CN101516320B - 稀土元素在毛发改善方面的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明披露了选自由铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)、钌(Lu)和它们的混合物组成的组的稀土元素或者它们的盐或氧化物用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的用途。
Description
技术领域
本发明涉及稀土元素在毛发改善方面的用途，更具体而言，涉及选自由铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)、钌(Lu)和它们的混合物组成的组的稀土元素或者它们的盐或氧化物在防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成方面的用途。
背景技术
通常，人体具有大约100,000～150,000根头发。头发通过彼此周期不同的生长期、退行期和休止期这几个阶段生长和脱落。这一生长周期每隔3至6年重复一次，因此，每天会脱落50至100根头发。脱发症是指发生处于生长期的头发减少而处于退行期和休止期的头发增多的情况。脱发症主要由发根和皮脂腺处的雄激素(一种雄性性激素)分泌过多引起，所述雄激素强烈刺激毛囊细胞并收缩毛囊，由此妨碍毛发生长。脱发症的其它已知原因包括局部血流紊乱引起的营养不足、皮脂分泌过多、过氧化物或细菌等引起的头皮功能障碍、因强烈的外部压力和慢性病所致的神经症的延续等等。随着工作过度、环境污染、因误用或滥用成瘾性药物引起的副反应、因烫发、染发、使用摩丝、喷发剂等引起的头皮血流紊乱和遗传因素等造成的脱发症的发生日益严重，人们对于头发再生也越来越关注。近来年轻人中脱发症在增加，其中包括女性肥胖型脱发症和男性型脱发症。因此，为改善脱发症，市面上有各种头发再生或生长剂在出售。可商购的头发再生或生长剂包括血管扩张剂，例如氯化镱、米诺地尔等；抑制雄性性激素活动的激素药物，例如雌性激素和雌二醇等；以及雄性性激素活性抑制剂，例如十五烷酸和非那甾胺等。
最常用的治疗或预防脱发症或促进毛发再生的药剂是由Upjohn Co.，Ltd.制造的含有米诺地尔的配方，美国专利4,596,812号公报披露了这种制剂。米诺地尔是已经美国食品和药品管理局(FDA)批准的两种毛发再生成分之一。米诺地尔最初是作为以降低血压为目的的高血压治疗药物而开发的。然而，毛发再生作为副作用被发现，因此米诺地尔作为毛发再生剂而更为闻名。虽然米诺地尔作为毛发再生剂的作用机理尚不明确，但是据信米诺地尔通过以血管舒张作用增加血流而改善了发根营养，由此促进毛发生长。最近的报道间接支持了这一增加血流模式(Br.J.ofDermatol.，1998；138；.407-411)，报道指出，米诺地尔提高血管内皮生长因子(VEGF)的表达，所述血管内皮生长因子是一种与真皮乳头的血管舒张有关的生长因子，而真皮乳头正是构成发根的主要细胞。除了在毛发再生中的血管舒张作用外，据报道，米诺地尔还促进体外培养的发根中的真皮乳头细胞的活化(Skin Pharmacol.，1996；9；3-8)，并在组织培养中促进毛囊的生长(J.Invest.Dermatol.，1989；92；315-320)。这间接表明米诺地尔可以作为生长因子直接作用于发根。此外，默克公司(Merck)最近商业化的保法止(Propecia)的一种主要成分非那甾胺通过5α-还原酶的作用抑制雄性性激素睾丸激素转化为二氢睾酮(DHT)，后者是比睾丸激素更有效的雄性激素。1997年12月，FDA批准了保法止的1mg片剂可以作为用于治疗男性型脱发症的毛发再生剂，目前可以商购获得。临床应用中，该药物已被证实具有明显效果(J.Am.Acad.Dermatol.，1998；39；578-589)。另外，也有通过向头皮涂抹或者口服各种天然物质或草药的提取物来促进毛发再生的许多成就。
然而，已经广泛应用于预防和治疗脱发症的米诺地尔和氯化镱的临床效果不足。抑制雄性性激素作用的激素药或者雄性性激素活性抑制剂的临床效果也不足，或者可能出现抑制男性性功能的副作用。另外，由于它们的活性成分是合成化合物，因而它们可能在人体安全性方面存在问题，并且在毛发再生或毛发生长方面不能表现出充分的效果。至于含有各种天然提取物的毛发改善组合物，它们的作用机理尚未得到明确揭示，其效果也尚未得到充分证明。此外，它们还存在下述问题：活性成分的吸收性较差、皮肤感觉不佳(例如，会粘结在头皮上)，并导致皮肤问题。
为了克服化学药物副作用所带来的毛发再生剂的局限性，已经实施了在头皮上植入头发的做法，然而这一做法费用很高，并且一根根地植入头发需要很长时间。因此，植入只是权宜之计，不足以作为基本治疗。
毛发由三部分构成：表皮、皮质和髓质。包围髓质的皮质是毛发最厚的部分(大约为毛发总厚度的80％～90％)，它包括被称作黑素体的细粒，所述黑素体由黑色素、脂质膜、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、TRP-2和其它蛋白构成。黑色素在黑素细胞内的细胞器官——黑素体处合成，并通过黑素细胞的树突被传送到临近的角化细胞。黑色素的合成路径中，酪氨酸(一种氨基酸)被氧化为DOPA，而DOPA被进一步氧化为多巴醌，酪氨酸酶参与了该步骤。后续反应是自氧化的，但是已经知道，诸如TRP-1和TRP-2等酶参与并加速这些反应。毛发的亮度由诸如以酪氨酸形成的真黑素和褐黑素的类型和分布量等因素决定，因此，每个人都具有独一无二的发色。真黑素是最常见和最黑的颜料，形成棕色或黑色毛发。褐黑素具有浅色并形成金色毛发。产生白发的原因在于，黑素生成停止于多巴醌，随之发生角质化，并且由于无法产生酪氨酸酶而不会发生氧化。在具有黑发或棕色毛发的人种中可以更明显地观察到白发，而且，白发是随黑素细胞中黑素生成停止而出现的一种老化现象。除了这种老年型白发，白发还包括过头发早白、遗传型白发症、寻常性白癜风和斑秃等引起的后天性白发症、药物和化学药品引起的白发、压力引起的白发症、自身免疫性疾病引起的白发、营养不良和营养失衡引起的白发症、肾功能异常引起的白发症等等。
