CN101422431B - 胰岛素经鼻给药制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胰岛素经鼻给药制剂，胰岛素的疏水核的表面积∶油滴的表面积＝1∶1～1.5，油滴的粒径为10～200纳米；油脂与水的体积比为：油脂∶水＝1∶3～195；油脂与乳化剂的体积重量比为：1ml∶0.6～1.2g；所说的乳化剂为卵磷脂和吐温80的混合物，卵磷脂和吐温80的重量份数比例为：卵磷脂1份，吐温800.10～0.35份。本发明的制剂，含药组合物的乳剂易于透过鼻黏膜的屏障，可显著提高药物的生物利用度，药物吸收和利用完全，且对鼻黏膜无刺激，具有良好的安全性。

Description

胰岛素经鼻给药制剂

技术领域

本发明涉及一种胰岛素制剂，具体涉及一种胰岛素经鼻给药制剂。

背景技术

胰岛素是一个由51个氨基酸组成的多肽激素，其分子量约为5800，在正常个体(非糖尿病的)胰岛的β细胞内生成。胰岛素主要起到调节糖代谢，降低血糖水平；胰岛素的缺乏将导致糖尿病。众多的糖尿病人需要长期频繁的施用胰岛素来维持可接受的血糖水平。

胰岛素最常用的给药方法是皮下注射，一般注入腹部或大腿上部。为了维持可接受的血糖水平，通常需要每天注射胰岛素至少一次或两次，并在必要时补充注射速效胰岛素。胰岛素的注射给药方式给患者带来众多不便。首先，患者会发现每天频繁的注射既困难又麻烦，还伴随着疼痛，因此可能会导致不情愿而不遵医嘱，由此一些较严重的患者会危及生命。此外，皮下注射胰岛素的吸收也相对较慢，通常需要45～90分钟，且释放缓慢，增加低血糖的风险。因此，医药工作者一直在寻求可以避免自我注射同时胰岛素又可以迅速吸收入体内的胰岛素制剂和给药途径。

现在国内外已经提出了各种可能的替代性胰岛素给药方式，包括肠溶口服、直肠内、透皮、肺部等给药方法。

尽管这些技术避免了皮下注射的不适，但它们也都受到了自身限制。直肠内给药不方便不舒适，不易为患者接受。将胰岛素制备成肠溶口服制剂最能为患者接受，但是胰岛素为多肽药物，对胃肠道各种蛋白酶非常敏感，并且胃肠道的粘膜紧密程度高，胰岛素难于透过，且肠溶口服制剂胰岛素的释放时间难以确定，药物可能会在不适当的时间释放入血。透皮给药同样需要克服皮肤的障碍，因此生物利用度很低，成本较高。肺部给药业已取得进展，2006年辉瑞公司的exubera肺部干粉吸入剂成功上市，尽管胰岛素的吸收较迅速且避免了疼痛，但是其市场反映并未取得预期效果，因为其使用需要较高的技巧，并且还需要患者定期检查肺生理情况。

将胰岛素经鼻给药，可增加脂溶性的胰岛素以雾化液体或粉末的形式释放至鼻腔粘膜，经粘膜上皮丰富的毛细血管和淋巴管吸收，与皮下注射相比吸收和消除均更为迅速，与肺部吸入相比使用更为便利、安全性更好。但是，经鼻给药仍然面临难题。

国内外在胰岛素鼻腔给药方面开展了大量的基础研究工作，二十年前即有研究发现胰岛素经鼻给药可使得血糖下降，使人们对鼻腔给药途径寄予了很大期望。胰岛素是大分子蛋白质药物，亲水性强，较难透过鼻粘膜的上皮细胞层，通常的办法是加入吸收促进剂。

但经进一步研究表明，鼻腔给药存在的最大问题是吸收促进剂对鼻粘膜纤毛的毒性。如何减轻或消除药物及其其添加剂的纤毛毒性，提高胰岛素透膜吸收，是使胰岛素经鼻给药成功进入临床应用的先决条件。

日本株式会社DDS研究所2001年在中国申请的专利，其申请号为01801146.2，胰岛素的经鼻吸入制剂，公开了以多孔球状碳酸钙作为载体的含胰岛素制剂，其中多孔球状碳酸钙是柱状或针状微晶或者它们的平行连生结晶的集合体，碳酸钙微粒在18-115μm，其比表面积不低于1.5m²/g，胰岛素以单层或多层的形式附载在其上。该专利存在的一个明显缺陷是使用大量的碳酸钙载体，容易对鼻粘膜产生刺激性。

