CN104399117B - 一种聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法，步骤如下：将具有良好生物降解性和生物相容性的聚乳酸（PLA）切片依次经过纺丝和绕纱工艺制成平行排列的纤维集合体；将松散且平行排列的PLA纤维集合体用医用粘合剂粘合起来形成稳定的结构；再固化，自然冷却至室温。本发明方法制备的聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架，具有较小的厚度和重量，较大的孔径和孔隙率，较好的有序度、孔间连通性、亲水性、吸水性、力学性能和对明胶的吸附能力。该有序支架具有较好的应用前景，可以应用在血管工程、神经组织工程的细胞载体、韧带基材、药物装载和释放、神经组织工程的神经再生、植入式功能性肌肉、修复膝盖损伤和骨关节炎患者、骨组织工程等方面。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法。
背景技术
在设计三维仿生支架时，支架的孔隙结构是比较关键的参数。现有的组织工程技术是将细胞培养在利用生物材料制备的三维仿生支架上，这些生物材料必须具有良好生物降解性、生物相容性、特定的物理与力学性能以及化学稳定性(Karande TS,Ong JL,Agrawal CM.Diffusion in musculoskeletal tissue engineering scaffolds:Designissues related to porosity,permeability,architecture,and nutrient mixing.AnnBiomed Eng.2004；32:1728-43.)。其中，氧气和营养物质的传输、废弃物的去除、蛋白质传输和细胞迁移均与支架的孔隙率相关(Yang J,Shi GX,Bei JZ,Wang SG,Cao YL,ShangQX,et al.Fabrication and surface modification of macroporous poly(L-lacticacid)and poly(L-lactic-co-glycolic acid)(70/30)cell scaffolds for human skinfibroblast cell culture.J Biomed Mater Res.2002；62:438-46.)。孔隙率大小直接影响营养物质的扩散和组织的向内生长(Taboas JM,Maddox RD,Krebsbach PH,HollisterSJ.Indirect solid free form fabrication of local and global porous,biomimeticand composite 3D polymer-ceramic scaffolds.Biomaterials.2003；24:181-94.)；(Yang SF,Leong KF,Du ZH,Chua CK.The design of scaffolds for use in tissueengineering.Part II.Rapid prototyping techniques.Tissue Eng.2002；8:1-11)。较大的孔隙率能够方便细胞传输和组织向内生长(Kim BS,Mooney DJ.Development ofbiocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering.TrendsBiotechnol.1998；16:224-30.)；(Kuboki Y,Jin QM,Takita H.Geometry of carrierscontrolling phenotypic expression in BMP-induced osteogenesis andchondrogenesis.J Bone Joint Surg Am.2001；83A:S105-S15.)。当支架具有较大的孔隙率时，更有利于组织培养液的扩散效果，并且提供足够大的面积确保细胞-聚合物之间的相互作用(Freed LE,Vunjaknovakovic G,Biron RJ,Eagles DB,Lesnoy DC,Barlow SK,etal.Biodegradable Polymer Scaffolds for Tissue Engineering.Bio-Technol.1994；12:689-93.)。同时，适当的孔径也利于营养物质供应、气体扩散和代谢废弃物的去除(YangSF,Leong KF,Du ZH,Chua CK.The design of scaffolds for use in tissueengineering.Part 1.Traditional factors.Tissue Eng.2001；7:679-89.)；(ZeltingerJ,Sherwood JK,Graham DA,Mueller R,Griffith LG.Effect of pore size and voidfraction on cellular adhesion,proliferation,and matrix deposition.TissueEng.2001；7:557-72.)。支架中纤维排列的方向性是另一个比较重要的参数。利用杂乱无序排列的纤维做成支架时，支架的机械性能较差，并且在替代高度有序组织时，容易使组织受到二次损伤([Newman AP,Anderson DR,Daniels AU,Dales MC.Mechanics of the HealedMeniscus in a Canine Model.Am J Sport Med.1989；17:164-75.)；(Beredjiklian PK,Favata M,Cartmell JS,Flanagan CL,Crombleholme TM,Soslowsky LJ.Regenerativeversus reparative healing in tendon:A study of biomechanical and histologicalproperties in fetal sheep.Ann Biomed Eng.2003；31:1143-52.)。
