CN101498728A - 检测邻烯丙基苯酚的试剂盒及其专用抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测邻烯丙基苯酚的试剂盒及专用抗体。该试剂盒包括抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体或抗邻烯丙基苯酚的多克隆抗体。所述抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.2905的小鼠杂交瘤细胞系mAb225#分泌产生的。本发明的检测邻烯丙基苯酚的酶联免疫试剂盒及检测邻烯丙基苯酚的方法，可用于检测农产品(如植物组织)中邻烯丙基苯酚的残留量，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性好、灵敏度高、精确度强等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。因此本发明检测方法及其专用试剂盒将在农作物产品中邻烯丙基苯酚药物的残留检测中发挥重要作用。

Description

检测邻烯丙基苯酚的试剂盒及其专用抗体

技术领域

本发明涉及检测邻烯丙基苯酚的试剂盒及其专用抗体。

背景技术

邻丙烯基苯酚(2-propenylphenol，商品名称银果)是山东省农业仿生应用工程研究中心开发研制的新型农用杀菌剂，已获得了国家发明专利(ZI 97 121 037.3)和农药临时登记(防治番茄灰霉病)，现已批量生产。它是以银杏中的杀菌、抑菌活性化合物的化学结构为模板.经结构简化后通过人工模拟化学合成得到，分子量为134，分子式为C₉H₁₀O。田间药效试验证明，邻丙烯基苯酚可有效防治草莓白粉病、番茄灰霉病、苹果腐烂病、玉米大斑病等病害。但是杀菌剂用量过多，会在农产品中残留，影响人的身体健康。

目前，邻烯丙基苯酚的分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法等。这些方法存在如下主要局限：样品前处理时间长，实验设备昂贵，试剂等成本高；对于大量样品的测定有一定的困难，尤其是在快速检测果实中的农药残留量时，这些方法都显得无能为力。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测邻烯丙基苯酚的试剂盒。

本发明所提供的检测邻烯丙基苯酚的试剂盒，包括抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体或抗邻烯丙基苯酚的多克隆抗体；所述单克隆抗体或多克隆抗体可以是以具有如下结构的抗原为免疫原得到的：

其中，所述抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体具体可以是由保藏号为CGMCC No.2905的小鼠杂交瘤细胞系mAb225#分泌产生的。

由保藏号为CGMCC No.2905的小鼠杂交瘤细胞系mAb225#分泌产生的抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的抗邻烯丙基苯酚抗体，是用邻烯丙基苯酚与对氨基苯甲酸衍生后的抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到的。

邻烯丙基苯酚是小分子物质，不具备免疫原性，不能直接刺激动物产生抗体，要想制备邻烯丙基苯酚的抗体，就必须把邻烯丙基苯酚与相应大分子载体蛋白偶联构建人工抗原，但因为其化学结构过于简单在与蛋白连接前必须进行一步衍生才能继续合成全抗原，并用此人工抗原免疫动物产生特异性抗体。

本发明的另一个目的是提供一种制备邻烯丙基苯酚抗原的方法。

本发明所提供的制备邻烯丙基苯酚抗原的方法，包括如下步骤：

1)将对氨基苯甲酸重氮化，得到重氮化对氨基苯甲酸；

2)将所述重氮化对氨基苯甲酸与邻烯丙基苯酚耦合，得到重氮化邻烯丙基苯酚；

3)将所述重氮化邻烯丙基苯酚与载体蛋白偶联，得到邻烯丙基苯酚抗原。

所述重氮化包括如下步骤：将对氨基苯甲酸溶解于0.5-1.5M NaNO₂溶液中，对氨基苯甲酸在NaNO₂溶液中的终浓度为67.6mM～107.9mM，再向其中加入酸，反应，得到含有重氮化对氨基苯甲酸的溶液I；

所述耦合包括如下步骤：将邻烯丙基苯酚溶解于甲醇中，得到溶液II，邻烯丙基苯酚在溶液II中的终浓度为74.6mM～111.9mM；将溶液I滴入溶液II中，反应3-5h，将pH值调至2-3，收集沉淀，即得重氮化邻烯丙基苯酚。