基因治疗可以治疗遗传性白发，而疾病的治疗可以治疗因该疾病引起的白发。其它情况中，已经知道可将软花属植物、苦参、羊栖菜、生地黄、熟地黄、桑果、车前草油、竹油、熊油等作为偏方使用，但是并不能寄希望于它们具有显著疗效。
稀土元素是在地壳中的含量约为0.016％的痕量元素，是指包括17种元素的矿物质，其中有元素周期表中的原子数从57至71的15种元素(La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)和2种3A族元素(Sc、Y)。稀土元素可以以盐的形态存在，其中所述稀土元素与其反离子离子键合，例如，可以以硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐、磷酸盐、氯化物等形态存在，或者以氧化物(包括氢氧化物)形态存在。尽管从发现至今仅有200年，但是稀土元素非常有用，而公众对其却仍知之甚少。由于稀土元素因其独特的电子结构而具有独特的物理和化学效应，因而被用在机械、石油化学、光化学等领域中作为永久磁铁、超导体或荧光团，近来，已经尝试将它们应用于农业、林业、家畜业等各种领域中。此外，作为生物效应，稀土元素能够促进高等植物的光合作用和叶绿素生成；促进成苗；提高根系活力；激活呼吸机能；促进营养在植物体中的输送；控制水分；促进细胞分裂、激素传递和营养的吸收和输送；激活新陈代谢；提高叶子中的蛋白质和RNA的合成；等等。另外，它们还能阻止叶子老化，提高绿藻中的蛋白质含量，并通过促进光合作用和放氧活性而促进蛋白质和叶绿素的合成。已经知道，La3+可以提高人类红血球的细胞膜中的(Na+，K+)-ATP酶和Mg2+-ATP酶的活性，并由此增强Ca2+离子在人体内的功能(The journal of BiologicalChemistry，1986；261(20)；9552-9557)。已经知道，一些稀土元素具有抗菌(Chem.Pharm.Bull，2003；51(5)；494-498)和抗氧化活性，其方式是防止反应性氧类物质的产生(Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，2006；2；86-91)。此外，已经知道，一些稀土元素可以通过与远红外线的相互作用作为碱性离子来活化细胞，促进血液循环，增强新陈代谢和提高组织再生能力，由此防止疲劳和老化。还已知道，在肥猪饲养中，它们可以增加肥猪重量，提高饲料转化率(FCR)(J.Anim.Physiol.a.Anim.Nutr.，2001；85；263-270)。此外，发现了稀土元素毒性低，消化器官吸收量极少，基本不在体内累积，而且不会致畸、不会致突变或致癌(Environmental Health Perspectives，1996；104；85-95)。
韩国专利569,083号公报公开了一种包含掺杂有金属氧化物的氧化铈的紫外线屏蔽剂和含有该屏蔽剂的化妆品组合物，所述氧化铈中掺杂的是离子半径比Ce4+大的金属离子和/或化合价比Ce4+低的金属离子。该专利还描述了所述化妆品组合物可以用作毛发用化妆品。然而，该专利涉及掺杂有金属氧化物的氧化铈，而未涉及稀土元素或者其盐或其混合物的使用。美国专利5,112,360号公报公开了一种包含5，6-二羟基吲哚和/或吲哚衍生物以及至少一种稀土元素的盐的染发剂。然而，该专利涉及所述含有吲哚化合物和稀土元素的盐的组合物的染发效果，而未教导或表明当施用于毛发或发根时稀土元素自身即可直接促进黑发形成。另外，日本专利2003-137749号公报(2003年5月14日公开)公开了一种装入喷雾容器的毛发用遮瑕剂，所述毛发用遮瑕剂通过以下过程制造，其中先将含有诸如镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)和钌(Lu)等放射性稀土元素的天然矿石粉碎为直径≤5μm的颗粒，再将经粉碎的所述天然矿石与着色剂在粘稠的液体粘合剂(由醇溶剂和可溶于所述溶剂的溶质构成)中混合以得到混合物，然后将所述混合物装入喷雾容器中。这一专利公报涉及毛发用遮瑕剂，利用所述毛发用遮瑕剂覆盖缺发区域以使其看起来像长有毛发，并改善头皮周围的环境以利于毛发的再生和生长。该专利公告描述了喷洒之后附着在头皮上的放射性稀土元素所放射的β射线形成阴离子，由此促进血液循环，从而促进毛发再生和生长。然而，该专利公告涉及通过由天然放射性稀土元素放射的β射线促进血液循环和由其衍生出的毛发遮瑕或生长作用，而没有提及通过稀土元素来促进细胞增殖、抑制TGF-β表达、促进VEGF表达、促进酪氨酸酶的活性和表达以及促进黑素生成。
发明内容
技术问题
为解决本领域已知的毛发再生剂的各种问题，本发明人进行了广泛研究，旨在开发对于人体安全、无副作用的用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和防止头皮屑并促进黑发形成的改良的制剂。结果，本发明人惊讶地发现，至少一种稀土元素在上述用途中极为有效，由此完成了本发明。