有序支架的概念首次出现是在1991年，当时Rizvi et al.(Rizvi AH,WassermanAJ,Zazanis G,Silver FH.Evaluation of Peripheral-Nerve Regeneration in thePresence of Longitudinally Aligned Collagen-Fibers.Cell Mater.1991；1:279-89.)将平行有序排列的小直径胶原纤维放置在硅胶管上，胶原纤维便形成10mm的间距。实验结果表明成纤维细胞和雪旺细胞可以沿着胶原纤维有序排列的方向进行迁移。同时，这种有序排列的纤维可以提高组织再生效果。并且有序支架可以控制和引导细胞的方向，其中一些天然的组织细胞是有序排列的，这种细胞的取向对组织功能具有重要作用。因此，通过控制组织工程中细胞的取向可以模拟细胞的自然环境(Ma ZW,Kotaki M,Inai R,Ramakrishna S.Potential of nanofiber matrix as tissue-engineeringscaffolds.Tissue Eng.2005；11:101-9.)。
Xu et al.(Xu CY,Inai R,Kotaki M,Ramakrishna S.Aligned biodegradablenanotibrous structure:a potential scaffold for blood vesselengineering.Biomaterials.2004；25:877-86.)的实验结果表明，平滑肌细胞以纺锤形的形状沿着纤维有序排列的轴向进行粘附和迁移，平滑肌细胞中骨架蛋白的分布和组织与纳米纤维方向平行。与平面结构的聚合物膜相比，平滑肌细胞在有序纳米纤维支架表面的粘附和增殖明显提高。这种可降解的纳米纤维支架能够模拟细胞外基质(ECM)和复制体内血管结构，主要应用在组织工程支架中的血管工程方面。
Yang et al.(Yang F,Murugan R,Wang S,Ramakrishna S.Electrospinning ofnano/micro scale poly(L-lactic acid)aligned fibers and their potential inneural tissue engineering.Biomaterials.2005；26:2603-10.)对静电纺纳米/微米PLLA(Poly-L-Lactic Acid)纤维的性能进行研究，实验结果表明神经干细胞的伸长增生方向与支架中纤维方向平行。细胞方向在不同纤维直径中没有显著差异，但在细胞分化方面，PLLA纳米纤维明显大于微米纤维。实验结果表明这种PLLA有序支架可以应用在神经组织工程的细胞载体。
Lee et al.(Lee CH,Shin HJ,Cho IH,Kang YM,Kim IA,Park KD,etal.Nanofiber alignment and direction of mechanical strain affect the ECMproduction of human ACL fibroblast.Biomaterials.2005；26:1261-70.)将20wt％的聚氨酯(PU)进行静电纺丝，其中，电压强度为0.7kV/cm，旋转收集辊半径为4cm。所制备的纳米纤维直径为657±183nm，孔隙率为82.72％，这种有序支架结构与体内成纤维细胞形态类似。将人工韧带成纤维细胞种植在有序支架上，发现有序结构能够促使细胞外基质增加。这种有序的纳米纤维支架为组织工程韧带提供一个有前途的基材，它能够提供更多更好的仿生结构和适当的体内机械环境。
Chew et al.(Chew SY,Wen J,Yim EKF,Leong KW.Sustained release ofproteins from electrospun biodegradable fibers.Biomacromolecules.2005；6:2017-24.)将人类生长因子固定在载体蛋白中，封装在聚己内酯和磷酸乙酯乙烯共聚物中进行静电纺丝制备纳米纤维有序支架，纺丝距离为5-10cm，纺丝电压为20kV，流速为9.0mL/min，纺丝浓度为2-12％，未含蛋白的纳米纤维直径为5.01±0.24μm，含蛋白的纳米纤维直径为2.80±0.15μm。这种含有蛋白的纳米纤维具有较好的药物装载和释放能力，可以作为具有生物功能的支架。
Ma et al.(Ma ZW,He W,Yong T,Ramakrishna S.Grafting of gelatin onelectrospun poly(caprolactone)nanofibers to improve endothelial cellspreading and proliferation and to control cell orientation.Tissue Eng.2005；11:1149-58.)将Mn＝80,000的聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)制备成10％的纺丝液，以0.5mL/h的流速，15cm的纺丝距离，15kV的纺丝电压，制备PCL有序静电纺纳米纤维。纤维直径为200nm-1μm，纳米膜厚度为25±3μm(纺丝40min)和100±10μm(纺丝3h)。再将PCL纳米膜进行等离子体处理和明胶接枝处理进行表面改性。与未处理过的PCL纳米膜相比，经过表面处理后的PCL有序纳米膜能够明显改善内皮细胞的扩散和增殖，并且内皮细胞沿着纤维排列方向进行生长。实验结果表明，经过表面处理后的PCL有序纳米膜是一种良好的血管组织工程材料。
