CN101444641B

CN101444641B - 一种基于纳米纤维的三维大孔径组织工程支架及其应用

Info

Publication number: CN101444641B
Application number: CN2008101636911A
Authority: CN
Inventors: 欧阳宏伟; 蔡友志; 张国荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2008-12-24
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2028-12-24
Also published as: CN101444641A

Abstract

本发明提供了一种基于纳米纤维的三维大孔径组织工程支架，由如下方法制备得到：将通过静电纺丝制得的纳米纤维膜切割制成直径10μm～1mm的纤维束，将所述纤维束叠置、使纤维之间的孔隙间距在10μm～1mm范围内，组装成三维结构，粘合固定，得到由纳米纤维组成的三维大孔径组织工程支架。本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明支架的纳米纤维二级结构大孔层可促进目标细胞生长、增殖、分化等，并形成一定的组织；支架的微米纤维一级结构大孔层可提供一个缺损内部细胞组织充分长入的空间；(2)本发明支架具有良好力学性能，大大减少高分子生物材料的需要量及降解产物；(3)本发明支架适合于骨、肌腱、软骨、皮肤等组织的大块缺损修复和组织工程。

Description

一种基于纳米纤维的三维大孔径组织工程支架及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种基于纳米纤维的三维大孔径组织工程支架及其应用。

(二)背景技术

人体各种组织的损伤极为普遍，特别像骨、软骨缺损以及肌腱、韧带等结缔组织损伤越来越多(占运动损伤的50％)，而皮肤损伤更是不计其数。有数据表明，在2001年，欧洲的骨移植手术有408000例，而单美国就有605000例。目前，全球65岁以上的人口每年以2～3％的速度增长。以及由于人们物质生活水平的提高、生活方式的改变以及医学水平的提高这些都导致了对骨移植、骨修复手术的更多需求和更广泛的应用。在我国，据不完全统计，全国每年因各类交通事故、骨科疾病等因素，造成骨缺损或骨损伤的患者有300万人，骨骼不健全的人数有上千万，据估计全国每年个体匹配骨骼的市场总额至少在五千万元以上。

目前临床运动器官的损伤以及皮肤等组织缺损主要靠自体/异体组织来修复加强，或者靠不可降解的生物材料来修复。但是这些治疗方法都有其固有的缺陷。如移植自体组织需要牺牲供区的功能，且供应十分有限；异体组织来源困难且可能存在免疫和病理上的问题。

组织引导再生膜技术是目前临床应用较成功的组织工程应用性技术。其基本原理是：利用膜技术将组织缺损区与周围组织隔离，阻挡周边纤维细胞/组织的侵入，为缺损内的组织生长创造一定的有利环境。其具有制作简单、组织适用性强、临床操作简便等独有特点。目前此类膜在骨科学，牙科学、神经、血管再生方面皆有广泛深入研究。目前已有胶原膜材料(如BioGide)、透明质酸(如HYAFF 11)用于临床，但该支架只能运用于缺损组织的表面修复，无法形成立体结构，使再生组织充分长入支架内，主要缺点有：1)空隙小，无法让细胞纵深生长；2)阻挡大分子营养物质、细胞因子的传递或交流，影响组织再生；3)在非轴向上力学性能差，容易塌陷；4)局部降解产物较多，排泄不畅，影响组织生成。但鉴于电纺制备的纳米纤维具有很好的机械性能和细胞生物学特性，有利于细胞生长、增殖、分化等，如将上述材料形成三维结构支架，克服膜支架的上述缺点，就能使目标细胞在支架内生长、增殖、分化并最终长成所需组织。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种同时具备有良好组织再生性能和足够相通的细胞组织容纳空间的三维微米孔径组织工程支架。

本发明采用的技术方案是：

一种基于纳米纤维的三维微米孔径组织工程支架，由如下方法制备得到：将通过静电纺丝制得的纳米纤维膜切割制成直径10μm～1mm的纤维束，将所述纤维束叠置、使纤维之间的孔隙间距在10μm～1mm范围内，组装成三维结构，粘合固定，得到由纳米丝组成的三维大孔径组织工程支架。

静电纺丝是在高压静电场下使高分子溶液带电，并在向低电场喷射过程中成丝的方法。理论上任何高分子材料只要能找到合适的溶液体系，都有可能静电纺丝成纳米纤维，且具有批量生产的可能。目前静电纺丝已经成为纳米纤维较为常用的方法之一。通常静电纺丝制得的纳米纤维成品为纳米纤维膜，由数根纳米纤维交错排列而成，为类似于纸张的平面结构，不利于细胞生长，本发明通过将纳米纤维组成的纳米纤维膜切割得到微米纤维，再将微米纤维叠加、组装成三维结构支架，可使目标细胞更容易在支架内生长、增殖、分化并最终长成所需组织。

为充分促进组织再生，所述纳米纤维中还可复合有活性因子或其他颗粒生物材料，所述活性因子或其他颗粒生物材料为下列之一：①TGF-β、②PRP、③BMP、④VEGF、⑤PDGF、⑥HA、⑦TCP。所述活性因子或其他颗粒生物材料添加量可不受限制，优选的，其添加量为1μg/cm³～10mg/cm³，即每1cm³支架中添加1μg～10mg活性因子或其他颗粒生物材料。

