CN101502650A - 密码子优化的乙型肝炎核酸疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种密码子优化的乙型肝炎病毒核酸疫苗。本发明经分析乙型肝炎表面抗原(HBs)基因序列(adr亚型)，找出其密码子使用偏好与哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点，对HBs基因序列的密码子进行替换，得到表面抗原基因，再将该基因序列合成，经扩增得到经密码子优化的MHBs，Pst I、BamH I，双酶切MHBs基因和载体pSW3891质粒，配制10ul的连接体系，得到中蛋白基因。本发明解决了原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致外源基因在哺乳动物宿主体内不能有效表达，不能产生较好免疫保护作用的缺陷。本发明显著提高了外源基因在哺乳动物宿主体内的蛋白表达量，有效的刺激了宿主的免疫系统，使之产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙肝疫苗，特别涉及一种密码子优化的乙型肝炎病毒核酸疫苗。
背景技术
在本发明之前，随着科学的发展，核酸疫苗作为一种新型疫苗逐渐受到人们的重视。目前用来构建核酸疫苗的目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而疫苗的研究和应用对象主要为真核生物，例如：小鼠，猕猴或人类等高级哺乳动物。问题在于，由于原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致用来构建核酸疫苗的外源基因在哺乳动物宿主体内不能有效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用，这是导致目前核酸疫苗免疫原性较低的主要原因。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，设计、研制一种密码子优化的乙型肝炎病毒核酸疫苗。
本发明的技术方案是：
密码子优化的乙型肝炎病毒表面抗原核酸疫苗，其主要技术特征在于构建核酸疫苗的表面抗原基因是按照高级哺乳动物密码子使用偏好进行优化的，优化后的目的基因序列如下：
ATGGGCGGCTGGTCCAGCAAGCCCCGGCAGGGCATGGGCACCAACCTGAGCGTGCCC
AACCCCCTGGGCTTCTTCCCCGATCACCAGCTGGACCCCGCCTTCGGCGCCAACAGCA
ACAATCCCGACTGGGACTTCAACCCCAACAAGGACCACTGGCCCGACGCCAACCAGG
TGGGAGCCGGCGCCTTCGGCCCTGGCTTCACCCCTCCCCACGGCGGACTGCTGGGCTG
GTCTCCTCAGGCCCAGGGCATCCTGACCACCGTGCCTGCCGCCCCTCCTCCCGCCAGC
ACCAACCGGCAGAGCGGCAGGCAGCCCACCCCCATCAGCCCCCCTCTGCGGGACAGC
CACCCCCAGGCCATGCAGTGGAACAGCACCACCTTCCACCAGGCCCTGCTGGACCCC
AGAGTGCGGGGCCTGTACTTCCCTGCCGGCGGAAGCAGCAGCGGCACCGTGAACCCC
GTGCCCACCACCGCCAGCCCCATCTCCAGCATCTTCAGCCGGACCGGCGACCCTGCCC
CCAACATGGAATCCACCACCTCCGGCTTTCTGGGCCCCCTGCTCGTGCTCCAGGCCGG
CTTCTTCCTGCTGACCAGAATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACTCCTGGTGGACC
AGCCTGAACTTCCTGGGCGGCGCTCCCACCTGCCCTGGCCAGAACAGCCAGAGCCCC
ACCTCCAACCACAGCCCTACCAGCTGCCCCCCCAT℃TGCCCCGGCTACCGGTGGATGT
GCCTGCGGCGGTTCATCATCTTTCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTTCTGCTGG
TGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGCTGCCCGGCACCAGCAC
CACAAGCACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCATCCCCGCCCAGGGAACCAGCATGTT
CCCTAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCAGCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCT
AGCAGCTGGGCCTTCGCCCGGTTCCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGCTGG
CTGTCTCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGCCGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGC
TGTCCGTGATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCTAGCCTGTACAACATCCTGAGCCCC
TTTCTGCCCCTGCTGCCTATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATCTGA
其编码的氨基酸序列如下：
MGGWSSKPRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPDANQ
VGAGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTVPAAPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA
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FPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFAGLSPTVWLSVI
WMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI
本发明的优点和效果在于经密码子优化后的乙型肝炎病毒表面抗原核酸疫苗显著提高了外源基因在哺乳动物宿主体内的蛋白表达量，有效的刺激了宿主的免疫系统，提高体液免疫反应和细胞免疫反应的水平。
本发明的其他优点和效果将在下面继续描述。
附图说明
图1——本发明中各组核酸疫苗质粒在293T细胞中的表达示意图。
图2——本发明中各组核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠血清抗-HBs滴度示意图。
图3——本发明中各组核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠表面抗原特异性分泌IFN-r脾细胞的比较示意图。
具体实施方式
本发明是在乙型肝炎病毒表面抗原核酸疫苗中引入密码子优化的方法，提高现有疫苗的免疫原性。密码子优化后乙型肝炎表面抗原基因可以用来编码三种蛋白质：大蛋白，中蛋白和小蛋白，其中密码子优化的乙型肝炎表面抗原中蛋白核酸疫苗已被构建，并在动物实验中证明密码子优化确实能提高乙型肝炎表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性。
具体方法说明：
首先说明：
优化后乙型肝炎病毒表面抗原命名为：HBs/opt，简称S-opt；
优化前乙型肝炎病毒表面抗原命名为：HBs/adr，简称S-adr；
密码子优化乙型肝炎表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗：pSW3891/MHBs/opt，简称opt
乙型肝炎表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗(adr亚型)：pSW3891/MHBs/adr，简称adr
空载体质粒作为对照：pSW3891。
第一步：
用MacVector 7.2软件分析基因库中乙型肝炎表面抗原(HBs)基因序列，找出其密码子使用偏好与哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点。例如：HBs基因组中编码丝氨酸Ser的三联体密码子主要是AGT或TCT，而在人类、小鼠等高级哺乳动物基因组中则主要是AGC；HBs基因组中脯氨酸Pro主要由CCA编码，而在高级哺乳动物则为CCC。
第二步：
按照哺乳动物密码子使用标准，在不改变基因编码蛋白质的基础上，对HBs基因序列的密码子进行替换。例如：在编码丝氨酸Ser时，将HBs的密码子AGT或TCT替换为AGC，得到了经密码子优化后的HBs基因序列。
得到的密码子优化后的表面抗原基因序列如下：
ATGGGCGGCTGGTCCAGCAAGCCCCGGCAGGGCATGGGCACCAACCTGAGCGTGCCC
AACCCCCTGGGCTTCTTCCCCGATCACCAGCTGGACCCCGCCTTCGGCGCCAACAGCA
ACAATCCCGACTGGGACTTCAACCCCAACAAGGACCACTGGCCCGACGCCAACCAGG
TGGGAGCCGGCGCCTTCGGCCCTGGCTTCACCCCTCCCCACGGCGGACTGCTGGGCTG
GTCTCCTCAGGCCCAGGGCATCCTGACCACCGTGCCTGCCGCCCCTCCTCCCGCCAGC
ACCAACCGGCAGAGCGGCAGGCAGCCCACCCCCATCAGCCCCCCTCTGCGGGACAGC
CACCCCCAGGCCATGCAGTGGAACAGCACCACCTTCCACCAGGCCCTGCTGGACCCC
AGAGTGCGGGGCCTGTACTTCCCTGCCGGCGGAAGCAGCAGCGGCACCGTGAACCCC
GTGCCCACCACCGCCAGCCCCATCTCCAGCATCTTCAGCCGGACCGGCGACCCTGCCC
CCAACATGGAATCCACCACCTCCGGCTTTCTGGGCCCCCTGCTCGTGCTCCAGGCCGG
CTTCTTCCTGCTGACCAGAATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACTCCTGGTGGACC
AGCCTGAACTTCCTGGGCGGCGCTCCCACCTGCCCTGGCCAGAACAGCCAGAGCCCC
ACCTCCAACCACAGCCCTACCAGCTGCCCCCCCATCTGCCCCGGCTACCGGTGGATGT
GCCTGCGGCGGTTCATCATCTTTCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTTCTGCTGG
TGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGCTGCCCGGCACCAGCAC
CACAAGCACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCATCCCCGCCCAGGGAACCAGCATGTT
CCCTAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCAGCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCT
AGCAGCTGGGCCTTCGCCCGGTTCCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGCTGG
CTGTCTCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGCCGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGC
TGTCCGTGATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCTAGCCTGTACAACATCCTGAGCCCC
TTTCTGCCCCTGCTGCCTATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATCTGA
其编码的氨基酸序列如下：
MGGWSSKPRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPDANQ
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FPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFAGLSPTVWLSVI
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第三步：
将该基因序列化学合成，密码子优化后的表面抗原基因HBs/S-opt
第四步：
装入载体pGA4中，得到了质粒：pGA4/HBs/opt。以该质粒为母板，经PCR法用上游引物(TACACTCTGCAGATGCAGTGGAACAGCACCACC)，下游引物(GAGCTCGGATCCTCAGATGTACACCCAC)扩增出乙型肝炎表面抗原中蛋白(MHBs)，PCR条件为：94℃，4min；94℃，45s，58℃，45s，72℃，lmin，25个循环；72℃，7min。将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(100V，35min)，经割胶回收后得到了经密码子优化的MHBs。
第五步：
Pst I、BamH I双酶切MHBs基因和载体pSW3891质粒(37℃水浴，2小时)，1％琼脂糖凝胶电泳(100V，35min)，分别割胶回收后得到了经Pst I、BamH I双酶切消化的MHBs基因和载体pSW3891。
第六步：
配制10ul的连接体系：10xbuffer 1ul，T4连接酶1ul，MHBs基因6ul，载体pSW3891 2ul，加入EP管中混匀，16℃水浴，过夜。将连接产物转化大肠杆菌HB101，取200ul转化产物涂具有卡那霉素抗性的LB平板，37℃，过夜。挑取平板上的单克隆于5ml的LB液中，37℃，摇菌12h。用小提试剂盒提取上述菌液中的质粒，即得到了密码子优化后的MHBs核酸疫苗即opt。
得到的密码子优化后的MHBs核酸疫苗，优化后的目的基因序列如下：
ATGCAGTGGAACAGCACCACCTTCCACCAGGCCCTGCTGGACCCCAGAGTGCGGGGC
CTGTACTTCCCTGCCGGCGGAAGCAGCAGCGGCACCGTGAACCCCGTGCCCACCACC
GCCAGCCCCATCTCCAGCATCTTCAGCCGGACCGGCGACCCTGCCCCCAACATGGAAT
CCACCACCTCCGGCTTTCTGGGCCCCCTGCTCGTGCTCCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTG
ACCAGAATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACTCCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCC
TGGGCGGCGCTCCCACCTGCCCTGGCCAGAACAGCCAGAGCCCCACCTCCAACCACA
GCCCTACCAGCTGCCCCCCCATCTGCCCCGGCTACCGGTGGATGTGCCTGCGGCGGTT
CATCATCTTTCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTTCTGCTGGTGCTGCTGGACTA
CCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGCTGCCCGGCACCAGCACCACAAGCACCGG
CCCCTGCAAGACCTGCACCATCCCCGCCCAGGGAACCAGCATGTTCCCTAGCTGCTGC
TGCACCAAGCCCAGCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCTAGCAGCTGGGCCT
TCGCCCGGTTCCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGCTGGCTGTCTCTGCTGGT
GCCCTTCGTGCAGTGGTTCGCCGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGTCCGTGATCTGG
ATGATGTGGTACTGGGGCCCTAGCCTGTACAACATCCTGAGCCCCTTTCTGCCCCTGCT
GCCTATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATCTGA
其编码的氨基酸序列如下：
MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPNMESTTSG
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FPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFAGLSPTVWLSVI
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为了明确显示进行密码子优化的位点，现将密码子优化后的核酸疫苗与密码子优化前的核酸疫苗目的基因序列进行对比。密码子优化后的核酸疫苗(opt)与密码子优化前的核酸疫苗(adr)基因序列比较如下(仅提供编码前80个氨基酸的基因序列)：
adr ATGCAGTGGAACTCCACAACATTCCACCAAGCTCTGCTAGACCCCAGAGTAAGGGGCCTA
opt ATGCAGTGGAACAGCACCACCTTCCACCAGGCCCTGCTGGACCCCAGAGTGCGGGGCCTG
aa M Q W N S T T F H Q A L L D P R V R G L
adr TACTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCA
opt TACTTCCCTGCCGGCGGAAGCAGCAGCGGCACCGTGAACCCCGTGCCCACCACCGCCAGC
aa Y F P A G G S S S G T V N P V P T T A S
adr CCCATATCGTCAATCTTCTCGAGGACTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAGTCCACAACA
opt CCCATCTCCAGCATCTTCAGCCGGACCGGCGACCCTGCCCCCAACATGGAATCCACCACC
aa P I S S I F S R T G D P A P N M E S T T
adr TCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATC
opt TCCGGCTTTCTGGGCCCCCTGCTCGTGCTCCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTGACCAGAATC
aa S G F L G P L L V L Q A G F F L L T R I
其中，adr：代表密码子优化前的核酸疫苗；opt：代表经密码子优化后的核酸疫苗；aa：表示氨基酸；序列中用下划线及加黑表示进行优化的基因位点。
本发明(经密码子优化的MHBs核酸疫苗)经各项测试：
如图1所示：
为各组核酸疫苗在293T细胞中的表达示意图，可以看出，opt及adr体外转染293T细胞后，均可以在细胞内表达，而且可以将表达产物分泌到细胞外。与adr相对而言，opt在细胞内外的表达量都要高(大约高2倍左右)。说明了经密码子优化后的核酸疫苗提高了外源基因在宿主细胞中的蛋白表达量。
如图2所示：
为各组核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠血清抗-HBs滴度示意图。可以看出，四次免疫后，opt免疫组小鼠血清中特异性抗体滴度最高可以达到1：364500，显著高于adr免疫组(1：121500)。说明了opt具有较好的抗-HBs的体液免疫反应。
如图3所示：
为各组核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠表面抗原特异性分泌IFN-r脾细胞的比较示意图。ELISPOT的结果显示：在相同的特异性多肽刺激之下，opt免疫组小鼠的斑点数要明显的高于adr免疫组。说明了opt具有较好的HBs特异性的细胞免疫反应。
序列表
<110>邢益平、王世霞、卢山、黄祖瑚
<120>密码子优化的乙型肝炎病毒表面抗原核酸疫苗
<160>4
<210>1
<211>1203
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据高级哺乳动物密码子使用偏好而设计。
<400>1
<210>2
<211>400
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒种(Hepatitis B)
<400>2
<210>3
<211>846
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据高级哺乳动物密码子使用偏好而设计。
<400>3
<210>4
<211>281
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒种(Hepatitis B)
<400>4
Claims (2)
1.密码子优化的乙型肝炎病毒表面抗原核酸疫苗，其特征在于构建核酸疫苗的表面抗原基因是按照高级哺乳动物密码子使用偏好进行优化的，优化后的表面抗原目的基因序列如下：
ATGGGCGGCTGGTCCAGCAAGCCCCGGCAGGGCATGGGCACCAACCTGAGCGTGCCC
AACCCCCTGGGCTTCTTCCCCGATCACCAGCTGGACCCCGCCTTCGGCGCCAACAGCA
ACAATCCCGACTGGGACTTCAACCCCAACAAGGACCACTGGCCCGACGCCAACCAGG
TGGGAGCCGGCGCCTTCGGCCCTGGCTTCACCCCTCCCCACGGCGGACTGCTGGGCTG
GTCTCCTCAGGCCCAGGGCATCCTGACCACCGTGCCTGCCGCCCCTCCTCCCGCCAGC
ACCAACCGGCAGAGCGGCAGGCAGCCCACCCCCATCAGCCCCCCTCTGCGGGACAGC
CACCCCCAGGCCATGCAGTGGAACAGCACCACCTTCCACCAGGCCCTGCTGGACCCC
AGAGTGCGGGGCCTGTACTTCCCTGCCGGCGGAAGCAGCAGCGGCACCGTGAACCCC
GTGCCCACCACCGCCAGCCCCATCTCCAGCATCTTCAGCCGGACCGGCGACCCTGCCC