Ghasemi-Mobarakeh et al.(Ghasemi-Mobarakeh L,Prabhakaran MP,MorshedM,Nasr-Esfahani MH,Ramakrishna S.Electrospun poly(epsilon-caprolactone)/gelatin nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering.Biomaterials.2008；29:4532-9.)将Mw＝80,000的PCL和明胶制备成6％的纺丝液，以1ml/h的流速，12kV的纺丝电压，1000转/分的旋转圆盘转速制备有序纳米纤维。与PCL纳米纤维相比，70:30的PCL/gelatin纳米复合纤维能够提高神经分化和增殖，并且满足神经组织的需求和神经突的增长。实验结果表明，神经细胞伸长和末端神经突生长的方向与纤维排列方向平行，70:30的PCL/gelatin纳米复合纤维适合神经组织工程的神经再生。
Choi et al.(Choi JS,Lee SJ,Christ GJ,Atala A,Yoo JJ.The influence ofelectrospun aligned poly(epsilon-caprolactone)/collagen nanofiber meshes onthe formation of self-aligned skeletal muscle myotubes.Biomaterials.2008；29:2899-906.)将PCL和胶原以5％的纺丝浓度，20kV的纺丝电压，3.0mL/h的流速，10cm的纺丝距离制备有序纳米纤维。与随机取向纳米纤维相比，有序纳米纤维能显著诱导肌细胞排列和肌管的形成，种植有骨骼肌细胞的有序复合纳米纤维支架可以提供植入式功能性肌肉来治愈肌肉缺陷的病人。
Baker et al.(Baker BM,Mauck RL.The effect of nanofiber alignment onthe maturation of engineered meniscus constructs.Biomaterials.2007；28:1967-77.)将PCL以14.3％的浓度，20cm的纺丝距离，7500转速的接收辊，13kV的纺丝电压，12-16h纺丝时间，制备厚度为0.9-1.3mm的有序和无序纳米纤维膜。在种植有相同细胞时，有序支架的力学性能较好，间充质干细胞会产生较多的细胞外基质。实验结果表明，有序支架能够引导组织生长，重建天然组织的形式和功能，可以应用于膝盖损伤和骨关节炎患者。
Corey et al.(Corey JM,Lin DY,Mycek KB,Chen Q,Samuel S,Feldman EL,etal.Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal rootganglia neurite growth.J Biomed Mater Res A.2007；83A:636-45.)将PLLA溶解于三氯甲烷中制备3％的纺丝液，然后采用6-9kV的纺丝电压，7cm纺丝距离，250转/分的接收辊转速，制备纤维直径为524±305nm的纳米纤维有序支架。实验结果表明，有序支架中神经突沿着神经节的方向和纤维排列方向。神经突的引导作用很明显，并且神经突的引导作用沿着纤维方向。与随机排列纤维支架相比，神经突在有序支架上高出16％，并且这种静电纺有序支架可以用作神经再生方面。
Wang et al.(Wang HB,Mullins ME,Cregg JM,Hurtado A,Oudega M,TrombleyMT,et al.Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers fornerve regeneration applications.J Neural Eng.2009；6.)利用8wt％的PLLA纺丝液，250-1000转/分的转速，制备纳米纤维有序支架，纳米纤维直径为1.2-1.6μm。实验结果表明，神经突的生长方向沿着有序支架纤维排列方向，并且神经突也可以沿着交叉纤维的方向生长。通过优化静电纺丝条件制备的有序纤维可以引导神经突的方向性生长。雪旺细胞沿着纤维排列方向呈现双极性细胞表型，有序排列纤维支架可以有效的评价神经突的生长，但交叉纤维支架在引导轴突生长方面是不利的。
Jose et al.(Jose MV,Thomas V,Dean DR,Nyairo E.Fabrication andcharacterization of aligned nanofibrous PLGA/Collagen blends as bone tissuescaffolds.Polymer.2009；50:3778-85.)将PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))/collagen以不同混合比例(80/20，65/35和50/50，溶剂为六氟丙烯)制备成纺丝液，接收辊的转速为6000转/分，8-10kV的纺丝电压，0.1-0.3mL/h的流速，15cm的纺丝距离。当PLGA/Collagen的混合比例为80/20,65/35和50/50时，所制备的纳米纤维平均直径分别为269nm，240nm和323nm，这种纳米纤维有序支架可以应用于骨组织工程。
Wang et al.(Wang CY,Zhang KH,Fan CY,Mo XM,Ruan HJ,Li FF.Alignednatural-synthetic polyblend nanofibers for peripheral nerve regeneration.ActaBiomater.2011；7:634-43.)将P(LLA-CL)(50:50)共聚物和生丝(silk fiber，SF)，以1.2ml/h的纺丝流速，12kV的纺丝电压，接收辊的转速为4000转/分，接收距离为12-15cm来制备有序纳米纤维。将制备的有序纳米纤维支架植入大鼠的坐骨神经10cm缺陷处，通过培养4周和8周来评价效果。实验结果表明，SF/P(LLA-CL)纳米纤维比P(LLA-CL)纳米纤维具有较好的再生神经修复功能和成熟的形态，能够显著促进周围神经再生，在神经再生方面有潜在应用价值。