日本产业化研究株式会社2002年在中国申请专利，其申请号为02804546.7，胰岛素的经鼻药用组合物，该发明提供一种以具有特定粒子分布的结晶纤维素聚集体作为胰岛素载体的经鼻用粒状组合物，其中胰岛素为未实施可溶化处理的粉末，且该结晶纤维素聚集体有90％以上的粒子分布在10～350μm的粒径范围内；胰岛素粉末与结晶纤维素聚集体的重量配比为1∶1～500，优选1∶2～100，通过将药物粉末和固体载体均匀混合进行制备而得。该专利存在的一个明显缺陷是使用了大量的结晶纤维素，不溶性异物的加入容易对鼻粘膜产生刺激性。

美国本特利药品公司2004年在中国申请专利，其申请号为200480041300.9，用于胰岛素治疗的药用组合物及方法，公开了用胰岛素治疗患者的组合物和方法，其组合了胰岛素、渗透增强剂以及保持酸性pH的液体载体，其pH不超过4.5，通过鼻喷雾形式释放。其中的渗透增强剂为CPE-215(环十五酸内酯)，该渗透增强剂在低温时容易产生结晶，而为了保持胰岛素的稳定性，该制剂需要低温保存，因此还需要加入结晶抑制剂；此外，该渗透增强剂在包含胰岛素的水相中乳化，因此选择了HLB值7～14的表面活性剂，所得的油滴粒径在0.1～20μm。因此，该专利存在的一个明显缺陷是渗透增强剂对鼻黏膜可能有刺激性及毒性，且容易吸收进入体内可能导致不可预知的副作用。

本发明人在先申请的中国专利：申请号为200510028990.0，发明名称为“一种胰岛素鼻用粉雾剂及制备方法”以及申请号为200510028991.5，发明名称为“一种胰岛素经鼻给药液体制剂”的中国专利的专利中，采用微乳技术制备了胰岛素经鼻给药的纳米制剂，通过磷脂微乳提高了胰岛素分子的亲脂性，并使用了具有生物粘附性的材料延长药液在鼻腔的滞留时间。但是，上述专利所制备的乳剂粒径大多在100nm以上，而得到100nm以下的乳剂则必须使用大量的表面活性剂，非磷脂的表面活性剂(泊洛沙姆)与磷脂的比例高达3∶1～5∶1。现经实验考察，发现以卵磷脂和泊洛沙姆作为乳化剂，由于两者的HLB值相差较大(卵磷HLB为5-6，而泊洛沙姆HLB为25)，所得体系物理稳定性较差，尽管两者具有良好的安全性，并广泛地应用于脂肪乳剂的制备中，但所得乳剂的粒径常大于100nm。

因此，如何优化胰岛素经鼻给药制剂中的胰岛素的含量、表面活性剂和其它助剂的选择和含量，以期达到较为理想的治疗效果和提高胰岛素的吸收速度与程度、迅速起效并避免低血糖反应和降低对鼻黏膜的刺激及毒性，一直是本领域十分关注的课题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种胰岛素经鼻给药制剂，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床治疗的需要。

本发明的技术构思是这样的：

发明人经过大量的试验，包括动物试验发现：对于一种含有活性成分胰岛素、水为连续相、油脂为分散相的乳剂，俗称水包油的乳剂(O/W)，胰岛素为一两性蛋白，溶解于水相，其二聚体的疏水内核与乳剂的油相之间存在吸附作用，而对于一个水包油的乳剂，其中的油相以近似圆球的油滴形态悬浮在水相中，胰岛素的二聚体的疏水内核则吸附在油滴表面，如图18所示。

因此，申请人的认为，对于胰岛素经鼻给药制剂，应当充分考虑活性成分胰岛素的用量与油滴表面积之间的配合关系，而片面的增加胰岛素的用量，并不能提高治疗效果，反而增加成本。本发明的试验，也证明了胰岛素降血糖作用与乳剂的含油量及油滴粒径有关，而油滴的粒径与乳化剂的选择和用量有关，在一般情况下，乳化剂的用量越多，则形成的油滴粒径越小，但是，制剂的不安全性也相应的增加，因此，应当综合考虑上述的各个方面的因素，选择合适的乳化剂及其用量。