所述偶联包括如下步骤：将所述重氮化邻烯丙基苯酚溶解于N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中，再在避光条件下向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺，再加入二环己基碳二亚胺，反应2～5h，取上清；将载体蛋白加入所述上清中，反应10-14h，得到邻烯丙基苯酚抗原。

其中所述N-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的终浓度可为47.8mM～191.7mM；所述二环己基碳二亚胺在反应体系中的终浓度可为124.1mM～489.5mM；所述载体蛋白在反应体系中的终浓度可为0.10mM～0.41mM。

为了使效果更好，所述载体蛋白可以先在0～10℃条件下溶解于pH9～10的碳酸盐缓冲液中，再加入所述上清中。

所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、兰素蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。

所述制备邻烯丙基苯酚抗原的方法还可包括如下纯化步骤：将上述反应得到的邻烯丙基苯酚抗原进行透析或过sephadex G-25柱以除去未联结的邻烯丙基苯酚及有机溶剂，然后冷冻干燥以浓缩制备得到邻烯丙基苯酚抗原。

本发明的另一个目的是提供一种邻烯丙基苯酚抗原。

本发明所提供的邻烯丙基苯酚抗原具有如下分子结构：

所述邻烯丙基苯酚抗原具体可以是按照上述方法制备得到的。

保藏号为CGMCC No.2905的小鼠杂交瘤细胞系mAb225#也属于本发明的保护范围。

将上述任一所述的抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂、或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱、或含有所述免疫亲和吸附剂和所述免疫亲和色谱柱的试剂盒、及其在分离纯化邻烯丙基苯酚中的应用也均属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种检测邻烯丙基苯酚的方法。

本发明所提供的检测邻烯丙基苯酚的方法，包括用前述任一试剂盒对待检测样品进行检测的步骤。

为取得更好的检测效果，所述方法还可包括如下样品前处理的步骤：用丙酮提取待检测样品，取上清；将所述上清加入衍生液，反应，得到待测样品液；所述衍生液是按照如下方法得到的：将每35-45mg对氨基苯甲酸溶于0.5-1.5ml 0.5-1.5MNaNO₂中，再滴加0.5-1.5M HCl，反应，得到衍生液。

详细检测方法如下：

1)取待检测样品(如植物组织)，用丙酮提取，取上清；将所述上清加入衍生液，反应，得到待测样品液；

2)用ELISA方法检测待测样品液；

3)通过测定孔的吸光值来判定邻烯丙基苯酚在果实中的残留量，吸光值越小残留量越大；也可通过孔中液体的颜色来判定邻烯丙基苯酚在果实中的残留量。

也可以根据上述原理，利用本发明的邻烯丙基苯酚抗体制备各种检测邻烯丙基苯酚含量的试剂盒，以便于现场快速检测。

本发明的邻烯丙基苯酚抗原制备方法，利用重氮化方法对邻烯丙基苯酚进行衍生，反应时间短，衍生率高，用于衍生的重氮化合物，可以提前制备，低温可以保存1～2个月。本发明制备方法成本低，效果好，操作简单，方便快捷。利用本发明方法得到的人工抗原免疫动物，可以快速高效地获得CAH的单克隆抗体，且获得的抗体的特异性好，检测极限高。

本发明的检测邻烯丙基苯酚的酶联免疫试剂盒及检测邻烯丙基苯酚的方法，可用于检测农产品(如植物组织)中邻烯丙基苯酚的残留量，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性好、灵敏度高、精确度强等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。因此本发明检测方法及其专用试剂盒将在农作物产品中邻烯丙基苯酚药物的残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为邻烯丙基苯酚抗原的合成示意图。

图2为邻烯丙基苯酚人工抗原CAH-BSA的紫外扫描光谱照片。

图3为邻烯丙基苯酚人工抗原CAH-OVA的紫外扫描光谱照片。

图4为非竞争性ELISA测定CAH单抗亲和常数曲线。

图5为邻烯丙基苯酚间接ELISA法标准曲线。

图6为邻烯丙基苯酚样品检测照片，示不同时期采集的草莓果实样品检测颜色区别。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

