CN101516913A

CN101516913A - Adcc活性得到增强的抗体及其制造方法

Info

Publication number: CN101516913A
Application number: CNA2007800338209A
Authority: CN
Inventors: 村上昭弘
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 2006-09-14
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2009-08-26

Abstract

本发明的课题在于提供ADCC活性得到增强的抗体及其制造方法。本发明人进一步扩展了Genentech Inc等研究者进行的Fc部分的氨基酸变异，通过向采用计算机检索无法导出的有可能伴有大幅结构变化的氨基酸即半胱氨酸(Cys)变异，研究是否能够增强ADCC活性。本发明提供在H链恒定区中，将选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308和309位中的至少1个位置的氨基酸残基变更成Cys的嵌合抗体。

Description

ADCC活性得到增强的抗体及其制造方法

技术领域

本发明涉及将抗体ADCC活性增强的方法和ADCC活性得到增强的抗体。

背景技术

使抗体的可变区为小鼠型而恒定区为人型的嵌合抗体、使可变区和恒定区双方均为人型的人源化抗体，作为癌、慢性风湿关节炎的治疗药受到期待。在癌的治疗中，一直以来使用的顺氯氨铂等化学合成的治疗药，对癌细胞和正常细胞的识别能力低，毒性高。因此现状是，癌的化学疗法对癌患者的体力负担大。另一方面，嵌合化或人源化的抗体由于具有识别癌细胞表面上的特异性分子的作用，因此其毒性低，对于接受治疗的患者来说体力负担轻。对于慢性风湿关节炎的治疗，在以往的以类固醇药为中心的治疗中，停留在延迟风湿症状的发展，但是对白介素6受体的人源化抗体由于能够抑制骨破坏、炎症的原因因子，因此发挥显著的治疗效果。

这些治疗用抗体(嵌合抗体、人源化抗体)的制作方法大致分为3种。第一种是通过基因重组技术，从小鼠抗体向嵌合抗体、人源化抗体转化，即通过将抗体的抗原结合部位残留并置换成人型蛋白来进行人源化的方法。第二种是使用噬菌体展示的方法。在该方法中，由于使多种源于人的抗体可变区在噬菌体表面表达，因此可以选出能够识别目的蛋白的完全人型可变区，从而可以以选出的完全人型可变区为材料，利用基因重组技术，制作进一步加有人型恒定区的完全人源化抗体。最后，还有利用通过基因操作而具有人的抗体产生基因的TC小鼠的方法(Nature Genetics，Vol.16，113-114，1997)。该TC小鼠被作为目的蛋白的抗原免疫时，由于小鼠产生的抗体被基因操作使得全部成为人型，因此由将对TC小鼠进行抗原免疫后取出的淋巴球细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合而得到的杂交瘤细胞，可以产生识别所免疫抗原的完全人源化抗体。

虽然可以通过上述的3种方法制作嵌合抗体或人源化抗体，但是无论使用哪种方法，治疗抗体的制造成本都远远高于低分子化合物的治疗药，这是个问题。由于其的高制造成本，治疗抗体的价格也非常高，对于癌或风湿患者来说形成很大的治疗费负担，这是现状。

作为解决该问题的一个解决对策，考虑了使每单位质量的治疗抗体对癌细胞等的治疗效果上升的方法。也就是说，只要以少的治疗抗体量就可以获得与以往给药量同样的治疗效果，则可以减少对患者的每一次给药量，此外，还可以减少每一次的药费。作为显示该治疗抗体的治疗效果的一个指标，是抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)活性。该ADCC活性的机理是，治疗抗体的Fc部分与能够杀伤癌细胞的杀伤细胞上的Fcγ受体结合，进而通过治疗抗体的可变区的识别作用，向癌细胞导入杀伤细胞，结果是杀伤细胞借助于治疗抗体将癌细胞杀伤。

作为用于使ADCC活性上升所要求的治疗抗体的性能，可以列举1)治疗抗体的可变区可以高效识别特异性地位于癌细胞表面的蛋白，2)治疗抗体的Fc部分可以与杀伤细胞上的Fcγ受体牢固结合。一直以来进行了很多通过解决该2)的项目而使ADCC活性上升的研究。

Shinkawa T等人着眼于与作为治疗抗体IgG1的Fc区域的297位氨基酸即天冬酰胺(Asn)结合的两个糖链(N-Linked oligosaccharide)结构，发现如果形成该糖链结构的岩藻糖缺损的糖链结构，则ADCC活性上升20倍～100倍(J.Biol.Chem.Vol.278，3466-3473，2003)。该由岩藻糖缺损结构带来的ADCC活性的报道，也由Shields R L等人发表(J.Biol.Chem.Vol.277，26733-26740，2002)。此外，Pablo U等人也着眼于同样的糖链结构，发现通过控制该糖链结构中bisectingN-acetylglucosamine的结合量，ADCC活性可以上升数倍(NatureBiotechnology Vol.17，176-180，1999)。

除了这样的、通过改变与IgG1的Fc区域结合的糖链结构来使该治疗抗体的ADCC活性上升的方法以外，美国Genentech Inc.等研究者采用计算机检索来检索通过在治疗抗体的Fc结构自身的氨基酸中加入变异而使其与Fc受体的结合增强的技术，通过S298A，E333A，K334A的三重变异，成功地使ADCC活性增强数十倍(J.Biol.Chem.Vol.276，6591-6604，2001)。

另外，以下列出与本发明相关的现有技术文献。

专利文献1：WO 2004/029207

专利文献2：WO 2000/042072

专利文献3：WO 2004/063351

专利文献4：WO 2004/099249

专利文献5：WO 2006/019447

专利文献6：特表2006-512407

专利文献7：特表2003-512019

专利文献8：WO2006/104989

专利文献9：WO2006/105062

非专利文献1：Nature Genetics，Vol.16，113-114，1997

非专利文献2：J.Biol.Chem.Vol.278，3466-3473，2003

非专利文献3：J.Biol.Chem.Vol.277，26733-26740，2002

非专利文献4：Nature Biotechnology Vol.17，176-180，1999

非专利文献5：J.Biol.Chem.Vol.276，6591-6604，2001

发明内容

本发明的课题在于提供ADCC活性得到增强的抗体及其制造方法。

本发明人进一步扩展了Genentech Inc等研究者进行的Fc区域的氨基酸变异，进行了如下研究，即，在Fc区域导入由计算机检索无法导出的可能伴有大幅度结构变化的氨基酸即半胱氨酸(Cys)，看是否可以使ADCC活性增强。半胱氨酸置换意味着导入硫醇基(-SH)，所以生成二硫键(-S-S-)。因此，期待带来Fc结构的强烈变化。本发明人进行了如下研究，即，在人Cγ1(序列号53记载的氨基酸序列)中，将ElvinA.Kabat等在Sequence of proteins of Immunological Interest(NIHPublication No.91-3242，1991)中给出的人IgG1H链恒定区的EUindex编号(在本说明书中，以下有时记作“kabat编号”)的280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308、309、310或314位的氨基酸置换成半胱氨酸(以下，有时简记为Cys)，看是否可以增强ADCC活性。

其结果发现，将人Cγ1的286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308或309位的氨基酸置换成Cys的嵌合抗体，与野生型嵌合抗体相比显示出非常高的ADCC活性，从而完成了本发明。即，本发明提供以下〔1〕～〔41〕的发明。

〔1〕一种抗体，其特征在于，在H链恒定区中，选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308或309位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸。

〔2〕如〔1〕所述的抗体，其特征在于，H链恒定区是选自人Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4中的任一个恒定区。

〔3〕如〔1〕或〔2〕中任一项所述的抗体，其特征在于，与置换前相比ADCC活性上升。

〔4〕如〔1〕～〔3〕中任一项所述的抗体，其特征在于，具有得到改善的稳定性、溶解性或对Fc配体的结合亲和性。

〔5〕如〔1〕～〔4〕中任一项所述的抗体，其特征在于，被赋予糖链。

〔6〕如〔5〕所述的抗体，其特征在于，改善了效应功能。

〔7〕如〔1〕～〔6〕中任一项所述的抗体，其特征在于，与FcγRI、FcγRII、FcγRIII、或FcRn结合。

〔8〕如〔1〕～〔7〕中任一项所述的抗体，其特征在于，对选自CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF中的目标抗原具有特异性。

〔9〕一种抗体，其特征在于，是对CD20具有特异性的人源化抗体，选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸。

〔10〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号95记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号93记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号97记载的氨基酸序列；

(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一项所述的H链、和下述(i)或(ii)所述的L链的对的抗体：

(i)具有作为CDR1的序列号58记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号60记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号62记载的氨基酸序列、和作为CL的序列号64记载的氨基酸序列的L链；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔11〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号101记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号99记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号103记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔12〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号107记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号105记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号109记载的氨基酸序列；

(4)含有上述(1)、(2)或(3)中任一项所述的H链、和下述(i)或(ii)所述的L链的对的抗体：

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔13〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号54记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号45记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号73记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔14〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号83记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号81记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号85记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔15〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号89记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号87记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号91记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链、

〔16〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号131记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号129记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号133记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔17〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号137记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号135记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号139记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔18〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号143记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号141记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号145记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔19〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号149记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号147记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号151记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔20〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号155记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号153记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号157记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔21〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号161记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号159记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号163记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔22〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号167记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号165记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号169记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔23〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号173记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号171记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号175记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔24〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号179记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号177记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号181记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔25〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号185记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号183记载的氨基酸序列的H链的抗体、

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号187记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔26〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号191记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号189记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号193记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔27〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号241记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号243记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号245记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

〔28〕下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号195记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号197记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号199记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号83记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号209记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号195记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号197记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号199记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号85记载的氨基酸序列；

(i)具有作为CDR1的序列号203记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号205记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号207记载的氨基酸序列、和作为CL的序列号247记载的氨基酸序列的L链；

(ii)具有序列号201记载的氨基酸序列的L链。

〔29〕ADCC活性得到增强的抗体的制造方法，包括如下工序：在H链恒定区中，将选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸。

〔30〕ADCC活性得到增强的抗体的制造方法，包括以下的(a)以及

(b)的工序：

(a)使编码H链的DNA、以及编码L链的DNA表达的工序，在所述H链恒定区中，选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸；

(b)回收工序(a)的表达产物的工序。

〔31〕如〔29〕或〔30〕所述的方法，其特征在于，H链恒定区是选自人Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4中的任一个恒定区。

〔32〕一种医药组合物，含有〔1〕～〔28〕中任一项所述的抗体和医药上能容许的担载体。

〔33〕一种非人哺乳动物的治疗方法，包括将〔1〕～〔28〕中的任一抗体给予对象的工序。

〔34〕一种核酸，编码〔1〕～〔28〕中的任一抗体。

〔35〕一种载体，含有〔34〕所述的核酸。

〔36〕一种宿主细胞，具有〔35〕所述的载体。

〔37〕一种宿主生物，具有〔35〕所述的载体。

〔38〕将抗体的ADCC活性增强的方法，其中，包括如下工序：在H链恒定区中，将选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸。

〔39〕如〔38〕所述的方法，其特征在于，H链恒定区是选自人Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4中的任一个恒定区。

〔40〕一种判定工序(a)的抗体的ADCC活性是否得到增强的方法，在工序(b)中测定的ADCC活性高于置换前抗体的ADCC活性时，判定工序(a)的抗体的ADCC活性得到增强；

(a)提供具有ADCC活性的抗体的变异体，即选自H链恒定区中的286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的抗体的工序，和

(b)测定工序(a)的抗体的ADCC活性的工序。

〔41〕ADCC活性得到增强的抗体的筛选方法，其中，包括以下的(a)～(d)的工序：

(a)提供具有ADCC活性的抗体的工序；

(b)将工序(a)的抗体的选自H链恒定区中的286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸的工序；

(c)采用〔40〕所述的方法判定在工序(b)中得到的抗体的ADCC活性是否得到增强的工序；

(d)选择在工序(c)中判定ADCC活性得到增强的的抗体的工序。

根据本发明，提供ADCC活性得到增强的抗体及其制造方法。关于采用乳酸脱氢酶释放分析体系评价的ADCC活性，本发明的抗体与野生型抗体相比，ADCC活性上升(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比上升)。因此，通过使用本发明的变异型抗体，与野生型抗体相比，可以引起更多的细胞毒。

此外，本发明的抗体特别是在低浓度时，ADCC活性上升(野生型抗体和变异型抗体显示相同的细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度比上升)。因此，通过将本发明的抗体作为治疗抗体使用，可以使对每单位质量的癌细胞等的治疗效果上升。此外，如果使用本发明的抗体，则可以减少对患者的每一次给药量，因此还可以减少药费。

附图说明

【图1】是表示经基因克隆的Anti-CD20小鼠L链可变区的DNA序列的图。该DNA序列的开始部分与MKV5引物序列一致。此外，图中的CDR是complementarity determing region的缩写。粗的下划线是小鼠L链恒定区的一部分，除了该恒定区之外的序列是Anti-CD20小鼠L链可变区。

【图2】是表示经基因克隆的Anti-CD20小鼠H链可变区的DNA序列的图。该DNA序列的开始部分与MHV7引物序列一致。此外，图中的CDR是complementarity determing region的缩写。粗的下划线是小鼠H链恒定区的一部分，除了该恒定区之外的序列是Anti-CD20小鼠H链可变区。

【图3】是表示经精制的野生型嵌合抗体或Cys型嵌合抗体的电泳图像的照片。各种精制嵌合抗体与含有2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液混合，煮沸5分钟。煮沸后的样品用12.5％SDS-PAGE凝胶进行电泳。在该照片中，50kDa附近的带是H链，25kDa附近的带是L链。

【图4】是表示野生型、294Cys型、298Cys型、301Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果的曲线图。与野生型嵌合抗体的ADCC活性相比，294Cys型嵌合抗体和301Cys型嵌合抗体在高浓度条件下(0.1～10μg/mL)显示出非常高的ADCC活性。另一方面，298Cys型嵌合抗体与野生型相比，在包括低浓度(0.1μg/mL以下的浓度)的所测定的全部范围内，均显示出高的ADCC活性。

【图5】是表示野生型、290Cys型、291Cys型、292Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果的曲线图。与野生型嵌合抗体的ADCC活性相比，291Cys型嵌合抗体和292Cys型嵌合抗体在高浓度条件下(0.01～10μg/mL)显示出非常高的ADCC活性。另一方面，290Cys型嵌合抗体与野生型相比，在包括低浓度(0.1μg/mL以下的浓度)的所测定的几乎全部范围内，均显示出高的ADCC活性。

【图6】是表示野生型、302Cys型、303Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果的曲线图。与野生型嵌合抗体的ADCC活性相比，303Cys型嵌合抗体在高浓度条件下(0.01～10μg/mL)显示出非常高的ADCC活性。另一方面，302Cys型嵌合抗体与野生型相比，在包括低浓度(0.1μg/mL以下的浓度)的所测定的几乎全部范围内，均显示出高的ADCC活性。

【图7】是表示野生型、298Cys型的Anti-EGFR嵌合抗体的ADCC活性结果的曲线图。298Cys型嵌合抗体与野生型相比，在包括低浓度(0.1μg/mL以下的浓度)的所测定的全部范围内，均显示出高的ADCC活性。

【图8】是表示野生型、286Cys型、287Cys型、288Cys型、289Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果的曲线图。与野生型嵌合抗体的ADCC活性相比，286Cys型嵌合抗体和289Cys型嵌合抗体在高浓度条件下(0.01～10μg/mL)显示出非常高的ADCC活性。

【图9】是表示野生型、305Cys型、306Cys型、307Cys型、308Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果的曲线图。与野生型嵌合抗体的ADCC活性相比，这些嵌合抗体在较高浓度条件下(0.001～10μg/mL)显示出高的ADCC活性。

【图10】是表示野生型以及309Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果的曲线图。与野生型嵌合抗体的ADCC活性相比，这些嵌合抗体在低浓度条件下(0.001～10μg/mL)显示出高的ADCC活性。

具体实施方式

本发明提供氨基酸残基被人为地置换成半胱氨酸的抗体，所述氨基酸残基是Elvin A.Kabat等人在Sequence of proteins of ImmunologicalInterest(NIH Publication No.91-3242，1991)中给出的选自人IgG1 H链恒定区的EU index编号(在本说明书中，只要没有特别说明，以下的氨基酸位置都是按照kabat编号中记载的EU index而记载的)的280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308、309、310或314位中的至少1个位置的氨基酸残基。将人Cγ1的碱基序列示为序列号71、氨基酸序列示为序列号53。

作为人的免疫球蛋白，已知IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体包括这些同种型之中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

此外，本发明的抗体还包括抗体的Fc区域以外的部分被置换成具有抗原结合能力的其他肽的抗体。作为抗体的Fc区域以外的部分，可以列举例如可变区、CH1区域、绞链区等，但并不限于这些。抗体的同种型由恒定区的结构决定。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各同种型的恒定区分别被称为Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。本发明的抗体还包括在Cγ2、Cγ3、或Cγ4中选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308、309、310或314位中的至少1个位置的氨基酸被置换成Cys的抗体。将人Cγ2、Cγ3、Cγ4的碱基序列例示为序列号65、67、69。此外，将人Cγ2、Cγ3、Cγ4的氨基酸序列例示为序列号66、68、70。

