CN101490199A - 过冷促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种过冷却促进剂。本发明人在对在寒冷地区生长的树木的细胞液能够在低温下保持液体状态的机理进行研究的过程中，对成为其原因的物质进行了鉴定研究。其结果鉴定出了树木中存在的过冷却促进物质。对鉴定出的黄酮苷和经合成的类似结构的黄酮苷的过冷却能力进行了试验，发现含有这些黄酮苷的过冷却促进剂能够在低温下长时间稳定地使大量的水过冷却。本发明的含有过冷却促进剂的水溶液可用作用于在低温下保持生物材料的溶液。

Description

过冷促进剂
技术领域
本发明涉及含有黄酮苷的过冷却促进剂、以及含有该黄酮苷的不冻性液体和玻璃化液。
背景技术
我们已经知道在寒冷地区生长的树木的细胞液能够在低温下保持液体状态。其原因认为是由于这样的树木的木质部薄壁细胞内的水为与外界分离的水滴，根据水的物理特性能够过冷却到-40℃(非专利文献1)。也就是说，认为即使细胞外有冰生成，由于包围着木质部薄壁细胞的细胞壁能够作为屏障发挥防止细胞脱水以及细胞外的冰浸入细胞内的功能，且细胞内的水作为与外界独立的水滴存在，从而进行过冷却。
另外，已给出越冬植物中含有的酚化合物能够作为防冷冻物质发挥功能的启示(非专利文献2)。
另外，公开了用于培养生殖细胞等的冷冻培养基中使用了类黄酮(专利文献1)，以及将类黄酮用作作为内燃机等的冷却液使用的防冻液的成分(专利文献2)。
此外，已知作为本发明过冷却促进剂的黄酮苷以非常多的种类作为二次代谢物存在于包括树木的植物中或生物来源的物质中(非专利文献3)。
专利文献1：日本特表2000-500327(WO97/14785)
专利文献2：日本再表WO2004/074397
非专利文献1：化学と生物vol.43，No.5,280-282(2005)
非专利文献2：化学と生物vol.37，No.12，778-780(1999)
非专利文献3：“FLAVONOIDS Chemistry，Biochemistry andApplications”published in 2006 by CRC Press Taylor and Francis Group
发明内容
已知不属于糖苷的苯酚物质(类黄酮)可能具有过冷却活性(非专利文献2)，而黄酮苷(非专利文献3)能够促进水的过冷却活性却还不为人所知。
本发明人在对在寒冷地区生长的树木的细胞液能够在低温下保持液体状态的机理进行研究的过程中，对成为其原因的物质进行了鉴定研究。结果本发明人成功地鉴定出了树木中存在的过冷却促进物质。
本发明人着眼于在自然界中数周长时间地持续稳定地过冷却至-40℃以下的树木的木质部薄壁细胞，从树木的木质部以过冷却活性为指标进行成分提取。结果弄清楚了这些细胞稳定地过冷却的原因物质为黄酮苷。进而，基于已清楚的化学结构特性，发现类似结构的黄酮苷也具有显著地促进水溶液过冷却能力的能力，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供一种过冷却促进剂，其含有下述通式表示的黄酮苷(flavonoid glycoside)：
Figure A200780026796D00051
式中，X1～X4中至少一个为除去了单糖或寡糖的还原末端部分的半缩醛羟基的氢原子的糖残基、其它为羟基或氢原子，R1～R6分别相同或不同地表示氢原子、羟基或甲氧基。
本发明还提供一种不冻性液体，其为将该过冷却促进剂溶解于水或根据用途而含有添加物的水溶液中而形成的，所述不冻性液体中含有0.01g/L以上的所述过冷却促进剂。
本发明另外还提供一种玻璃化液，其为在单独或组合地含有20～100体积％的抗冻剂且剩余为水或根据用途而含有添加物的水溶液的玻璃化液中，含有0.01g/L以上的该过冷却促进剂而成的。
本发明的过冷却促进剂，通过添加生物来源或合成的黄酮苷而使水的过冷却成为可能，因此能够应用到低温保存或冷冻状态的控制等。
本发明的过冷却促进剂能够将水或含有水的物质的冷冻温度从原来水的冷冻温度降低15℃左右。该过冷却促进剂能够使大量的水在低温下长期稳定地过冷却。
另外，本发明的过冷却促进剂通过与水混合，能够成为在约-15℃左右下使用的不冻性液体，从而能够在该不冻性液体中长期低温保持生物材料等。
本发明的过冷却促进剂使水、根据用途而含有添加物的水溶液或含水的物质溶解并冷冻，从而能够作为控制冰晶大小的冷冻控制剂使用。通过有关物质的添加，能够将利用过冷却而使冷冻开始温度降低从而使形成的冰晶的大小减小。因此，通过将添加有有关物质的水溶液或改变冷却速度或改变添加物的组成或浓度以进行冷冻，能够用作多样地改变冰的大小的冷冻控制剂。