从这些文献看出，与无序支架相比，有序支架具有很多优势，可以应用在血管工程、神经组织工程的细胞载体、韧带基材、药物装载和释放、神经组织工程的神经再生、植入式功能性肌肉、修复膝盖损伤和骨关节炎患者、骨组织工程等方面。
目前，有序支架的制备方法主要为静电纺丝法。新加坡国立大学的Xu et al.(XuCY,Inai R,Kotaki M,Ramakrishna S.Aligned biodegradable nanotibrous structure:a potential scaffold for blood vessel engineering.Biomaterials.2004；25:877-86.)利用直径为20cm，转速为11m/s的旋转磁盘收集器接收静电纺纳米纤维来制备P(LLA-CL)有序支架。P[(LLA-CL)]的共聚比例为75:25，所用溶剂为丙酮，5％的纺丝液浓度，20mL的纺丝液，20kV的纺丝电压，15cm的纺丝距离，0.4mm的针头直径，1ml/h的注射针头流速，所制备纳米纤维直径范围为200-800nm，平均直径为550±120nm，纳米纤维支架厚度为0.5mm，并且大多数纤维的取向排列效果比较好。
华盛顿大学的Li et al.(Li D,Wang YL,Xia YN.Electrospinning ofpolymeric and ceramic nanofibers as uniaxially aligned arrays.Nano Lett.2003；3:1167-71.)利用两块导电硅条作为接收装置，这两块导电硅条之间有一定距离，距离可以从数百微米到几厘米。这两块导电硅条可以是别的导电体，比如，金属、高度掺杂硅或铝箔。所用纺丝电压为5kV，注射针头中poly(vinyl pyrrolidone)(PVP，平均分子量为1 300000g/mol)纺丝液的流速为0.2mL/h，纺丝距离为7.6cm。注射针头中polyacrylonitrile(PAN)纺丝液流速为0.3mL/h，纺丝距离为14cm，纺丝时间为5s-2min。当两块导电硅条之间的距离>1cm时，制备的纳米纤维直径会小于150nm。
Katta et al.(Katta P,Alessandro M,Ramsier RD,Chase GG.Continuouselectrospinning of aligned polymer nanofibers onto a wire drum collector.NanoLett.2004；4:2215-8.)利用线鼓作为接收器(直径为12.7cm，6cm深的凹槽，转速为1rpm)，将20wt％的锦纶-6制备成纺丝液，流量为1.5μL/min，20kV的纺丝电压制备有序排列的纳米纤维。
Choi et al.(Choi JS,Lee SJ,Christ GJ,Atala A,Yoo JJ.The influence ofelectrospun aligned poly(epsilon-caprolactone)/collagen nanofiber meshes onthe formation of self-aligned skeletal muscle myotubes.Biomaterials.2008；29:2899-906.)利用旋转的心轴来接收有序纳米纤维，旋转心轴有不锈钢板制备，尺寸为3.8×3.8×0.6cm3，转速为2350rpm来制备281±68nm的PCL/collagen有序纳米纤维。
Carnell et al.(Carnell LS,Siochi EJ,Holloway NM,Stephens RM,Rhim C,Niklason LE,et al.Aligned mats from electrospun singlefibers.Macromolecules.2008；41:5345-9.)利用静电纺纳米纤维制备层状有序支架，首先将聚酰亚胺和PGA(Polyglycolic Acid)分别制备成纺丝液，利用1.5和2mL/h的纺丝流速，接收器转速为2400转/分，13-17cm的纺丝距离，10kV和15kV的纺丝电压进行纺丝。在接收辊上制备第一层有序纳米纤维膜，然后将接收辊旋转90°，继续在第一层纳米纤维膜上制备第二层有序排列纳米纤维膜，便形成两层有序排列的纳米纤维膜。
此外，还有单向拉伸方法(Zong XH,Ran SF,Fang DF,Hsiao BS,Chu B.Controlof structure,morphology and property in electrospun poly(glycolide-co-lactide)non-woven membranes via post-draw treatments.Polymer.2003；44:4959-67.)和熔融沉积成型方法[30]可以制备有序支架。纽约州立大学石溪分校的Zong et al.(Zong XH,Ran SF,Fang DF,Hsiao BS,Chu B.Control of structure,morphology andproperty in electrospun poly(glycolide-co-lactide)non-woven membranes viapost-draw treatments.Polymer.2003；44:4959-67.)首先将poly(glycolide-colactide)(PLGA，Mw＝7.5×104g/mol)进行静电纺丝制备纳米纤维膜，其中电场强度为2kV/cm，纺丝距离为15cm，流速为100ml/min，电压为30kV。再利用改进的带有加热装置的4400Instron电子拉伸机对制备的纳米纤维膜进行处理，先将试样裁剪为20×5×0.2mm3尺寸，沿长度方向以4mm/min的拉伸速度，并在一定温度下处理试样，热处理后的试样具有较好的取向排列、较大强力和较快的降解速度(两周后的降解速度较快)。与未拉伸前的试样相比，拉伸后试样的孔隙率减小(拉伸前为71％。拉伸后为65％)、纤维直径减小、孔径分布更为均匀。Zeinet al.(Zein I,Hutmacher DW,Tan KC,Teoh SH.Fused deposition modeling of novelscaffold architectures for tissue engineering applications.Biomaterials.2002；23:1169-85.)首先利用熔融纺丝技术制备直径为1.70+0.08mm的PCL纤维，然后将PCL纤维进行有序排列，再利用计算机控制挤压和沉积过程，得到160-700mm的孔道、48％-77％孔隙率的规则蜂窝状支架。这种支架的压缩刚度范围为4-77MPa，屈服强度为0.4-3.6MPa，屈服应变为4％-28％。