应说明的是，在表1～表7中示出本说明书所附的序列表中记载的Cγ1(碱基序列序列号71；氨基酸序列序列号53)、Cγ2(碱基序列序列号65；氨基酸序列序列号66)、Cγ3(碱基序列序列号67；氨基酸序列序列号68)、以及Cγ4(碱基序列序列号69；氨基酸序列序列号70)的各序列中的密码以及氨基酸、与kabat的EU index的关系。表1～7中的密码以及氨基酸按从上到下的顺序、与序列表的N末端侧到C末端侧的密码以及氨基酸相对应。

应说明的是，本说明书中的恒定区的序列全部是以[Sequence ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)]为基础制作的。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

本发明的半胱氨酸还包括其衍生物。作为本发明的半胱氨酸衍生物，可以列举在半胱氨酸分子中加成有羟基、甲基、乙基、羧基、氨基等的化合物，构成半胱氨酸分子的原子、官能团部分缺失的化合物，构成半胱氨酸分子的原子、官能团部分被置换成其他原子、官能团的化合物等，但并不限于这些。

关于采用乳酸脱氢酶释放分析体系评价的ADCC活性，本发明的抗体与野生型抗体相比，ADCC活性上升(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比上升)。此外，286Cys型抗体、289Cys型抗体、305Cys型抗体、306Cys型抗体、307Cys型抗体、308Cys型抗体、290Cys型抗体、291Cys型抗体、292Cys型抗体、298Cys型抗体、302Cys型抗体、303Cys型抗体、309Cys型抗体特别在低浓度下，ADCC活性上升约2倍以上、优选约5倍以上、更优选约10倍以上、约100倍以上，进而优选约500倍以上、特别优选约1000倍以上(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比上升)。

此外，本发明的抗体具有得到改善的稳定性、溶解性、对Fc受体的结合亲和性、或CDC活性。本发明的抗体优选与野生型相比其稳定性、溶解性、对Fc受体的结合亲和性、或CDC活性没有变化或者上升。然而本发明的抗体只要至少ADCC活性上升即可，其稳定性、溶解性、对Fc受体的结合亲和性、或CDC活性减少的抗体也包括在本发明的抗体中。另外，作为Fc受体，可以列举FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn等，但并不限于这些。

本发明的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体这两者。单克隆抗体和多克隆抗体的制备和精制方法在本领域中是已知的，记载于例如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988)。

本发明的抗体的一种形态是人源化抗体。所谓“人源化抗体”，是指使结构与人的抗体类似的抗体，包括人型嵌合抗体(例如抗体的一部分被人源化的抗体、CH2区域被人源化的抗体、Fc区域被人源化的抗体、恒定区被人源化的抗体)、以及在恒定区以及可变区存在的CDR(互补性决定区域)以外的部分被人源化的人型CDR移植(CDR-grafted)抗体(P.T.Johons et al.，Nature 321，522(1986))、完全人源化抗体等。为了提高人型CDR移植抗体的抗原结合活性，已经开发出选择与小鼠抗体同源性高的人抗体FR的方法、制作同源性高的人源化抗体的方法、将小鼠CDR移植到人抗体之后进一步置换FR的氨基酸的方法的改良技术(参照美国专利第5585089号、美国专利第5693761号、美国专利第5693762号、美国专利第6180370号、欧州专利第451216号、欧州专利第682040号、日本特许第2828340号等)，还可以用于制作本发明的人型CDR移植抗体。

人型嵌合抗体可以如下制作，例如，将具有上述的H链可变区结构和/或L链可变区结构的抗体的恒定区置换成人抗体的恒定区。作为人抗体的恒定区，可以采用公知的区域。以下示出人型嵌合抗体的制作方法的一例。

首先，从对特定对象抗原产生小鼠抗体的杂交瘤中提取mRNA，根据常规方法合成cDNA。将所合成的cDNA组入载体，构建cDNA文库。根据该cDNA文库，通过将H链基因片段以及L链基因片段作为探针使用，来选择含有H链基因以及L链基因的载体。通过进行所选择载体的插入序列的测序，确定H链可变区以及L链可变区的基因序列。以如此得到的序列数据为基础，采用化学合成、生化学的切断/再结合等制作编码H链可变区的DNA。使所得到的编码H链可变区的DNA和编码人H链恒定区的DNA进行连接反应而组入到表达用载体中，由此制作H链表达载体。作为表达载体，可以使用例如基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV(乳头瘤病毒)的载体等，但并不限于这些。另一方面，采用同样的方法制作L链表达载体。通过这些H链表达载体以及L链表达载体将宿主细胞共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)(A.Wright&S.L.Morrison，J.Immunol.160，3393-3402(1998))、SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmanset al.，Eur.J.Cancer Prev.5，512-519(1996)，R.P.Junghans et al.，CancerRes.50，1495-1502(1990))等。此外，转化优选使用lipofectin法(R.W.Malone et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6077(1989)，P.L.Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413(1987)、电穿法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van der Eb，Virology 52，456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。

培养转化体后，从转化体的细胞内或培养液分离人型嵌合抗体。抗体的分离、精制可以将离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、蛋白A柱色谱法、蛋白G柱色谱法、蛋白L柱色谱法等方法适当组合利用。

另一方面，人型CDR移植抗体可以采用例如以下的方法来制作。首先，采用在上述嵌合抗体的制造方法栏中叙述的方法，确定对特定抗原的抗体的H链可变区以及L链可变区的氨基酸序列以及编码其的碱基序列。并且确定各CDR区域的氨基酸序列以及碱基序列。

接着，选择夹着CDR区域而存在的FR(框架区域)。FR的选择可以采用大约三种方法。第一种方法是使用NEWM、REI等已经清楚三维结构的人抗体框架的方法(Riechmann L.et al.，Nature 332，323-3Z7(1988)；Tempst，PR.et al.，Protein Engineering 7，1501-1507(1994)；Ellis JH.et al.，J.Immunol 155，925-937(1995))。第二种方法是从数据库中选择与目的小鼠抗体可变区具有最高同源性的人抗体可变区，使用其FR的方法(Queen C.et al.，Proc Natl Acad SciUSA 86，10029-10033(1989)；Rozak MJ.et al.，J Biol Chem 271，22611-22618(1996)；Shearman CW.et al.，J.Immunol 147，4366-4373(1991))。第三种方法是在人抗体的FR中选择最共通使用的氨基酸的方法(Sato K.et al.，MolImmunol 31，371-381(1994)；Kobinger F.et al.，Protein Engineering 6，971-980(1993)；Kettleborough CA.et al.，Protein Engineering 4，773-783(1991))。在本发明中可以使用这些任意的方法。

另外，即使是将所选择的人FR的氨基酸序列改变而得到的氨基酸序列，只要最终得到的人型CDR移植抗体对对象抗原具有特异的结合性，就可以作为FR的氨基酸序列利用。特别是所选择的人FR的一部分氨基酸变更为成为CDR的抗体的来源的FR的氨基酸时，抗体的特性得到维持的可能性很高。改变的氨基酸数目优选是FR全体的30％以下，更优选是FR全体的20％以下，进一步优选是FR全体的10％以下。

接着，将采用这些任一方法选择的FR和上述CDR组合，由此设计编码H链可变区以及L链可变区的DNA。以该设计为基础，通过化学合成、生化学的切断/再结合等分别制作编码H链可变区的DNA和编码L链可变区的DNA。接着将编码H链可变区的DNA与编码人免疫球蛋白H链恒定区的DNA一起组入到表达载体中，构建H链表达载体。同样地，将编码L链可变区的DNA与编码人免疫球蛋白L链恒定区的DNA一起组入到表达载体中，构建L链表达载体。作为表达载体，可以使用例如基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV(乳头瘤病毒)的载体等，但并不限于这些。

通过用以上方法制作的H链表达载体以及L链表达载体，将宿主细胞共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)(A.Wright&S.L.Morrison，J.Immunol.160，3393-3402(1998))、SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans etal.，Eur.J.Cancer Prev.5，512-519(1996)，R.P.Junghans et al.，Cancer Res.50，1495-1502(1990))等。此外，转化优选使用lipofectin法(R.W.Malone et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6077(1989)，P.L.Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413(1987)、电穿法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van der Eb，Virology 52，456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。

培养转化体后，从转化体的细胞内或培养液中将人型CDR移植抗体分离。抗体的分离、精制可以将离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、蛋白A柱色谱法、蛋白G柱色谱法、蛋白L柱色谱法等方法适当组合进行。

此外，人抗体的获取方法也是已知的。例如，在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴球，使致敏淋巴球与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，可以得到对抗原具有结合活性的所需人抗体(参照特公平1-59878)。此外，用所需抗原免疫具有人抗体基因的全部库的转基因动物，可以获得所需的人抗体(参照国际专利申请公开号WO 93/12227，WO 92/03918，WO 94/02602，WO 94/25585，WO 96/34096，WO96/33735)。

在进一步的实施方式中，抗体或抗体片断可以从使用McCafferty等(Nature，348：552-554(1990))中记载的技术而产生的抗体噬菌体文库中分离。Clackson等(Nature，352：624-628(1991))以及Marks等(J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))记述有使用了噬菌体文库的小鼠以及人抗体的分离。后续的发行物记述有采用链改组的高亲和性(nM范围)的人抗体的生成(Marks等，Bio/Technology，10：779-783[1992])，以及作为用于构建非常大的噬菌体文库的方针策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266[1993])。因此，这些技术是相对于传统的单克隆抗体杂交瘤法来分离单克隆抗体而实行的其他可能的方法。

在这一点上，细菌噬菌体(噬菌体)展示是能够检索很大的寡肽文库并可鉴定具有与多肽目标特异性结合能力的这些文库的成员的公知技术之一。噬菌体展示是各种多肽作为与细菌噬菌体粒子表面上的被覆蛋白质融合的蛋白而呈示出来的技术(Scott，J.K.以及Smith G.P.(1990)Science 249：386)。噬菌体展示的有用性在于，可以选择性地将随机化的蛋白质变异体(或随机克隆cDNA)的大文库就高亲和性地结合于目标分子的这些序列而快速且有效地进行分类。噬菌体中的肽(Cwirla，S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白质(Lowman，H.B.等(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)文库展示，用于对具有特异性结合特性的物质而筛选无数的多肽或寡肽(Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668)。随机突然变异体的噬菌体文库的分类需要构建大量变异体并使之增殖的方法、使用了目标受体的亲和性精制方法、以及评价结合增强结果的手段(参照美国专利第5223409号、美国专利第5403484号、美国专利第5571689号、以及美国专利第5663143号)。

大部分的噬菌体展示法都使用纤维状噬菌体，但还已知λ噬菌体展示系统(WO95/34683；美国专利第5627024号)、T4噬菌体展示系统(RenJ.等Gene 215：439(1998)；Zhu等Cancer Research，58(15)：3209-3214(1998)；Jiang等Infection&Immunity，65(11)：4770-4777(1997)；Ren等，Gene，195(2)：303-311(1997)；Ren，Protein Sci.5：1833(1996)；Efimov等VirusGenes 10：173(1995)以及T7噬菌体展示系统(Smith以及Scott Methods in Enzymology，217，228-257(1993)；美国专利第5766905号)。

现在，开发出对基础的噬菌体展示法进行许多改良以及变形的方法。通过这些改良，基于与所选择目标分子的结合性等、根据肽文库或蛋白质文库的特性、能力等进行筛选的方法得到改善。对于用于噬菌体展示法的重组反应手段，在WO98/14277中有记载。噬菌体展示文库用于分析和控制二分子间相互作用(WO98/20169；WO98/20159)以及限制性螺旋肽的特性(WO98/20036)。WO97/35196中记载有使噬菌体展示文库与下述溶液接触而选择性地分离结合配位体的、亲和性配位体的分离方法，所述溶液是配位体能够与目标分子结合的第一溶液、以及亲和性配位体不与目标分子结合的第二溶液。WO97/46251记载用亲和性精制抗体将随机噬菌体展示文库生物淘筛，接着将结合噬菌体分离，然后用微量反应板的孔进行微量淘筛，从而将高亲和性结合噬菌体分离的方法。还报道有作为金黄色葡萄球菌(Staphlylococcus aureus)蛋白质A的亲和性标签的使用(Li等，(1998)Mol Biotech.，9：187)。WO97/47314记载有使用可以是噬菌体展示文库的组合文库来识别酶特异性的基质消减文库。选择适于在噬菌体展示中使用的清洗剂中使用的酶的方法记载于WO97/09446中。选择特异性结合的蛋白质的进一步的方法记载于美国专利第5498538号、美国专利第5432018号、以及WO98/15833中。肽文库的制作以及这些文库的筛选方法记载于美国专利第5723286号、美国专利第5432018号、美国专利第5580717号、美国专利第5427908号、美国专利第5498530号、美国专利第5770434号、美国专利第5734018号、美国专利第5698426号、美国专利第5763192号、以及美国专利第5723323号中。

进而，还知道使用人抗体文库、通过淘筛来获取人抗体的技术。例如，可以将人抗体的可变区作为一根链抗体(scFv)并采用噬菌体展示法使之在噬菌体的表面表达，从而能选择与抗原结合的噬菌体。只要解析所选择的噬菌体的基因，就可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果明确与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以制作具有该序列的适当表达载体，通过导入到适当的宿主中使其表达来获取人抗体。这些方法已经是公知的，可以参考WO 92/01047、WO92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388来实施。

作为其他的方法，使用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553[1990])，从非免疫化供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库可以在体外生产人抗体以及抗体片断。根据该技术，在框架单位中，用纤维状细菌噬菌体、例如M13噬菌体或fd的被覆蛋白质基因中的任一个克隆抗体V结构域基因，在噬菌体粒子的表面作为功能性抗体片断而呈示出来。由于纤维状粒子含有噬菌体基因组的一根链DNA复制品，因此基于抗体的功能特性的选择，结果完成了编码显示这些特性的抗体的基因的选择。因此，该噬菌体模仿B细胞的几个特性。噬菌体展示可以采用多样形式进行；参照例如Johnson，Kevin S.以及Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。可以将V-基因片段的几个供给源用于噬菌体展示。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从源于免疫化的小鼠脾脏的V基因的小随机组合文库中分离各种大量的抗-噁唑酮抗体。可以构成非免疫化人供体的V基因库，对各种大量抗原(包括自身抗原)的抗体可以直接根据Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)、或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)记载的技术进行分离。此外，参照美国专利第5565332号以及美国专利5573905号。

本发明的抗体还包括本发明的抗体和其他肽或蛋白质融合而成的融合蛋白质。制作融合蛋白质的方法，可以使框架一致地将编码本发明的抗体的聚核苷酸和编码其他肽或多肽的聚核苷酸连接，并将其导入到表达载体中，使之在宿主中表达，可以采用本领域技术人员公知的方法。作为在与本发明的抗体融合中加入的其他肽或多肽，可以使用例如FLAG(Hopp，T.P.et al.，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、由6个His(组氨酸)残基构成的6×His、10×His、流行性感冒血凝集素(HA)、人c-myc的片断、VSV-GP的片断、p18HIV的片断、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原的片断、lck tag、α-tubulin的片断、B-tag、蛋白C的片断等公知的肽。此外，作为在与本发明的抗体的融合中加入的其他多肽，可以列举例如GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流行性感冒血凝集素)、β-半乳糖酶、MBP(麦芽糖结合蛋白质)等。

此外，在本发明的抗体中，还可以赋予或改变糖链，或置换成岩藻糖缺损糖链。糖链向抗体的赋予可以如下进行，使导入于糖链的溴乙酰基与经变异而导入的半胱氨酸中的-SH基结合，从而在抗体中导入糖链。通过糖链、肽或多肽的赋予，可以提高抗体的效应功能。作为效应功能，可以列举ADCC活性、补体依赖性细胞毒作用(CDC)活性，但并不限于这些。

进而，本发明的抗体还包括部分氨基酸经受乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化等化学修饰的抗体。这样的化学修饰可以根据本领域技术人员公知的方法进行。

本发明的抗体可以与提高其他效应功能的技术组合使用。作为提高其他效应功能的技术，包括使用将岩藻糖转移酶敲除(knock out)或敲减(knock down)而得的CHO细胞等培养细胞来进行生产的技术(WO2003/085119)，或用原来的氨基酸以外的氨基酸置换抗体重链中的氨基酸残基的技术(WO 2004/029207、WO 2000/042072)，但并不限于此。