进而，通过在以高浓度含有抗冻剂的玻璃化液中添加本发明的过冷却促进剂，可以降低玻璃化液的浓度，能够减轻浸渍于玻璃化液所引起的毒性、能够在液氮温度等超低温下高效地产生玻璃体、以及可以保存至今为止在超低温的玻璃体中玻璃保存困难的生物材料等。
附图说明
图1是表示连香树(Cercidiphyllum japonicum tree)提取物的乙酸乙酯可溶级分的硅胶柱层析的图。
图2是表示硅胶柱层析级分的过冷却活性的图。横轴表示载有液滴的铜板的温度，纵轴表示冷冻的液滴的比例。
图3是表示合并上述级分9和10的级分的高效液相色谱法的图。
图4表示化合物1的乙酰化物的1H-NMR谱图。
图5表示化合物2的乙酰化物的1H-NMR谱图。
图6表示化合物3的乙酰化物的1H-NMR谱图。。
图7表示化合物4的乙酰化物的1H-NMR谱图。
图8是表示将猪肝脏小片在含有山奈黄素-7-O-葡糖苷(K7G)的低温(-5℃和-8℃)的保存液中以过冷却状态保存后的细胞生存率的图。横轴表示保存时间(日数)、纵轴表示生存率(％)。
图9是表示将酸果蔓(酸果蔓)的茎顶(芽)在室温下浸渍到75％玻璃化液中一定时间后的生存率(对照区)与其后浸于液氮中随即融解至室温后的生存率(冷冻区)的图。A表示使用含有山奈黄素-7-O-葡糖苷的玻璃化液、B表示使用不含有山奈黄素-7-O-葡糖苷的玻璃化液的情况。横轴表示浸渍时间(分钟)，纵轴表示生存率(％)。
具体实施方式
作为本发明的过冷却促进剂的黄酮苷用下式表示：
Figure A200780026796D00071
式中，X1～X4中至少一个、优选X1和X2或者X2和X4、更优选X1和X2、最优选X2为除去了单糖或寡糖的还原末端部分的半缩醛羟基的氢原子的糖残基，天然中仅仅已知了在X1和X2或者X2和X4上糖苷结合的糖残基，但是包括这些，并不排除能够合成的多个位置的羟基(X3等)被糖基化的糖残基。
此外，半缩醛羟基是指例如结合在下式的单糖或二糖的基本骨架的C1碳上的羟基。
Figure A200780026796D00072
作为该单糖，可列举出葡萄糖、甘露糖、半乳糖，作为寡糖可列举出芸香糖，棉籽糖等，但糖残基优选为葡萄糖、甘露醇、半乳糖的单糖。
该糖残基以外的X1～X4为羟基或氢原子，优选其中至少一个为氢原子，更优选X3为羟基、X4为氢原子。
R1～R6可以分别相同或不同地表示氢原子、羟基或甲氧基。
其中，R1优选为氢原子或羟基，更优选为氢原子。
R4优选为氢原子或甲氧基、更优选为氢原子，R2、R3、R5和R6优选为氢原子。
本发明中使用的黄酮苷由于含有在树木等的全部的生物体中，因此可以从这些生物体或生物来源的物质中提取，也可以进行合成。
这些树木由于在寒冷地区生长的树木中大量地含有所述过冷却促进物质，因此被认为是适用的。作为这样的针叶树(acicular tree)，例如可列举出落叶松(Larix kaempferi)、金钟柏(Thuja occidentalis)、红豆杉(Taxuscuspidata)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、日光冷杉(Abies homolepis)、库页冷杉(Abies sachalinensis)、鱼鳞云杉(Picea jezoensis)、红皮云杉(Piceaglehnii)、五针松(Pinus parviflora)、白松(Pinus strobus)、长白松(Pinus sylvestris)、黑松(Pinus thunbergii)等，作为阔叶树(broad leaf tree)可列举出日本白桦(Betula platyphylla var.japonica)、山杨(Populussieboldii)、日本粟(Castanea crenata)、合花楸(Sorbus commixta)、玉玲花(Styrax obassia)、大叶栎(Quercus crispula)、春榆(Ulmus davidiana var.japonica)、连香树(Cercidiphyllum japonicum)等。此外，无论量的多少，在寒冷地区以外的区域生长的树木也都含有。所述黄酮苷不仅能从这些树种的包括边材、芯材的木质部中提取，而且也能从树皮、冬芽和叶子中提取。另外，这些物质通常被认为存在于活细胞(薄壁细胞)内，但也有存在于细胞外的可能性。另外，这些物质不仅能够稳定地从生长的树木中，而且也能够从枯死的树木或长期贮藏的木材中提取。