聚乳酸(Poly(lactic acid)，PLA)是一种可降解聚合物，来自可再生能源(主要是淀粉和糖)。PLA是1932年首次获得的聚合物，当时是通过在真空条件下加热乳酸得到的低分子量聚合物，随后美国杜邦公司(DuPont)生产PLA高分子量聚合物，并且在1972年开始商业化生产PLA缝合线(Gupta B,Revagade N,Hilborn J.Poly(lactic acid)fiber:Anoverview.Prog Polym Sci.2007；32:455-82.)。嘉吉公司(Cargill Inc.)是研究PLA的最为活跃的公司，经过9年的发展，成立于1997年的嘉吉公司陶氏聚合物有限责任公司(Cargill Dow polymers LLC)是美国嘉吉公司(Cargill)和陶氏化工(Dow Chemicalcompany)的合资企业。但是商业生产PLA始于2002年，这种聚合物的产品在需要重要领域均有巨大的应用潜力(Gupta B,Revagade N,Hilborn J.Poly(lactic acid)fiber:Anoverview.Prog Polym Sci.2007；32:455-82.)。过去的十年中，由于PLA具有较高成本，低可用性和有限的分子量，它主要用途仅限于医疗应用，比如植入设备、组织支架和缝线。最近，新技术使高分子量聚合物PLA扩大了其应用范围(Datta R,Henry M.Lactic acid:recent advances in products,processes and technologies-a review.J ChemTechnol Biot.2006；81:1119-29.)。由于PLA是可降解的，来自可持续的来源，所以它被视为是一种很有前途的材料，并且用来减少社会固体废物处置问题(Auras R,Harte B,SelkeS.An overview of polylactides as packaging materials.Macromol Biosci.2004；4:835-64.)；(Garlotta D.A literature review of poly(lactic acid).J PolymEnviron.2001；9:63-84.)。这种可生物降解聚合物在生理环境中会由大分子链分解成更小的片段，并最终形成简单稳定的产物(Mooney DJ,Sano K,Kaufmann PM,Majahod K,SchlooB,Vacanti JP,et al.Long-term engraftment of hepatocytes transplanted onbiodegradable polymer sponges.J Biomed Mater Res.1997；37:413-20.)。由于需氧或厌氧微生物，生物活性过程(如酶反应)，或被动的水解均会引起PLA的降解(SatyanarayanaD,Chatterji PR.Biodegradable Polymers-Challenges and Strategies.J MacromolSci R M C.1993；C33:349-68.)；(Hutmacher DW.Scaffolds in tissue engineeringbone and cartilage.Biomaterials.2000；21:2529-43.)。可降解聚酯来源于三个单体，丙交酯、乙交酯和己内酯，它们的降解时间可以从几天到几年，降解时间主要依赖于配方和分子量。因此，聚乳酸是一种很有前途的生物可降解聚合物，具有较好的力学性能、热塑性、可加工性生物相容性和生物降解能力。聚乳酸(PLA)作为生物材料的研究主要集中在组织工程、肌腱和韧带、心血管、血管、皮肤、神经、药物传输和医疗设备等方面(Gupta B,RevagadeN,Hilborn J.Poly(lactic acid)fiber:An overview.Prog Polym Sci.2007；32:455-82.)；(Woodruff MA,Hutmacher DW.The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century.Prog Polym Sci.2010；35:1217-56.)。
目前，将PLA聚合物制备成纤维(单丝或复丝)的方法有熔融纺丝法(Schmack G,Tandler B,Optiz G,Vogel R,Kornber H,Haussler L,et al.High-speed melt spinningof various grades of polylactides.J Appl Polym Sci.2004；91:800-6.)、干法纺丝(Fambri L,Pegoretti A,Mazzurana M,Migliaresi C.Biodegradable Fibers.1.Poly-L-Lactic Acid Fibers Produced by Solution Spinning.J Mater Sci-Mater M.1994；5:679-83.)、湿法纺丝(Nelson KD,Romero A,Waggoner P,Crow B,Borneman A,SmithGM.Technique paper for wet-spinning Poly(L-lactic acid)and poly(DL-lactide-co-glycolide)monofilament fibers.Tissue Eng.2003；9:1323-30.)