发明人通过蟾蜍上颚纤毛毒性试验和溶血试验对乳化剂用量进行筛选，发现2％为吐温的安全浓度，在此浓度下吐温与磷脂联合应用能制备出粒径小于100nm的乳剂，更有利于促进胰岛素的透粘膜吸收。经过实验发现，此微乳体系具有良好的物理稳定性和粘膜安全性。大量的实验数据显示：油脂和胰岛素的量存在一定的比例关系；当体系中油滴的表面积与胰岛素二聚体疏水核的表面积之比达1∶1～1.5，胰岛素经鼻腔吸收的降血糖效果最好，油相超过此比例，降糖效果并未增加，相反粘膜刺激性和纤毛毒性均增加。为此，申请人提出了如下的技术方案：

本发明的胰岛素经鼻给药制剂，为一种含有提高胰岛素脂溶性的油脂和表面活性剂组成的纳米乳剂，其特征在于：

胰岛素的疏水核的表面积∶油滴的表面积＝1∶1～1.5，油滴的平均粒径为10～200纳米；

油脂与水的体积比为：油脂∶水＝1∶3～195；

油脂与乳化剂的体积重量比为：1ml∶0.6～1.2g；

所说的乳化剂为卵磷脂和吐温80的混合物，卵磷脂和吐温80的重量份数比例为：

卵磷脂1份，吐温80 0.10～0.35份。

优选的，所说的乳剂包括如下配比的组分：

油脂0.4～2.5ml，水6～96ml

胰岛素1g，乳化剂0.24～3.0g

生物凝胶粘附剂0.02～1g

甘露醇0～5g，甘油0～2.5g，防腐剂0.001～0.05g，抗氧剂0.01～0.045g，使体系的pH为3.5～8.5的pH调节剂；

优选的油滴的平均粒径为40～100纳米；

所说的油脂选自合成油脂如辛癸酸甘油酯或天然植物油脂如豆油、椰子油、茶油、花生油，动物油脂如鱼油等；

所说的生物凝胶粘附剂选自壳聚糖、海藻酸盐、阿拉伯胶、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素钠；

所说的pH调节剂包括HCl、NaOH、有机酸、有机碱如醋酸、柠檬酸、氨基丁三醇、乙醇胺或氨基酸如甘氨酸、精氨酸等；

优选的，还包括0.001～0.05g的防腐剂，所说的防腐剂选自苯扎氯胺或尼泊金酯；

优选的，还包括0.01～0.045g的维生素E；

需要着重说明的是，本发明中，胰岛素的用量是根据油滴的表面积确定的，为：

胰岛素的疏水核的表面积∶油滴的表面积＝1∶1～1.5；

所说的胰岛素的疏水核的表面积为一个确定的值，根据文献：[The PeotidesAnalysis，sythesis，Biology，1981，4：63]的记载，胰岛素的疏水核表面积计为1.5nm²，1g胰岛素分子所含的分子数为1.03×10²⁰，则其二聚体的个数为5.15×10¹⁹，总疏水核表面积为7.7×10¹⁹nm²，即，1g胰岛素与油滴发生吸附作用的胰岛素的疏水核的表面积为7.7×10¹⁹nm²；

油滴的粒径可采用文献(：郑少辉，邓意辉，动态光散射技术在静脉注射亚微乳剂粒径评价中的应用，中国药剂学杂志，2005，3(3)：126)报道的方法，采用Nicomp-380激光粒度测定仪进行测定；