邻烯丙基苯酚购自山东京蓬生物药业股份有限公司。

实施例1、邻烯丙基苯酚抗原(CAH抗原)的合成

邻烯丙基苯酚抗原的合成示意图如图1所示。

一、邻烯丙基苯酚免疫抗原(CAH-牛血清蛋白(BSA))的合成

1、重氮化：

(1)取邻烯丙基苯酚30mg，溶解在1ml的甲醇中，蒸馏水稀释至5mL，常温下磁力搅拌。

(2)取对氨基苯甲酸40mg，溶解在1ml、1M NaNO₂中，再滴加1M HCl，淀粉碘化钾试纸变蓝时终止反应。

(3)将步骤(2)得到的溶液缓慢滴加至不断搅拌的步骤(1)得到的溶液中，4℃，12h后反应完全，pH值调至2-3时，有大量砖红色沉淀析出，将沉淀离心；将沉淀溶解于蒸馏水中，调节pH值，当pH值为8-9时沉淀完全溶解，pH值为2-3时沉淀析出，过滤，收集沉淀；用1M HCl、蒸馏水冲洗沉淀三次，冷冻抽干，得到砖红色粉末，即为重氮化邻烯丙基苯酚(CAH)。

2、与牛血清蛋白(BSA)偶联

(1)取步骤1得到的重氮化邻烯丙基苯酚(CAH)10mg，溶解在1ml的N，N-二甲基甲酰胺中，常温下磁力搅拌，得到溶液I。

(2)向溶液I中加入10mg的N-羟基琥珀酰亚胺，在避光下磁力搅拌，再加15mg二环已基碳二亚胺，4℃下搅拌4h，离心，取上清液。

(3)将30mg BSA用2ml pH为9.5的碳酸钠缓冲液在4℃下搅拌溶解，得到BSA溶液。

(4)将BSA溶液加入(2)中得到的上清液中，4℃下反应12h；将反应得到的液体装入透析袋中，用PB透析液透析4d，每d换三次透析液，得到CAH-牛血清蛋白(BSA)；分装，经-40℃冷冻后，真空干燥，放-20℃冰箱中。

二、邻烯丙基苯酚包被抗原(CAH-卵清蛋白(OVA))的合成

1、重氮化：

(1)取邻烯丙基苯酚30mg，溶解在1ml的甲醇中，蒸馏水稀释至5mL，常温下磁力搅拌。

(2)取对氨基苯甲酸40mg，溶解在1ml、1M NaNO₂中，再滴加1M HCl，淀粉碘化钾试纸变蓝时终止反应。

(3)将步骤(2)得到的溶液缓慢滴加至不断搅拌的步骤(1)得到的溶液中，4℃，12h后反应完全，pH值调至2-3时，有大量砖红色沉淀析出，将沉淀离心；将沉淀溶解于蒸馏水中，调节pH值，当pH值为8-9时沉淀完全溶解，pH值为2-3时沉淀析出，过滤，收集沉淀；用1M HCl、蒸馏水冲洗沉淀三次，冷冻抽干，得到砖红色粉末，即为重氮化邻烯丙基苯酚(CAH)。

2、与卵清蛋白(OVA)偶联

(1)取步骤1得到的重氮化邻烯丙基苯酚(CAH)10mg，溶解在1ml的N，N-二甲基甲酰胺中，常温下磁力搅拌，得到溶液I。

(2)向溶液I中加入10mg的N-羟基琥珀酰亚胺，在避光下磁力搅拌，再加15mg二环已基碳二亚胺，4℃下搅拌4h，离心，取上清液。

(3)将30mg卵清蛋白(OVA)用2ml pH为9.5的碳酸钠缓冲液在4℃下搅拌溶解，得到OVA溶液。

(4)将OVA溶液加入(2)中得到的上清液中，4℃下反应12h；将反应得到的液体装入透析袋中，用PB透析液透析4d，每天换三次透析液，得到CAH-牛血清蛋白(BSA)；分装，经-40℃冷冻后，真空干燥，放-20℃冰箱中。