、干-湿复合纺丝法(Gupta B,Revagade N,Anjum N,Atthoff B,Hilborn J.Preparation of poly(lacticacid)fiber by dry-jet-wet-spinning.I.Influence of draw ratio on fiberproperties.J Appl Polym Sci.2006；100:1239-46.)；(Gupta B,Revagade N,Anjum N,Atthoff B,Hilborn J.Preparation of poly(lactic acid)fiber by dry-jet-wetspinning.II.Effect of process parameters on fiber properties.J Appl PolymSci.2006；101:3774-80.)和静电纺丝方法(Luu YK,Kim K,Hsiao BS,Chu B,HadjiargyrouM.Development of a nanostructured DNA delivery scaffold via electrospinningof PLGA and PLA-PEG block copolymers.J Control Release.2003；89:341-53.)。Schmack et al.(Schmack G,Tandler B,Optiz G,Vogel R,Kornber H,Haussler L,etal.High-speed melt spinning of various grades of polylactides.JAppl PolymSci.2004；91:800-6.)将五种不同分子量的PLA进行高速熔融纺丝(Mw/Mn＝2.2，7.7，5.3，2.6，2.4)，Tg＝52-67℃，Tm＝153-170℃，纺丝速度高达2000-5000m/min，然后研究PLA性能和纺丝速度对纤维的形态、取向度、结晶度以及物理性能的影响及变化规律。所制备的PLA纤维的拉伸强力高达300MPa，断裂伸长率为30％，拉伸模量为6.8GPa。
Fambri et al.(Fambri L,Pegoretti A,Mazzurana M,MigliaresiC.Biodegradable Fibers.1.Poly-L-Lactic Acid Fibers Produced by SolutionSpinning.J Mater Sci-Mater M.1994；5:679-83.)将PLLA(粘度分子量为660000，购自PURAC(Gorinchem,The Netherlands))进行两步法纺丝(干法纺丝和热牵伸)，纺丝前需要将聚合物在50℃真空干燥2天，聚合物熔点为184.9℃。首先将聚合物溶解在三氯甲烷溶剂中制备浓度为3-12g/dl的纺丝液，然后在30℃纺丝1h，纤维从长度为15mm，直径为1mm的注射针头中挤出(挤出速率为1-200cm/min)，然后将所纺纤维接收在旋转的玻璃缠线管上，缠线管与针头距离为65mm。为了防止纤维伸长、横向移动和叠加，玻璃缠线管的旋转速度与挤出速度相同。并且将所纺纤维通过两个圆柱热辊进行牵伸，温度为150-210℃，纤维运动速度为2.8cm/min。在不同牵伸温度下(150-210℃)，纤维的模量为6.3-9.6GPa，拉伸强力为0.34-1.1GPa。
Nelson et al.(Nelson KD,Romero A,Waggoner P,Crow B,Borneman A,SmithGM.Technique paper for wet-spinning Poly(L-lactic acid)and poly(DL-lactide-co-glycolide)monofilament fibers.Tissue Eng.2003；9:1323-30.)先将PLLA(Polysciences,Warrington,PA)分别溶解在三氯甲烷、1,4-二氧六环、5：1的三氯甲烷：甲苯混合溶剂、和4:1的三氯甲烷：己烷的混合溶剂中，制备7.5-15wt/v％的纺丝溶液，然后将纺丝液放入玻璃注射器中，并把玻璃注射器放置在注射器泵上，纺丝液流量为0.02-0.1mL/min，并利用氟橡胶管连接注射器。同时，将注射针头浸入凝固浴中，凝固浴要不能溶解聚合物，比如，异丙醇、短链烷烃(庚烷、环己烷、己烷、戊烷)和聚乙二醇等。当纤维从凝固浴出来后，采用直径为8.25cm的缠线管进行缠绕来获得不同的牵伸比(牵伸比范围为20-45)。将卷绕好的纤维放置在室温条件下4h去除残留溶剂，并且将纤维放置在干燥器或-20℃的冰箱中备用，所纺纤维直径为28-550μm。Gupta et al.(Gupta B,Revagade N,Anjum N,AtthoffB,Hilborn J.Preparation of poly(lactic acid)fiber by dry-jet-wet-spinning.I.Influence of draw ratio on fiber properties.J Appl Polym Sci.2006；100:1239-46.)；(Gupta B,Revagade N,Anjum N,Atthoff B,Hilborn J.Preparation ofpoly(lactic acid)fiber by dry-jet-wet spinning.II.Effect of processparameters on fiber properties.J Appl Polym Sci.2006；101:3774-80.)先将PLA(瑞典乌普萨拉大学提供)溶解在三氯甲烷中搅拌24h，然后聚合物溶液利用纺丝机进行纺丝。聚合物溶液被被0.5mm的喷丝孔挤出在甲醇凝固浴中，凝固浴中两组转辊的转速为10m/min，喷丝板与凝固浴之间的距离为25mm。然后将纤维进行牵伸和热定型，纤维的牵伸比为2-10，牵伸温度为90℃，热定型温度为120℃制备PLA纤维。