体系中，单个油滴的表面积可根据球体的面积计算公式计算，计算公式如下：

单个油滴的表面积S₁＝4πr²＝πd²；

单个油滴的体积 $V_1=\frac{4}{3}\mathrm{\π}{r}^3=\frac{\mathrm{\π}{d}^3}{6};$

因此，当体系中，总体积为V的油脂被分散为粒径为d油滴时，其总的油滴的数量n＝V/V₁；

而油滴总的表面积为n×S₁；

单位体积的油脂分散后其比表面积 $\mathrm{\δ}=n{S}_1=\frac{S_1}{V_1}=\frac{6}{d}.$

本发明上述的技术方案中，胰岛素与油脂的配比就是按照胰岛素与油脂的表面积的之间的关系进行确定的，胰岛素的疏水核的表面积与油滴的表面积的之间的关系为：

胰岛素疏水核表面积∶油滴表面积＝1∶1～1.5；

大量的动物试验证明，在上述的条件和配比下，能够获得最佳的药物治疗效果。

本发明胰岛素经鼻给药制剂的制备方法包括下列步骤：

(1)将生物凝胶粘附剂用水或盐酸溶解，获得生物凝胶粘附剂与水或盐酸的混合物；

(2)将油脂和表面活性剂混合溶解，获得油相，然后与总体积25～50％的水混合，搅拌，得初乳，将初乳在乳匀机中，400-800bar压力下均质2～10个循环，得到半透明至透明的微乳液，其中，油滴的粒径为10～200纳米，优选40-100纳米；

(3)称取处方量胰岛素，加入步骤(2)中微乳液与步骤(1)的水凝胶、滴加1-6mol/L盐酸或其他酸使胰岛素溶解；

(4)加入处方中其他组份，并用pH调节剂，调节步骤(4)溶液，使体系pH为3.5～8.5，最后加入余量的水，获得产品；

本发明的胰岛素经鼻给药制剂，可用于治疗糖尿病疾病，可供鼻腔喷雾或滴鼻给药，剂量一般为25～100IU，具体可根据病人的病情等因素，由医师决定。

本发明的技术效果在于：本发明确立了胰岛素的用量与油滴之间的关系，并选择了合适的乳化剂，将胰岛素制备成纳米乳剂，获得具有生物粘附性的纳米乳剂。含药组合物进入鼻腔后，纳米大小的乳剂易于透过鼻黏膜的屏障，经鼻黏膜内丰富的毛细血管和淋巴管进入体内发挥疗效，从而可显著提高药物的生物利用度，吸收迅速，而对鼻黏膜无刺激性；另外生物粘附剂使得含药乳剂滞留时间延长，使药物吸收和利用更为完全。

附图说明

图1是本发明及对照胰岛素制剂的透黏膜试验结果图。

图2溶血试验结果。

图3家兔经鼻给药胰岛素溶液与胰岛素纳米乳剂后平均血糖曲线。

图4家兔经鼻给药不同实施例胰岛素纳米乳剂后平均血糖曲线。

图5血糖曲线上面积与ins-油脂比关系。

图6Beagle犬经鼻给药胰岛素后平均血糖曲线。

图7800bar压力制备微乳粒径测定结果(平均粒径45.2nm)。

图8600bar压力制备微乳粒径测定结果(平均粒径60.5nm)。

图9400bar压力制备微乳粒径测定结果(平均粒径95.1nm)。

图10空白微乳(实施例9)的粒径测定电位测定结果(平均粒径61.4nm)。

图11胰岛素纳米乳剂(1∶0.4)粒径测定结果(平均粒径66.1nm)。

图12胰岛素纳米乳剂(1∶0.8)粒径测定结果(平均粒径66.3nm)。

图13胰岛素纳米乳剂(1∶1.2)粒径测定结果(平均粒径67.0nm)。

图14空白微乳(实施例9)的zeta电位测定结果(-17.20mv)。

图15胰岛素纳米乳剂(1∶0.8)的zeta电位测定结果(-10.14mv)。

图16胰岛素纳米乳剂(1∶0.8)的zeta电位测定结果(-7.54mv)。

图17胰岛素纳米乳剂(1∶1.2)的zeta电位测定结果(-6.38mv)。

图18为胰岛素的二聚体的疏水内核则吸附在油滴表面时的示意图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1

取壳聚糖75mg用1ml 0.1mol/l盐酸溶解备用；

取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween80 0.4g和维生素E 40mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以800bar压力循环6次，得到空白微乳60ml，油滴的平均粒径测定为45.2nm，单个油滴的表面积为6.42×10³nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为4.42×10¹⁸nm²；

取胰岛素3.0g和上述微乳混合，加入壳聚糖溶液，滴加3mol/l HCl溶解胰岛素；加入1.5g甘露醇，3.0g甘油，苯扎氯胺15mg，用0.1mol/l NaOH调节pH至4.0，水加至150ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例2