本发明的过冷却促进剂显示出-0.1～-15.0℃的过冷却活性。
此外，在本发明中，过冷却活性(也称为抗冰核形成活性)可以用按照以下方法测定的数值来表示。准备在含有冰核活性细菌(Erwinia ananas)的灭活菌体的缓冲液中混合有0.5mg/mL被测定物的溶液。在能够控制温度的铜板上载置多个该溶液的2μL的液滴，以0.2℃/分钟将铜板冷却、肉眼观察冷冻的液滴数，以使50％的液滴冷冻的温度为冷冻温度。以含有被测定物和冰核活性细菌的溶液的冷冻温度与仅由冰核活性细菌和缓冲液构成的溶液的冷冻温度的差值(℃)为过冷却活性。
过冷却促进剂(也称为过冷却物质)是指通过以低浓度(一般在1％体积或重量％以下)添加到水中，而具有远远超过依赖于添加浓度的凝固点下降的过冷却活性的物质。盐、糖、糖醇等一般性的物质显示出凝固点下降温度的2倍左右的过冷却活性，但过冷却促进物质显示出10倍以上，有时显示出100倍以上的过冷却活性。
该本发明的黄酮苷的过冷却活性比如下述那些其它的被称为过冷却物质的物质的过冷却活性更优异。
1)从各种植物(桃等)的种子提取的未鉴定的粗提取物显示出-2.6～-8.1℃的水的过冷却活性(Caple et al.，(1983)Cryoletters，4，59-64.)。但是，该值是在下述条件下获得的：其仅使用作为冰核形成物质能力低的碘化银，且使用的冷却速度也为1℃/分钟，其比本发明的过冷却促进剂的冷却速度远远地快。因此，该条件是易于进行暂时性的过冷却的条件。
2)从丁香提取的丁子酚或其类似物显示出-0.2～-2.5℃的水的过冷却活性(Kawahara and Obata(1996)J.Antibact.Antifung.Agents，24，95-100.)。添加浓度为1mg/mL、且冷却速度也为1℃/分钟，其比本发明的过冷却促进剂的冷却速度远远地快。因此，该条件是易于进行暂时性的过冷却的条件。
3)桧木醇及其类似物显示出-0.4～-2.1℃的水的过冷却活性(Kawaharaet al.，(2000)Biosci.Biotechnol.Biochem.，64，2651-2656.)。添加浓度为10mM、且冷却速度也为1℃/分钟，其比本发明的过冷却促进剂的冷却速度远远地快。因此，该条件是易于进行暂时性的过冷却的条件。
4)从细菌提取的130kDa的甲壳素多糖显示出0～-4.2℃的水的过冷却活性(Yamashita et al.，(2002)Biosci.Biotechnol.Biochem.，66，948-954.)。添加浓度为50μg/mL、使用的冷却速度为1℃/分钟，其比本发明的过冷却促进剂的冷却速度远远地快。因此，该条件是易于进行暂时性的过冷却的条件。
5)各种不冻蛋白质显示出最大-7.8℃的水的过冷却活性(Duman(2002)J.Comp.Physiol.，172，163-168.)。但是能够获得该最大值的添加不冻蛋白质浓度并不清楚，而且是添加0.5M的高浓度的柠檬酸时得到的值。仅不冻蛋白质为-1.2℃，其仅仅促进过冷却。
本发明的过冷却促进剂含有上述的黄酮苷。
该黄酮苷通常以水溶液形式使用，通常可以使之以0.01g/L以上、优选0.01～30g/L、更优选0.01～10g/L、进一步优选0.1～1.0g/L溶解到水中并作为防冻性液体使用。
该防冻性液体通常是将该黄酮苷溶解到水中而获得的，但也可以使用根据用途而含有添加物的水溶液来代替水。作为这样的添加物，例如可列举出动植物细胞的培养基的成份、生物材料的保存液成份等。水溶液中的添加物的浓度可以根据用途适当地确定。
另外，该防冻性液体也可以含有其它的过冷却促进剂或抗冻剂。
含有抗冻剂时，可以单独或组合地含有1～40体积％、优选1～20体积％的抗冻剂。
抗冻剂是指通过添加到生物材料或浸渍有这些生物材料的水溶液中，从而减轻冷冻造成的伤害的物质。被称为抗冻剂的物质都具有降低浓度依赖的凝固点、减轻冰晶的形成量、减轻冷冻材料的盐浓度上升、容易地进行玻璃化等中的一个或复合的效果。
作为这样的抗冻剂，例如可列举出甲醇、乙醇、乙酰胺、DMSO、甲醛、乙二醇、丙二醇、甘油、脯氨酸、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、葡聚糖10-150、PVP、白蛋白、聚糖体、HES等。
这样的防冻性液体在完全不加入抗冻剂的情况下或在以对凝固点下降几乎没有影响的浓度(1重量％左右以下)添加抗冻剂等添加物的情况下，能够长时间(1～2周)在-15℃附近保持液体状态。