与湿法纺丝方法相比，熔融纺丝技术具有很大的优势，比如，它是一个无需溶剂的纺丝过程，提供了一个更经济、环保的路线，并且纺丝速度更大，熔融纺丝是目前制备大量纤维并且满足产业化应用的主要方法(Persson M,Cho SW,Skrifvars M.The effect of process variables on theproperties of melt-spun poly(lactic acid)fibres for potential use as scaffoldmatrix materials.J Mater Sci.2013；48:3055-66.)。但对于热稳定性差和熔融过程中降解的聚合物是不能采取此种方法的。在干法纺丝过程中，溶剂是通过热蒸发的方法去除，而对于湿法纺丝，聚合物的凝固是在另一种与聚合物的液体中，这种液体必须与纺丝溶剂兼容，并且不能溶解高聚物(Gupta B,Revagade N,Hilborn J.Poly(lactic acid)fiber:Anoverview.Prog Polym Sci.2007；32:455-82.)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，而提供一种聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法。
本发明所提供的聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法，包括如下步骤：
1)将具有良好生物降解性和生物相容性的聚乳酸(PLA)切片通过熔融纺丝、干法纺丝、湿法纺丝或干-湿复合纺丝法制备直径为1-100μm的聚乳酸纤维；
2)取步骤1)制备的聚乳酸纤维800-1300根，用缕纱测长仪以1-300转/分钟的转速对纤维进行平行绕制，得到聚乳酸有序纤维束；
3)将医用粘合剂均匀刷涂在聚乳酸有序纤维束表面，使聚乳酸有序纤维束粘合成整体，所述的医用粘合剂的固含量范围为5-30％；
4)将步骤3)制备的整体聚乳酸有序纤维束在20-160℃下固化10分钟-2小时，然后自然冷却至室温，得到聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架。
本发明中，所述的医用粘合剂可以为氰基丙烯酸酯粘合剂、聚氨酯粘合剂、有机硅粘合剂或纤维蛋白粘合剂。
本发明步骤1)优选制备直径为10-20μm的聚乳酸纤维。步骤4)优选固化温度为40-60℃，固化时间为1小时。
上述的熔融纺丝、干法纺丝、湿法纺丝或干-湿复合纺丝法制备PLA纤维，可采用背景技术中所及的文献来制备。
本发明的有益效果在于：
本发明方法工艺简单，制备的聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架具有较小的厚度和重量，较大的孔径和孔隙率，较好的有序度、孔间连通性、亲水性、吸水性、力学性能和对明胶的吸附能力。该有序支架具有较好的应用前景，可以应用在血管工程、神经组织工程的细胞载体、韧带基材、药物装载和释放、神经组织工程的神经再生、植入式功能性肌肉、修复膝盖损伤和骨关节炎患者、骨组织工程等方面。
附图说明
图1是实施例1制备的PLA纤维有序支架表面的扫描电镜照片。
图2是实施例1制备的PLA纤维有序支架横截面形态的扫描电镜照片。
图3是实施例2制备的PLA纤维有序支架表面的扫描电镜照片。
图4是实施例2制备的PLA纤维有序支架横截面形态的扫描电镜照片。
图5是实施例3制备的PLA纤维有序支架表面的扫描电镜照片。
图6是实施例3制备的PLA纤维有序支架横截面形态的扫描电镜照片。
图7是实施例4制备的PLA纤维有序支架表面的扫描电镜照片。
图8是实施例4制备的PLA纤维有序支架横截面形态的扫描电镜照片。
图9是实施例5制备的PLA纤维有序支架表面的扫描电镜照片。
图10是实施例5制备的PLA纤维有序支架横截面形态的扫描电镜照片。
图11是实施例6制备的PLA纤维有序支架表面的扫描电镜照片。
图12是实施例6制备的PLA纤维有序支架横截面形态的扫描电镜照片。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1：
将分子量为170000的PLA切片采用熔融纺丝法制备成平均直径为12.41μm的PLA熔融纺纤维，利用缕纱测长仪进行绕制平行排列的集合体，转速为300r/min，纱框周长为1000mm，宽度为3.5cm。绕制平行排列的PLA纤维为800根，100cN的初始张力。将刷子完全浸没在15％固含量的聚氨酯粘合剂中约2s，取出刷子轻轻在PLA纤维表面刷涂一次，然后再将刷子完全浸没在15％固含量的聚氨酯粘合剂中约2s，再取出刷子轻轻在PLA纤维表面刷涂一次，使PLA有序纤维束粘合成整体。在40℃，固化1h，固化过程中不加任何张力。自然冷却至室温，得到PLA熔融纺纤维三维多孔有序支架。该实施例制备的PLA熔融纺纤维有序支架的表面及横截面形态如图1和2所示。
由图可见，这种三维多孔有序支架中PLA纤维呈现平行有序排列，平均厚度为0.082cm，重量为0.0288g/cm2，有序度为89.28°，平均孔径为6.39μm，孔隙率为50.00％，孔间连通性较好。由于水滴直接从支架表面进入内部孔隙，因此，从接触角测试可以知道，支架是亲水性的。该支架在1h的吸水率为147.44％，在6h的吸水率为164.98％。支架对1mg/mL明胶溶液在10min的吸附量为0.72g/cm3，在60min的吸附量为0.76g/cm3。支架沿纤维排列方向的拉伸应力和应变分别为0.28MPa和1.68％。
实施例2：
采用与实施例1相同的方法和条件，只是改变PLA纤维根数为1300根。该实施例制备的PLA熔融纺纤维有序支架的表面及横截面形态如图3和4所示。
所制备的三维多孔有序支架的平均厚度为0.0988cm，重量为0.05466g/cm2，有序度为104.78°，孔径为5.90μm，孔隙率为53.33％，孔间连通性较好。由于水滴直接从支架表面进入内部孔隙，因此，从接触角测试可以知道，支架是亲水性的。该支架在1h的吸水率为116.22％，在6h的吸水率为141.42％。支架对1mg/mL明胶溶液在10min的吸附量为0.66g/cm3，在60min的吸附量为0.63g/cm3。支架沿纤维排列方向的拉伸应力和应变分别为1.84MPa和7.20％。