取壳聚糖75mg用1ml 0.1mol/l盐酸溶解备用；

取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween80 0.4g和维生素E 40mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以600bar压力循环6次，得到空白微乳60ml，粒径测定为60.5纳米，单个油滴的表面积为1.15×10⁴nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为3.31×10¹⁸nm²；

取胰岛素3.0g和上述微乳混合，加入壳聚糖溶液，滴加3mol/l HCl溶解胰岛素；加入1.5g甘露醇，3.0g甘油，苯扎氯胺15mg，用0.1mol/l NaOH调节pH至4.0，水加至150ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例3

取壳聚糖75mg用1ml 0.1mol/l盐酸溶解备用；

取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween80 0.4g和维生素E 40mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以400bar压力循环6次，得到空白微乳60ml，粒径测定为95.1纳米，单个油滴的表面积为2.84×10⁴nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为2.10×10¹⁸nm²；

取胰岛素3.0g和上述微乳混合，加入壳聚糖溶液，滴加3mol/l HCl溶解胰岛素；加入1.5g甘露醇，3.0g甘油，苯扎氯胺15mg，用0.1mol/l NaOH调节pH至4.0，水加至150ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例4

取海藻酸钠2g用20ml水溶解备用；

取卵磷脂1.2g、精制豆油1.8ml、tween80 0.32g和维生素E 30mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以800bar压力循环2次，得到空白微乳40ml，粒径测定为59.6纳米，单个油滴的表面积为1.12×10⁴nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为4.28×10¹⁸nm²。

取胰岛素2.0g和上述微乳混合，加入海藻酸钠溶液，滴加1mol/l HCl溶解胰岛素；加入10g甘露醇，尼泊金甲酯100mg，用0.1mol/l NaOH调节pH至7.4，水加至200ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例5

取壳聚糖0.1g用5ml 0.1mol/l盐酸溶解备用；

取卵磷脂2.7g、鱼油2.5ml、tween80 0.3g和维生素E 70mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以400bar压力循环10次，得到空白微乳50ml，粒径测定为193.3纳米，单个油滴的表面积为1.17×10⁵nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为1.55×10¹⁸nm²；

取胰岛素2.0g和上述微乳混合，加入壳聚糖溶液，滴加1mol/l柠檬酸溶解胰岛素；加入1g甘露醇，尼泊金丙酯25mg，用甘氨酸调节pH至3.5，水加至100ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例6

取羟丙基纤维素5g用50ml水溶胀备用；

取卵磷脂2.5g、辛癸酸甘油酯5.1ml、tween80 0.5g和维生素E 60mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以800bar压力循环10次，得到空白微乳120ml，粒径测定为为39.9纳米，单个油滴的表面积为5.0×10³nm²；1ml油滴总表面积为6.39×10¹⁸nm²；

取胰岛素10.0g和上述微乳混合，加入羟丙基纤维素溶液，滴加6mol/l HCl溶解胰岛素；加入25g甘油，苯扎氯胺80mg，用氨基丁三醇调节pH至6.0，水加至800ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例7

取羧甲基纤维素钠0.5g用10ml水溶解备用；

取卵磷脂1.8g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween80 0.6g和维生素E 60mg以及，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以600bar压力循环4次，得到空白微乳40ml，粒径测定为55.2纳米，单个油滴的表面积为9.57×10³nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为5.43×10¹⁸nm²

取胰岛素2.0g和上述微乳混合，加入羧甲基纤维素钠溶液，滴加1mol/l HCl溶解胰岛素；加入2g甘油，尼泊金甲酯26.4mg，尼泊金丙酯13.6mg，用0.1mol/l NaOH调节pH至8.5，水加至80ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例8

取壳聚糖200mg用1 0ml 0.1mol/l盐酸溶解备用；

取卵磷脂13.5g、茶油19.2ml、tween80 1.5g和维生素E 450mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以600bar压力循环6次，得到空白微乳75ml，粒径测定99.4nm，单个油滴的表面积为3.10×10⁴nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为1.54×10¹⁹nm²；

取胰岛素10.0g和上述微乳混合，加入壳聚糖溶液，滴加6mol/l HCl溶解胰岛素；加入苯扎氯胺10mg，用0.1mol/l NaOH调节pH至5.0，水加至100ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例9