鉴于此，本发明的第一目的是提供一种用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的组合物，所述组合物包含至少一种稀土元素。
本发明的第二目的是提供至少一种稀土元素对于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的用途。
本发明的第三目的是提供一种通过使用至少一种稀土元素来防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的方法。
本发明的第四目的是提供一种通过使用至少一种稀土元素来制备用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的制剂的方法。
技术方案
本发明的一个方面涉及一种用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的组合物，所述组合物包含作为活性成分的选自由铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)、钌(Lu)和它们的混合物组成的组的稀土元素或者它们的盐或氧化物。
本发明的另一方面涉及选自由铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)、钌(Lu)和它们的混合物组成的组的稀土元素或者它们的盐或氧化物用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的用途。
本发明的又一方面涉及一种用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的方法，所述方法包括对于有需要的对象施用选自由铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)、钌(Lu)和它们的混合物组成的组的稀土元素或者它们的盐或氧化物的步骤。
本发明的再一方面涉及一种通过使用选自由铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)、钌(Lu)和它们的混合物组成的组的稀土元素或者它们的盐或氧化物，制备用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的制剂的方法。
此处所用的术语“防止脱发”是指防止、抑制、阻止和减少部分或完全脱发。
此处所用的术语“促进毛发再生”被定义为包括维持、诱发、刺激、促进和恢复毛发产生、缺发的生长，或者毛发生长周期中生长期的延长。
此处所用的术语“毛发生长”被定义为包括防脱、促进毫毛的发展和生长以及毫毛向终毛的转化。
此处所用的术语“脱发”或“脱发症”是指毛发生长不足和毛发部分或完全脱落，包括但不限于雄激素源性脱发症或男性型脱发症、中毒性脱发症、斑秃、休止期脱发、因内分泌反常、代谢紊乱或营养不良引起的脱发症、药物诱发的脱发症、机械性脱发、皮肤病并发的脱发症、瘢痕性脱发症、先天性脱发症和拔毛癖。
稀土元素具有相似的物化性质，可用于本发明的稀土元素的种类不受特别限制，可以单独使用任何一种稀土元素或者将任何一种稀土元素与其它稀土元素混合使用。优选的是使用铈(Ce)。也可以使用稀土元素的盐，只要其无毒、可药用或可化妆品用即可。其实例包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐、磷酸盐、氯化物等。此外，也可以使用稀土元素的氧化物(例如Ce2O3、La2O3等)，只要其无毒、可药用或可化妆品用，即可不受其它限制。在本发明中，稀土元素的氧化物包括稀土元素的氢氧化物(例如Ce(OH)3、La(OH)3等)。
为用于本发明，可将稀土元素粉碎成细粉，并且含量可以是0.0001重量％～10重量％，特别是0.001重量％～10重量％，更特别是0.001重量％～0.1重量％。
本发明的组合物可以进一步包含一种或多于一种的可药用或可化妆品用的载体。本发明的组合物可以使用制药或化妆品制造中常用或广为人知的任何装置或方法制备(例如，Remington’s Pharmaceutical Science，15’th Edition，1975，Mack Publishing.Company，Easton，Pennsylvania 18042(Chapter 87：Balug，Seymour))。本发明的组合物通常包含基剂，如果需要也可以向其中适当加入用于药物或化妆品的其它成分。作为用于本发明的组合物的基剂，可以使用任何一种常规基剂，其实例包括纯水、矿泉水、乙醇、甘油、鲨烯、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、蓖麻油、山茶油和液体矿脂。加入本发明的组合物的其它成分的实例包括但不限于表面活性剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂和香味剂。