制备所述纳米纤维的生物材料为本领域常规适用于制备组织工程支架的生物材料，本发明中优选为下列之一：①PLLA，②PGA，③PCL，④PLGA，⑤PCL/PLLA(指PCL和PLLA的混合物)，⑥胶原，⑦丝素蛋白、⑧壳聚糖、⑨透明质酸。

最为优选的，制备所述纳米纤维膜的生物材料为PLLA，所述纳米纤维膜按如下方法制备得到：配制40～120g/L的PLLA溶液，溶剂为氯仿、乙醇体积比1～3∶1的混合溶剂，将所述PLLA溶液置于静电纺丝装置中，于流量0.5ml/h～2ml/h、电压14KV～18.7KV条件下成丝，纳米丝累积叠加成纳米纤维膜。

优选的，所述微米纤维直径为30～500μm。优选的，所述纳米纤维直径为200～900nm。

本发明所述的基于纳米纤维的三维微米孔径组织工程支架，由如下方法制备得到：取低熔点生物材料加热融熔，将所述微米纤维层层叠置、使纤维之间的孔隙间距在10μm～1mm之内，组装成三维结构，得到所述三维微米孔径组织工程支架，所述低熔点生物材料为PCL。

本发明所述的基于纳米纤维的三维微米孔径组织工程支架，还可以由如下方法制备得到：取粘合剂溶于与所述的纳米纤维不相溶的有机溶剂制成粘合剂溶液，将所述微米纤维层层叠置、使纤维之间的孔隙间距在10μm～1mm之内，组装成三维结构，将粘合剂溶液浇筑三维结构，挥发去除有机溶剂，固定得到所述三维微米孔径组织工程支架，所述的粘合剂为下列之一：①PLLA，②PGA，③PCL，④PLGA，⑤PCL/PLLA，⑥胶原，⑦丝素蛋白、⑧壳聚糖、⑨透明质酸。

所述的三维微米孔径组织工程支架在生物体外组织构建中的应用。

所述组织工程支架制备方法如下：

先配制低浓度的PLLA、PGA等的溶液(40～120g/L)，溶剂为氯仿/乙醇(体积比3∶1)。通过电纺技术，制备纳米纤维支架。用切片机将所得的纤维支架沿一定的轴向进行切割，切割距离为10～1000μm皆可，收集大纤维后按所需形状进行组装，加低熔点生物材料如PCL加热固定或不同溶剂的生物材料如胶原浸泡后干燥制成复合材料。最终得到由纳米纤维集合成的大孔径组织工程支架。

优选的，制备所述纳米纤维膜的生物材料为PLLA，所述纳米纤维膜按如下方法制备得到：配制40～120g/L的PLLA溶液，溶剂为氯仿、乙醇体积比3∶1的混合溶剂，将所述PLLA溶液置于静电纺丝装置中，于流量0.5ml/h～2ml/h、电压14KV～18.7KV条件下制备得到纳米纤维膜。

所述的大孔径组织工程支架可应用于生物体内组织修补或加强。如体内植入进行骨、软骨、肌腱、皮肤等各种组织修补或加强。所述的大孔径组织工程支架也可应用于生物体外组织构建。如体外接种各种间充质干细胞、纤维细胞或纤维母细胞，构建组织工程骨，软骨、肌腱及皮肤等组织补片。

本发明是在以前研究的基础上进一步提高，利用能良好地模拟胞外基质胶原的功能、提供良好的组织生长微环境、促进细胞生物学表达的生物材料纳米纤维作为细胞直接生活层，利用能让足够多的细胞黏附到支架内、并有利于营养成分交换和细胞信号传导的微米纤维作为组织再生支撑层和加强层，可促进组织工程技术走向临床化和产业化。

本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明使纳米级纤维组装成三维大孔支架用于组织再生修复，支架的纳米纤维二级结构大孔层可促进目标细胞生长、增殖、分化等，并形成一定的组织；支架的微米纤维一级结构大孔层可提供一个缺损内部细胞组织充分长入的空间；(2)本发明支架具有良好力学性能，大大减少高分子生物材料的需要量及降解产物；(3)本发明支架适合于骨、肌腱、软骨、皮肤等组织的大块缺损修复和组织工程。

(四)附图说明

图1为纳米纤维的电镜照片；

图2为基于纳米纤维的三维微米孔径支架的电镜照片；

图3为三维微米孔径支架截面电镜照片；

图4为骨髓间质干细胞生长于三维微米孔径支架的电镜照片。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

先配制浓度(10mg/ml)的PLLA溶液，溶剂为氯仿/乙醇(v/v＝3∶1)。通过电纺(控制流量为0.5ml/h～1.0ml/h，电压为14KV～16KV)技术，制备纳米纤维膜(电镜照片见图1)，将制得的纳米纤维膜切割成宽度50～200μm、厚度50～200μm的细条，得到微米纤维，将微米纤维交错叠加组成三维构型，加入PCL纳米丝，65度以上加热熔融1分钟，冷却后可得到纳米纤维集合成的三维大孔径组织工程复合支架(所得纳米纤维层孔径为100～500nm，微米纤维层孔径为50～200μm)。将骨髓间质干细胞种植于纤维支架上，培养7天后电镜观察，见细胞能在支架良好生长。