本发明的抗体以与效应细胞表面的FcγRI、FcγRII、或FcγRIII结合为其特征。效应功能还通过Fc受体(FcR)与抗体的Fc区域的相互作用而传播。Fc受体作为造血细胞上存在的分化的细胞表面受体是已知的。Fc受体之中，对IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，对IgE的Fc受体被称为FcεR，对IgA的Fc受体被称为FcαR，FcR根据免疫球蛋白同种型定义。关于Fcγ受体，确认有FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和FcγRIII(CD16)这3种亚型。各FcγR亚型由2个或3个基因编码，且选择性RNA剪切获得多个转录物，因此FcγR异构体中存在广泛的多样性。编码FcγRI亚型(FcγRIA、FcγRIB、和FcγRIC)的3个基因在第1染色体长臂的区域1q21.1中形成簇，编码FcγRII异构体(FcγRIIA、FcγRIIB、和FcγRIIC)的基因以及编码FcγRIll(FcγRIIIA和FcγRIIIB)的2个基因都在区域1q22形成簇。FcR在Ravetch andKinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；and de Haas et al.，J Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中概述。

FcγRI以高亲和性与IgG单体结合，另一方面，FcγRII和FcγRIII是低亲和性的受体，与复合型或块状的IgG相互作用。作为用于检测这些低亲和性受体的古典方法，已知使用被通过IgG致敏的抗体覆盖的红血球(EA)的“形成玫瑰花结”(Bredius et al.Immunology 83：624-630(1994)。此外，关于玫瑰花结分析，请参照Tax et al.J.Immunol.133(3)：1185-1189(1984)；Nagarajan et al.J.Biol.Chem.270(43)：25762-25770(1995)；和Warmerdam et al.J.Immunol.147(4)：1338-1343(1991))。

在本发明中，作为效应细胞，没有特别限制，但可以列举例如PBMC。

此外，本发明提供编码本发明的抗体的核酸、插入有该核酸的载体、以及导入有该载体的转化细胞。作为载体的例子，可以列举M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，以cDNA的亚克隆、切出为目的时，除了上述载体之外，还可以列举例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。

作为表达载体，例如，以在大肠杆菌中表达为目的时，除了具有载体在大肠杆菌中得到扩增这样的上述特征之外，在宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌时，具有在大肠杆菌中可以有效表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等，Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better等，Science(1988)240，1041-1043)、或T7启动子等也是不可或缺的。作为这样的载体，除了上述载体之外，还可以列举pGEX-5X-1(Pharmacia公司制)、“QIAexpress system”(Qiagen公司制)、pEGFP、或pET(此时，宿主优选使T7RNA聚合酶表达的BL21)等。

此外，在载体中还可以含有用于分泌多肽的信号序列。作为分泌蛋白质的信号序列，使之在大肠杆菌的外周胞质中产生时，使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)即可。载体向宿主细胞的导入可以采用例如氯化钙法、电穿法来进行。

除了大肠杆菌以外，还可以列举例如源于哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(In vitro gene公司制)、pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM8)、源于昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC baculovairus expression system”(Gibco BRL公司制)、pBacPAK8)、源于植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、源于动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、源于逆转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、源于酵母的表达载体(例如“PichiaExpression Kit”(In vitro gene公司制)、pNV11、SP-Q01)、源于枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。

以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达为目的时，具有使之在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等，Nature(1979)277，108)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV启动子等是不可或缺的，进一步优选具有用于挑选向细胞的转化的基因(例如、通过药品(新霉素、G418、嘌呤霉素等)可以辨别的药品耐受性基因)。作为具有这种特性的载体，可以列举例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

进而，以使基因稳定表达、且扩增细胞内的基因复制品数为目的时，可以列举在缺损核酸合成路径的CHO细胞中导入具有与其互补的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，并用氨甲喋呤(MTX)使之扩增的方法，此外，以基因的暂时性表达为目的时，可以列举使用在染色体上具有使SV40 T抗原表达的基因的COS细胞、用具有SV40复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。作为复制开始点，还可以使用来源于多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的物质。进而，为了扩增宿主细胞系中的基因复制品数，表达载体可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。

作为导入有载体的宿主细胞没有特别限制，可以使用例如大肠杆菌或各种动物细胞等。宿主细胞可以作为例如用于制造或表达本发明抗体的产生系而使用。用于制造多肽的产生系，有体外和体内的产生系。作为体外的产生系，可以列举使用真核细胞的产生系或使用原核细胞的产生系。

使用真核细胞时，例如，可以在宿主中使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，已知哺乳类细胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero；两生类细胞，例如非洲爪蟾卵母细胞(Valle，et al.，Nature(1981)291，358-340)；或昆虫细胞，例如Sf9、Sf21、Tn5。在本发明中，优选使用CHO-DG44、CHO-DXB11、COS7细胞、BHK细胞。在动物细胞中，以大量表达为目的时，特别优选CHO细胞。载体向宿主细胞的导入可以采用例如磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用了阳离子脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim公司制)的方法、电穿法、lipofection等方法进行。

作为植物细胞，已知将源于例如烟草(Nicotiana tabacum)的细胞作为蛋白质生产系，并将其进行愈伤组织培养即可。作为真菌细胞，已知酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)属、例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)；丝状菌，例如曲霉(Aspergillus)属、例如黑曲霉(Aspergillus niger)。

使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生株系。作为细菌细胞，可以列举大肠杆菌(E.coli)，例如JM109、DH5α、HB101等，除此之外，还已知枯草杆菌。将用本发明的DNA进行转化而成的细胞在体外培养，采用本领域技术人员通常进行的方法进行精制，可以得到本发明的抗体。

此外，本发明还提供具有载体的宿主生物，该载体含有编码本发明抗体的核酸。本发明的宿主生物在产生重组型抗体方面有用。作为本发明的宿主生物，可以列举山羊等。例如，本发明的转基因山羊的制作可以如下进行。即，构建在编码于乳汁中固有地产生的蛋白质(山羊β酪蛋白等)的基因内部、在框架内插入有抗体基因的融合基因。将含有插入有抗体基因的融合基因的DNA片断注入山羊的胚中，将该注入胚导入雌山羊。从接受胚的山羊生的转基因山羊或其子孙后代所产生的乳汁中，可以获取本发明的抗体。为了增加从转基因山羊中产生的含有本发明抗体的乳汁量，也可以在转基因山羊中适当使用激素(Ebert，K.M.etal.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。

本发明的抗体优选是识别在要赋予细胞毒的靶细胞表面存在的分子的抗体。作为要赋予细胞毒的靶细胞来源，优选是人，但并不限于此。此外，作为要赋予细胞毒的靶细胞，没有特别限制，可以列举例如癌细胞、Raji、KG-1a、TL-1、HUT78、Jurkat、BALL-1、HEPG2、MKN-7、KB、或Hela，但并不限于这些。作为在要赋予细胞毒的靶细胞表面存在的分子(抗原)，可以列举例如选自CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF中的目标抗原，但并不限于这些。

作为290Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号93记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为291Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号99记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为292Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号105记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为293Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号113记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号111记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号115记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为294Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号45记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为298Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号81记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为299Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号119记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号117记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号121记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为300Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号125记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号123记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(3)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为Fc区域的序列号127记载的氨基酸序列；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为301Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号87记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为302Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号129记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为303Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号135记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为304Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号141记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链；

作为286Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号147记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为287Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号153记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为288Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号159记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为289Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号165记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为305Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号171记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为306Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号177记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为307Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号183记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为308Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号189记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为309Cys型抗CD20抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(1)含有具有如下氨基酸序列的H链的抗体，所述氨基酸序列是作为CDR1的序列号47记载的氨基酸序列、作为CDR2的序列号49记载的氨基酸序列、作为CDR3的序列号51记载的氨基酸序列、和作为CH的序列号243记载的氨基酸序列；

(2)含有具有序列号241记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

作为298Cys型抗EGFR抗体，具体可以列举以下的抗体，但并不限于这些。

(2)含有具有序列号209记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号201记载的氨基酸序列的L链。

如上所述，本发明的抗体还包括人源化(humanized)抗体等重组抗体。人源化抗体包括嵌合(chimeric)抗体(特别是人型嵌合抗体)、CDR移植抗体(特别是人型CDR移植抗体)。这些抗体的具体说明如上所述。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的290Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号94记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号92记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号96记载的碱基序列编码Fc区域的H链的抗体；

(i)具有由序列号57记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号59记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号61记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号63记载的碱基序列编码的CL的L链；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的291Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号100记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号98记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号102记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的292Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号106记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号104记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号108记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

作为编码293Cys型抗CD20抗体的DNA，可以列举以下的DNA。此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的293Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号112记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号110记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号114记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的294Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号52记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号44记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号72记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的298Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号82记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号80记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号84记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的299Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号118记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号116记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号120记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的300Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号124记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号122记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号126记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的301Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号88记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号86记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号90记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的302Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号130记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号128记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号132记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的303Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号136记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号134记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号138记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的304Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号142记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号140记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号144记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的286Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号148记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号146记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号150记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的287Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号154记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号152记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号156记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的288Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号160记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号158记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号162记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的289Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号166记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号164记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号168记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的305Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号172记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号170记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号174记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的306Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号178记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号176记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号180记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的307Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号184记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号182记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号186记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的308Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号190记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号188记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号192记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的309Cys型抗CD20抗体。

(1)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号242记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号240记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号46记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号48记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号50记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号244记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(ii)由序列号55记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供例如下述(1)～(4)中任一项所述的298Cys型抗EGFR抗体。

(1)含有具有由序列号194记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号196记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号198记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号82记载的碱基序列编码的CH的H链的抗体；

(2)含有由序列号208记载的碱基序列编码的H链的抗体；

(3)含有具有由序列号194记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号196记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号198记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号84记载的碱基序列编码的Fc区域的H链的抗体；

(i)具有由序列号202记载的碱基序列编码的CDR1、由序列号204记载的碱基序列编码的CDR2、由序列号206记载的碱基序列编码的CDR3、和由序列号246记载的碱基序列编码的CL的L链；

(ii)由序列号200记载的碱基序列编码的L链。

此外，本发明还提供选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308、309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸被置换成半胱氨酸的Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4。这样的Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4在ADCC活性得到增强的抗体的制造中有用。

只要是本领域技术人员，通过例如将上述选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸被置换成Cys的Cγ1、Cγ2、Cγ3、或Cγ4与任意抗体可变区组合，就可以制造ADCC活性得到增强的识别任意抗原的抗体。而且只要是本领域技术人员，通过例如将上述选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸被置换成Cys的Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4的Fc区域与任意抗体Fab区域组合，就可以制造ADCC活性得到增强的识别任意抗原的抗体。如上所述，本发明的抗体优选是识别在要赋予细胞毒的靶细胞表面存在的分子的抗体。此外，作为要赋予细胞毒的靶细胞的来源，优选是人，但并不限于此。作为在要赋予细胞毒的靶细胞表面存在的分子(抗原)，可以列举例如选自CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF中的目标抗原，但并不限于这些。

本发明还提供包括如下工序的ADCC活性得到增强的抗体的制造方法，所述工序是在H链恒定区中，将选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸的工序。

作为该制造方法的一个方式，在本领域技术人员公知的具有ADCC活性的抗体的H链恒定区中，将选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸。但并不限于本领域技术人员公知的具有ADCC活性的抗体的获得方法。例如，可以由实施本发明制造方法的人来自己制造，也可以由他人购买。作为将氨基酸残基置换成半胱氨酸的方法，可以列举例如部位特异性变异诱发法(Hashimoto-Gotoh，T，Mizuno，T，Ogasahara，Y，and Nakagawa，M.(1995)Anoligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis.Gene 152，271-275、Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned intoM13 vectors.Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W，Drutsa，V，Jansen，HW，Kramer，B，Pflugfelder，M，andFritz，HJ(1984)The gappedduplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction.Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer W，and FritzHJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA Methods.Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection.Proc Natl Acad Sci U S A.82，488-492)。使用该方法，可以将抗体所需的氨基酸置换成半胱氨酸。

作为该制造方法的另外的方式，首先，通过本领域技术人员周知的方法，得到与所需抗原结合的抗体。如果获得的抗体是非人动物抗体，还可以进行人源化。接着，通过本领域技术人员周知的方法判定所获得的抗体是否具有ADCC活性。抗体的ADCC活性可以采用例如实施例记载的乳酸脱氢酶释放分析系测定，但并不限于该方法，还可以通过例如Cr51-release assay测定。接着，在判定为具有ADCC活性的抗体的H链恒定区中，将选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸。

更具体地说，提供包括以下的(a)以及(b)工序的、ADCC活性得到增强的抗体的制造方法。

(a)使编码H链的DNA、以及编码L链的DNA表达的工序，所述H链在H链恒定区中，选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸。

(b)回收工序(a)的表达产物的工序。

在本发明的制造方法中，首先，使编码H链的DNA、和编码具有ADCC活性的抗体的L链的DNA表达，该编码H链的DNA是编码具有ADCC活性的抗体的变异体的H链的DNA，该H链选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的H链。编码H链，即，在H链恒定区中，选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的H链的DNA可以如下获得，例如，获取编码野生型H链的DNA的H链恒定区部分，导入适当置换，使得编码该H链恒定区中的特定氨基酸的密码编码半胱氨酸。应说明的是，编码半胱氨酸密码是TGT或TGC。

此外，预先设计编码野生型H链的恒定区部分的氨基酸被半胱氨酸置换的蛋白质的DNA，将该DNA化学合成，也可以得到编码如下H链的DNA，即，在H链恒定区中，选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的H链。

此外，编码如下H链的DNA可以分成部分DNA来制造，该H链是在Fc区域的H链恒定区中，选自286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的H链。作为部分DNA的组合，可以列举例如编码可变区的DNA和编码恒定区的DNA、或编码Fab区域的DNA和编码Fc区域的DNA，但并不限于这些组合。编码L链的DNA也可以同样地分成部分DNA来制造。

例如，作为使编码选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308以及309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的H链恒定区的DNA、编码H链可变区的DNA、编码L链恒定区的DNA、编码H链恒定区的DNA表达的方法，可以列举以下方法。即，将编码H链可变区的DNA与编码H链恒定区的DNA一起组入表达载体中，构建H链表达载体。同样地将编码L链可变区的DNA与编码L链恒定区的DNA一起组入表达载体，构建L链表达载体。作为表达载体，可以使用例如基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV(乳头瘤病毒)的载体等，但并不限于这些。

作为将上述4个DNA导入载体的方法，包括将4个DNA导入1个载体的方法、将4个DNA分开导入2个载体的方法、将4个DNA分开导入3个载体的方法(在1个载体中导入1个DNA、在另一个载体中导入1个DNA、在剩余的载体中导入2个DNA的方法)、将4个DNA导入4个载体的方法(将4个DNA分别导入各个载体的方法)。在此，将4个DNA分开导入2个载体时以及分开导入3个载体时，4个DNA的分组没有任何限制。

采用通过以上方法制作的抗体表达载体将宿主细胞共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)等上述细胞等。此外，转化优选使用lipofectin法(R.W.Malone et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077(1989)，P.L.Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84,7413(1987)、电穿法、磷酸钙法(F.L.Graham & A.J.van der Eb，Virology 52，456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。

在本发明的抗体的制造方法中，接着，回收在工序(a)中得到的表达产物。表达产物的回收可以如下进行，例如，培养转化体后，从转化体的细胞内或培养液中分离。抗体的分离、精制可以将离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、蛋白A、蛋白G、蛋白L柱、亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等方法适当组合来进行。

通过上述方法可以增强抗体的ADCC活性。即，本发明还提供包括如下工序的将抗体ADCC活性增强的方法，所述工序是在H链恒定区中，将选自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸的工序。

本发明提供含有本发明的抗体和医药上能容许的担载体的医药组合物。本发明还提供包括给予本发明的抗体的、哺乳动物的治疗方法。作为哺乳动物，可以列举人、非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猴子等)。抗体是识别CD20的抗体时，本发明的医药组合物在B细胞性恶性淋巴瘤等的治疗中有用。此外，抗体是识别EGFR的抗体时，在肺癌等的治疗中有用。此外，抗体是识别Her2的抗体时，在乳癌等的治疗中有用。

本发明的医药组合物除了抗体外还可以导入医药上能容许的担载体、用公知的方法制剂化。例如，可以采用与水或除水以外的药学上能容许的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂形式，非经口使用。例如与药理学上容许的担载体或媒介，具体地说，与灭菌水或生理食盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、结合剂等适当组合，采用一般认可的制药实施所要求的单位用量形态进行混合来制剂化。这些制剂中的有效成分量设为可获得所标识范围的适当容量。

用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸留水那样的媒介物，根据通常的制剂进行配药。

作为注射用的水溶液，可以列举例如生理食盐水、含有葡萄糖或其他辅助药的等渗液，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，还可以与适当的溶解辅助剂，例如醇、具体地说是乙醇、多元醇、例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂、例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50合用。

作为油性液体可以列举芝麻油、大豆油，还可以与作为溶解辅助剂的苯甲酸苄酯、苄醇合用。此外，还可以与如下物质合用：缓冲剂，例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液；无痛化剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定剂，例如苄醇、苯酚、抗氧化剂。制备的注射液通常填充于适当的安瓿中。

给药优选非经口给药，具体可以列举注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药型等。作为注射剂型的例子，例如，可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给药。