表面活性剂可以是阳离子、阴离子或非离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的实例包括诸如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等高级脂肪酸的碱盐(例如，氯化钠、氯化钾、氯化铵和三乙醇胺氯化物)；诸如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸三乙醇胺等烷基硫酸酯的盐；和诸如聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠、聚氧乙烯月桂基醚硫酸三乙醇胺等烷基醚硫酸酯的盐。非离子表面活性剂的实例包括诸如聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯油烯基醚等聚氧乙烯烷基醚；和诸如椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺等烷醇酰胺。阴离子表面活性剂的实例包括硬脂基三甲基氯化铵、鲸蜡基三甲基氯化铵和硬脂基二(二乙醇)羟乙基氯化铵。
乳化剂的实例包括cethanol、硬脂醇和山嵛醇。
增稠剂的实例包括海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。
防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯和苯扎氯铵。
抗氧化剂的实例包括丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯和丁基羟基茴香醚。
香味剂可以是常用香料，其实例包括柑橘、薰衣草和花香香料(floral)。
除了上述成分，本发明的组合物还可以进一步包含至少一种糖，所述糖包括诸如葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖等单糖；和诸如麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖等二糖，所述糖可以起到为毛囊提供营养的作用。相对于所述组合物的总重量，糖的用量优选为0.01重量％～1重量％。此外，本发明的组合物可以进一步包含一种或多于一种的促进毛发生长的常用辅剂，其实例包括选自由人参、苦参、柑橘皮、绿茶、胡萝卜、桔梗、桑椹、鹿藿、石榴、松针、月见草籽、侧柏针叶、软花属植物、鳢肠、刺蒺藜提取物、甜菜碱、薄荷提取物、荨麻提取物、问荆提取物、薰衣草提取物、蛇麻草提取物、芦荟、刺五加、冬虫夏草(vegetable worm)、高丽悬钩子、桑果、木醋酸液(Poroligenous liquor)、竹盐、黄芪、朝鲜当归、枸杞、胡桃、葡萄、红花、芝麻、紫苏子、大蒜、海藻、褐海藻、梅、绿豆、水稻、十五烷酸甘油酯、日扁柏素、辣椒酊、姜酊、斑蝥酊、毛喉萜(forskolin)、反式-3，4’-二甲基-3-羟基黄烷酮、诸如醋酸维生素E等维生素E、烟酸、烟酰胺、维生素A棕榈酸酯、β-胡萝卜素、维生素D2、叶酸、生物素、D-泛醇、乙酰基泛醇乙醚、泛酸钙、泛醇乙醚、抗坏血酸、葡萄柚籽提取物、千金藤素、烟酸苄基酯、维生素A、B1、B2、B6(吡哆醇)和它们的衍生物、泛酸及其衍生物、米诺地尔、瘤毛獐牙菜提取物、精氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、胱氨酸、氨基酸提取物、β-甘草次酸、甘草酸、盐酸吡哆辛、水杨酸、尿囊素、光敏剂301、异丙基甲基苯酚、吡啶酮乙醇胺、甘油、吡咯烷酮羧酸、雌二醇、乙炔雌二醇和1-薄荷醇等组成的组中的一种或多于一种的辅剂。其用量优选为所述组合物总重量的0.0001重量％～10重量％。
诸如镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)或钌(Lu)等稀土元素与辣椒酊结合具有协同效应，可以通过降低TGF-β表达和提高VEGF表达提供更为优异的防止脱发、促进毛发再生和毛发生长以及除去和预防头皮屑的效果，并且通过促进酪氨酸酶的表达和活性以及黑素色的产生可以提供更为优异的促进黑发形成的效果。这两种成分之间的结合比例不受特别限制，只要能够获得需要的协同效应即可，但是优选的是，包含的稀土元素与辣椒酊的重量比为1∶0.0001～1，特别是1∶0.01～1，更特别是1∶0.1～1。这是因为，在此范围内需要的协同效应可以实现最大化，但是本发明的范围并不限于此特定范围。此外，本组合物还可以包含姜酊和/斑蝥酊。姜酊是通过以乙醇提取姜(拉丁名：Zingiber officinaleroscoe)的根茎获得的酊剂，以其刺激性成分姜油酮、生姜酚等闻名，可以刺激发根，从而促进毛发再生。斑蝥是指芫菁科昆虫，斑蝥酊通过使用乙醇提取这种昆虫而获得。
施用本发明的组合物的对象不受特别限制，本发明的组合物可以施用于人和包括家畜和宠物在内的所有动物。
本发明的组合物可以经皮施用或口服施用，为此目的，可将其配制为洗液、软膏、乳膏、贴剂、喷剂、片剂、丸剂、粉末、袋装剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆或者软胶囊或硬胶囊。
特别的是，本发明的组合物可以通过直接涂抹或喷洒而使用。可施用本发明的组合物的毛发包括发根和毛囊，并包括头上的头发、眉毛和睫毛、颔毛、髭须、腮须、腋毛和身体上具有发根和毛囊的任何区域。因此，本发明可以用作生发水、发乳、发膏、发胶、摩丝、发用啫喱、护发素、洗发香波、染发液、焗油膏、毛发护理剂、眉毛再生剂、睫毛再生剂或睫毛营养剂，或者宠物用香波和染发剂。
本发明的稀土元素的剂量应该根据性别、年龄、脱发症状况、毛发状况等适当确定。通常，成人日剂量为大约0.1mg/cm2～大约5mg/cm2，可以在一天内分1～5次施用。
附图说明
通过结合附图提供的下述优选实施方式的描述，可以更清楚本发明的上述及其它目的、特征和优点，在附图中：
图1是显示不同浓度的各元素促进细胞增殖作用的图；
图2是显示浓度恒定的混合和单一的稀土元素促进细胞增殖作用的图；