三、CAH-BSA免疫抗原、CAH-OVA包被抗原的鉴定

将邻烯丙基苯酚(AP)的免疫抗原CAH-BSA和包被抗原CAH-OVA及重氮化邻烯丙基苯酚(CAH)进行紫外扫描，结果如图2和图3所示。结果表明，CAH-BSA和CAH-OVA的吸收峰，与AP、BSA和OVA的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明人工抗原CAH-BSA和CAH-OVA的偶联是成功的。

实施例2、制备邻烯丙基苯酚单克隆抗体及其鉴定

一、单抗的制备

(一)杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

将免疫原CAH-BSA溶于0.5mL生理盐水中，加入等体积的完全佐剂后制成免疫原乳化剂，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠。4周后行第二次免疫，再两周后行第三次免疫，均使用加入等体积的不完全佐剂后制成免疫原乳化剂。在第三次免疫后第10d间接ELISA测定小鼠血清中抗体效价，效价高者进行下一步细胞融合。

2、细胞融合

无菌取材免疫过CAH-BSA的Balb/c小鼠脾脏，制成脾细胞悬浮液。分别吸取含1×10⁸个脾细胞和2×10⁷个骨髓瘤细胞的悬浮液，移至50mL离心管中。加不完全培养液，使细胞液总体积为30mL。充分混匀后，于1000×g离心7min，将上清弃尽。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀糊状。将离心管底部浸入37℃温水中，一只手均匀转动离心管，另一只手用1mL移液管将1mL50％PEG溶液沿离心管壁移入转动的离心管。从移入到移完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬浮液全部吸入吸管(时间控制在30s左右)，静置30s后，再将其吹入离心管内(时间也控制在30s左右)。在5min内加入25mL不完全培养液以稀释PEG，使PEG失去促融作用。于8000g离心7min，弃去上清。加入10mL HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬浮液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每个孔0.1mL。然后将培养板置于37℃和5％ CO₂的培养箱内培养。

将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于37℃和5％ CO₂的培养箱内培养。根据情况每2~3d更换培养液一次，换液时吸去1/2~2/3培养液，再加入等量新鲜培养液。所用的培养液应按培养的时间不同而有所不同：在融合后7d内用HAT培养液；第7~14d改用HT培养液；第14d以后则用普通的完全培养液。

3、间接免疫酶联吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞

在细胞融合后第7d，每次换液收集杂交瘤细胞培养液，然后采用间接ELISA方法对每个细胞培养孔的培养液进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。具体操作如下：

(1)包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释至最佳工作浓度(2.5μg/mL)，用移液枪准确移至酶标板，每个孔100μL，置湿盒中于37℃温育1h。

(2)封闭：弃去酶标板孔内的液体。每个孔加入封闭液150μL，置湿盒中于37℃温育1h后，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次90s(简称洗涤，下同)，然后拍干。

(3)加待测培养细胞上清样品：用抗体稀释液将培养细胞上清样品倍比稀释后加入酶标板，每个孔100μL，每个浓度梯度设3个重复。37℃温育1h后，洗涤，拍干。

(4)加酶标二抗：用抗体稀释液将酶标二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀释到工作浓度(1:5000)，加入酶标板，每个孔100μL，置于37℃温育1h后，洗涤，拍干。

(5)加底物溶液：向各酶标孔加新鲜配制的OPD底物使用液100μL，37℃温育15~30min。

(6)终止反应：每个孔加终止液50μL，终止底物显色反应。

(7)判定结果：用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂)，若待测孔OD₄₉₂大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即认为是阳性值，从而得出血清的效价。

其中，包被缓冲液的组成为：0.85mol/L、pH 9.6的碳酸缓冲液；封闭液的组成为：用包被缓冲液配制成1％(质量百分含量)的明胶；洗涤缓冲液的组成为：含0.05％(质量百分含量)Tween-20的0.01mol/L PBS(pH 7.4)；抗体稀释液的组成为：含0.01％(质量百分含量)Tween-20、0.1％(质量百分含量)明胶的0.01mol/L PBS(pH 7.4)；0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)：pH 7.4，配方为8.00g NaCl，0.20g KCl，0.20g KH₂PO₄，1.15g Na₂HPO₄·12H₂O；加蒸馏水至1000mL。

