小鼠⁶⁰Co放疗的减毒作用(X±SD，n＝10)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白乳+⁶⁰Co组比较

由表9的数据表明，灵芝孢子油注射乳iv给药对H₂₂荷瘤小鼠⁶⁰Co放疗具有减毒作用。

实施例21 灵芝孢子油注射乳iv给药对正常小鼠⁶⁰Co放疗的减毒作用

实验方法：取上述规格ICR小鼠60只，除空白对照组10只动物外，其余50只小鼠进行⁶⁰Co照射，剂量为500rad；⁶⁰Co照射后动物按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半，实验设：空白对照组，静注对照组(20ml/kg，空白乳)，灵芝孢子油注射乳高、中、低剂量组(1、0.5、0.25g/kg)iv给药，阳性对照药迈普新注射液组(0.42mg/kg，)Sc给药。各组动物于接种后24h给药，除迈普新为隔日给药一次外，其余各组均为每天给药一次，共给药7次，并于停药后24h处死动物，处死前称重，并由眼眶静脉取血，镜检外周血白细胞总数，同时摘取脾脏、胸腺和一侧完整股骨，分别测定骨髓有核细胞数，称脾脏、胸腺重，计算脾脏指数和胸腺指数，并进行统计学处理(t检验)。

实验结果：结果表明，与空白对照组相比，空白乳+⁶⁰Co模型(500rad)组的外周血白细胞、骨髓有核细胞数、胸腺、脾系数均明显下降(P<0.01)。与⁶⁰Co模型组相比，迈普新注射液组可显著地对抗由⁶⁰Co造成的正常小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞数和脾脏、胸腺系数的下降(P<0.05)，灵芝孢子油注射乳高剂量组可显著地对抗由⁶⁰Co造成的正常小鼠外周血白细胞数、骨髓有核细胞数和脾脏系数的下降(P<0.05)，结果见表10。

表10.灵芝孢子油注射乳iv给药对正常小鼠⁶⁰Co放疗的减毒作用(X±SD，n＝10)

^*P<0.05，^**P<0.01与⁶⁰Co+空白乳组比较

由表10的数据表明，灵芝孢子油注射乳iv给药对正常小鼠⁶⁰Co放疗具有减毒作用。

Claims (10)

1.一种灵芝孢子油脂肪乳剂，其特征在于由如下组分和重量百分数组成：

精制灵芝孢子油                   2～25％；

乳化剂                           0.5～10％；

等渗剂                           0.2～5％；

余量为水；

其中所述脂肪乳剂的最终pH为        6～9。

2.根据权利要求1所述的灵芝孢子油脂肪乳剂，其特征在于所述精制灵芝孢子油是指将提取后的灵芝孢子油进行精制，其精制方法为：

将灵芝孢子油离心，脱去水分，加入占灵芝孢子油重量0.5％～10％的吸咐剂，搅拌均匀，加热到40～70℃，保温20～40分钟，离心，精过滤，得到精制灵芝孢子油；所述吸附剂为活性碳、硅胶、中性氧化铝、硅藻土、白土中的一种或几种混合物。

3.根据权利要求1所述的灵芝孢子油脂肪乳剂，其特征在于所述乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、普流罗尼、聚甘油棕榈酸二醇或海藻酸盐中的一种或几种的混合物。

4.根据权利要求1所述的灵芝孢子油脂肪乳剂，其特征在于所述等渗剂为甘油、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖或山梨醇中的一种或几种的混合物。

5.一种权利要求1所述灵芝孢子油脂肪乳剂的质量控制方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定其产品中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯和/或甘油三油酸酯的含量，每1g灵芝孢子油脂肪乳剂中含1，2-油酸-3-棕榈酸甘油三酯的量分别为2mg～62.5mg和/或含甘油三油酸酯的量分别为1.6mg～50.0mg；

所述的高效液相色谱法是按下述色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈、异丙醇、二氯甲烷三种溶剂以任意比例的二元或三元组成的混合液为流动相，流动相的流速为0.5～2.0ml/min；用蒸发光散射检测器或差示折光率检测器检测；理论板数按1，2—油酸—3—棕榈酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰计算，均应不低于2000；色谱柱温为10～50℃。

6.一种权利要求1所述灵芝孢子油脂肪乳剂的质量控制方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定其产品中麦角甾醇的含量，每1g的灵芝孢子油脂肪乳剂中含麦角甾醇的量为0.04mg～7.5mg；

所述色谱条件为：用十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇、乙醇、乙腈、甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液为流动相，或以甲醇、乙醇、乙腈与水的三元或四元组成混合液为流动相，或以四氢呋喃和水的混合液为流动相，四氢呋喃和水的体积比为75：25；检测波长为280±2nm；理论板数按麦角甾醇峰计算，应不低于2000。

7.一种权利要求1所述灵芝孢子油脂肪乳的质量控制方法，其特征在于，采用高效液相的方法，通过比较若干批灵芝孢子油脂肪乳剂色谱图，由其共有特征峰构成的灵芝孢子油脂肪乳剂标准指纹图谱。

8.根据权利要求7所述的标准指纹图谱，其特征在于，所述高效液相的色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-异丙醇，体积配比为53：47；蒸发光散射检测器；参照物：取甘油三油酸酯对照品；

所述灵芝孢子油脂肪乳剂指纹图谱中，共有峰有15个，其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个，以甘油三油酸酯的色谱峰的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间并计算相对峰面积，上述4个指纹峰分别是9号峰平均相对保留时间RT为0.778，相对峰面积范围为9.54～15.36％；10号峰的平均RT为0.832，相对峰面积范围为5.76～9.43％；11号峰甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000，相对峰面积范围为22.29～27.80％；12号峰的平均RT为1.075，相对峰面积范围为26.82～37.76％。

9.权利要求1所述灵芝孢子油脂肪乳剂在制备用于治疗肿瘤、提高免疫作用、对放化疗药物减毒作用的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射用乳剂。

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