图3是显示本发明的组合物促进动物毛发再生作用的图；
图4是显示以本发明的组合物治疗过的动物皮肤组织的显微照片；
图5是显示以本发明的组合物治疗过的动物组织中的TGF-β2和VEGF表达的图；
图6是显示本发明的组合物促进人头发再生作用的照片；
图7是显示以不同浓度的各元素处理过的人黑素瘤细胞系中酪氨酸酶活性的图；
图8是显示以不同浓度的各元素处理过的小鼠黑素瘤细胞系中酪氨酸酶活性的图；
图9是显示以混合和单一的稀土元素处理过的人和小鼠黑素瘤细胞系中酪氨酸酶表达的图；
图10是显示以混合和单一的稀土元素处理过的人和小鼠黑素瘤细胞系中黑色素产生的图；
图11是显示以镧和辣椒酊的组合处理过的人和小鼠黑素瘤细胞系中TGF-β2和VEGF表达的图；和
图12是显示以镧和辣椒酊的组合处理过的人和小鼠黑素瘤细胞系中黑色素产生的图。
具体实施方式
下面将参考实施例具体描述本发明，但是不应认为这些实施例会以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：用于毛发改善的组合物的制备
采用图1所示的成分和用量，将稀土元素的混合粉末与其它成分均匀混合，然后过滤该混合物，以制备用于毛发改善的组合物。所制备的用于毛发改善的组合物为浅棕色不透明物，其pH为5.0～8.5。
表1：用于毛发改善的组合物的成分和用量
实施例2～实施例18：用于毛发改善的组合物的制备
根据与实施例1基本相同的方法制备用于毛发改善的组合物，不同之处在于，分别使用单一稀土元素，即，Ce(实施例2)、Pr(实施例3)、Pm(实施例4)、Eu(实施例5)、Tb(实施例6)、Dy(实施例7)、Ho(实施例8)、Er(实施例9)、Tm(实施例10)、Yb(实施例11)、Sc(实施例12)、Y(实施例13)、La(实施例14)、Nd(实施例15)、Sm(实施例16)、Gd(实施例17)和Lu(实施例18)代替混合的稀土元素。
实施例19：用于毛发改善的组合物的制备
根据与实施例1基本相同的方法制备用于毛发改善的组合物，不同之处在于，使用0.1重量％的La、Nd、Sm和Lu的混合粉末代替稀土元素的混合粉末，并且还使用了0.001重量％的辣椒酊。所制备的用于毛发改善的组合物为浅棕色不透明物，其pH为5.0～8.5。
实施例20～实施例24：用于毛发改善的组合物的制备
根据与实施例19基本相同的方法制备用于毛发改善的组合物，不同之处在于，分别使用单一稀土元素，即，La(实施例20)、Nd(实施例21)、Sm(实施例22)、Gd(实施例23)和Lu(实施例24)代替La、Nd、Sm和Lu的混合粉末。
比较例：
根据与实施例1基本相同的方法制备组合物，不同之处在于不使用稀土元素的混合粉末。
实验例1：稀土元素促进细胞增殖的作用的评价
于37℃(95％O2、5％CO2的60％湿度)在培养器中培养小鼠胚成纤维细胞NIH 3T3，同时保持在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s media，DMEM)中的浓度为2×106细胞/ml或者4×106细胞/ml。通过使用MTT[3-(3，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]分析测量细胞增殖。对于MTT分析，将细胞以2×103细胞/ml的浓度接种于96孔板的每个孔中，并使用补充有10％FBS的培养基进行处理。将细胞在培养器中稳定24小时，使用无FBS的DMEM代替补充有FBS的培养基，然后分别使用10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg的混合稀土元素和10ng的单一稀土元素处理细胞。接下来，将细胞培养一段给定时间，向其中添加每孔50μl的MTT(2mg/1ml无菌蒸馏水)，使混合物反应4小时。使用DMSO(二甲亚砜)处理反应混合物，并摇动30分钟。使用酶标仪(ELISA reader)(550，Bio-rad)测量540nm处的吸光度。
使用不同浓度的各元素(混合的稀土元素、Ce、Eu、La、Gd)进行处理的结果如图1中所示，使用恒定浓度的各元素进行处理的结果如图2所示。如图1中所示，发现与未处理的组相比，使用10μg～1pg的各元素处理的组中，细胞增殖得到提高。特别是，与未处理的组相比，铈使细胞增殖提高高达1.69倍。由此得出结论：各元素都影响了细胞增殖。另外，如图2中所示，发现与未处理的组相比，使用10ng的各元素处理的组中细胞增殖得到提高，并且铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)和钇(Y)显示出相似的效果。特别是，在使用铈(Ce)处理的组中，细胞增殖得到最大程度的提高。相反，镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)和钌(Lu)显示了较差的效果。
实验例2：促进动物细胞增殖的作用的评价
在实验开始之前，向6周龄的雄性C57BL6小鼠(29±3g)自由提供压缩饲料(Samyang Co.)和水。为使其适应环境，预先将它们在聚丙烯箱(453×293×247(H)mm，19l)中饲养1周(20℃～24℃，60％～80％湿度)。然后，在背部预定区域(3×5cm2)去除鼠毛，并将它们随机分成使用比较例的组合物处理的组(对照组)，使用实施例1的组合物处理的组和使用实施例2处理的组(实验组)。每组都保持在12小时的明/暗循环中。每天两次(在早、晚给定时间)以恒定的量(1ml)向小鼠施用根据实施例1和实施例2和比较例制备的组合物。在所有实验中，在黑暗中时允许小鼠休息不进行实验，收集组织后允许小鼠恢复24小时。