通过将生物材料(植物或动物的细胞或组织、食用或观赏用等的鱼贝类、蔬菜等植物的本身等、或者是其一部分)放入该防冻性液体中进行冷却，可在通常约5℃以下的低温下使用，且在0℃以下、特别在约0～-15℃的温度范围下不引起冷冻地长期低温保存。
该防冻性液体通过利用过冷却降低冷冻开始温度，能够减小冰晶的大小，另外通过单独或与防冻剂等并用，能够用作通过冷冻干燥来制备的医药品或食品等的冷冻控制剂。
在来自含有上述物质的树木等生物材料的提取物(粗提取液等)中，可以有同样的应用。
另一方面，以高浓度含有上述抗冻剂的水溶液被称为玻璃化液，即使在超低温(例如液氮温度)下水也不会形成晶体，从而成为玻璃化体(非晶质的冰)(新野孝南等編「植物超低温保存マニュアル」農業生物資源研究所発行2006年)。
玻璃化液是指单独或几个组合地含有20～100体积％、优选40～100体积％的上述防冻剂，且其余为水的溶液。作为水可以使用动植物培养液等溶剂。
在用于动植物的培养或保存的情况下，优选混合30体积％以上、特别优选40体积％以上的水或动植物培养液。目前，最常使用的玻璃化液PVS2为在培养基溶液中添加有30体积％的甘油、15体积％的乙二醇、15体积％的DMSO和0.4M的蔗糖的玻璃化液。培养基溶液的种类或浓度可以根据进行培养或保存的材料而适当变更。
本发明中，在该玻璃化液中通常添加0.01g/L以上、优选0.01～30g/L、更优选0.01～10g/L、进一步优选0.1～1.0g/L的本发明的过冷却促进剂。
这样的玻璃体能够在玻璃化液的冷冻温度以下，例如-15℃、特别是-60℃～-273℃的温度范围例如液氮温度(77K)下保持非晶质状态。
玻璃化所引起的冷冻保持通常预先将欲保存的材料在室温或0℃以上的温度下进行短时间浸渍处理。通过该冷冻前处理能够将材料中的水在高浓度的玻璃化液中脱去，同时玻璃化液与材料内水分进行置换。因此，若将这些材料投入液氮中，则材料内外的水不形成冰晶地发生玻璃化。若将植物等生物材料放入玻璃化液然后投入液氮中，则生物材料内外的水变成玻璃体(非晶质的冰)，从而在玻璃状态下不发生冷冻所引起的伤害，因此能够将生物材料在超低温的玻璃化液中冷冻保持。
下面，通过实施例对本发明进行例证，但并不是为了对本发明进行限定。
实施例1
从在北海道札幌地区生长的连香树采集树枝。将该连香树树枝的木质部组织用铅笔刀削成小片后，在液氮中冷冻，用乳钵和乳棒尽可能地粉碎成小片。将得到的木质部组织的粉碎物3.7Kg浸渍到甲醇中2周。以14,000G离心分离得到的提取液(Hitachi：HIMC CF15R)，回收上清液。干燥上清液，将干燥物93.8g溶解到300mL水中。
将该粗提取物的水悬浮液在20℃下以14,000G离心分离，回收上清液。将该上清液300mL与乙酸乙酯600mL混合，用分液漏斗将水可溶部分与乙酸乙酯可溶部分分离并干燥。
它们的过冷却活性用以下的方法进行测定。在含有冰核活性细菌(Erwinia ananas)的灭活菌体(和光纯药)的缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH为7)中混合0.5mg/mL的被测定物，在经温度控制的铜板上载置2μL的液滴，以0.2℃/分钟的速度冷却铜板并肉眼观察冷冻的液滴数，以50％的液滴冷冻的温度为冷冻温度。测定该冷冻温度与上述缓冲液的冷冻温度的差值(℃)。得到水可溶部分的过冷却活性为-2℃左右、乙酸乙酯可溶部分的过冷却活性为-4℃左右。
将显示有更高的过冷却活性的经干燥的乙酸乙酯可溶级分用己烷/2-丙醇/水、氯仿/甲醇/水在自制的硅胶柱层析中分离30段级分。该硅胶柱层析如图1所示。接着，按照与上述同样的方法测定各级分物质的过冷却活性。其结果如图2所示，级分9和10显示出最大过冷却值。
将上述得到的级分9和10用高效液相色谱法(柱：Wakosil 5C18HG、溶剂：甲醇:水＝1:1、流速为1mL/分钟)分析，结果如图3所示得到显示7个物质存在的峰(1～7)。
在这些峰中，显示了过冷却活性的仅为4、5、6、7的峰(以下分别称它们为化合物1～4(Cj4～7))。它们的活性分别为-1.8℃(化合物1)、-7.7℃(化合物2)、-0.2℃(化合物3)、-2.5℃(化合物4)。
这4种物质用质量分析装置(JMS-AX500：JEOL)进行负-HRFAB-MS分析。这些物质各自的质量为463.0893(Cj4)、447.0942(Cj5)、477.1038(Cj6)、447.0958(Cj7)，分子式分别预测为C21H20O12(Cj4)、C21H20O11(Cj5)、C22H22O12(Cj6)、C21H20O11(Cj7)。