此外，可以根据患者的年龄、症状而选择适当的给药方法。作为含有抗体或编码抗体的聚核苷酸的医药组合物的给药量，例如，可以在每1kg体重一次0.0001mg～1000mg的范围内选择。或者，例如可以对每个患者以0.001～100000mg/个体的范围选择给药量，但并不一定限于这些数值。给药量、给药方法根据患者的体重、年龄、症状等而变化，但是只要是本领域技术人员，就能够适当选择。

此外，本发明还提供判定受验抗体的ADCC活性是否得到增强的方法。具体地说，提供如下方法，即，在以下的工序(b)中测定的ADCC活性高于置换前的ADCC活性时，则判定以下的工序(a)的抗体的ADCC活性得到增强。

(a)提供具有ADCC活性的抗体的变异体，即，选自H链恒定区中的280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的抗体的工序；和

(b)测定工序(a)的抗体的ADCC活性的工序。

此外，本发明提供使用上述判定方法、筛选ADCC活性得到增强的抗体的方法。具体地说，提供包括以下的(a)～(d)的工序的、ADCC活性得到增强的抗体的筛选方法。

(a)提供具有ADCC活性的抗体的工序；

(b)将选自工序(a)的抗体的H链恒定区中的280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308和309、310以及314位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸的工序；

(c)用上述方法判定在工序(b)中得到的抗体的ADCC活性是否得到增强的工序；

(d)选择在工序(c)中判定ADCC活性得到增强的抗体的工序。

在这些判定方法、和筛选方法中，具有ADCC活性的抗体只要具有ADCC活性就没有特别限制。具有ADCC活性的抗体的获取方法如上所述。

应说明的是，本说明书中公开的抗体的碱基序列和氨基酸序列按照以下的序列号记载于序列表中。

<290Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号92：H链全长的碱基序列(290Cys型)

序列号93：H链全长的氨基酸序列(290Cys型)

序列号94：H链恒定区的碱基序列(290Cys型)

序列号95：H链恒定区的氨基酸序列(290Cys型)

序列号96：H链Fc区域的碱基序列(290Cys型)

序列号97：H链Fc区域的氨基酸序列(290Cys型)

<291Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号98：H链全长的碱基序列(291Cys型)

序列号99：H链全长的氨基酸序列(291Cys型)

序列号100：H链恒定区的碱基序列(291Cys型)

序列号101：H链恒定区的氨基酸序列(291Cys型)

序列号102：H链Fc区域的碱基序列(291Cys型)

序列号103：H链Fc区域的氨基酸序列(291Cys型)

<292Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号104：H链全长的碱基序列(292Cys型)

序列号105：H链全长的氨基酸序列(292Cys型)

序列号106：H链恒定区的碱基序列(292Cys型)

序列号107：H链恒定区的氨基酸序列(292Cys型)

序列号108：H链Fc区域的碱基序列(292Cys型)

序列号109：H链Fc区域的氨基酸序列(292Cys型)

<293Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号110：H链全长的碱基序列(293Cys型)

序列号111：H链全长的氨基酸序列(293Cys型)

序列号112：H链恒定区的碱基序列(293Cys型)

序列号113：H链恒定区的氨基酸序列(293Cys型)

序列号114：H链Fc区域的碱基序列(293Cys型)

序列号115：H链Fc区域的氨基酸序列(293Cys型)

<294Cys型抗CD20抗体>

序列号44：H链全长的碱基序列(294Cys型)

序列号45：H链全长的氨基酸序列(294Cys型)

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号52：H链恒定区的碱基序列(294Cys型)

序列号54：H链恒定区的氨基酸序列(294Cys型)

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号72：H链Fc区域的碱基序列(294Cys型)

序列号73：H链Fc区域的氨基酸序列(294Cys型)

<298Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号80：H链全长的碱基序列(298Cys型)

序列号81：H链全长的氨基酸序列(298Cys型)

序列号82：H链恒定区的碱基序列(298Cys型)

序列号83：H链恒定区的氨基酸序列(298Cys型)

序列号84：H链Fc区域的碱基序列(298Cys型)

序列号85：H链Fc区域的氨基酸序列(298Cys型)

<299Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号116：H链全长的碱基序列(299Cys型)

序列号117：H链全长的氨基酸序列(299Cys型)

序列号118：H链恒定区的碱基序列(299Cys型)

序列号119：H链恒定区的氨基酸序列(299Cys型)

序列号120：H链Fc区域的碱基序列(299Cys型)

序列号121：H链Fc区域的氨基酸序列(299Cys型)

<300Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号122：H链全长的碱基序列(300Cys型)

序列号123：H链全长的氨基酸序列(300Cys型)

序列号124：H链恒定区的碱基序列(300Cys型)

序列号125：H链恒定区的氨基酸序列(300Cys型)

序列号126：H链Fc区域的碱基序列(300Cys型)

序列号127：H链Fc区域的氨基酸序列(300Cys型)

<301Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号86：H链全长的碱基序列(301Cys型)

序列号87：H链全长的氨基酸序列(301Cys型)

序列号88：H链恒定区的碱基序列(301Cys型)

序列号89：H链恒定区的氨基酸序列(301Cys型)

序列号90：H链Fc区域的碱基序列(301Cys型)

序列号91：H链Fc区域的氨基酸序列(301Cys型)

<302Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号128：H链全长的碱基序列(302Cys型)

序列号129：H链全长的氨基酸序列(302Cys型)

序列号130：H链恒定区的碱基序列(302Cys型)

序列号131：H链恒定区的氨基酸序列(302Cys型)

序列号132：H链Fc区域的碱基序列(302Cys型)

序列号133：H链Fc区域的氨基酸序列(302Cys型)

<303Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号134：H链全长的碱基序列(303Cys型)

序列号135：H链全长的氨基酸序列(303Cys型)

序列号136：H链恒定区的碱基序列(303Cys型)

序列号137：H链恒定区的氨基酸序列(303Cys型)

序列号138：H链Fc区域的碱基序列(303Cys型)

序列号139：H链Fc区域的氨基酸序列(303Cys型)

<304Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号140：H链全长的碱基序列(304Cys型)

序列号141：H链全长的氨基酸序列(304Cys型)

序列号142：H链恒定区的碱基序列(304Cys型)

序列号143：H链恒定区的氨基酸序列(304Cys型)

序列号144：H链Fc区域的碱基序列(304Cys型)

序列号145：H链Fc区域的氨基酸序列(304Cys型)

<286Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号146：H链全长的碱基序列(286Cys型)

序列号147：H链全长的氨基酸序列(286Cys型)

序列号148：H链恒定区的碱基序列(286Cys型)

序列号149：H链恒定区的氨基酸序列(286Cys型)

序列号150：H链Fc区域的碱基序列(286Cys型)

序列号151：H链Fc区域的氨基酸序列(286Cys型)

<287Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号152：H链全长的碱基序列(287Cys型)

序列号153：H链全长的氨基酸序列(287Cys型)

序列号154：H链恒定区的碱基序列(287Cys型)

序列号155：H链恒定区的氨基酸序列(287Cys型)

序列号156：H链Fc区域的碱基序列(287Cys型)

序列号157：H链Fc区域的氨基酸序列(287Cys型)

<288Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号158：H链全长的碱基序列(288Cys型)

序列号159：H链全长的氨基酸序列(288Cys型)

序列号160：H链恒定区的碱基序列(288Cys型)

序列号161：H链恒定区的氨基酸序列(288Cys型)

序列号162：H链Fc区域的碱基序列(288Cys型)

序列号163：H链Fc区域的氨基酸序列(288Cys型)

<289Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号164：H链全长的碱基序列(289Cys型)

序列号165：H链全长的氨基酸序列(289Cys型)

序列号166：H链恒定区的碱基序列(289Cys型)

序列号167：H链恒定区的氨基酸序列(289Cys型)

序列号168：H链Fc区域的碱基序列(289Cys型)

序列号169：H链Fc区域的氨基酸序列(289Cys型)

<305Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号170：H链全长的碱基序列(305Cys型)

序列号171：H链全长的氨基酸序列(305Cys型)

序列号172：H链恒定区的碱基序列(305Cys型)

序列号173：H链恒定区的氨基酸序列(305Cys型)

序列号174：H链Fc区域的碱基序列(305Cys型)

序列号175：H链Fc区域的氨基酸序列(305Cys型)

<306Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号176：H链全长的碱基序列(306Cys型)

序列号177：H链全长的氨基酸序列(306Cys型)

序列号178：H链恒定区的碱基序列(306Cys型)

序列号179：H链恒定区的氨基酸序列(306Cys型)

序列号180：H链Fc区域的碱基序列(306Cys型)

序列号181：H链Fc区域的氨基酸序列(306Cys型)

<307Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号182：H链全长的碱基序列(307Cys型)

序列号183：H链全长的氨基酸序列(307Cys型)

序列号184：H链恒定区的碱基序列(307Cys型)

序列号185：H链恒定区的氨基酸序列(307Cys型)

序列号186：H链Fc区域的碱基序列(307Cys型)

序列号187：H链Fc区域的氨基酸序列(307Cys型)

<308Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号188：H链全长的碱基序列(308Cys型)

序列号189：H链全长的氨基酸序列(308Cys型)

序列号190：H链恒定区的碱基序列(308Cys型)

序列号191：H链恒定区的氨基酸序列(308Cys型)

序列号192：H链Fc区域的碱基序列(308Cys型)

序列号193：H链Fc区域的氨基酸序列(308Cys型)

<309Cys型抗CD20抗体>

序列号46：H链CDR1的碱基序列

序列号47：H链CDR1的氨基酸序列

序列号48：H链CDR2的碱基序列

序列号49：H链CDR2的氨基酸序列

序列号50：H链CDR3的碱基序列

序列号51：H链CDR3的氨基酸序列

序列号55：L链全长的碱基序列

序列号56：L链全长的氨基酸序列

序列号57：L链CDR1的碱基序列

序列号58：L链CDR1的氨基酸序列

序列号59：L链CDR2的碱基序列

序列号60：L链CDR2的氨基酸序列

序列号61：L链CDR3的碱基序列

序列号62：L链CDR3的氨基酸序列

序列号63：L链恒定区的碱基序列

序列号64：L链恒定区的氨基酸序列

序列号240：H链全长的碱基序列(309Cys型)

序列号241：H链全长的氨基酸序列(309Cys型)

序列号242：H链恒定区的碱基序列(309Cys型)

序列号243：H链恒定区的氨基酸序列(309Cys型)

序列号244：H链Fc区域的碱基序列(309Cys型)

序列号245：H链Fc区域的氨基酸序列(309Cys型)

<298Cys型抗EGFR抗体>

序列号194：H链CDR1的碱基序列

序列号195：H链CDR1的氨基酸序列

序列号196：H链CDR2的碱基序列

序列号197：H链CDR2的氨基酸序列

序列号198：H链CDR3的碱基序列

序列号199：H链CDR3的氨基酸序列

序列号200：L链全长的碱基序列

序列号201：L链全长的氨基酸序列

序列号202：L链CDR1的碱基序列

序列号203：L链CDR1的氨基酸序列

序列号204：L链CDR2的碱基序列

序列号205：L链CDR2的氨基酸序列

序列号206：L链CDR3的碱基序列

序列号207：L链CDR3的氨基酸序列

序列号246：L链恒定区的碱基序列

序列号247：L链恒定区的氨基酸序列

序列号208：H链全长的碱基序列(298Cys型)

序列号209：H链全长的氨基酸序列(298Cys型)

序列号82：H链恒定区的碱基序列(298Cys型)

序列号83：H链恒定区的氨基酸序列(298Cys型)

序列号84：H链Fc区域的碱基序列(298Cys型)

序列号85：H链Fc区域的氨基酸序列(298Cys型)

实施例

以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例中记载的方式。

〔实施例1〕

制作293、294、298、299、300、以及301Cys型的Anti-CD20嵌合抗体，评价这些各种Cys型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性。其结果是，与野生型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性相比，294、298、以及301Cys型Anti-CD20嵌合抗体显示出非常高的ADCC活性。

以下记载Anti-CD20嵌合抗体的野生型和3种变异型(294Cys、298Cys、301Cys)的制作方法以及其的ADCC活性测定和对CD20分子的反应性。

1)Anti-CD20嵌合抗体的制作

嵌合抗体经过以下的A)～F)工序，得到精制嵌合抗体。

A)在制作嵌合抗体上必需的基因的克隆；

B)所克隆的基因的变异导入；

C)构建组合了克隆的基因及该导入变异的基因的嵌合抗体表达载体；

D)嵌合抗体表达载体向CHO细胞的基因导入和嵌合抗体高表达的CHO细胞的筛选；

E)嵌合抗体高表达CHO细胞的培养；

F)从嵌合抗体高表达细胞的培养上清的柱精制。

以下依次记载A)～F)工序。

A)在制作嵌合抗体上必需的基因的克隆

为了制作1种Anti-CD20嵌合抗体，必需4种基因。这4种基因是Anti-CD20小鼠L链可变区基因、Anti-CD20小鼠H链可变区基因、人IgG1L链恒定区基因、人IgG1H链恒定区基因。对于该基因的克隆实施例，在以下记述。

(Anti-CD20小鼠L链可变区基因)

使用Quick Prep micro mRNA purification kit(AmershamBiosciences，code 27-9255-01)，由本申请人拥有的产生Anti-CD20小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞得到mRNA。使用First-Strand cDNASynthesis kit(Amersham Biosciences，code 27-9261-01)，将该mRNA制成cDNA。将该cDNA作为模板，采用PCR法使基因扩增，采用以下所示的11种模式的引物的组合进行PCR反应。

PCR反应条件如下：

来自小鼠杂交瘤的cDNA 4μL

2.5mM dNTPs 4μL

MKV1～MKV11引物(20μM)的11种中的1个 2.5μL

MKC引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 28.5μL

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(30次循环)

72℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的DNA序列参照以下。

MKV1引物：ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG(序列号1)

MKV2引物：ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG(序列号2)

MKV3引物：ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG(序列号3)

MKV4引物：ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG(序列号4)

MKV5引物：ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC(序列号5)

MKV6引物：ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG(序列号6)

MKV7引物：ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG(序列号7)

MKV8引物：ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG(序列号8)

MKV9引物：ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG(序列号9)

MKV10引物：ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT(序列号10)

MKV11引物：ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC(序列号11)

MKC引物：ACTGGATGGTGGGAAGATGG(序列号12)

(M＝A或C，R＝A或G，W＝A或T，S＝C或G，Y＝C或T，K＝G或T)

在PCR反应中，通过MKV5和MKC引物的组合，Anti-CD20小鼠L链可变区基因得到扩增，该基因被暂时插入pCR2.1载体(Invitogen)中保存。此外，将插入有该基因的载体命名为pCR2.1-MLV。将经基因克隆的Anti-CD20小鼠L链可变区的DNA序列附于图1。

此外，将Anti-CD20小鼠L链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的碱基序列分别示为序列号57、59、61。此外，将Anti-CD20小鼠L链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示为序列号58、60、62。

(Anti-CD20小鼠H链可变区基因)

与Anti-CD20小鼠L链可变区基因的克隆同样，将由产生Anti-CD20小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞制备的cDNA作为模板，进行以下所示的12模式的PCR扩增。

来自小鼠杂交瘤的cDNA 4μL

2.5mM dNTPs 4μL

MHV1～MHV12引物(20μM)的12种中的1个 2.5μL

MHCG2b引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 28.5μL

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(30次循环)

72℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的DNA序列参照以下。

MHV1引物：ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC(序列号13)

MHV2引物：ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT(序列号14)

MHV3引物：ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT(序列号15)

MHV4引物：ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT(序列号16)

MHV5引物：ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT(序列号17)

MHV6引物：ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC(序列号18)

MHV7引物：ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT(序列号19)

MHV8引物：ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG(序列号20)

MHV9引物：ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG(序列号21)

MHV10引物：ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG(序列号22)

MHV11引物：ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG(序列号23)

MHV12引物：ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG(序列号24)

MHCG2b引物：CAGTGGATAGACTGATGGGGG(序列号25)

(M＝A或C，R＝A或G，W＝A或T，S＝C或G，Y＝C或T，K＝G或T)

在PCR反应中，通过MHV7和MHCG2b引物的组合，Anti-CD20小鼠H链可变区基因得到扩增，该基因被暂时插入pCR2.1载体(Invitogen)中保存。此外，将插入有该基因的载体命名为pCR2.1-MHV。将经基因克隆的Anti-CD20小鼠H链可变区的DNA序列附于图2。

此外，将Anti-CD20小鼠H链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的碱基序列分别示为序列号46、48、50。此外，将Anti-CD20小鼠H链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示为序列号47、49、51。

(人IgG1L链恒定区基因)

使用Lymphoprep(Axis Shield)从人血液中获取淋巴球。使用QuickPrep micro mRNA purification kit(Amersham Biosciences，code27-9255-01)，由该淋巴球得到mRNA。使用First-Strand cDNA Synthesiskit(Amersham Biosciences，code 27-9261-01)将该mRNA制成cDNA。将来自该人淋巴球的cDNA作为模板，进行以下的PCR反应，得到人IgG1L链恒定区基因。该基因也被暂时插入pCR2.1载体(Invitogen)中保存。此外，将插入有该基因的载体命名为pCR2.1-LC。