结果如图3中所示。如图3所示，在使用实施例1和实施例2的组合物处理的组中，发现毛发随时间推移而生长。与使用比较例的组合物处理的组相比，在使用实施例1和实施例2的组合物处理的组中，毛发生长速度快得多，毛发数量多得多，并且毛发较粗且较有光泽。发现实验组和对照组之间存在明显区别，因为前者从开始处理后的第20天起毛发生长速度变得比后者快得多。特别是，含有铈的实施例2的组合物显示出与含有混合的稀土元素的实施例1的组合物相似的效果。
实验例3：动物皮肤组织的观察
将实施例2的小鼠以颈椎脱臼法处死，分离其皮肤，并使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)尽可能地清除污垢。使用剪刀剪下实验区域，并将其用于以下实验。将分离的皮肤在10％的甲醛中固定1天，切割成10mm2的尺寸，并在自动浸透器中浸透12小时，以制备蜡块。然后，使用显微镜用薄片切片机将所述蜡块切成厚度为4μm，并使用苏木精和曙红着色。使用放大100倍的光学显微镜进行读取和照相。
结果如图4中所示。如图4中所示，发现使用实施例1和实施例2的组合物处理的实验组与使用比较例的组合物处理的对照组在毛发生长方面存在显著区别。即，实验组中毛囊产生于皮肤和脂肪组织和真皮中并向表皮生长，而对照组中毛发生长只是刚刚开始。还发现实验组中毛囊数比对照组中多。特别是，含有铈的实施例2的组合物显示出与含有混合的稀土元素的实施例1的组合物相似的效果。作为参考，小鼠的毛发是同步型的，其中所有毛发具有同步周期，而人的毛发则是镶配型(mosaic type)的，其中每根毛发都具有不同的周期。
实验例4：TGF-β2和VEGF的表达的测量
具有亚型的TGF-β是一种多效能细胞因子，它可调节各种细胞和组织的初期发育；细胞周期；细胞的增殖、分化、迁移和存活；细胞外基质的产生；免疫系统；血管和血细胞的形成；细胞凋亡的诱发；骨骼形成；和伤口愈合。已经知道，TGF-β在毛发生长周期的退行期中被表达，从而诱发毛细胞的凋亡。血管内皮生长因子(VEGF)是一种具有亚型的糖蛋白，并且是最常见和有效的生长因子，已经知道，它可以刺激伤口的血管形成，并在许多血管组织中被表达。还已知道，它是一种对于上皮细胞具有特异性的促细胞分裂剂，可以诱发上皮细胞的迁移和增殖，并可以提高血管的渗透性。据信，VEGF参与了由已经商业化的米诺地尔引发的毛发再生，它通过构成毛囊的主要细胞——真皮乳头中的血管舒张作用而增加血流，并向发根提供营养，由此促进毛发生长。
为了通过免疫印迹法(Western blotting)测量上述因子的表达，从实施例3的实验动物的组织获取蛋白质，将其溶解在12％的SDS-PAGE中，并转移到硝化纤维膜(NC)上。将使用含有镧的实施例14的组合物处理的组加入实施例2和实施例3的组中。然后，使用含有5％脱脂乳的tris缓冲盐水(TBS)封闭NC，并使其分别与稀释至1∶1000的第一抗体(抗TGF-β2和抗VEGF兔IgG)和稀释至1∶1000的第二抗体(过氧化物酶结合的抗兔IgG)反应。接下来，使用含有0.05％Tween-20的TBS对其进行洗涤，并使用ECL检测试剂盒使其在X射线膜上感光。然后，利用LabWorkTM(版本4.4.00.0)图像分析程序绘出OD值。
结果如图5中所示。如图5中所示，发现与使用比较例的组合物处理的组(对照组)相比，在使用实施例1、实施例2和实施例14的组合物处理的组(实验组)中TGF-β2的表达显著降低。此外，还发现与对照组相比，实验组中有更多VEGF被表达。即，本发明的用于毛发改善的组合物降低了TGF-β2的活性并且提高了VEGF的活性，由此抑制了TGF-β2造成的毛囊细胞的凋亡，并通过由血管舒张作用增加血流而向发根提供营养，从而促进毛发生长，由此显示出防止脱发和促进毛发生长的作用。特别是，使用含有铈的实施例2的组合物处理的组显示出比使用含有混合的稀土元素的实施例1的组合物处理的组更好的效果。相反，使用含有镧的实施例14的组合物处理的组显示出比未处理的组更好的效果，但是与使用实施例1或实施例2的组合物处理的组相比则效果较差。
实验例5：促进人头发再生和黑发形成的作用的评价
分别使用实施例1的组合物、实施例2的组合物和比较例的组合物治疗患有各种脱发症的三十位男女患者中的十位，然后评价其疗效。每天向头皮施用两次，每天都施用且持续2个月，在1个月和2个月后评价头发生长情况。评价标准如下：
1.高度有效-显示出新生终毛。
2.中度有效-显示出新生毫毛。
3.微效-脱发减少。
4.头皮屑减少。
结果如表2和表3中所示。
表2：对人的头发再生作用
(优秀：++，良好：+，无变化：-，恶化：--)
表3
(优秀：++，良好：+，无变化：-，恶化：--)
如表2和表3中所示，本发明的组合物在1个月后显示出头发再生和头发生长的作用，并且这些作用在2个月后得到了维持。此外，涂抹实施例1和实施例2的组合物之后的1周～2周内脱发减少。虽然存在个体差异，但是在涂抹组合物5～7天后头皮屑减少，而且随时间推移头皮屑和头痒完全消失。另外，通过肉眼观察，确认了在受测者中具有白发的男性和女性中形成了黑发。从上述结果可以看出，本发明的组合物在头发再生的时间和程度方面存在较小的个体差异，对于脱发症高度有效。另外，在所有受测者中，头发的粗度增加，并且黑发形成得到促进。未观察到副作用。在使用比较例的组合物治疗的组中，显示出毫毛生长、脱发减少或头皮屑脱除，但是不很明显。