进而将这些物质进行乙酰化，利用高分解能核磁共振装置(BRUKER：AMX-500)进行反应生成物的各种一维和二维NMR谱图分析。乙酰化反应是通过将约10mg的干燥试样溶解到200μL甲醇中，并向其中加入2mL醋酸酐和1mL吡啶，在70℃下处理1.5小时而进行的。将得到的乙酰化物用分取TLC进行纯化，然后溶解到氘代氯仿中进行1H-NMR、13C-COM、DEPT、1H-1H COSY、HMBC、HSQC的NMR谱图分析。
从这些物质均显示具有在250～270nm和300～380nm处的吸收峰的特征性的UV谱预测它们具有黄酮醇骨架。各个乙酰化物的1H-NMR谱图表示在图4～7中。
将化合物1(Cj4)与化合物4(Cj7)的乙酰化物的1H-NMR谱图进行比较，化合物1中由乙酰基带来的信号(δ 1.92～2.45)为8个，并可见由结合在B环的2′、5′、6′的氢带来的信号(δ 7.33、7.93、7.96)。从该结果和HMBC相关可知化合物1为槲皮素-3-O-β-葡糖苷(图4)。
化合物2(Cj5)与化合物4(Cj7)的乙酰化物的1H-NMR谱图同样地显示7个由乙酰基带来的信号(δ1.92～2.45)、由B环的2′、3′、5′、6′位的氢带来的信号(δ 7.27、7.84)、由结合于芳香环的2个氢带来的信号(δ6.73、7.01)。另外，乙酰化化合物2的酸水解产物而得到的构成糖的乙酰化物的1H-NMR谱图与乙酰化的葡萄糖的1H-NMR谱图一致(图5)。从构成糖的1位的氢与苷元的7位的碳之间存在HMBC相关可知化合物2为山奈黄素-7-O-β-葡糖苷。
将化合物3(Cj6)与化合物4(Cj7)的乙酰化物的1H-NMR谱图进行比较，化合物3中结合于芳香环的氢为1个(δ6.79)，并可见由甲氧基带来的信号(δ4.01)。从该结果和HMBC相关可知化合物3为8-甲氧基山奈黄素-3-O-β-葡糖苷(图6)。
化合物4(Cj7)的乙酰化物的1H-NMR谱图显示出由7个乙酰基带来的信号(δ 1.92～2.45)、由B环的2′、3′、5′、6′位的氢带来的信号(δ7.23、8.04)、由结合于芳香环的2个氢带来的信号(δ 6.84、7.30)。另外，还确认了β-葡萄糖残基的存在(δ 3.60、3.96、5.04、5.17、5.28、5.53)。在结合于葡萄糖异头碳的氢和葡萄糖3位的碳之间可见HMBC相关。从以上的结果可知化合物4为山奈黄素-3-O-β-葡糖苷(图7)。
从这些质量分析和NMR谱图分析的结果得出结论：这些物质均是黄酮苷，且苷元是槲皮素、山奈黄素、8-甲氧基山奈黄素中的一个，是在这些苷元上连接有1个葡萄糖的糖苷。
即，经提取的过冷却促进物质为下式表示的黄酮苷。式中的编号表示化合物的编号。
Figure A200780026796D00141
合成例1
在本合成例中，合成化合物5(白杨黄素-7-O-β-D-葡糖苷)。
将白杨黄素(Chrycin，东京化成工业株式会社制)0.51g(2.0mmol)、1.38g(10mmol)K2CO3、0.12g(0.4mmol)苄基三丁基氯化铵和CHCl3(10ml)进行磁力搅拌，在室温下加入1.61g(3.8mmol)四-O-乙酰基-α-D-溴化吡喃葡糖苷(关东化学株式会社制)，然后加热回流2小时。进而，加入上述溴化物1.00g(2.4mmol)继续加热回流1小时。将反应混合物与20mL 2N盐酸震荡后，分离有机层并干燥(MgSO4)。减压浓缩并将得到的残余物从己烷/乙醇中结晶化，得到白杨黄素7-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷1.03g(收率为88％)。生成物的分析值如下所示。
FAB-MS：m/z 585(M+H+，57％)，331(29)，255(100).FAB-HR-MS：m/z585.1599(calc.for C29H28O13+H+，585.1609)
1H NMR(DMSO-d6)δ1.97(3H，s)，2.02(9H，s)，4.11(1H，br d，J＝12.4)，4.19(2H，dd，J＝5.3，12.4)，4.35(1H，m)，5.01(1H，t like，J＝9.6)，5.10(1H，dd，J＝7.9，9.6)，5.39(1H，t like，J＝9.6)，5.76(1H，d，J＝7.9)，6.47(1H，d，J＝1.6)，6.84(1H，d，＝1.6)，7.08(1H，s)，7.55-7.65(3H，m)，8.09(2H，d，J＝7.9)，12.85(1H，s，OH).