结果，筛选得到分泌邻烯丙基苯酚单克隆抗体的阳性细胞株。

4、阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选的阳性细胞株进行克隆，具体步骤如下：于克隆前一天制备饲养细胞。将待克隆的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，转至24孔细胞培养板中，并进行细胞计数。根据计数结果，对细胞悬浮液做适当稀释。取250个活细胞悬浮于4.6mL(终体积)培养液中(此时平均每0.1mL溶液中含5个细胞)，接种96孔培养板，每个孔0.1mL，共36个孔。将4mL培养液加入到余下的1.0mL细胞溶液中(此时平均每0.1mL溶液中含1个细胞)，将此细胞液接种至其次的36孔，每个孔0.1mL。向剩余的1.4mL细胞悬浮液中补加培养液1.4mL(此时平均每0.1mL溶液中含0.5个细胞)。混匀后，将其接种于剩余的24孔，每个孔0.1mL。将培养板置于37℃和5％ CO₂孵箱中培养。

适时进行换液和检测。有多孔阳性时，应尽可能取单克隆孔进行再次克隆，直至所有细胞孔的培养液均为阳性。

最后获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞系mAb225#，该细胞株已于2009年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2905。

(二)体外培养法制备单抗

将已经建立的杂交瘤细胞CGMCC No.2905置于细胞培养基中，置于37℃和5％CO₂孵箱中培养，每隔2d换一次细胞培养液，待细胞浓度大于10⁵mg/ml时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。收集培养上清，1500rpm，离心10分钟，上清含有高水平的单克隆抗体，-20℃保存备用。

所述细胞培养基为向DMEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(体积百分含量)，所述细胞培养基的pH为7.4。

(三)体内诱生腹水法制备单抗

抗体的大量制备采用体内诱生法。将液体石蜡(0.5mL/只)注入健康的Balb/c雌性小鼠腹腔内，1~2周后备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹落，于1000×g离心5min后收集细胞，弃上清。用不完全培养液将细胞悬浮，混匀，将细胞浓度调整至10⁶个/mL。向已进行石蜡处理的小鼠腹腔内注射1mL/只的上述杂交瘤细胞。7~9d后收集腹水，于3000×g离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，置于-70℃冻存。

(四)单抗的纯化

步骤1：腹水的预处理(二氧化硅吸附法)

取小鼠腹水，用等体积的巴比妥缓冲液稀释。加二氧化硅粉末，室温下不时摇动30min。于2000×g离心20min，即得澄清的腹水。

步骤2：辛酸-硫酸铵沉淀法纯化IgG

向一份预处理过的腹水中加入2倍腹水体积的0.06mol/L乙酸缓冲液(pH5.0)。用0.1mol/L HCl调pH值至4.8。于室温下搅拌，并在30min内逐滴加入辛酸(每1mL稀释前的腹水加33μL辛酸)。在4℃静置2h后，于15000×g离心30min。弃沉淀，上清液经砂芯漏斗过滤。向溶液中加入1/10腹水体积的0.1mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH值至7.4。将腹水置于4℃冰浴中，在30min内加入0.277g/mL的(NH₄)₂SO₄，使其饱和度达45％。静置1h以上后，于10000×g离心30min。弃上清，将沉淀溶于适量的PBS(含137mmol/L NaCl、2.6mmol/LKCl和0.2mmol/L EDTA，pH 7.4)中。在4℃于PBS中透析过夜。于10000×g离心30min后，除去不溶性沉渣，澄清液即为初级纯的抗体。