PCR的反应条件如下。

人淋巴球cDNA 4μL

2.5mM dNTPs 4μL

hIgG1LCF引物(20μM) 2.5μL

hIgG1LCR引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 28.5μL

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(30次循环)

72℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的DNA序列参照以下。

hIgG1LCF引物：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC(序列号26)

hIgG1LCR引物：TTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT(序列号27)

(人IgG1H链恒定区基因)

与人IgG1L链恒定区基因的克隆同样地操作，以来自人淋巴球的cDNA为模板，进行以下的PCR反应，得到人IgG1H链恒定区基因。该基因也被暂时插入pCR2.1载体(Invitrogen)中保存。该载体被命名为pCR2.1-HC(野生型)。

PCR的反应条件如下。

人淋巴球cDNA 4μL

2.5mM dNTPs 4μL

hIgG1HCF引物(20μM) 2.5μL

hIgG1HCR引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 28.5μ

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(30次循环)

72℃ 4min

4℃无限制时间

引物的DNA序列参照以下。

hIgG1HCF引物：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(序列号28)

hIgG1HCR引物：TTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT(序列号29)

B)经克隆的基因的变异导入

为了得到294Cys嵌合抗体、298Cys嵌合抗体、301Cys嵌合抗体，必须在经克隆的人IgG1H链恒定区的特定位置中导入变异。根据ElvinA.Kabat等在Sequence of proteins of Immunological Interest(NIHPublication No.91-3242，1991)中示出的人IgG1H链恒定区的编号，为了将294号的Glu变更为Cys，将298号的Ser变更为Cys，将301号的Arg变更为Cys，将插入有经克隆的Hunan IgG1H链恒定区的pCR2.1载体：pCR2.1-HC(野生型)作为模板，采用PCR法导入变异。

以下记述该变异导入法的详细内容。

(1)向294(Glu→Cys)的变异导入

pCR2.1-HC(野生型)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

294Cys1引物(20μM) 1.25μL

294Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的DNA序列参照以下。

294Cys1引物：AAGCCGCGTGAGTGCCAGTACAACAGC(序列号74)

294Cys2引物：GCTGTTGTACTGGCACTCACGCGGCTT(序列号75)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由转化后大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了经导入变异294(Glu→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。将该导入变异的载体命名为pCR2.1-HC(294Cys)。

(2)向298(Ser→Cys)的变异导入

该变异导入也与上述294(Glu→Cys)的变异导入同样地进行。不同的地方仅在于，代替所使用的294Cys1引物和294Cys2引物，而使用298Cys1引物和298Cys2引物。以下示出298Cys1引物和298Cys2引物的序列。将插入了通过这些操作得到的导入变异298(Ser→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体命名为pCR2.1-HC(298Cys)。

298Cys1引物：GAGCAGTACAACTGCACGTACCGTGTG(序列号76)

298Cys2引物：CACACGGTACGTGCAGTTGTACTGCTC(序列号77)

(3)向301(Arg→Cys)的变异导入

该变异导入也与上述294(Glu→Cys)的变异导入同样地进行。不同的地方仅在于，代替所使用的294Cys1引物和294Cys2引物，而使用301Cys1引物和301Cys2引物。以下示出301Cys1引物和301Cys2引物的序列。将插入了通过这些操作得到的导入变异301(Arg→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体命名为pCR2.1-HC(301Cys)。

301Cys1引物：TACAACAGCACGTACTGTGTGGTCAGCGTCCTC(序列号78)

301Cys2引物：GAGGACGCTGACCACACAGTACGTGCTGTTGTA(序列号79)

C)构建组合了克隆的基因及该导入变异的基因的嵌合抗体表达载体

为了使1种Anti-CD20嵌合抗体表达，通过使Anti-CD20嵌合抗体的L链和H链这2种表达载体在CHO细胞中转染来实现。在此，所谓Anti-CD20嵌合抗体的L链的表达载体，是指将Anti-CD20小鼠L链可变区基因+人IgG1L链恒定区基因的结合物组入表达载体而成的，所谓Anti-CD20嵌合抗体的H链的表达载体，是指将Anti-CD20小鼠H链可变区基因+人IgG1H链恒定区基因的结合物组入表达载体而成的。制作野生型、294Cys型、298Cys型或301Cys型的Anti-CD20嵌合抗体时，Anti-CD20嵌合抗体的L链的表达载体是为了使这4种嵌合抗体表达而共同使用的，但Anti-CD20嵌合抗体的H链的表达载体必须对野生型、294Cys型、298Cys型或301Cys型嵌合抗体分别使用专用的H链表达载体。在此，首先详细记述在各嵌合抗体的表达中能够通用的Anti-CD20嵌合抗体L链的表达载体的构建，然后记述野生型、294Cys型、298Cys型或301Cys型嵌合抗体的表达所必需的专用的Anti-CD20嵌合抗体H链表达载体的构建。

Anti-CD20嵌合抗体L链的表达载体的构建

作为表达载体，使用BCMGneo载体，在该载体的XhoI和NotI位点插Anti-CD20小鼠L链可变区基因+人IgG1L链恒定区基因。Anti-CD20小鼠L链可变区基因通过以在先制作的pCR2.1-MLV为模板进行以下的PCR反应而得到片断。此外，人IgG1L链恒定区基因通过以在先制作的pCR2.1-LC为模板进行以下的PCR反应得到片断。

(Anti-CD20小鼠L链可变区基因的扩增反应)

pCR2.1-MLV(20ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

L1引物(20μM) 2.5μL

L2引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 30.5μL

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(20次循环)

72℃ 4min

4℃无限制时间

L1引物：ACCGCTCGAGATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGC(序列号36)

L2引物：TTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACC(5’-被磷酸化)(序列号37)

(人IgG1L链恒定区基因的扩增反应)

pCR2.1-LC(20ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

L3引物(20μM) 2.5μL

L4引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 30.5μL

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(20次循环)

72℃ 4min

4℃ 无限制时间

L3引物：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC(5’-被磷酸化)(序列号38)

L4引物：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGT(序列号39)

在上述的PCR反应中得到的Anti-CD20小鼠L链可变区基因片断用限制性内切酶XhoI(TakaraBio)切断后进行精制。此外，在PCR反应中得到的人IgG1L链恒定区基因片断用限制性内切酶NotI(TakaraBio)切断后进行精制。在将BCMG-neo载体用XhoI和NotI切断并精制而得到的片断中，混合之前的精制Anti-CD20小鼠L链可变区基因片断和精制人IgG1L链恒定区基因片断进行连接。通过测序确认在该连接中得到的载体插入有目的片断。该Anti-CD20嵌合抗体L链的表达载体被命名为p嵌合LC。

Anti-CD20嵌合抗体H链表达载体的构建

作为表达载体，使用BCMGneo载体，在该载体的XhoI和NotI位点插Anti-CD20小鼠H链可变区基因+人IgG1H链恒定区基因。Anti-CD20小鼠H链可变区基因通过以在先制作的pCR2.1-MHV为模板进行以下的PCR反应得到片断。分别对野生型、294Cys型、298Cys型或301Cys型嵌合抗体而专用的H链表达载体，与成为使人IgG1H链恒定区基因进行PCR扩增时的模板的质粒不同，但操作自身完全同样地进行，得到各种人IgG1H链基因片断。以下记述包括PCR反应的详细内容。

(Anti-CD20小鼠H链可变区基因的扩增反应)

pCR2.1-MHV(20ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

H1引物(20μM) 2.5μL

H2引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 30.5μL

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(20次循环)

72℃ 4min

4℃无限制时间

H1引物：ACCGCTCGAGATGGGATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTC(序列号40)

H2引物：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC(5’-被磷酸化)(序列号41)

(人IgG1H链恒定区基因的扩增反应)

#各种模板质粒(20ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

H3引物(20μM) 2.5μL

H4引物(20μM) 2.5μL

DMSO 2.5μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu聚合酶 1μL

灭菌水 30.5μL

共计 50μL

94℃ 2min

94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(20次循环)

72℃ 4min

4℃ 无限制时间

H3引物：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-被磷酸化)(序列号42)

H4引物：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT(序列号43)

#：为了制备野生型Anti-CD20嵌合抗体用的基因片断，使用pCR2.1-HC(野生型)作为模板。为了制备294Cys型Anti-CD20嵌合抗体用的基因片断，使用pCR2.1-HC(294Cys)作为模板。为了制备298Cys型Anti-CD20嵌合抗体用的基因片断，使用pCR2.1-HC(298Cys)作为模板。为了制备301Cys型Anti-CD20嵌合抗体用的基因片断，使用pCR2.1-HC(301Cys)作为模板。

在上述的PCR反应中得到的Anti-CD20小鼠H链可变区基因片断，用限制性内切酶XhoI(Takara)切断后精制。此外，在模板不同的各种PCR反应中得到的人IgG1H链恒定区基因片断用限制性内切酶NotI(TakaraBio)切断后精制。在用XhoI和NotI切断BCMG-neo载体而精制的片断中，混合之前精制的Anti-CD20小鼠H链可变区基因片断和精制人IgG1H链恒定区基因片断，进行连接。通过测序确认在该连接中得到的载体插入有目的片断。该Anti-CD20嵌合抗体H链的表达载体分别命名为p嵌合HC(野生型)、p嵌合HC(294Cys)、p嵌合HC(298Cys)或p嵌合HC(301Cys)。

D)嵌合抗体表达载体向CHO细胞的基因导入和嵌合抗体高表达的CHO细胞的筛选

所构建的各种表达载体以以下的组合使用TransIT-CHOTransfection kit(Mirus，MIR2170)向CHO细胞中导入基因。

野生型嵌合抗体：p嵌合LC+p嵌合HC(野生型)

294Cys嵌合抗体：p嵌合LC+p嵌合HC(294Cys)

298Cys嵌合抗体：p嵌合LC+p嵌合HC(298Cys)

301Cys嵌合抗体：p嵌合LC+p嵌合HC(301Cys)

经基因导入的CHO细胞用补充了10％胎牛血清(EQITEC-BIO)和1mg/mL的Geneticin(GIBCO，10131-035)的Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium(Sigma，D5796)、在37℃、5％二氧化碳的条件下进行培养，得到增殖。选择从该增殖后形成群落的CHO细胞中选择高表达嵌合抗体的CHO细胞，首先将各群落的一部分移植到96孔板，进而培养10天。取出该培养上清的一部分，通过进行以下所示的ELISA测定确定高表达CHO细胞克隆。

(ELISA测定)

1)以100μL/孔将经转染的CHO细胞的培养上清添加到覆有

Anti-Human IgG(γ-chain)(MBL，103AG)的96孔板上，在室温下放置1小时。

2)将培养上清液从96孔板上丢弃，用含有0.05％的Tween20的PBS(PBS-0.05％Tween20)充分清洗孔。

3)以100μL/孔添加用PBS-0.05％Tween20将Anti-Human IgG(γ-chain)Peroxidase conjugated(MBL，208)稀释2000倍而成的溶液，在室温下放置1小时。

4)将溶液从96孔板丢弃，用PBS-0.05％Tween20充分清洗孔。

5)以100μL/孔添加TMB Peroxidase Substrate(Moss，TMBE-1000s)，使之发生显色反应。

6)进行显色反应10～15分钟后，以100μL/孔添加1N硫酸，使显色反应停止。

7)测定450nm的吸光度。

在该ELISA测定中显示高显色值的群落是嵌合抗体高表达的株系。

E)嵌合抗体高表达的CHO细胞的培养

采用ELISA测定而选择的嵌合抗体高表达的CHO细胞，通过用补充了10％胎牛血清和0.1mg/mL的Geneticin的Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium、在37℃、5％二氧化碳的条件下培养，使之增殖。充分增殖的嵌合抗体的高表达CHO细胞被置换到补充了0.1mg/mL的Geneticin的无血清培养基的CHO-S-(GIBCO，12052-098)中进行培养，继续培养1000mL左右。

F)嵌合抗体高表达细胞的培养上清的柱精制

回收在作为无血清培养基的CHO-S-SFMII中培养的嵌合抗体高表达CHO细胞的培养上清。野生型嵌合抗体的精制由于没有在其Fc区域结构中加以变化，因此采用抗体精制中通常使用的蛋白A柱精制实施。然而，294Cys型嵌合抗体、298Cys型嵌合抗体、301Cys型嵌合抗体没有在其Fc区域结构中加以变异，因此随着Fc区域的结构变化，几乎不向通常的蛋白A柱吸附。根据该理由，对这些Cys型嵌合抗体使用蛋白L柱进行精制。这次制作的Anti-CD20嵌合抗体的可变区是κ链。该蛋白L是能够识别并结合该可变区κ链的蛋白质。以下记述野生型嵌合抗体的蛋白A柱精制和Cys型嵌合抗体的蛋白L柱精制的详细内容。

野生型嵌合抗体的蛋白A柱精制

1)使用安装有Amicon Ultrafiltration Membranes(Millipore，CodeYM10)的Amicon Stirred Uitrafiltration Cell(Millipore，Model 8400)，将1000mL的用CHO-S-SFMII培养野生型嵌合抗体高表达CHO细胞而得到的培养上清从1000mL浓缩到100mL。

2)在培养上清浓缩液中添加作为蛋白A-琼脂糖的rProteinASepharose Fast Flow(Amersham Bioscience，17-1279-03)8mL，在4℃搅拌2天使野生型嵌合抗体吸附于蛋白A。

3)将吸附了野生型嵌合抗体的蛋白A-琼脂糖填充于直径1.5cm、长8cm的柱。

4)填充有蛋白A-琼脂糖的柱用PBS 100mL清洗后，用Elution缓冲液(0.17M Glycine-HCl，pH2.3)从柱中洗脱野生型嵌合抗体。

5)经洗脱的野生型嵌合抗体溶液立即加入适量的1M Tris-HClpH8.5，使pH成为中性。

6)野生型嵌合抗体洗脱液装入作为透析管的Cell Sep T2(Membrane filtration products Inc，8030-23)中，在4℃、在PBS 5L中透析。将透析后回收的野生型嵌合抗体作为精制品。

Cys型嵌合抗体的蛋白L柱精制

1)使用安装有Amicon Ultrafiltration Membranes(Millipore，CodeYM10)的Amicon Stirred Uitrafiltration Cell(Millipore，Model 8400)，将1000mL的用CHO-S-SFMII培养Cys型嵌合抗体高表达CHO细胞而得到的培养上清从1000mL浓缩到100mL。

2)在培养上清浓缩液100mL中加入蛋白L结合缓冲液(0.1MPhosphate，0.15M NaCl，pH 7.2)100mL进行混合。

3)在直径1.5cm、长8cm的柱中填充作为蛋白L-琼脂糖的ImmunoPure Immobilized Protein L Plus(PIERCE，20250)2mL。

4)从柱上端加入在2)中制备的液体，从柱下端慢慢地流出。通过该操作使Cys型嵌合抗体吸附于蛋白L-琼脂糖。然后，用蛋白L结合缓冲液50mL清洗柱，将吸附于柱的多余的蛋白除去。

5)用Elution缓冲液(0.17M Glycine-HCl，pH2.3)从柱中洗脱Cys型嵌合抗体。经洗脱的Cys型嵌合抗体溶液立即加入适量的1MTris-HCl pH8.5，使pH成为中性。

6)将Cys型嵌合抗体洗脱液装入作为透析管的Cell Sep T2(Membrane filtration products Inc，8030-23)中，在4℃、在PBS 5L中透析。将透析后回收的Cys型嵌合抗体作为精制品。

如上所述，经精制的野生型嵌合抗体或Cys型嵌合抗体用12.5％SDS-PAGE电泳后，进行银染色。该电泳图像附于图3。

<各种嵌合抗体的ADCC活性评价>

各种嵌合抗体的抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)活性评价通过乳酸脱氢酶释放分析法进行。在该分析中，作为靶细胞，使用在细胞膜表面具有CD20分子的Daudi细胞，作为效应细胞，使用人外周血单个核细胞(PBMC)。该人PBMC是使用Lymphoprep(Axis Shield)，由人的血液制备。

将Daudi细胞(1×10⁴个/50μL)装入96孔U型底的板的各孔中，加入作为效应细胞的人PBMC 2×10⁵个，使得E/T比达到20/1。在该细胞液中以制成连续的稀释系列的方式进一步添加各种Anti-CD20嵌合抗体，在37℃保温20小时。保温后，对96孔U型底的板进行离心分离，使用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(Promega，G1780)测定其上清中的乳酸脱氢酶活性。抗体依赖性且特异性的细胞毒(Cytotoxicity)％使用下式算出。

细胞毒％＝100×(E-S_E-S_T)/(M-S_T)