将上述得到的白杨黄素7-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷0.23g(0.39mmol)加入10mL CH3OH-Et3N(2:1)并加热回流12小时，然后浓缩干燥。将得到的粗结晶从己烷/乙醇中结晶化，得到目标物0.12g(收率为72％)。生成物(化合物5)的分析值如下所示。
FAB-MS：m/z 417(M+H+，15％)，307(32)，255(34)，154(100).FAB-HR-MS：m/z 417.1180(calc.for C21H20O9+H+，417.1182)
1H NMR(DMSO-d6)δ3.1-3.6(5H，m)，3.70(1H，m)，4.62(1H，br s，OH)，5.08(2H，d like，J＝6.9，anomeric H，OH)，5.15(1H，br s，OH)，5.43(1H，br s，OH)，6.47(1H，d，J＝2.0)，6.87(1H，d，J＝2.0)，7.06(1H，s)，7.45-7.70(3H，m)，8.09(2H，d，J＝6.5)，12.72(1H，br s，OH).
13C NMR(DMSO-d6)δ60.5，69.5，73.0，76.4，77.1，94.9，99.6，99.7，105.4，105.5，126.4，129.0，130.4，132.1，156.9，160.9，163.0，163.5，182.0.
合成例2、3
在本合成例中合成化合物6(芹菜素7-O-β-D-吡喃葡糖苷)和化合物7(芹菜素4’，7-二-O-β-D-吡喃葡糖苷)。
(1)芹菜素7-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷和芹菜素4’，7-二-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷的合成
按照已报道(J.Chin.Chem.Soc.，48，201-206(2001))的方法，将柚(柚皮素，东京化成工业株式会社制)进行碘氧化，制备芹菜素。将芹菜素1.66g(6.1mmol)、3.59g(9.2mmol)四-O-乙酰基-α-D-溴化吡喃葡糖苷(关东化学株式会社制)和2.54g(9.2mmol)Ag2CO3加入30mL喹啉/吡啶(1:1)中，在室温下搅拌1小时。进而，追加上述溴化物1.21g(3.1mmol)和0.83g(3.0mmol)Ag2CO3并继续反应8小时。将反应混合物在50mL丙酮中稀释、搅拌后进行硅藻土过滤。减压浓缩滤液并将得到的残渣再溶解到100mL乙酸乙酯中，先与30mL的2N盐酸再与饱和氯化钠溶液振荡，然后分离有机层并干燥(MgSO4)。减压浓缩并将得到的残余物进行两次硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝40:1和氯仿:乙酸乙酯＝1:1)，得到芹菜素7-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷1.00g(收率为27％)和芹菜素4′，7-二-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷0.21g(收率为4％)。生成物的分析值如下所示：
(a)芹菜素7-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷；
FAB-MS：m/z 601(M+H+，30％)，331(41)，271(91)，169(100).FAB-HR-MS：m/z 601.1541(calc.for C29H28O14+H+，601.1558)
1H NMR(DMSO-d6)δ1.97(3H，s)，2.02(9H，s)，4.11(1，br d，J＝12.5)，4.19(1H，dd，J＝5.3，12.5)，4.33(1H，m)，5.01(1H，t like，J＝9.7)，5.09(2H，dd，J＝6.9，9.7)，5.39(1H，9.7)，5.74(1H，d，J＝7.9)，6.44(1H，d，J＝2.1)，6.79(1H，d，J＝2.1)，6.89(1H，s)，6.92(2H，d，J＝8.7)，7.95(2H，d，J＝8.7)，13.02(1H，s，OH).
(b)芹菜素4’，7-二-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷
FAB-MS：m/z 931(M+H+，44％)，601(33)，271(66)，169(49)，43(100).FAB-HR-MS：m/z 931.2524(calc.for C43H46O23+H+，931.2508)
1H NMR(DMSO-d6)δ1.97(6H，s)，2.01(18H，s)，4.0-4.25(4H，m)，4.25-4.37(2H，m)，4.95-5.15(4H，m)，5.3-5.5(2H，m)，5.76(2H，br d，J＝7.9，anomeric H)，6.47(1H，d，J＝2.0)，6.83(1H，d，J＝2.0)，7.05(1H，s)，7.17(2H，d，J＝8.9)，8.10(2H，d，J＝8.9)，12.91(1H，s，OH).
(2)化合物6(芹菜素7-O-β-D-吡喃葡糖苷)和化合物7(芹菜素4′，7-二-O-β-D-吡喃葡糖苷)的合成
将上述得到的芹菜素7-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷0.21g(0.35mmol)加入10mL CH3OH-Et3N(2:1)中，加热回流12小时后，浓缩干燥。从甲醇中结晶化得到的粗结晶，得到目标物0.11g(收率为73％)。
通过同样的反应，从上述得到的0.17g芹菜素4’，7-二-O-β-D-四-O-乙酰基吡喃葡糖苷得到芹菜素4′，7-二-O-β-D-吡喃葡糖苷(78mg)(71％)。生成物的分析值如下所示：
(c)化合物6(芹菜素7-O-β-D-吡喃葡糖苷)
FAB-MS：m/z 433(M+H+，9％)，241(96)，185(100).
        m/z 431(M-H+，7％)，279(20)，269(24)，148(100).