步骤3：亲和层析纯化IgG

抗体的进一步纯化采用HiTrap Protein G HP亲和层析柱进行。具体操作如下：用10倍柱体积(约10mL)的结合缓冲液(20mmol/L磷酸盐，pH 7.0)平衡层析柱。用直径为0.45μm的过滤器过滤样品以除去不溶物，然后与结合缓冲液按1:1(V/V)混合。然后用注射器进样，再用10倍柱体积(约10mL)的结合缓冲液冲洗，以除去未结合杂蛋白。之后用2~5倍柱体积的洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸-盐酸，pH2.7)洗脱样品。收集洗脱液(收集试管事先加有1mol/L pH 9.0的Tris-HCl中和液，其用量为100μL/mL收集液)。于5mmol/L PBS中充分透析，然后浓缩备用。

体外培养法制备的单抗不做纯化，直接做如下鉴定实验。

二、邻烯丙基苯酚单克隆抗体的鉴定

(1)抗体与类似物交叉反应

用竞争性ELISA测定邻烯丙基苯酚与其结构或功能类似物之间的交叉反应。将Mabs进行浓度稀释后，以等体积分别与系列倍比稀释的类似物混匀后，室温反应15min。然后加至已包被处理的酶标板中。用于ELISA分析的包被抗原浓度为50.0μg/mL，抗体浓度为25ng/mL。其余步骤同间接免疫酶联吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞的实验步骤。根据OD₄₉₂值绘制标准曲线，计算各类似物的抑制率，结果见表1。

表1、抗体与邻烯丙基苯酚及其结构类似物或相关物质的交叉反应

 

竞争物	IC50，平均值±标准差，ng/mL(交叉反应，％)
		邻烯丙基苯酚	0.3±0.6(100.0)
对氨基苯甲酸	NIa
		4-丁酰基苯酚	193±0.1(0.1)
水杨酸	36±0.4(0.8)
		2-(2-羟丙基)苯酚	3±0.7(10)

a，竞争物浓度达到10,000ng/mL，无抑制检出。

(2)抗体类型检测

用Pierce公司的单抗类型检测试剂盒对CAH单抗类型进行检测，通过OD值来进行判断。结果如表2。结果表明：抗体为IgG1类，轻链为κ型。

表2、CAH单抗类型

(3)亲和常数检测

用非竞争ELISA方法测定抗体的亲和常数，包被抗原稀释的倍数依次为1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，抗体从1：1000倍开始2倍稀释至1：1024000。用得到的OD值和抗体浓度制作曲线(图4，其中B0和B分别为没有CAH和有CAH时的OD值)。再根据公式计算得出CAH单抗的亲和常数，计算公式为K＝(n-1)/2(n[Ab’]-[Ab])，其中n为抗原的稀释比，[Ab’]代表抗原浓度较高的吸收值Amax的一半、[Ab]代表抗原浓度较低的吸收值Amax的一半。最后计算得出CAH单抗的亲和常数为4.47×10⁹M^-1，说明CAH单抗与CAH的结合能力很强。

实施例3、制备邻烯丙基苯酚多克隆抗体

(1)取8-10周龄的Balb/C雌性小白鼠为实验动物。实验免疫剂量：基础免疫为0.25-2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5-2.0mg/kg。

(2)基础免疫：用无菌水稀释实施例1中得到的CAH-BSA免疫抗原，无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的免疫抗原采用背部皮下多点注射动物，注射0.2mL。

(3)加强免疫：采用不完全弗氏佐剂乳化免疫抗原，方法同(2)。每隔3-4周进行加强免疫，腹腔与背部轮换注射，从第三次免疫开始，每次免疫后第8-10d，从小鼠眼眶采血，测效价，待效价大于1：10000后，采血，分离出抗血清，即得抗体。

实施例4、多克隆抗体的抗体抑制试验

1)CAH-OVA包被抗原溶液的配制

取CAH-OVA包被抗原，完全解冻后取8μL，用包被液(1.5g Na₂CO₃，2.93gNaHCO₃，加1000mL蒸馏水，pH为9.6)按1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000进行稀释。96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配的包被抗原液100μL，于37℃温箱中温育3h。