取壳聚糖200mg用10ml 0.1mol/l盐酸溶解备用；

取卵磷脂5g、辛癸酸甘油酯10.0ml、tween80 1g和维生素E 150mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以600bar压力循环10次，得到空白微乳60ml，粒径测定61.4纳米，单个油滴的表面积为1.18×10⁴nm²；1ml空白乳中油滴总表面积为1.63×10¹⁹nm²；

取胰岛素10.0g和上述微乳混合，加入壳聚糖溶液，滴加6mol/l HCl溶解胰岛素；加入5g甘露醇，甘油1g，苯扎氯胺20mg，用乙醇胺调节pH至4.5，水加至200ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例10

取羟丙基纤维素5g用50ml水溶胀备用；

取卵磷脂2g、辛癸酸甘油酯4ml、tween80 0.4g和维生素E 50mg，60℃溶解得到油相；

将油相在60℃下，倒入同温的蒸馏水，搅拌，制得初乳，将初乳于高压乳匀机下以800bar压力循环10次，得到空白微乳100ml，粒径测定为为21.7纳米，单个油滴的表面积为1.48×10³nm²；1ml油滴总表面积为1.10×10¹⁸nm²；

取胰岛素10.0g和上述微乳混合，加入羟丙基纤维素溶液，滴加3mol/l HCl溶解胰岛素；加入25g甘油，苯扎氯胺80mg，用甘氨酸调节pH至4.5，水加至800ml，即获得本发明的胰岛素经鼻给药制剂。

实施例11

透膜实验：

1、试验方法：取新鲜牛鼻黏膜，生理盐水洗净，剥离脂肪等组织，取牛鼻黏膜剪成适宜大小，固定在改装Franz扩散池的供给室与接收室之间，黏膜外表面朝向供给室，在接收室中注入pH4.0的生理盐水至满，记录加入液的体积。开启磁力搅拌器和恒温水浴，保持恒速搅拌，37℃恒温，用移液管分别移取2ml胰岛素溶液置于扩散室中，于各个时间点取样0.3ml，并在接收室中补充新鲜pH4.0的生理盐水0.3ml。将所取得样品离心后用HPLC法测定胰岛素透膜量。

2、测定：采用高效液相法测定。

仪器型号：SHIMADZU SCL-10A VP,SPD-10A VP，LC-10AD VP,SIL-10ADVP，CTO-10AS；色谱柱：色谱柱：C18 250mm×4.6mm(5μm)(Dikma，Diamonsil^TM)；流动相：0.2mol/L硫酸盐缓冲溶液(取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml、水800ml，用乙醇胺调节pH至2.3，加水至1000ml)-乙腈(74：26)；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：214nm，柱温：40℃，进样体积：20μL。

3、试验样品配置：

样品1：pH4.0胰岛素溶液(1.0mg/ml)(配方：胰岛素0.1g，0.1mol/l盐酸1g，0.1mol/l NaOH调节ph为4.0，1g甘露醇，水加至100ml)

样品2：pH4.0胰岛素的纳米乳剂(1.0mg/ml)(实施例2制剂，1％甘露醇稀释得)；

样品3：pH4.0胰岛素加表面活性剂溶液(1.0mg/ml)(配方胰岛素0.1g，磷脂0.027g，吐温80 0.007g，0.1mol/l盐酸1g，0.1mol/lNaOH调节ph为4.0，1g甘露醇，水加至100ml)；

4、透膜试验结果：

透膜试验结果见图1。由测定结果可见，对于同一种生物膜而言，本发明胰岛素纳米乳剂透黏膜能力明显大于单纯溶液和胰岛素加表面活性剂溶液。

由上述试验结果提示：本发明的胰岛素经鼻给药制剂透黏膜能力增强，生物利用度将获得提高。

实施例12

鼻黏膜刺激性试验(在体法)：

鼻黏膜纤毛毒性评价：

分组，每组各3只，组1：本发明胰岛素纳米乳剂(实施例6)，组2：生理盐水，组3：1％普萘洛尔。将蟾蜍仰卧固定于蛙板上，用止血钳使口腔张开，分别滴加0.2ml上述溶液于黏膜处，放置0.5h后用手术剪分离上腭黏膜，取约3mm×3mm的黏膜，生理盐水洗净血块及杂物，将其平铺于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察黏膜纤毛的摆动情况，之后将载玻片置于加有少量蒸馏水饱和的层析缸中，密闭，置于室温环境(25℃)中，此后每隔一定时间取出标本，置于显微镜下观察，如纤毛继续摆动则放回层析缸中，直至纤毛停止运动为止，记录纤毛持续运动时间，见表1。