FAB-HR-MS：m/z 431.0993(calc.for C21H20O10-H+，431.0978)
MS(FAB+)：m/z 433(M+H+)，185，150，93，75，57，45.
1H NMR(DMSO-d6)δ3.0-3.6(5H，m)，3.70(1H，dd，J＝4.8，9.4)，4.60(1H，m，OH)，5.08(2H，d like，J＝5.1，anomeric H，OH)，5.13(1H，d，J＝4.5，OH)，5.39(1H，d，J＝4.5，OH)，6.43(1H，d，J＝2.1)，6.82(1H，d，J＝2.1)，6.89(1H，s)，6.93(2H，d，J＝8.8)，7.95(2H，d，J＝8.8)，10.40(1H，br s，OH)，12.95(1H，s，OH).
13C NMR(DMSO-d6)δ60.6，69.5，73.0，76.4，77.1，94.7，99.4，99.8，103.0，105.2，115.9，120.9，128.5，156.7，160.9，161.2，162.7，164.0，181.8.
(d)化合物7(芹菜素4’，7-二-O-β-D-吡喃葡糖苷)
FAB-MS：m/z 595(M+H+，0.6％)，271(4)，185(56)，93(100).FAB-HR-MS：m/z 595.1688(calc.for C27H30O15+H+，595.1663)
1H NMR(DMSO-d6)δ3.1-3.6(10H，m)，3.70(2H，m)，4.55-4.65(2H，m，OH)，5.0-5.1(4H，m，anomeric H x2，OH x2)，5.14(2H，d like，J＝4.0，OH)，5.35-5.45(2H，m，OH)，6.44(1H，d，J＝2.1)，6.86(1H，d，J＝2.1)，6.99(1H，s)，6.19(2H，d，J＝8.9)，8.06(2H，d，J＝8.9)，12.88(1H，s，OH).
13C NMR(DMSO-d6)δ60.55，60.60，69.5，69.6，73.0，73.1，76.4，76.5，77.1，94.8，99.5，99.7，104.0，105.3，116.5，123.5，128.1，156.8，160.2，160.9，162.8，163.4，181.8.
合成例4
在本合成例中合成化合物8(野漆树苷(Rhoifolin)，芹菜素7-O-β-新橙皮糖苷)。
将柚皮苷二水合物(东京化成工业株式会社制)1.23g(2.0mmol)和0.51g(2.0mmol)碘加入吡啶(5mL)中，搅拌下加热回流9小时。将反应液降至室温后，滤掉不溶物，减压浓缩滤液。将得到的残余物从含水乙醇中结晶化，得到目标物0.47g(收率为41％)。生成物的分析值如下所示：
FAB-MS：m/z 579(M+H+，10％)，277(57)，241(63)，207(72)，185(100).FAB-HR-MS：m/z 579.1712(calc.for C27H30O14+H+，579.1714)
1H NMR(DMSO-d6)δ1.19(3H，d，J＝6.1)，3.1-3.9(9H，m)，4.47(1H，d，J＝4.4，OH)，4.6-4.75(3H，m，OH x3)，5.12(1H，s，anomeric H)，5.16(1H，d，J＝4.4，OH)，5.22(H，d，J＝6.6，anomeric H)，5.34(1H，d，J＝4.4，OH)，6.36(1H，br s)，6.78(1H，br s)，6.86(1H，s)，6.93(2H，d，J＝8.6)，7.93(2H，d，J＝8.6)，10.40(1H，s，OH)，12.96(1H，s，OH).
13C NMR(DMSO-d6)δ18.1，60.4，68.3，69.6，70.35，70.43，71.8，76.2，77.0，77.1，94.4，97.7，99.2，100.4，103.1，105.3，115.9，120.9，128.4，156.8，160.9，161.2，162.3，164.0，181.7.