实施例2：

先配制浓度(15mg/mL)的PGA溶液，溶剂为氯仿/乙醇(v/v＝3∶1)。通过电纺(控制流量为1.5ml/h～2.0ml/h，电压为16KV～18.7KV)技术制备纳米纤维膜，膜厚为200～500μm。将所得的纳米纤维膜沿一定的轴向进行切割，切割距离为200～500μm皆可，制作出一级结构的微米大纤维。而后按所需块状进行组装，浸泡入3mg/ml的胶原溶液后，提起滤干1分钟后于-70℃冷冻，将其冻干，可得到纳米纤维为基层，由微米纤维集合成的三维微米孔径组织工程复合支架。(见图2、图3)(所得纳米纤维直径为100～1000nm，支架孔径为100～500μm)。

实施例3：

先配制PLLA(10mg/mL)和TCP(5mg/ml)的混合溶液，溶剂为氯仿/乙醇(v/v＝3∶1)。通过电纺(控制流量为0.5ml/h～1.0ml/h，电压为14KV～16KV)技术，制备纳米纤维膜，将制得的纳米纤维膜切割成宽度50～200μm、厚度50～200μm的细条，得到微米纤维，将微米纤维交错叠加组成三维构型，(加入PCL纳米丝，65度以上加热熔融3分钟，冷却后可得到纳米纤维集合成的三维大孔径组织工程复合支架(支架孔径为50～200μm)。

实施例4：

将实施例2所得的支架种植上骨髓间质干细胞，培养7天后电镜观察，见细胞在支架上良好生长(见图4)。

实施例5：

将实施例3所得的支架植入白兔体内用于修复胫骨缺损。6周后可发现组织均匀长入缺损部位，形成了功能性骨组织。

实施例6：

将实施例1所得的支架植入白兔用于修复胫骨缺损，3周后组织长入良好，没有明显的炎性反应。

Claims

1.一种基于纳米纤维的三维大孔径组织工程支架，由如下方法制备得到：

将通过静电纺丝制得的纳米纤维膜切割制成直径10μm～1mm的纤维束，将所述纤维束叠置、使纤维之间的孔隙间距在10μm～1mm范围内，组装成三维结构，粘合固定，得到由纳米纤维组成的三维大孔径组织工程支架；制备所述纳米纤维膜的生物材料为下列之一：①PLLA，②PGA，③PCL，④PLGA，⑤PCL/PLLA，⑥胶原，⑦丝素蛋白、⑧壳聚糖、⑨透明质酸。

2.如权利要求1所述的组织工程支架，其特征在于所述纳米纤维中还复合有活性因子或颗粒生物材料，所述活性因子或颗粒生物材料为下列之一：①TGF-β、②PRP、③BMP、④VEGF、⑤PDGF、⑥HA、⑦TCP。

3.如权利要求2所述的组织工程支架，其特征在于所述活性因子或颗粒生物材料添加量为1μg/cm³～10mg/cm³。

4.如权利要求1所述的组织工程支架，其特征在于制备所述纳米纤维膜的生物材料为PLLA，所述纳米纤维膜按如下方法制备得到：配制40～120g/L的PLLA溶液，溶剂为氯仿、乙醇体积比1～3∶1的混合溶剂，将所述PLLA溶液置于静电纺丝装置中，于流量0.5ml/h～2ml/h、电压14KV～18.7KV条件下成丝，纳米丝累积成纳米纤维膜。

5.如权利要求1所述的基于纳米纤维的三维大孔径组织工程支架，由如下方法制备得到：取低熔点生物材料加热融熔，将所述纤维束层层叠置、使纤维之间的孔隙间距在10μm～1mm之内，组装成三维结构，得到所述三维大孔径组织工程支架，所述低熔点生物材料为PCL。

6.如权利要求1所述的基于纳米纤维的三维大孔径组织工程支架，由如下方法制备得到：取粘合剂溶于与所述的纳米纤维不相溶的有机溶剂制成粘合剂溶液，将所述纤维束层层叠置、使纤维之间的孔隙间距在10μm～1mm之内，组装成三维结构，用粘合剂溶液浇筑三维结构，挥发去除有机溶剂，固定得到所述三维大孔径组织工程支架，所述的粘合剂为下列之一：①PLLA，②PGA，③PCL，④PLGA，⑤PCL/PLLA，⑥胶原，⑦丝素蛋白、⑧壳聚糖、⑨透明质酸。

7.如权利要求1～3之一所述的组织工程支架，其特征在于所述纤维束直径为30～500μm。

8.如权利要求1～3之一所述的组织工程支架，其特征在于所述纳米纤维直径为200～900nm。

9.如权利要求1所述的三维大孔径组织工程支架在制备生物体修复和构建组织工程材料的应用。