实施例3：
将分子量为200000的PLA切片制备成平均直径为12.41μm的PLA熔融纺纤维，利用缕纱测长仪进行绕制平行排列的集合体，转速为1r/min，纱框周长为1000mm，宽度为3.5cm。绕制平行排列的PLA纤维为1000根，100cN的初始张力。将刷子完全浸没在5％固含量的氰基丙烯酸酯粘合剂中约2s，取出刷子轻轻在PLA纤维表面刷涂一次，然后再将刷子完全浸没在5％固含量的聚氨酯粘合剂中约2s，再取出刷子轻轻在PLA纤维表面刷涂一次，使PLA有序纤维束粘合成整体。在100℃，固化时间为1.5h，固化过程中不加任何张力。自然冷却至室温，得到PLA熔融纺纤维三维多孔有序支架。该实施例制备的PLA熔融纺纤维有序支架的表面及横截面形态如图5和6所示。这种三维多孔有序支架中PLA纤维呈现平行有序排列，平均厚度为0.068cm，重量为0.04354g/cm2，有序度为90.89°，孔径为24.97μm，孔隙率为53.33％，孔间连通性较好。由于水滴直接从支架表面进入内部孔隙，因此，从接触角测试可以知道，支架是亲水性的。该支架在1h的吸水率为176.88％，在6h的吸水率为161.59％。支架对1mg/mL明胶溶液在10min的吸附量为1.78g/cm3，在60min的吸附量为1.31g/cm3。支架沿纤维排列方向的拉伸应力和应变分别为1.85MPa和0.97％。
实施例4：
采用与实施例3相同的方法和条件，只是改变氰基丙烯酸酯粘合剂固含量为30％。该实施例制备的PLA熔融纺纤维有序支架的表面及横截面形态如图7和8所示。
所制备的三维多孔有序支架的平均厚度为0.141cm，重量为0.07128g/cm2，有序度为89.61°，孔径为11.19μm，孔隙率为46.67％，孔间连通性较好。该支架表面接触角为41.1°，因此，支架是亲水性的。该支架在1h的吸水率为98.15％，在6h的吸水率为109.16％。支架对1mg/mL明胶溶液在10min的吸附量为0.24g/cm3，在60min的吸附量为0.31g/cm3。支架沿纤维排列方向的拉伸应力和应变分别为1.93MPa和0.69％。
实施例5：
将分子量为200000的PLA切片制备成平均直径为12.41μm的PLA熔融纺纤维，利用缕纱测长仪进行绕制平行排列的集合体，转速为300r/min，纱框周长为1000mm，宽度为3.5cm。绕制平行排列的PLA纤维为500根，100cN的初始张力。将刷子完全浸没在5％固含量的有机硅粘合剂中约2s，取出刷子轻轻在PLA纤维表面刷涂一次，然后再将刷子完全浸没在5％固含量的有机硅粘合剂中约2s，再取出刷子轻轻在PLA纤维表面刷涂一次，使PLA有序纤维束粘合成整体。在160℃，固化时间为15min，固化压力为1119.8Pa。自然冷却至室温，得到PLA熔融纺纤维三维多孔有序支架。该实施例制备的PLA熔融纺纤维有序支架的表面及横截面形态如图9和10所示。这种三维多孔有序支架中PLA纤维呈现平行有序排列，平均厚度为0.07cm，重量为0.03972g/cm2，有序度为81.74°，孔径为17.85μm，孔隙率为46.67％，孔间连通性较好。由于水滴直接从支架表面进入内部孔隙，因此，从接触角测试可以知道，支架是亲水性的。该支架在1h的吸水率为113.09％，在6h的吸水率为115.17％。支架对1mg/mL明胶溶液在10min的吸附量为0.73g/cm3，在60min的吸附量为0.82g/cm3。支架沿纤维排列方向的拉伸应力和应变分别为1.08MPa和2.20％。
实施例6：
采用与实施例5相同的方法和条件，只是改变固化压力为3359.4Pa。该实施例制备的PLA熔融纺纤维有序支架的表面及横截面形态如图11和12所示。所制备的三维多孔有序支架的平均厚度为0.062cm，重量为0.0417g/cm2，有序度为83.64°，孔径为24.68μm，孔隙率为46.67％，孔间连通性较好。由于水滴直接从支架表面进入内部孔隙，因此，从接触角测试可以知道，支架是亲水性的。该支架在1h的吸水率为112.23％，在6h的吸水率为126.13％。支架对1mg/mL明胶溶液在10min的吸附量为0.94g/cm3，在60min的吸附量为0.93g/cm3。支架沿纤维排列方向的拉伸应力和应变分别为1.14MPa和2.61％。
Claims (4)
1.一种聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法，其特征是包括如下步骤：
1) 将具有良好生物降解性和生物相容性的聚乳酸切片通过熔融纺丝、干法纺丝、湿法纺丝或干-湿复合纺丝法制备直径为1-100µm的聚乳酸纤维；
2) 取步骤1)制备的聚乳酸纤维800-1300根，用缕纱测长仪以1-300 转/分钟的转速对纤维进行平行绕制，得到聚乳酸有序纤维束；
3) 将医用粘合剂均匀刷涂在聚乳酸有序纤维束表面，使聚乳酸有序纤维束粘合成整体，所述的医用粘合剂的固含量范围为5-30%；
4) 将步骤3) 制备的整体聚乳酸有序纤维束在20-160℃下固化10分钟-2小时，然后自然冷却至室温，得到聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架。
2.根据权利要求1所述的聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法，其特征是所述的医用粘合剂为氰基丙烯酸酯粘合剂、聚氨酯粘合剂、有机硅粘合剂或纤维蛋白粘合剂。
3. 根据权利要求1所述的聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法，其特征是步骤1) 制备直径为10-20µm的聚乳酸纤维。
4. 根据权利要求1所述的聚乳酸纤维三维仿生多孔有序支架的制备方法，其特征是步骤4) 的固化温度为40-60℃，固化时间为1小时。
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