在此，所谓E，是表示Experimental release，是抗体和效应细胞与靶细胞一起保温时从靶细胞释放的乳酸脱氢酶活性。所谓S_E，是从效应细胞自然产生所释放的乳酸脱氢酶活性。所谓S_T，是从靶细胞自然发生所释放的乳酸脱氢酶活性。所谓M，表示靶细胞最大释放的乳酸脱氢酶活性，其是通过添加Lysis Solution(9％Triton X-100)，从靶细胞释放的乳酸脱氢酶活性。

通过以上的评价方法，将野生型、294Cys型、298Cys型、301Cys型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果附于图4。根据该图4，与野生型嵌合抗体的ADCC活性相比较，在抗体高浓度的条件下(0.1～10μg/mL)294Cys型嵌合抗体和301Cys型嵌合抗体显示非常高的ADCC活性，298Cys型嵌合抗体与野生型相比，在包括低浓度(0.1μg/mL以下的浓度)的所测定的全部范围都显示出高的ADCC活性。

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和298Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度是0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是6.9％、10.2％、25.0％、33.0％、36.5％、37.9％，为298Cys型嵌合抗体时分别是10.6％、12.5％、33.2％、39.6％、42.9％、45.2％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.5倍、1.2倍、1.3倍、1.2倍、1.2倍、1.2倍(表8)。

【表8】

此外，根据表8，在野生型抗体和298Cys型嵌合抗体之间，选择细胞毒比例为相同程度的2点，尝试比较ADCC活性。例如，298Cys型嵌合抗体为0.1μg/mL，显示约40％的细胞毒，野生型抗体为10μg/mL，显示约40％的细胞毒。使用该2点比较时，为了得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到100分之1。由此可以判断，ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比为100倍)。

这样的ADCC活性的上升(约10-100倍左右)在其他浓度范围也得到确认。只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图4和表8可以算出ADCC活性的上升。

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较294Cys型嵌合抗体和野生型抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度是0.00001、0.0001、0.001、0.1、1、10μg/mL的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是4.25、6.92、10.19、33.04、36.50％、37.88％，为294Cys型嵌合抗体时分别是8.41、9.79、11.37、40.75、74.98、83.68％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是2.0、1.4、1.1、1.2、2.1、2.2倍(表9)。

另外，294Cys型嵌合抗体的浓度为10μg/mL时，细胞毒的比例为83.68％，显示出极高的值。

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较301Cys型嵌合抗体和野生型抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度是0.00001、0.0001、0.1、1、10μg/mL的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是4.25、6.92、33.04、36.50％、37.88％，为301Cys型嵌合抗体时分别是7.33、7.04、35.68、75.31、78.59％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别为1.7、1.02、1.1、2.1、2.1倍(表9)。

另外，301Cys型嵌合抗体的浓度为10μg/mL时，细胞毒的比例为78.59％，显示出极高的值。

【表9】

〔实施例2〕

采用与实施例1同样的方法制作290、291、292、302以及303Cys型的Anti-CD20嵌合抗体，评价这些各种Cys型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性。其结果是，与野生型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性相比，290、291、292、302以及303Cys型的Anti-CD20嵌合抗体显示出非常高的ADCC活性。

以下记载Anti-CD20嵌合抗体的野生型和5种变异型(290Cys、291Cys、292Cys、302Cys、303Cys)的制作方法以及其的ADCC活性测定和对CD20分子的反应性。

1)Anti-CD20嵌合抗体的制作

嵌合抗体经过以下的A)～F)工序，得到精制嵌合抗体。

A)对制作嵌合抗体所必需的基因的克隆；

B)经克隆的基因的变异导入；

C)组合了经克隆的基因及其导入变异的基因的嵌合抗体表达载体的构建；

E)嵌合抗体高表达CHO细胞的培养；

F)嵌合抗体高表达细胞的培养上清的柱精制。

这些工序中，A)、C)～F)与实施例1相同。因此在本实施例中，对工序B)进行说明。

B)经克隆的基因的变异导入

为了得到291Cys嵌合抗体、292Cys嵌合抗体、303Cys嵌合抗体，必须在经克隆的人IgG1 H链恒定区的特定位置导入变异。根据ElvinA.Kabat等在Sequence of proteins of Immunological Interest(NIHPublication No.91-3242，1991)中示出的人IgG1 H链恒定区的编号，为了将291号的Pro变更为Cys、将292号的Arg变更为Cys、将303号的Val变更为Cys，将插入有经克隆的人IgG1 H链恒定区的pCR2.1载体：pCR2.1-HC(野生型)作为模板，采用PCR法导入变异。以下记述该变异导入法的详细内容。

(1)向290(Lys→Cys)的变异导入

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

290Cys1引物(20μM) 1.25μL

290Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

290 Cys1引物：GTGCATAATGCCAAGACATGCCCGCGTGAGGAGCAGTAC(序列号210)

290 Cys2引物：GTACTGCTCCTCACGCGGGCATGTCTTGGCATTATGCAC(序列号211)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EbglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异290(Lys→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

(2)向291(Pro→Cys)的变异导入

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

291Cys1引物(20μM) 1.25μL

291Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

291Cys1引物：CATAATGCCAAGACAAAGTGCCGTGAGGAGCAGTACAAC(序列号212)

291Cys2引物：GTTGTACTGCTCCTCACGGCACTTTGTCTTGGCATTATG(序列号213)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异291(Pro→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

(3)向292(Arg→Cys)的变异导入

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

292Cys1引物(20μM) 1.25μL

292Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

292Cys1引物：GCCAAGACAAAGCCGTGTGAGGAGCAGTACAAC(序列号214)

292Cys2引物：GTTGTACTGCTCCTCACACGGCTTTGTCTTGGC(序列号215)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异292(Arg→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

(4)向302(Val→Cys)的变异导入

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

290 Cys1引物(20μM) 1.25μL

290Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

302Cys1引物：TACAACAGCACGTACCGTTGCGTCAGCGTCCTCACCGTC(序列号216)

302Cys2引物：GACGGTGAGGACGCTGACGCAACGGTACGTGCTGTTGTA(序列号217)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异302(Val→Cys)导入的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

(5)向303(Val→Cys)的变异导入

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

303Cys1引物(20μM) 1.25μL

303Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

303Cys1引物：AACAGCACGTACCGTGTGTGCAGCGTCCTCACCGTCCTG(序列号218)

303Cys2引物：CAGGACGGTGAGGACGCTGCACACACGGTACGTGCTGTT(序列号219)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异303(Val→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

<经精制的各种嵌合抗体的流式细胞分析>

经精制的各种嵌合抗体的流式细胞分析采用与实施例1记载的方法同样的方法进行。

<各种嵌合抗体的ADCC活性评价>

各种嵌合抗体的抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)活性评价也采用与实施例1记载的方法同样的方法进行。野生型、290Cys、291Cys、292Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果示于图5。此外，野生型、302Cys、303Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性结果示于图6。由图5和图6可知，291Cys、292Cys、303Cys型嵌合抗体与野生型相比在包括低浓度(0.1μg/mL以下的浓度)所测定的全部范围都显示出高的ADCC活性。此外，290Cys、302Cys与野生型相比，显示出高的ADCC活性。

【表10】

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和290Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是13.7％、14.2％、17.2％、27.3％、35.5％，为290Cys型嵌合抗体时分别是18.0％、19.5％、26.6％、40.9％、41.6％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.5倍、1.2倍(表10)。

此外，从表10中选择野生型抗体和290Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，290Cys型嵌合抗体为约0.0001μg/mL，显示约18％的细胞毒，野生型抗体为0.01μg/mL，显示约17％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

只要是本领域技术人员，根据上述方法，由图5和表10可以算出ADCC活性的上升。

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和291Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是13.7％、14.2％、17.2％、27.3％、35.5％、49.5％，为291Cys型嵌合抗体时分别是17.9％、26.1％、65.7％、73.9％、74.7％、64.7％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.3倍、1.8倍、3.8倍、2.7倍、2.1倍、1.3倍(表10)。

此外，从图5选择野生型抗体和291Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，291Cys型嵌合抗体为约0.01μg/mL，显示65.7％的细胞毒，野生型抗体为10μg/mL，显示约50％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到1000分之1以下。由此可以判断ADCC活性上升1000倍以上(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是2000倍)。

只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图5和表10可以算出ADCC活性的上升。

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和292Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是12.7％、13.7％、14.2％、17.2％、27.3％、35.5％、49.5％，为292Cys型嵌合抗体时分别是13.9％、14.7％、15.2％、34.8％、58.5％、78.7％、79.1％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.1倍、1.1倍、1.1倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、1.6倍(表10)。

此外，从图5选择野生型抗体和292Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，292Cys型嵌合抗体为0.1μg/mL，显示58.5％的细胞毒，野生型抗体是10μg/mL，显示约50％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

这样的ADCC活性的上升(约10-100倍左右)在其他浓度范围也得到确认。只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图5和表10可以算出ADCC活性的上升。

【表11】

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和302Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是5.8％、3.4％、7.6％、14.7％、30.5％、34.3％、42.5％，为302Cys型嵌合抗体时分别是7.9％、9.6％、11.3％、19.6％、39.9％、42.9％、42.9％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.4倍、2.8倍、1.5倍、1.3倍、1.3倍、1.3倍、1.0倍(表11)。

此外，从图6选择野生型抗体和302Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，302Cys型嵌合抗体为0.1μg/mL，显示约40％的细胞毒，野生型抗体为10μg/mL，显示约40％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

这样的ADCC活性的上升(约10-100倍左右)在其他浓度范围也得到确认。只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图6和表11可以算出ADCC活性的上升。

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和303Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是5.8％、3.4％、7.6％、14.7％、30.5％、34.3％、42.5％，为303Cys型嵌合抗体时分别是6.5％、7.7％、14.5％、46.6％、74.5％、87.1％、89.3％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.1倍、2.3倍、1.9倍、3.2倍、2.4倍、2.5倍、2.1倍(表11)。

此外，从图6选择野生型抗体和303Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，303Cys型嵌合抗体为0.01μg/mL，显示约40％的细胞毒，野生型抗体为10μg/mL，显示约40％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到1000分之1。由此可以判断ADCC活性上升约1000倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是1000倍)。

只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图6和表11可以算出ADCC活性的上升。

〔实施例3〕

(Anti-EGFR人源化抗体的制作)

为了使野生型和298Cys型Anti-EGFR人源化抗体在CHO细胞中表达，构建作为表达载体的3种表达载体(Anti-EGFR人源化抗体L链表达载体、野生型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体、298Cys型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体)。以下记述各表达载体的构建的详细内容。

1)Anti-EGFR人源化抗体L链表达载体的构建

以包含人型Anti-EGFR抗体L链的可变区和恒定区的基因为模板，使用以下所示的引物，采用PCR反应得到DNA片断。

EGFR-L1引物：ACCGCTCGAGATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC(序列号220)

EGFR-L2引物：ATAGTTTAGCGGCCGCTTACGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT(序列号221)

PCR反应中得到的DNA片断进行乙醇沉淀而精制后，采用限制性内切酶Xho I(TakaraBio、1094A)和Not I(TakaraBio、Code 1166A)处理。BCMG-neo载体也同样地采用限制性内切酶XhoI和NotI处理。接着，经限制性内切酶处理的PCR扩增DNA片断和BCMG-neo载体用含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳后，通过UV照射，从可视化的DNA片断中，将目的尺寸的DNA片断从凝胶中切出，使用SUPREC-01(TakaraBio、code 9040)从凝胶中提取DNA片断进行精制。从凝胶中切出并精制的PCR扩增片断和BCMG-neo载体，使用DNALigation kit Ver.2.1(TakaraBio、code 6022)进行连接反应。连接反应结束后的DNA溶液用于对大肠杆菌JM109进行转化，由得到的转化体采用碱性SDS法精制质粒DNA。精制的质粒进行序列解析，确认包含Anti-EGFR人源化抗体的L链(可变区和恒定区)基因，将其作为Anti-EGFR人源化抗体L链表达载体。

应说明的是，将Anti-EGFR人源化抗体L链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的碱基序列分别示为序列号200、202、204。此外，将Anti-EGFR人源化抗体L链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示为序列号201、203、205。

2)野生型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体和298Cys型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体的构建

以包含人型Anti-EGFR抗体H链的可变区的基因为模板，使用以下所示的引物，采用PCR反应得到DNA片断。

EGFR-H1引物：ACCGCTCGAGATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC(序列号222)

EGFR-H2引物：CGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG(5’-被磷酸化)(序列号223)

PCR反应中得到的DNA片断进行乙醇沉淀而精制后，采用限制性内切酶Xho I(TakaraBio、1094A)处理。接着，经限制性内切酶处理的PCR扩增DNA片断用含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳后，从通过UV照射而可视化的DNA片断中，将目的尺寸的DNA片断从凝胶中切出，使用SUPREC-01(TakaraBio、code 9040)，从凝胶中提取DNA片断进行精制。该精制DNA片断是Anti-EGFR人源化抗体H链可变区基因。

应说明的是，将Anti-EGFR人源化抗体H链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的碱基序列分别示为序列号194、196、198。此外，将Anti-EGFR人源化抗体H链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示为序列号195、197、199。

Anti-EGFR人源化抗体的制作所必需的人IgG1H链恒定区基因，使用与制作Anti-CD20嵌合抗体时使用的DNA片断同样的基因。以质粒pCR2.1-HC(野生)为模板，使用H3引物和H4引物进行PCR扩增，得到DNA片断。该DNA片断用限制性内切酶Not I处理后进行精制。该DNA片断是野生型Anti-EGFR人源化抗体H链恒定区基因。将以质粒pCR2.1-HC(298Cys)为模板，与野生型同样地使用H3引物和H4引物进行PCR扩增而得到的DNA片断用限制性内切酶NotI处理后精制的基因，是298Cys型Anti-EGFR人源化抗体H链恒定区基因。

将如上制备的Anti-EGFR人源化抗体H链可变区基因片断和野生型Anti-EGFR人源化抗体H链恒定区基因片断与，用Xho I和Not I切断BCMG-neo载体并精制的DNA片断混合，使用DNA Ligation kitVer.2.1(TakaraBio、code 6022)进行连接反应。连接反应结束后的DNA溶液用于对大肠杆菌JM109进行转化，由得到的转化体，采用碱性SDS法精制质粒DNA。精制的质粒进行序列解析，确认包含Anti-EGFR人源化抗体的野生型H链(可变区和恒定区)基因，将其作为野生型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体。同样地将Anti-EGFR人源化抗体H链可变区基因片断和298Cys型Anti-EGFR人源化抗体H链恒定区基因片断与、用Xho I和Not I切断BCMG-neo载体而精制的DNA片断混合，使用DNA Ligation kit Ver.2.1(TakaraBio、code 6022)进行连接反应。连接反应结束后的DNA溶液用于对大肠杆菌JM109进行转化，由得到的转化体采用碱性SDS法精制质粒DNA。精制的质粒进行序列解析，确认包含Anti-EGFR人源化抗体的298Cys型H链(可变区和恒定区)基因，将其作为298Cys型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体。

3)野生型Anti-EGFR人源化抗体和298Cys型Anti-EGFR人源化抗体在CHO细胞中的表达和精制

使Anti-EGFR人源化抗体L链表达载体和野生型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体在CHO细胞中转染，在CHO细胞中产生野生型Anti-EGFR人源化抗体。同样地，使Anti-EGFR人源化抗体L链表达载体和298Cys型Anti-EGFR人源化抗体H链表达载体在CHO细胞中转染，在CHO细胞中产生298Cys型Anti-EGFR人源化抗体。选择使野生型或298Cys型Anti-EGFR人源化抗体高表达的CHO细胞，所选择的高表达CHO细胞在无血清培养基CHO-S-SFMII培养基中培养。培养结束后，将培养液上清进行蛋白A柱精制，得到高纯度的Anti-EGFR人源化抗体。

【表12】

进而，通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗EGFR野生型抗体和298Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是3.0％，3.3％，5.8％，6.1％，10.2％，11.6％，10.9％；为298Cys型嵌合抗体时分别是4.6％，6.7％，8.7％，11.0％，18.8％，20.6％，20.2％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.5倍、2.0倍、1.5倍、1.8倍、1.8倍、1.8倍、1.9倍(表12)。

此外，从图7选择野生型抗体和298Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，298Cys型嵌合抗体是0.01μg/mL，显示约40％的细胞毒，野生型抗体是10μg/mL，显示约40％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到1000分之1。由此可以判断ADCC活性上升约1000倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是1000倍)。

只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图7和表12就可以算出ADCC活性的上升。

〔实施例4〕

采用与实施例2同样的方法，制作286、287、288、289、305、306、307、以及308Cys型的Anti-CD20嵌合抗体，评价这些各种Cys型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性。其结果是，与野生型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性相比，286、287、288、289、305、306、307以及308Cys型的Anti-CD20嵌合抗体显示出非常高的ADCC活性。

以下记载Anti-CD20嵌合抗体的野生型和8种变异型(286Cys型、287Cys型、288Cys型、289Cys型、305Cys型、306Cys型、307Cys型以及308Cys型)的制作方法以及其的ADCC活性测定和对CD20分子的反应性。