2)配制CAH的标样溶液

取实施例1中制得的重氮化邻烯丙基苯酚(即CAH)作为标准品，用样品稀释液(8.0g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.96g Na₂HPO₄·12H₂O，1ml Tween-20，1g明胶，加1000mL蒸馏水，pH为7.5)配成2000ng/mL供试标样溶液，以样品稀释液作对照即0ng/mL。取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液(8.0g NaCl，0.2gKH₂PO₄，2.96g Na2HPO₄·12H₂O，1ml Tween-20，加1000mL蒸馏水)洗4次后甩干，每孔加入50μL标准品。

3)CAH抗血清稀释液的配制

取实施例3的小白鼠抗血清，用样品稀释液依次按1:500、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000进行稀释。每孔加入50μL抗血清稀释液，于37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干。

4)酶标二抗反应

每孔加入经1:2000稀释的用常规方法制备的HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)样品稀释液溶液100μL，放入37℃温箱中温育30min。用洗涤液洗涤4次，甩干。

5)显色

每孔加入底物OPD～H₂O₂溶液100μL，37℃温箱中温育10min后用50μL2M H₂SO₄终止反应。在酶联仪上测定492nm波长下的吸光度值。

实验设3次重复，结果取平均数，数据如表3所示。

表3、CAH抗体与CAH抑制实验结果

注：0^a表示无CAH，1^b表示2000ng/ml CAH

由表3可以看出，当包被抗原与抗血清浓度适宜时，就有抑制现象，即2000ng/mL孔与0ng/mL孔的吸光度度值有差别，2000ng/mL孔吸光度值小，0ng/mL孔吸光度值高；当包被抗原稀释度为1:8000，抗血清稀释度为1:32000时，零水平与标准品的吸收值之差最大，此时抑制为最好。说明，本发明的抗原能制备出抑制较好、检测极限较高的抗体。

实施例5、建立邻烯丙基苯酚标准曲线

1)配制包被抗原稀释液

取CAH-OVA包被抗原，完全解冻后取1μL，用包被液按1:8000稀释。

2)配制邻烯丙基苯酚标准溶液

取邻烯丙基苯酚标样配制成0.5μg/mL的标准溶液，从中取出40μL，加入1.96mL的样品稀释液中，即得10ng/mL标准样溶液，再依次配成5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL及0.0ng/mL共10个浓度。

3)配制抗血清稀释液

取小鼠抗血清，用样品稀释液按1:32000稀释。

4)点板

将96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配的包被抗原稀释液100μL，于37℃温箱中温育3h。取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，每孔加入经系列稀释的邻烯丙基苯酚各浓度标准液50μL，再加入抗血清稀释液50μL。放37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干。

5)加酶标二抗

每孔加入经1:1000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)样品稀释液溶液100μL，放入37℃温箱中温育30min。用洗涤液洗涤4次，甩干。

6)显色

每孔加入底物OPD-H₂O₂溶液100μL，37℃温箱中温育10min后用50μL 2MH₂SO₄终止反应。在酶联仪上测定492nm波长下的吸光度值。实验设3次重复，结果取平均数，所得数据换算即得如图5所示的标准曲线，图中曲线的横坐标为邻烯丙基苯酚各浓度(ng/mL)的自然对数，纵坐标用邻烯丙基苯酚各浓度吸光度值的logit值表示。Logit值的计算方法如下：

$\mathrm{Logit}(B/B0)=\ln \frac{B/B0}{1-B/B0}=\ln \frac{B}{B0-B}$

其中B0是0ng/ml孔的吸光度值，B是其它浓度的吸光度值。)

本发明的抗原及由其得到的单克隆抗体或多克隆抗体可用于检测农作物组织(如果实)中邻烯丙基苯酚残留。

实施例6、草莓果实中邻烯丙基苯酚残留的测定

1)20g草莓果实用榨汁机捣碎后加50mL丙酮离心，取上清液，重复三次合并上清，减压浓缩至2mL加入提前制备好的衍生液100μL(衍生液的配制方法为：取对氨基苯甲酸40mg，溶解在1ml、1M NaNO₂中，再滴加1M HCl，淀粉碘化钾试纸变蓝时终止反应，得到衍生液)，得到待测样品液；

2)取CAH-OVA抗原，用包被液按1：8000稀释，将96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配CAH-OVA抗原稀释液100μL，于37℃保温3h；