实验结果显示：生理盐水组纤毛清晰完整，纤毛运动活跃，摆动的纤毛数量多，持续摆动时间为668±20min；给予1％普萘洛尔溶液后，观察可见少量黏膜上皮脱落且纤毛运动停止。给予本发明胰岛素纳米乳剂后，纤毛较清晰，持续摆动时间为680±24min。结果可见，本发明的胰岛素纳米乳剂对鼻腔纤毛具有良好的相容性，不会对纤毛摆动造成损伤。

表1纤毛持续摆动时间

组别	1	2	3
				纤毛摆动/min	680±24	668±20	0

纤毛情况

清晰完整

清晰完整

脱落，无摆动

实施例13

鼻黏膜刺激性试验(离体法)：

鼻黏膜纤毛毒性评价：

分组，每组各3只，组1：本发明胰岛素纳米乳剂(实施例10)，组2：生理盐水，组3：1％普萘洛尔。将蟾蜍仰卧固定于蛙板上，用止血钳使口腔张开，生理盐水清洗粘膜后手术剪分离上腭黏膜，取约3mm×3mm的黏膜，生理盐水洗净血块及杂物，将其平铺于载玻片上，滴加上述试液，盖上盖玻片，显微镜下观察黏膜纤毛的摆动情况，之后将载玻片置于加有少量蒸馏水饱和的层析缸中，密闭，置于室温环境(25℃)中，此后每隔一定时间取出标本，置于显微镜下观察，如纤毛继续摆动则放回层析缸中，直至纤毛停止运动为止，记录纤毛持续运动时间，见表2。

实验结果显示：生理盐水组纤毛清晰完整，纤毛运动活跃，摆动的纤毛数量多，持续摆动时间为676±30min；给予1％普萘洛尔溶液后，观察可见少量黏膜上皮脱落且纤毛运动停止。给予本发明胰岛素纳米乳剂后，纤毛较清晰，持续摆动时间为662±20min。结果可见，本发明的胰岛素纳米乳剂对鼻腔纤毛具有良好的相容性，不会对纤毛摆动造成损伤。

表2纤毛持续摆动时间

组别	1	2	3
				纤毛摆动/min	662±20	676±30	0
纤毛情况	清晰完整	清晰完整	脱落，无摆动

实施例14

溶血性试验：

鼻粘膜组织受损的原因之一是药物或辅料对细胞膜有破坏作用，因此通过考察药物或辅料对生物膜的作用可间接评价鼻粘膜毒性。常用的天然生物膜是红细胞膜，通过溶血实验来考察。

血细胞悬液的配制：取兔血数毫升(约20ml)，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1200r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液配成2％的混悬液，供试验用。

受试物的制备：

本发明胰岛素纳米乳剂(实施例5)，均用0.9％氯化钠溶液1∶3稀释后作为供试品溶液。

试验方法：取洁净试管7只，进行编号，1-5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按下表所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。按下列顺序加入各种溶液：

试管编号	1	2	3	4	5	6	7
								2％红细胞混悬液ml	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
生理盐水ml	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	-
								蒸馏水ml							2.5
受试物ml	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	-	-

结果观察：

3h后取出各试管，于3000r/m下离心5min，观察结果见图2，试验中的7号管(阳性对照)溶液呈澄明红色，管底无细胞残留，表明有溶血发生；6号红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。1-5号样品管与阴性管相比未见明显血红色，无溶血发生。

结果判断：

阴性对照管无溶血，阳性对照管有溶血发生，受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血。可以看出，本发明的胰岛素纳米乳剂具有良好的生物膜相容性。

实施例15

动物药效学试验：

实验动物和给药方式：

家兔12只，雌雄各半，随机分为两组，体重2.5±0.2kg，分为组1：胰岛素溶液剂；组2：本发明实施例8制备的胰岛素经鼻给药纳米乳剂组。饲养7天后，开始实验。实验前夜禁食，只饮净水。

给药剂量：25IU/只

分别于给药前30、10分钟及给药后0、5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、300、360分钟兔耳静脉，用葡萄糖氧化酶测定法测定血清葡萄糖含量；测定结果见图3。