1)Anti-CD20嵌合抗体的制作

嵌合抗体经过以下的A)～F)工序，得到精制嵌合抗体。

A)对制作嵌合抗体所必需的基因的克隆；

B)经克隆的基因的变异导入；

C)组合了克隆基因以及其导入变异的基因的嵌合抗体表达载体的构建；

E)嵌合抗体高表达CHO细胞的培养；

F)嵌合抗体高表达细胞的培养上清的柱精制。

这些工序中，A)、C)～F)与实施例1相同。因此，在本实施例中对工序B)进行说明。

B)克隆基因的变异导入

为了得到286Cys嵌合抗体、287Cys嵌合抗体、288Cys嵌合抗体、289Cys嵌合抗体、305Cys嵌合抗体、306Cys嵌合抗体、307Cys嵌合抗体、308Cys嵌合抗体，必须在经克隆的人IgG1H链恒定区的特定位置导入变异。根据Elvin A.Kabat等在Sequence of proteins ofImmunological Interest(NIH Publication No.91-3242，1991)中示出的人IgG1H链恒定区的编号，为了将286号的Asn变更为Cys、将287号的Ala变更为Cys、将288号的Lys变更为Cys、将289号的Thr变更为Cys、将305号的Val变更为Cys、将306号的Leu变更为Cys、将307号的Thr变更为Cys、将308号的Val变更为Cys，以插入有经克隆的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体：pCR2.1-HC(野生型)为模板，采用PCR法导入变异。以下记述该变异导入法的详细内容。

286(Asn→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

286Cys1引物(20μM) 1.25μL

286Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

286Cys1引物：gacggcgtggaggtgcattgtgccaagacaaagccgcgt(序列号224)

286Cys2引物：acgcggctttgtcttggcacaatgcacctccacgccgtc(序列号225)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异286(Asn→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

287(Ala→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

287Cys1引物(20μM) 1.25μL

287Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

287Cys1引物：ggcgtggaggtgcataattgcaagacaaagccgcgtaag(序列号226)

287Cys2引物：cttacgcggctttgtcttgcaattatgcacctccacgcc(序列号227)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异287(Ala→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

288(Lys→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

288Cys1引物(20μM) 1.25μL

288Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

288Cys1引物：gtggaggtgcataatgcctgtacaaagccgcgtgaggag(序列号228)

288Cys2引物：ctcctcacgcggctttgtacaggcattatgcacctccac(序列号229)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了288(Lys→Cys)变异导入的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

289(Thr→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

289Cys1引物(20μM) 1.25μL

289Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

289Cys1引物：gaggtgcataatgccaagtgcaagccgcgtgaggagcag(序列号230)

289Cys2引物：ctgctcctcacgcggcttgcacttggcattatgcacctc(序列号231)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异289(Thr→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

305(Val→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

305Cys1引物(20μM) 1.25μL

305Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

305Cys1引物：acgtaccgtgtggtcagctgcctcaccgtcctgcaccag(序列号232)

305Cys2引物：ctggtgcaggacggtgaggcagctgaccacacggtacgt(序列号233)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异305(Val→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

306(Leu→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

306Cys1引物(20μM) 1.25μL

306Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

306Cys1引物：taccgtgtggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccaggac(序列号234)

306Cys2引物：gtcctggtgcaggacggtgcagacgctgaccacacggta(序列号235)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异306(Leu→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

307Cys(Thr→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

307Cys1引物(20μM) 1.25μL

307Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

307Cys1引物：cgtgtggtcagcgtcctctgcgtcctgcaccaggactgg(序列号236)

307Cys2引物：ccagtcctggtgcaggacgcagaggacgctgaccacacg(序列号237)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异307Cys(Thr→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

308(Val→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

308Cys1引物(20μM) 1.25μL

308Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

308Cys1引物：gtggtcagcgtcctcacctgcctgcaccaggactggctg(序列号238)

308Cys2引物：cagccagtcctggtgcaggcaggtgaggacgctgaccac(序列号239)

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异308(Val→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

<精制的各种嵌合抗体的流式细胞分析>

精制的各种嵌合抗体的流式细胞分析采用与实施例1记载的方法同样的方法进行。

<各种嵌合抗体的活性评价>

<286Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和286Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是0.0％、0.9％、2.2％、8.7％、26.7％、33.5％、34.8％，为286Cys型嵌合抗体时分别是0.8％、2.8％、8.1％、26.9％、82.2％、88.5％、87.5％。因此ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是41.0倍、3.0倍、3.7倍、3.1倍、3.1倍、2.6倍、2.5倍(表13)。

【表13】

此外，从表13选择野生型抗体和286Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，286Cys型嵌合抗体为约0.01μg/mL，显示约26.9％的细胞毒，野生型抗体为0.1μg/mL，显示约26.7％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约10倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是10倍)。

只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图8可以算出ADCC活性的上升。

<287Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和287Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是0.02％、0.9％、2.2％、8.7％、26.7％、33.5％、34.8％，为287Cys型嵌合抗体时分别是0.2％、0.5％、1.5％、16.5％、34.9％、36.9％、45.5％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是9.7倍、0.5倍、0.7倍、1.9倍、1.3倍、1.1倍、1.3倍(表13)。

此外，从表13选择野生型抗体和287Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，287Cys型嵌合抗体为约0.1μg/mL，显示约34.9％的细胞毒，野生型抗体为10μg/mL，显示34.8％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

<288Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和288Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是0.02％、0.9％、2.2％、8.7％、26.7％、33.5％、34.8％，为288Cys型嵌合抗体时分别是0.5％、1.2％、0.5％、9.4％、33.5％、37.5％、36.5％。因此ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是24.3倍、1.3倍、0.2倍、1.1倍、1.3倍、1.1倍、1.1倍(表13)。

此外，从表13选择野生型抗体和288Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，288Cys型嵌合抗体为约0.1μg/mL，显示约33.5％的细胞毒，野生型抗体为1μg/mL，显示约33.5％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约10倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是10倍)。

<289Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和289Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是0.02％、0.9％、2.2％、8.7％、26.7％、33.5％、34.8％，为289Cys型嵌合抗体时分别是0.5％、0.5％、1.6％、29.1％、87.2％、85.2％、80.6％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是22.8倍、0.5倍、0.7倍、3.3倍、3.3倍、2.5倍、2.3倍(表13)。

此外，从表13选择野生型抗体和289Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，289Cys型嵌合抗体为约0.01μg/mL，显示约29.1％的细胞毒，野生型抗体为0.1μg/mL，显示约26.7％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约10分之1。由此可以判断ADCC活性上升约10倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是10倍)。

<305Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和305Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.0000001、0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是8.1％、4.7％、4.3％、3.4％、5.6％、14.1％、40.5％、52.3％、63.3％，为305Cys型嵌合抗体时分别是8.1％、5.2％、4.2％、5.5％、15.2％、38.7％、53.8％、55.8％、52.7％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.0倍、1.1倍、1.0倍、1.6倍、2.7倍、2.7倍、1.3倍、1.1倍、0.8倍(表14)。

【表14】

此外，从表14选择野生型抗体和305Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，305Cys型嵌合抗体为约0.01μg/mL，显示约15.2％的细胞毒，野生型抗体为0.1μg/mL，显示约14.1％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图9可以算出ADCC活性的上升。

<306Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和306Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.0000001、0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是8.1％、4.7％、4.3％、3.4％、5.6％、14.1％、40.5％、52.3％、63.3％，为306Cys型嵌合抗体时分别是4.3％、8.5％、6.0％、6.6％、15.2％、42.1％、53.2％、53.4％、49.3％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是0.5倍、1.8倍、1.4倍、1.9倍、2.7倍、3.0倍、1.3倍、1.0倍、0.8倍(表14)。

此外，从表14选择野生型抗体和306Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，306Cys型嵌合抗体为约0.01μg/mL，显示约15.2％的细胞毒，野生型抗体为0.1μg/mL，显示约14.1％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

<307Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和307Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.0000001、0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是8.1％、4.7％、4.3％、3.4％、5.6％、14.1％、40.5％、52.3％、63.3％，为307Cys型嵌合抗体时分别是3.1％、4.0％、3.0％、3.5％、13.1％、42.1％、57.8％、74.0％、86.9％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是0.4倍、0.8倍、0.7倍、1.0倍、2.3倍、3.0倍、1.4倍、1.4倍、1.4倍(表14)。

此外，从表14选择野生型抗体和307Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，307Cys型嵌合抗体为约0.1μg/mL，显示约57.8％的细胞毒，野生型抗体为10μg/mL，显示约63.3％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

<308Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和308Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.0000001、0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是8.1％、4.7％、4.3％、3.4％、5.6％、14.1％、40.5％、52.3％、63.3％，为308Cys型嵌合抗体时分别是10.6％、3.9％、7.8％、4.5％、12.6％、35.5％、55.8％、60.3％、72.5％。因此，ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.3倍、0.8倍、1.8倍、1.3倍、2.3倍、2.5倍、1.4倍、1.2倍、1.1倍(表14)。

此外，从表14选择野生型抗体和308Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，308Cys型嵌合抗体为约0.1μg/mL，显示约55.8％的细胞毒，野生型抗体为1μg/mL，显示约52.3％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约10分之1。由此可以判断ADCC活性上升约10倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是10倍)。

〔实施例5〕

采用与实施例2同样的方法，制作309Cys型的Anti-CD20嵌合抗体，评价这些各种Cys型的Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性。其结果是，与野生型Anti-CD20嵌合抗体的ADCC活性相比，309Cys型的Anti-CD20嵌合抗体显示出非常高的ADCC活性。

以下记载Anti-CD20嵌合抗体的野生型和1种变异型(309Cys型)的制作方法以及其的ADCC活性测定和对CD20分子的反应性。

1)Anti-CD20嵌合抗体的制作

嵌合抗体经过以下的A)～F)工序，得到精制嵌合抗体。

A)对制作嵌合抗体所必需的基因的克隆；

B)经克隆的基因的变异导入；

D)嵌合抗体表达载体向CHO细胞的基因导入和使嵌合抗体高表达的CHO细胞的筛选；

E)嵌合抗体高表达CHO细胞的培养；

F)嵌合抗体高表达细胞的培养上清的柱精制。

这些工序中，A)、C)～F)与实施例1相同。因此在本实施例中对工序B)进行说明。

B)经克隆的基因的变异导入

为了得到309Cys嵌合抗体，必须在经克隆的人IgG1H链恒定区的特定位置导入变异。根据Elvin A.Kabat等在Sequence of proteins ofImmunological Interest(NIH Publication No.91-3242，1991)中示出的人IgG1H链恒定区的编号，为了将309号的Leu变更为Cys，以插入有经克隆的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体：pCR2.1-HC(野生型)为模板，采用PCR法导入变异。以下记述该变异导入法的详细内容。

309(Leu→Cys)变异

pCR2.1-HC(野生)(25ng/μL) 2μL

2.5mM dNTPs 4μL

309Cys1引物(20μM) 1.25μL

309Cys2引物(20μM) 1.25μL

×10pfu聚合酶缓冲液 5μL

pfu DNA聚合酶 1μL

灭菌水 35.5μL

共计 50μL

(PCR扩增反应)

95℃ 30sec

95℃ 30sec 55℃ 1min 68℃ 13min(12次循环)

68℃ 4min

4℃ 无限制时间

引物的碱基序列如下。

309Cys1引物：gtcagcgtcctcaccgtctgtcaccaggactggctgaat

309Cys2引物：attcagccagtcctggtgacagacggtgaggacgctgac

上述的PCR反应结束后，添加1μL的DpnI(New EnglandBioLabs)，在37℃温育2小时。使用温育结束的液体，将大肠杆菌JM109转化，由经转化的大肠杆菌精制质粒。通过确认精制质粒的DNA序列，得到插入了导入变异309(Leu→Cys)的人IgG1H链恒定区的pCR2.1载体。

<精制的各种嵌合抗体的流式细胞分析>

<各种嵌合抗体的活性评价>

<309Cys变异抗体>

通过乳酸脱氢酶释放分析法比较抗CD20野生型抗体和309Cys型嵌合抗体的细胞毒比例。其结果是，添加的抗体的浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1μg/mL时的细胞毒比例，为野生型抗体时分别是1.8％、2.4％、2.2％、7.4％、28.4％、35.7％、37.2％、44.3％，为309Cys型嵌合抗体时分别是3.4％、7.7％、11.8％、28.5％、39.7％、45.7％、39.8％、41.5％。因此ADCC活性之比(野生型抗体和变异型抗体为相同浓度的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的细胞毒比例之比)分别是1.9倍、3.2倍、5.3倍、3.9倍、1.4倍、1.3倍、1.1倍、0.9倍(表15)。

【表15】

此外，从表15选择野生型抗体和309Cys型嵌合抗体之间细胞毒比例为相同程度的2点，尝试ADCC活性的比较。例如，309Cys型嵌合抗体为约0.01μg/mL，显示约39.7％的细胞毒，野生型抗体为1μg/mL，显示约37.2％的细胞毒。使用该2点进行比较时，用于得到相同ADCC活性所必需的抗体浓度减少到约100分之1。由此可以判断ADCC活性上升约100倍(野生型抗体和变异型抗体显示相同细胞毒比例的2点间的、变异型抗体相对于野生型抗体的浓度之比是100倍)。

只要是本领域技术人员，根据上述的方法，由图10可以算出ADCC活性的上升。

序列表

<110>株式会社医学生物学研究所

<120>ADCC活性得到增强的抗体及其制造方法

<130>P07066P

<160>247

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>1

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg 30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>2

atggagwcag acacactcct gytatgggtg 30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>3

atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg 30

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>4

atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg 33

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>5

atggatttwc aggt gcagat twtcagcttc 30

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>6

atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg 27

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>7

atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 31

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>8

atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g 31

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>9

atggtrtccw casctcagtt ccttg 25

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>10

atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>11

atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>12

actggatggt gggaagatgg 20

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>13

atgaaatgca gctggggcat sttcttc 27

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>14

atgggatgga gctrtatcat sytctt 26

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>15

atgaagwtgt ggttaaactg ggttttt 27

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>16

atgractttg ggytcagctt grttt 25

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>17

atggactcca ggctcaattt agttttcctt 30

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>18

atggctgtcy trgsgctrct cttctgc 27

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>19

atggratgga gckggrtctt tmtctt 26

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>20

atgagagtgc tgattctttt gtg 23

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>21

atggmttggg tgtggamctt gctattcctg 30

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>22

atgggcagac ttacattctc attcctg 27

<210>23

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>23

atggattttg ggctgatttt ttttattg 28

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>24

atgatggtgt taagtcttct gtacctg 27

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>25

cagtggatag actgatgggg g 21

<210>26

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>26

actgtggctg caccatctgt cttc 24

<210>27

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>27

ttaacactct cccctgttga agctctt 27

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>28

gcctccacca agggcccatc ggtc 24

<210>29

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>29

ttatttaccc ggagacaggg agaggct 27

<210>30

<400>30

000

<210>31

<400>31

000

<210>32

<400>32

000

<210>33

<400>33

000

<210>34

<400>34

000

<210>35

<400>35

000

<210>36

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>36

accgctcgag atggattttc aggtgcagat tatcagc 37

<210>37

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>37

tttcagctcc agcttggtcc cagcacc 27

<210>38

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>38

actgtggctg caccatctgt cttcatc 27

<210>39

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>39

atagtttagc ggccgcttaa cactctcccc tgttgaagct ctttgt 46

<210>40

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>40

accgctcgag atgggatgga gctgggtctt tctcttc 37

<210>41

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>41

tgaggagacg gtgaccgtgg tccc 24

<210>42

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>42

gcctccacca agggcccatc ggtc 24

<210>43

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>43

agtttagc ggccgcttat ttacccggag acagggagag gctctt 46

<210>44

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>44

atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

gcttatctac agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

agacagggcc tggaatggat tggagctatt tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca agggcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag agtggtgtac 360

tatagtaact cttactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 420

cagcctcca ccaagggccca tcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcgtga gtgccagtac 960

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1140

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1413

<210>45

<211>471

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>45

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

l His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210>46

<211>15

<212>DNA

<213>鼠肌肉

<400>46

agttacaata tgcac 15

<210>47

<211>5

<212>PRT

<213>鼠肌肉

<400>47

Ser Tyr Asn Met His

1 5

<210>48

<211>51

<212>DNA

<213>鼠肌肉

<400>48

gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc tacaatcaga agttcaaggg c 51

<210>49

<211>17

<212>PRT

<213>鼠肌肉

0>49

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>50

<211>39

<212>DNA

<213>鼠肌肉

<400>50

gtggtgtact atagtaactc ttactggtac ttcgatgtc 39

<210>51

<211>13

<212>PRT

<213>鼠肌肉

<400>51

l Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210>52

<211>990

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>52

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agcagagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgtgagtg ccagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210>53

<211>330

<212>PRT

<213>智人

<400>53

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

r Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>54

<211>330

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>54

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Cys Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>55

<211>702

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>55

atggattttc aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60

agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180

ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccccatcca acctggcttc tggagtccct 240