3)取小鼠抗血清，用样品稀释液1:32000稀释，得抗血清稀释液；

4)取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，加入待测样品液50μL，再加入50μL抗血清稀释液，对照加入100μL水，放37℃保温箱中保温30min；

5)弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干后，每孔加入经1:2000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG100μL，放入37℃保温箱中保温30min；

6)酶联板用洗涤液洗涤4次甩干后，每孔加入底物OPD～H₂O₂溶液100μL，37℃保温箱中保温10min后用50μL 2M H₂SO₄终止反应。

实验设3次重复。结果如图6所示，不同取样时间的草莓果实提取液的孔颜色有梯度变化。图中1号孔为空白对照，即未施药草莓果实提取后的测定结果。从2~8号孔，分别为15d、13d、11d、9d、7d、5d、3d、0d采集的草莓果实样品提取后检测的结果。可以肉眼观察到，随着采样时间的延长，果实中邻烯丙基苯酚的含量递减，该方法可以追踪分析样品中邻烯丙基苯酚残留量的动态变化，准确反应样品中药剂的含量。

实施例7、添加回收实验

将不含邻烯丙基苯酚的草莓按照实施例6的方法进行样品前处理后，添加邻烯丙基苯酚，使其终浓度分别为0.16μg/g、0.31μg/g、0.63μg/g、1.25μg/g、2.50μg/g、5.00μg/g。用上述单克隆抗体及包被原进行实验，具体的实验方法如下：

1)取CAH-OVA抗原，用包被液按1：8000稀释，将96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配CAH-OVA抗原稀释液100μL，于37℃保温3h；

2)取单克隆抗体，用样品稀释液1:32000稀释，得单抗工作液；

3)取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，加入待测样品液50μL，再加入50μL单抗工作液，对照加入100μL水，放37℃保温箱中保温30min；

4)弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干后，每孔加入经1:2000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG100μL，放入37℃保温箱中保温30min；

5)酶联板用洗涤液洗涤4次甩干后，每孔加入底物OPD～H₂O₂溶液100μL，37℃保温箱中保温10min后用50μL 2M H₂SO₄终止反应。

每个实验重复3次，统计回收率。结果如表4所示。

表4、邻烯丙基苯酚草莓添加样品的回收率

^a数据来自三次重复平均值；±标准偏差

Claims (10)

1、一种检测邻烯丙基苯酚的试剂盒，包括抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体或抗邻烯丙基苯酚的多克隆抗体；所述单克隆抗体或多克隆抗体是以具有如下结构的抗原为免疫原得到的：

。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.2905的小鼠杂交瘤细胞系mAb225#分泌产生的。

3、由保藏号为CGMCC No.2905的小鼠杂交瘤细胞系mAb225#分泌产生的抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体。

4、一种邻烯丙基苯酚抗原，其分子结构如下：

。

5、一种制备邻烯丙基苯酚抗原的方法，包括如下步骤：

1)将对氨基苯甲酸重氮化，得到重氮化对氨基苯甲酸；

2)将所述重氮化对氨基苯甲酸与邻烯丙基苯酚耦合，得到重氮化邻烯丙基苯酚；

3)将所述重氮化邻烯丙基苯酚与载体蛋白偶联，得到邻烯丙基苯酚抗原。

6、保藏号为CGMCC No.2905的小鼠杂交瘤细胞系mAb225#。

7、将权利要求3所述的抗邻烯丙基苯酚的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱或含有所述免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。

8、权利要求7所述的免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱、所述试剂盒在分离纯化邻烯丙基苯酚中的应用。

9、一种检测邻烯丙基苯酚的方法，包括用权利要求1或2中所述试剂盒对待检测样品进行检测的步骤。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下样品前处理的步骤：用丙酮提取待检测样品，取上清；将所述上清加入衍生液，反应，得到待测样品液；所述衍生液是按照如下方法得到的：将每35-45mg对氨基苯甲酸溶于0.5-1.5ml0.5-1.5M NaNO₂中，再滴加0.5-1.5M HCl，反应，得到衍生液。

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