实施例2
按照与实施例1相同的方法测定合成例1～4中合成的黄酮苷(下式的化合物5～8、式中的编号表示化合物的编号。)的过冷却活性。其中，被测定物的浓度为0.1mg/mL。
Figure A200780026796D00181
结果，化合物5(白杨黄素-7-O-D-吡喃葡糖苷)的过冷却活性为-4.5℃、化合物6(芹菜素7-O-D-吡喃葡糖苷)的过冷却活性为-12.0℃、化合物7(芹菜素4’，7-二-O-D-吡喃葡糖苷)的过冷却活性为-4.9℃、化合物8(野漆树苷)的过冷却活性为-1.8℃。
实施例3
将0.01重量％的山奈黄素-7-葡糖苷(化合物2(Cj5))，Extrasynthese公司制)和1体积％DMSO(和光纯药工业制，特级)加入缓冲液(UW液，100mM乳糖酸、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉籽糖、2.5mM腺苷、3mM GSH、1mM别嘌呤醇、0.25mg/mL链霉素、10UI/mL青霉素)以制备保存液。DMSO是用来提高山奈黄素-7-O-葡糖苷的融解性的，并被认为即使在4℃的保存试样中也不会对生存率产生影响(图8)。
另外，为了进行比较，还准备不加入山奈黄素-7-O-葡糖苷和DMSO的混合液(UV液)。
将猪肝脏5百万细胞/mL浸渍到上述保存液0.5cc中，并使之在-5℃和-8℃下过冷却，在保存1、4、7天时，利用台盼蓝染色(GIBCO制)对细胞的生存率进行评价。
结果如图8所示。可知通过利用山奈黄素-7-O-葡糖苷的过冷却所致的低温保存，能够保持动物细胞的长时间生存率。
实施例4
使用PVS2的75％稀释液(22.5体积％甘油、11.25体积％乙二醇、11.25体积％的DMSO、0.4M蔗糖、其余为MS培养基(Murashige & Skoog的培养基，DUCHEFABIOCHEMIE BV制)作为玻璃化液，向其中加入0.05重量％的山奈黄素-7-O-葡糖苷(化合物2，Extrasynthese公司制)(以下称为“75％玻璃化液”)。将酸果蔓的茎顶置于PVS2液中，由于室温下的浸渍，生存率因化学毒性随着处理时间显著地下降，因此使用将如上所述的玻璃化液成份减至75％的混合液。
为了进行比较，还准备不加入山奈黄素-7-O-葡糖苷的该混合液。
从酸果蔓(在北海道大学农学研究院经传代培养的酸果蔓)取出茎顶(芽)，将其在室温下浸渍到上述混合液中。
通过降低玻璃化液的浓度，相对于在室温下的浸渍时间，茎顶的生存率缓缓下降，显示出较高的生存率(图9A和B对照区)。
另一方面，图9A的冷冻区显示出在室温下浸渍到含有山奈黄素-7-O-葡糖苷的75％玻璃化液中一定时间(负载时间)后，投入液氮中冷冻过夜，然后在室温下溶解后的生存率。同样地，图9B的冷冻区表示浸渍到不含有山奈黄素-7-O-葡糖苷的75％玻璃化液中后，投入液氮后的生存率。
在使用未混合山奈黄素-7-O-葡糖苷的玻璃化液进行冷冻的情况下，冷冻所造成的伤害是显著的(图9B冷冻区)。
但是，通过向玻璃化液中加入山奈黄素-7-O-葡糖苷，可知显著地减少了冷冻产生的伤害(图9A冷冻区)，从而可以超低温保持。
酸果蔓的芽顶等生物材料由于通常玻璃化液的化学毒性而至今为止不能够进行玻璃化保存。但是，通过将本发明的过冷却促进剂添加到玻璃化液中，从而使得即使将玻璃化液的浓度降低到可以抑制化学毒性的影响的程度，也能够充分发挥玻璃化液的功能，能够不会由高浓度的玻璃化液的毒性和冷冻而造成损伤地将生物材料在超低温下进行冷冻保存。

Claims (8)

1、一种过冷却促进剂，其含有下述通式表示的黄酮苷：
Figure A200780026796C00021
式中，X1～X4中至少一个为除去了单糖或寡糖的还原末端部分的半缩醛羟基的氢原子的糖残基、其它为羟基或氢原子，R1～R6分别相同或不同地表示氢原子、羟基或甲氧基。
2、如权利要求1所述的过冷却促进剂，其中，所述X2为葡萄糖、甘露糖或半乳糖的糖残基，X1、X3和X4分别相同或不同地表示羟基或氢原子，R1～R6为氢原子。
3、一种不冻性液体，其为将权利要求1或2所述的过冷却促进剂溶解于水或根据用途而含有添加物的水溶液中而形成的，该不冻性液体中含有0.01g/L以上的所述过冷却促进剂。
4、如权利要求3所述的不冻性液体，其中，单独或组合地含有1～40体积％的抗冻剂。
5、如权利要求3或4所述的不冻性液体，其中，含有生物材料，并被冷却至0～-15℃。
6、一种玻璃化液，其为在单独或组合地含有20～100体积％的抗冻剂且剩余为水或根据用途而含有添加物的水溶液的玻璃化液中，含有0.01g/L以上的权利要求1或2所述的过冷却促进剂而成的。
7、如权利要求6所述的玻璃化液，其中含有40体积％以上的所述水或根据用途而含有添加物的水溶液。
8、如权利要求6或7所述的玻璃化液，其中，含有生物材料，并被冷却至液氮温度。
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