在使用实施例2的组合物治疗之前和治疗2个月之后拍摄了受测者中40～47岁男性的头部，照片如图6中所示。如图6中所示，受测者开始脱发，并且前额和头顶的头发很少，显示出脱发症的迹象。他们因头痒、头皮屑和压力诱发的疲劳等而出现严重发展的脱发症症状。每天向头皮涂抹实施例2的组合物两次以后，从第三天开始头痒和头皮屑消失，脱发也显著减少。涂抹后1个月起，在前额或头顶的脱发区域开始长出毫毛，而后持续生长，2个月后肉眼可观察到该生长。从上述结果可以获得以下结论，即，本发明的组合物具有优异的毛发生长作用，并且即使长期使用对于人体也是无毒的。
实验例6：用于评价促进黑发形成作用的酪氨酸酶活性的测量
为了评价促进黑发形成作用，在人黑毒瘤细胞Sk-mel-31中和鼠黑毒瘤细胞B16F10中测量了酪氨酸酶活性。于37℃(5％CO2和60％相对湿度)在培养器中培养这些细胞，同时保持Sk-mel-31在RPMI-1640培养基(含有1％的青-链霉素和10％的胎牛血清)中的浓度为1×106细胞/ml，B16F10在所述培养基中的浓度为2×105细胞/ml。将细胞在培养器中稳定24小时，使用无FBS的RPMI-1640替换含FBS的培养基。分别使用10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg的混合稀土元素和10ng的单一稀土元素处理细胞。为测量酪氨酸酶活性，将细胞培养一段指定时间，并离心分离(100×g)10分钟，然后收集。将收集的细胞在0.01M的磷酸钠缓冲液(含有1％Triton X-100和0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH 7.4)中进行声波处理。将细胞放置在冰浴中一小时，并在4℃以40,000×g离心20分钟，以获得细胞提取物。向250μl含有100mM磷酸钾(pH 7.1)、4％的N，N-二甲基甲酰胺和0.1％(v/v)的Triton X-100的分析缓冲液中加入130μl 5mM的L-DOPA(L-3，4-二羟基苯丙氨酸)和120μl25mM的MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)，并在恒温箱中于37℃反应5分钟，然后向其中加入100μg的细胞提取物，另外反应2小时。接下来，向其中加入500μl 1M的高氯酸，并在室温以9,000×g将所述混合物离心20分钟。然后，取出上清液并在505nm处测量吸光度。
图7和图8显示了分别使用混合稀土元素和单一稀土元素(Ce、Eu、La、Gd)处理Sk-mel-31和B16F10的结果。如图7和图8所示，发现与对照组相比，在使用10μg～1pg混合稀土元素和单一稀土元素处理的组中酪氨酸酶活性增加。由此可以得出结论，即，稀土元素影响了酪氨酸酶的活性。也就是说，混合稀土元素和单一稀土元素具有促进黑发形成的作用，因为它们增加了酪氨酸酶活性，由此促进了黑色素产生。还发现单一稀土元素——铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)和钇(Y)显示了与混合稀土元素基本相同的效果。特别是，铈(Ce)最大地提高了酪氨酸酶的活性。与上述元素相比，镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)和钌(Lu)显示了较差的效果。
实验例7：用于评价促进黑发形成作用的酪氨酸酶表达的测量
根据与实验例6中相同的方法培养细胞，并离心分离(100×g)10分钟以收集细胞。为了通过免疫印迹测量酪氨酸酶的表达，将100μg细胞提取物溶解在10％的SDS-PAGE中，将其转移到NC上，然后使用含有5％脱脂乳的TBS封闭NC。接下来，将其分别与稀释至1∶2500的第一抗体(单克隆抗酪氨酸羟化酶克隆Th-2)和稀释至1∶5000的第二抗体(抗-鼠IgG)反应，并使用含有0.2％Tween-20的TBS洗涤，然后使用ECL检测试剂盒使其在X射线膜上感光。随后利用LabWorkTM(版本4.4.00.0)图像分析程序绘出OD值。
结果如图9中所示。如图9中所示，发现与对照组相比，使用混合稀土元素处理的组中酪氨酸酶的表达得到提高。由此可以得出结论，即，混合稀土元素提高了酪氨酸酶的表达，从而促进决定毛发颜色的黑色素的产生。还发现使用单一稀土元素——铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)和钇(Y)处理的组显示出与使用混合稀土元素处理的组基本相同的效果。特别是，在使用铈(Ce)处理的组中，酪氨酸酶的表达得到了最大程度的提高。此外，还发现与上述元素相比，镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)和钌(Lu)显示出较差的效果。
实验例8：用于评价促进黑发形成作用的黑色素产生的测量
根据与实验例6中相同的方法培养细胞，并离心分离(100×g)10分钟，收集细胞。为了测量黑色素的产生，向1N NaOH(总共1ml)中加入200μg的细胞提取物，并使其在室温静置30分钟，然后在400nm处测量吸光度。
结果如图10中所示。如图10中所示，发现与对照组相比，使用混合稀土元素处理的组中黑色素的产生得到提高。这意味着，酪氨酸酶的活性和表达的提高导致了黑色素产生的提高，由此促进黑发的形成。还发现在使用单一稀土元素处理的组中，可以获得与使用混合稀土元素处理的组中基本相同的效果。使用单一稀土元素——铈(Ce)、镨(Pr)、钷(Pm)、铕(Eu)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、钪(Sc)和钇(Y)处理的组显示出与上述组基本相同的效果。特别是，在使用铈(Ce)处理的组中，黑色素的量得到了最大程度的提高。此外，与上述元素相比，镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)和钌(Lu)显示出较差的效果。