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagtt ttaacccacc cacgttcggt 360

gctgggacca agctggagct gaaaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 702

<210>56

<211>234

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>56

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210>57

<211>30

<212>DNA

<213>鼠肌肉

<400>57

agggccagct caagtgtaag ttacatgcac 30

<210>58

<211>10

<212>PRT

<213>鼠肌肉

<400>58

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210>59

<211>21

<212>DNA

<213>鼠肌肉

<400>59

gccccatcca acctggcttc t 21

<210>60

<211>7

<212>PRT

<213>鼠肌肉

<400>60

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210>61

<211>27

<212>DNA

<213>鼠肌肉

<400>61

cagcagtgga gttttaaccc acccacg 27

<210>62

<211>9

<212>PRT

<213>鼠肌肉

<400>62

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

1 5

<210>63

<211>318

<212>DNA

<213>智人

<400>63

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210>64

<211>106

<212>PRT

<213>智人

<400>64

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>65

<211>978

<212>DNA

<213>智人

<400>65

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540

gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960

tccctgtctc cgggtaaa 978

<210>66

<211>326

<212>PRT

<213>智人

<400>66

a Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210>67

<211>1131

<212>DNA

<213>智人

<400>67

gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacacctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagctc 300

aaaaccccac ttggtgacac aactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt 360

gacacacctc ccccgtgccc acggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctccccca 420

tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccgtgccc aaggtgccca 480

gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggatacc 540

cttatgattt cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600

cccgaggtcc agttcaagtg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 780

cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900

ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac 960

tacaagacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacatcttct catgctccgt gatgcatgag 1080

gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1131

<210>68

<211>377

<212>PRT

<213>智人

<400>68

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210>69

<211>981

<212>DNA

<213>智人

<400>69

gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300

aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360

cctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960

ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210>70

<211>327

<212>PRT

<213>智人

<400>70

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210>71

<211>990

<212>DNA

<213>智人

<400>71

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agcagagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

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<210>72

<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>72

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>73

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>73

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

o Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

o Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>74

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>74

aagccgcgtg agtgccagta caacagc 27

<210>75

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>75

gctgttgtac tggcactcac gcggctt 27

<210>76

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>76

gagcagtaca actgcacgta ccgtgtg 27

<210>77

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>77

cacacggtac gtgcagttgt actgctc 27

<210>78

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>78

tacaacagca cgtactgtgt ggtcagcgtc ctc 33

<210>79

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>79

gaggacgctg accacacagt acgtgctgtt gta 33

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<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>80

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cagaagttca agggcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

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tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

ggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540

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cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcgtga ggagcagtac 960

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<210>81

<211>471

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>81

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly

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Val His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

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Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

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Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

p Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu

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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

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Asn Cys Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

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Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

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<210>82

<211>990

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>82

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

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gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

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ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

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<211>330

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>83

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

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Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

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Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Cys Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210>84

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>84

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ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

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caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

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ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

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<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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Gln Tyr Asn Cys Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

hr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>86

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>86

atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

gcttatctac agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

agacagggcc tggaatggat tggagctatt tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca agggcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag agtggtgtac 360

tatagtaact cttactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 420

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

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aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

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gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

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tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1413

<210>87

<211>471

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>87

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

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50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

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Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser LeuSer Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu

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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

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Asn Ser Thr Tyr Cys Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210>88

<211>990

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>88

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ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

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<210>89

<211>330

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>89

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210>90

<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>90

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<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>91

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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210 215

<210>92

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>92

atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

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cagctcagca gcctgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag agtggtgtac 360

tatagtaact cttactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 420

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacat gcccgcgtga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1140

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

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<211>471

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<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>93

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p Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

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<211>990

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>94

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

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ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

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<210>95

<211>330

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>95

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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<210>96

<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>96

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacatgc 180

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tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>97

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>97

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Cys Pro Arg Glu Glu

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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>98

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>98

atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

gcttatctac agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

agacagggcc tggaatggat tggagctatt tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca agggcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag agtggtgtac 360

tatagtaact cttactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 420

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600

aggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

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aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

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gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

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acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1413

<210>99

<211>471

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>99

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

Asp Val Trp Gly Thr Gly ThrThr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Cys Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210>100

<211>990

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>100

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

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ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagt gccgtgagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

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ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

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cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210>101

<211>330

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>101

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Cys Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>102

<211>651

2>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>102

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

tgccgtgagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>103

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>103

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Cys Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>104

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>104

atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

gcttatctac agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

agacagggcc tggaatggat tggagctatt tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca agggcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag agtggtgtac 360

tatagtaact cttactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 420

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgtgtga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1140

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1413

<210>105

<211>471

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>105

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

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450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210>106

<211>990

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>106

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agcagagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

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agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

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<210>107

<211>330

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>107

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>108

<211>651

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>108

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgtgtgagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

ccgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>109

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>109

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

al Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>110

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

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<223>人工合成的肽序列

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180 185 190

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195 200 205

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215

<210>116

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>116

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180 185 190

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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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<210>120

<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

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<212>PRT

<213>人工的

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<223>人工合成的肽序列

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115 120 125

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130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>122

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

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<223>人工合成的肽序列

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130 135 140

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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

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180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

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Asn Ser Thr Cys Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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r Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<223>人工合成的肽序列

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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

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tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

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<211>217

<212>PRT

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<223>人工合成的肽序列

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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>134

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>135

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Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

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100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

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130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

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260 265 270

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275 280 285

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Cys Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

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<212>DNA

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<223>人工合成的核苷酸序列

<400>136

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<223>人工合成的肽序列

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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180 185 190

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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<211>651

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<213>人工的

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<223>人工合成的核苷酸序列

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<213>人工的

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<223>人工合成的肽序列

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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210>140

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<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>140

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<211>471

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>人工的

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<223>人工合成的肽序列

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Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

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Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

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Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

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tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

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20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Cys Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

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<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

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<223>人工合成的核苷酸序列

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<213>人工的

<220>

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tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat tgcaagacaa agccgcgtga ggagcagtac 960

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agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

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ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

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180 185 190

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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<210>156

<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>156

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

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ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

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tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>157

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>157

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Cys Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

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<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>158

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<212>PRT

<213>人工的

0>

<223>人工合成的肽序列

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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

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Pro Ala Pro Ile Glu Lys ThrIle Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>160

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<213>人工的

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<223>人工合成的肽序列

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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Cys Thr Lys Pro Arg Glu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

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<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

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<211>217

<212>PRT

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>

3>

人工合成的肽序列

<400>163

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Cys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

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<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>164

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Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

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Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

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<223>人工合成的核苷酸序列

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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

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<223>人工合成的核苷酸序列

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tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>169

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>169

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Cys Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>170

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>170

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>171

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly

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Val His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

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Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

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65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

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100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

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Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

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145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp TyrPhe Pro Glu

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Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

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Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Cys Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

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<212>DNA

<213>人工的

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<223>人工合成的核苷酸序列

<400>172

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<223>人工合成的肽序列

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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<211>651

<212>DNA

<213>人工的

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<210>175

<211>217

<212>PRT

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<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>175

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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<223>人工合成的核苷酸序列

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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

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<223>人工合成的核苷酸序列

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agcacgtacc gtgtggtcag cgtctgcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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<210>180

<211>651

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<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>180

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

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<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

0>181

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Cys Thr Val Leu His

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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

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<211>1413

<212>DNA

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<223>人工合成的核苷酸序列

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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

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<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>192

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgtgagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac ctgcctgcac 240

aggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>193

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>193

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Cys Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>194

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>194

agtggtggtt actactggag c 21

<210>195

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>195

Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser

1 5

10>196

<211>48

<212>DNA

<213>智人

<400>196

tacatctatt acagtgggag cacctactac aacccgtccc tcaagagt 48

<210>197

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>197

Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210>198

<211>30

<212>DNA

<213>智人

<400>198

acaccgtggg agctactagc ttttgatatc 30

<210>199

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>199

Thr Pro Trp Glu Leu Leu Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210>200

<211>705

<212>DNA

<213>智人

<400>200

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgcggtgcc 60

agatcctatg agctgactca gccaccctca gtgtcagtgg ccccaggaaa gacgaccagg 120

ttacctgtg ggggaaacaa cattggaagt aaaagtgcgc actggtacca gcagaagcca 180

ggccaggccc ctgtgctggt catctattat gatagcgacc ggccctcagg gatccctgag 240

cgattctctg gctccaactc tgggaacacg gccaccctga ccatcagcag ggtcgaagcc 300

ggggatgagg ccgactatta ctgtcaggtg tgggatagta gtagtgatca ttgggtgttc 360

ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 420

ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480

gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540

ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 600

ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat 660

gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcg 705

<210>201

<211>235

<212>PRT

<213>智人

<400>201

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

20 25 30

Val Ala Pro Gly Lys Thr Thr Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile

35 40 45

Gly Ser Lys Ser Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp

100 105 110

Ser Ser Ser Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

115 120 125

Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

145 150 155 160

Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser

165 170 175

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn

180 185 190

Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp

195 200 205

Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr

210 215 220

Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210>202

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<400>202

gggggaaaca acattggaag taaaagtgcg cac 33

<210>203

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>203

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Ala His

1 5 10

<210>204

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>204

tatgatagcg accggccctc a 21

<210>205

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>205

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser

1 5

<210>206

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<400>206

caggtgtggg atagtagtag tgatcattgg gtg 33

<210>207

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>207

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val

1 5 10

<210>208

<211>1404

2>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>208

atgaaacacc tgtggttctt cctcctacta gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60

gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120

tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtggttact actggagctg gatccgccag 180

cacccaggga agggcctgga gtggattggg tacatctatt acagtgggag cacctactac 240

aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc 300

ctgaagctga gctctgtgac tgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gaggacaccg 360

tgggagctac tagcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcggcctcc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

aggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagcaga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcgtg aggagcagta caactgcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaa 1404

<210>209

<211>468

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>209

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile

35 40 45

Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

85 90 95

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Trp Glu Leu Leu Ala Phe Asp Ile

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Cys Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210>210

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>210

gtgcataatg ccaagacatg cccgcgtgag gagcagtac 39

<210>211

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>211

gtactgctcc tcacgcgggc atgtcttggc attatgcac 39

<210>212

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>212

cataatgcca agacaaagtg ccgtgaggag cagtacaac 39

<210>213

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>213

gttgtactgc tcctcacggc actttgtctt ggcattatg 39

<210>214

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>214

gccaagacaa agccgtgtga ggagcagtac aac 33

<210>215

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>215

gttgtactgc tcctcacacg gctttgtctt ggc 33

<210>216

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>216

tacaacagca cgtaccgttg cgtcagcgtc ctcaccgtc 39

<210>217

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>217

gacggtgagg acgctgacgc aacggtacgt gctgttgta 39

<210>218

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>218

aacagcacgt accgtgtgtg cagcgtcctc accgtcctg 39

<210>219

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

3>人工合成的引物序列

<400>219

caggacggtg aggacgctgc acacacggta cgtgctgtt 39

<210>220

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>220

accgctcgag atggacatga gggtccccgc tcagctc 37

<210>221

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

0>221

atagtttagc ggccgcttac gaacattctg taggggccac tgtctt 46

<210>222

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>222

accgctcgag atgaaacacc tgtggttctt cctc 34

<210>223

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>223

cgagacggtg accattgtcc cttg 24

<210>224

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>224

gacggcgtgg aggtgcattg tgccaagaca aagccgcgt 39

<210>225

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>225

acgcggcttt gtcttggcac aatgcacctc cacgccgtc 39

<210>226

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>226

ggcgtggagg tgcataattg caagacaaag ccgcgtaag 39

<210>227

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>227

cttacgcggc tttgtcttgc aattatgcac ctccacgcc 39

<210>228

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>228

gtggaggtgc ataatgcctg tacaaagccg cgtgaggag 39

<210>229

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>229

ctcctcacgc ggctttgtac aggcattatg cacctccac 39

<210>230

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>230

gaggtgcata atgccaagtg caagccgcgt gaggagcag 39

<210>231

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>231

ctgctcctca cgcggcttgc acttggcatt atgcacctc 39

<210>232

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>232

acgtaccgtg tggtcagctg cctcaccgtc ctgcaccag 39

<210>233

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>233

ctggtgcagg acggtgaggc agctgaccac acggtacgt 39

<210>234

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>234

taccgtgtgg tcagcgtctg caccgtcctg caccaggac 39

<210>235

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>235

gtcctggtgc aggacggtgc agacgctgac cacacggta 39

<210>236

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>236

cgtgtggtca gcgtcctctg cgtcctgcac caggactgg 39

<210>237

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>237

ccagtcctgg tgcaggacgc agaggacgct gaccacacg 39

<210>238

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>238

gtggtcagcg tcctcacctg cctgcaccag gactggctg 39

<210>239

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>239

cagccagtcc tggtgcaggc aggtgaggac gctgaccac 39

<210>240

<211>1413

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>240

atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

gcttatctac agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

agacagggcc tggaatggat tggagctatt tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca agggcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag agtggtgtac 360

tatagtaact cttactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 420

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcgtga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtctgtc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1140

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1413

<210>241

<211>471

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>241

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val LeuThr Val Cys His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210>242

<211>990

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>242

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

actctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

cacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agcagagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgtgagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtctgtcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

gaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210>243

<211>330

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>243

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu MetIle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

GlnLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>244

<211>651

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>244

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgtgagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtctgtcac 240

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210>245

<211>217

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>245

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210>246

<211>315

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>246

cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc 60

aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc 120

tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa 180

agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc 240

cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc 300

cctacagaat gttcg 315

<210>247

<211>105

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的肽序列

<400>247

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

Claims

1、一种抗体，其特征在于，在H链恒定区中，选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸。

2、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，H链恒定区是选自人Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4中的任一个恒定区。

3、如权利要求1或2中任一项所述的抗体，其特征在于，与置换前相比，ADCC活性上升。

4、如权利要求1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，具有得到改善的稳定性、溶解性或对Fc受体的结合亲和性。

5、如权利要求1～4中任一项所述的抗体，其特征在于，被赋予糖链。

6、如权利要求5所述的抗体，其特征在于，改善效应功能。

7、如权利要求1～6中任一项所述的抗体，其特征在于，与FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn结合。

8、如权利要求1～7中任一项所述的抗体，其特征在于，对选自CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF中的目标抗原具有特异性。

9、一种抗体，其特征在于，是对CD20具有特异性的人源化抗体，选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸。

10、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号93记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

11、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号99记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

12、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号105记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一项所述的H链、和下述(i)或(ii)所述的L链的对的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

13、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号45记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

14、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号81记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

15、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体；

(2)含有具有序列号87记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

16、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号129记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

17、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号135记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

18、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号141记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

19、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号147记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

20、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号153记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

21、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号159记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

22、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号165记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

23、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号171记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

24、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号177记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

25、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号183记载的氨基酸序列的H链的抗体、

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

26、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号189记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

27、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号243记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号56记载的氨基酸序列的L链。

28、下述(1)～(4)中任一项所述的抗体：

(2)含有具有序列号209记载的氨基酸序列的H链的抗体；

(ii)具有序列号201记载的氨基酸序列的L链。

29、ADCC活性得到增强的抗体的制造方法，其特征在于，包括如下工序：在H链恒定区中，将选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸的工序。

30、ADCC活性得到增强的抗体的制造方法，其特征在于，包括以下的(a)以及(b)的工序：

(b)回收工序(a)的表达产物的工序。

31、如权利要求29或30所述的方法，其特征在于，H链恒定区是选自人Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4中的任一个恒定区。

32、一种医药组合物，含有权利要求1～28中任一项所述的抗体和医药上能容许的担载体。

33、一种非人哺乳动物的治疗方法，包括将权利要求1～28中的任一抗体给予对象的工序。

34、一种核酸，编码权利要求1～28中的任一抗体。

35、一种载体，含有权利要求34所述的核酸。

36、一种宿主细胞，具有权利要求35所述的载体。

37、一种宿主生物，具有权利要求35所述的载体。

38、将抗体ADCC活性增强的方法，其特征在于，包括如下工序：

H链恒定区中，将选自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基置换成半胱氨酸。

39、如权利要求38所述的方法，其特征在于，H链恒定区是选自人Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4中的任一个恒定区。

40、一种判定工序(a)的抗体的ADCC活性是否得到增强的方法，其特征在于，在工序(b)中测定的ADCC活性高于置换前抗体的ADCC活性时，判定工序(a)的抗体的ADCC活性得到增强；

(a)提供具有ADCC活性的抗体的变异体，即选自H链恒定区中的286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1个位置的氨基酸残基被置换成半胱氨酸的抗体，和

(b)测定工序(a)的抗体的ADCC活性的工序。

41、ADCC活性得到增强的抗体的筛选方法，其特征在于，包括以下的(a)～(d)的工序：

(a)提供具有ADCC活性的抗体的工序；

(c)采用权利要求40所述的方法判定在工序(b)中得到的抗体的ADCC活性是否得到增强的工序；

(d)选择在工序(c)中判定ADCC活性得到增强的抗体的工序。