CCAACATGGAATCCACCACCTCCGGCTTTCTGGGCCCCCTGCTCGTGCTCCAGGCCGG
CTTCTTCCTGCTGACCAGAATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACTCCTGGTGGACC
AGCCTGAACTTCCTGGGCGGCGCTCCCACCTGCCCTGGCCAGAACAGCCAGAGCCCC
ACCTCCAACCACAGCCCTACCAGCTGCCCCCCCATCTGCCCCGGCTACCGGTGGATGT
GCCTGCGGCGGTTCATCATCTTTCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTTCTGCTGG
TGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGCTGCCCGGCACCAGCAC
CACAAGCACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCATCCCCGCCCAGGGAACCAGCATGTT
CCCTAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCAGCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCT
AGCAGCTGGGCCTTCGCCCGGTTCCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGCTGG
CTGTCTCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGCCGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGC
TGTCCGTGATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCTAGCCTGTACAACATCCTGAGCCCC
TTTCTGCCCCTGCTGCCTATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATCTGA
其编码的氨基酸序列如下：
MGGWSSKPRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPDANQ
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FPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFAGLSPTVWLSVI
WMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI。
2.根据权利要求1所述的密码子优化的乙型肝炎病毒表面抗原核酸疫苗，构建乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗，其特征在于构建核酸疫苗的表面抗原中蛋白基因是按照高级哺乳动物密码子使用偏好进行优化的，优化后的基因序列如下：
ATGCAGTGGAACAGCACCACCTTCCACCAGGCCCTGCTGGACCCCAGAGTGCGGGGC
CTGTACTTCCCTGCCGGCGGAAGCAGCAGCGGCACCGTGAACCCCGTGCCCACCACC
GCCAGCCCCATCTCCAGCATCTTCAGCCGGACCGGCGACCCTGCCCCCAACATGGAAT
CCACCACCTCCGGCTTTCTGGGCCCCCTGCTCGTGCTCCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTG
ACCAGAATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACTCCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCC
TGGGCGGCGCTCCCACCTGCCCTGGCCAGAACAGCCAGAGCCCCACCTCCAACCACA
GCCCTACCAGCTGCCCCCCCATCTGCCCCGGCTACCGGTGGATGTGCCTGCGGCGGTT
CATCATCTTTCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTTCTGCTGGTGCTGCTGGACTA
CCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGCTGCCCGGCACCAGCACCACAAGCACCGG
CCCCTGCAAGACCTGCACCATCCCCGCCCAGGGAACCAGCATGTTCCCTAGCTGCTGC
TGCACCAAGCCCAGCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCTAGCAGCTGGGCCT
TCGCCCGGTTCCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGCTGGCTGTCTCTGCTGGT
GCCCTTCGTGCAGTGGTTCGCCGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGTCCGTGATCTGG
ATGATGTGGTACTGGGGCCCTAGCCTGTACAACATCCTGAGCCCCTTTCTGCCCCTGCT
GCCTATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATCTGA
其编码的氨基酸序列如下：
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