实验例9：通过镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)或钌(Lu)与辣椒酊的组合比较TGF-β和VEGF的表达与黑色素的产生
为了测试稀土元素中镧(La)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)或钌(Lu)与辣椒酊的协同作用，测量了TGF-β和VEGF的表达和黑色素的产生。
为了测量TGF-β和VEGF的表达，根据与实验例1相同的方法培养细胞，并根据与实验例4相同的方法测量其表达。
为了测量黑色素的产生，根据与实验例6相同的方法培养和收集细胞，并根据与实验例8相同的方法测量黑色素的产生。
结果如图11和图12中所示。如图11中所示，对于TGF-β，使用实施例20的组合物(含有镧和辣椒酊的组合)处理的组显示出与使用含有铈的实施例2的组合物处理的组相似的降低的表达。对于VEGF，使用实施例20的组合物(含有镧和辣椒酊的组合)处理的组显示出与使用含有铈的实施例2的组合物处理的组相似的提高的表达。另外，如图12中所示，使用实施例20的组合物(含有镧和辣椒酊的组合)处理的组显示出与使用含有铈的实施例2的组合物处理的组相似的提高的黑色素产生。使用分别含有钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)和钌(Lu)与辣椒酊的组合的实施例21～实施例24的组合物处理的组显示出与上述实施例基本相同的效果。
工业实用性
如上所述，本发明的毛发改善组合物可以降低TGF-β2的表达，从而防止毛囊细胞凋亡，并且可以促进VEGF表达，从而通过血管舒张作用增加血流，并向发根提供营养，由此促进毛发生长。因此，本发明的组合物可以防止脱发，促进毛发再生和毛发生长，并除去和预防头皮屑。此外，本发明的组合物可以激活发根周围的黑素细胞，从而提高黑色素的生产，由此促进黑发形成。本发明的组合物安全无害，具有较高的皮肤吸收性，并且是非粘性的，因而具有良好的皮肤感觉，而且对于头皮不具有副作用。
Claims (17)
1.铈（Ce）或其盐在制备用于防止脱发、促进毛发再生和毛发生长、除去和预防头皮屑或者促进黑发形成的制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，所述制剂包含0.0001重量%～10重量%的铈（Ce）或者其盐。
3.如权利要求1所述的应用，所述制剂进一步包含一种或多于一种的药用或化妆品用载体或添加剂。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述药用或化妆品用载体或添加剂选自由表面活性剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂和香味剂以及它们的混合物组成的组。
5.如权利要求3所述的应用，所述制剂经皮施用或口服施用。
6.如权利要求5所述的应用，所述制剂配制为洗液、软膏、贴剂、喷剂、片剂、丸剂、粉末、袋装剂、酏剂、糖浆或者软胶囊或硬胶囊。
7.如权利要求5所述的应用，所述制剂配制为乳膏。
8.如权利要求5所述的应用，所述制剂配制为悬浮液。
9.如权利要求5所述的应用，所述制剂配制为乳液。
10.如权利要求5所述的应用，所述制剂配制为溶液。
11.如权利要求1所述的应用，所述制剂用作毛发护理剂。
12.如权利要求1所述的应用，所述制剂用作生发水、发乳、发膏、发胶、摩丝、发用啫喱、护发素、洗发香波、染发液、焗油膏、眉毛再生剂、睫毛再生剂或睫毛营养剂。
13.如权利要求1所述的应用，所述制剂用作宠物用香波和染发液。
14.如权利要求1所述的应用，所述制剂用于人体、家畜或宠物。
15.如权利要求1所述的应用，其中，所述铈（Ce）或其盐与至少一种促进毛发生长的辅剂组合，所述辅剂选自由人参、苦参、柑橘皮、绿茶、胡萝卜、桔梗、桑椹、鹿藿、石榴、松针、月见草籽、侧柏针叶、软花属植物、鳢肠、刺蒺藜提取物、甜菜碱、薄荷提取物、荨麻提取物、问荆提取物、薰衣草提取物、蛇麻草提取物、芦荟、刺五加、冬虫夏草、高丽悬钩子、桑果、木醋酸液、竹盐、黄芪、朝鲜当归、枸杞、胡桃、葡萄、红花、芝麻、紫苏子、大蒜、海藻、梅、绿豆、水稻、十五烷酸甘油酯、日扁柏素、辣椒酊、姜酊、斑蝥酊、毛喉萜、反式-3,4’-二甲基-3-羟基黄烷酮、维生素E、烟酸、烟酰胺、维生素A棕榈酸酯、β-胡萝卜素、维生素D2、叶酸、生物素、D-泛醇、乙酰基泛醇乙醚、泛酸钙、泛醇乙醚、抗坏血酸、葡萄柚籽提取物、千金藤素、烟酸苄基酯、维生素A、B1、B2和B6、泛酸、米诺地尔、瘤毛獐牙菜提取物、精氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、胱氨酸、氨基酸提取物、β-甘草次酸、甘草酸、盐酸吡哆辛、水杨酸、尿囊素、异丙基甲基苯酚、吡啶酮乙醇胺、甘油、吡咯烷酮羧酸、雌二醇、乙炔雌二醇和l-薄荷醇组成的组。
16.如权利要求15所述的应用，所述促进毛发生长的辅剂为褐海藻。
17.如权利要求15所述的应用，其中，所述促进毛发生长的辅剂选自由辣椒酊、姜酊和斑蝥酊组成的组。
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