从图3可以看出：本发明的胰岛素经鼻给药纳米乳剂经鼻给药后，能够有效促进胰岛素透过鼻黏膜进入血液循环，发挥降血糖作用；而胰岛素溶液剂，未见其降血糖作用，说明胰岛素未能经鼻吸收。

实施例16

动物药效学试验

实验动物和给药方式：

家兔18只，体重2.5±0.2kg，雌雄各半，随机分为3组。饲养7天后，开始实验。实验前夜禁食，只饮净水。组1给予实施例1所制得胰岛素纳米乳剂、组2给予实施例2所制得胰岛素纳米乳剂、组3给予实施例3所制得胰岛素纳米乳剂。

给药剂量：25IU/只

分别于给药前及给药后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分钟兔耳静脉，用葡萄糖氧化酶测定法测定血清葡萄糖含量，计算平均血糖，结果见图4。结果表明，在处方相同的条件下，乳剂粒径的大小对药效具有明显影响，粒径越小，所具有的油滴表面积越大，降糖效果越好，说明根据乳剂粒径或油脂用量与胰岛素降糖效果相关的假设得到验证。

实施例17

动物药效学试验

药液配置：制备实施例4所制备的空白微乳，以胰岛素与空白乳1∶10、1∶15、1∶18、1∶25、1∶30(g/ml)的比例制备胰岛素纳米乳，其余各组分均相同。

实验动物和给药方式：

家兔15只，体重2.5±0.2kg，雌7雄8，随机分为5组。饲养7天后，开始实验。实验前夜禁食，只饮净水。分别给予上述所制得胰岛素纳米乳剂。

给药剂量：25IU/只

分别于给药前及给药后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分钟兔耳静脉，用葡萄糖氧化酶测定法测定血清葡萄糖含量，计算平均血糖，比较各制剂(空白微乳粒径相近而油脂与胰岛素比例不同)的血糖曲线上面积的关系，结果见图5。结果表明，在相同粒径(约60nm)时，当胰岛素与空白乳比例在1∶18(g/ml)以上即胰岛素与油脂的比例达到1∶0.77(油滴与胰岛素疏水面积比为1.0)以上时，其血糖曲线上面积基本保持不变，而低于该比值时降糖效果随胰岛素与油脂比例增大而增加。

实施例18

动物药效学试验

实验动物和给药方式：

Beagle犬6只，体重100±0.5kg，雌雄各半，随机分为2组。饲养7天后，开始实验。实验前夜禁食，只饮净水。组1给予实施例1所制得胰岛素纳米乳剂、组2给予实施例7所制得胰岛素纳米乳剂。

给药剂量：25IU/只

分别于给药前及给药后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分钟兔耳静脉，用葡萄糖氧化酶测定法测定血清葡萄糖含量，计算平均血糖，结果见图6。由结果显示，两处方的降糖效果明显，仅略微差别；尽管实施例1和7的胰岛素与油脂用量比值分别为1∶0.67和1∶1(g/ml)，而其粒径分别为45.2、61.4nm，油滴与胰岛素疏水面积比分别为1.15∶1和1.27∶1再次验证了胰岛素与油脂用量比的关系：当两者总表面积比在1～1.5∶1时，降糖效果也相当。

实施例19

空白微乳及胰岛素纳米乳剂的粒径及zeta电位测定

(1)分别取适量实施例1、2、3所制备的空白微乳，于Nicomp ZPW380粒度测定仪进行粒径测定，结果见图7-9。

(2)制备适量实施例9空白微乳，分别配置相同浓度的胰岛素溶液，加入不同量的空白乳，换算后加入胰岛素的重量与油脂的体积比例为1∶0.4、1∶0.8、1∶1.2(g/ml)，测定空白乳及配置的胰岛素乳剂粒径及zeta电位，结果见图10-17。

由粒径测定结果发现，相同处方在不同压力下制备的空白微乳粒径不同，压力越大，粒径越小；胰岛素加入到微乳中粒径增加，表明两者之间产生了相互作用，同时zeta电位的变化也可以揭示两者之间的作用。

Claims (8)

1.胰岛素经鼻给药制剂，为一种含有提高胰岛素脂溶性的油脂和乳化剂组成的纳米乳剂，其特征在于，胰岛素的疏水核的表面积∶油滴的表面积＝1∶1～1.5，油滴的平均粒径为10～200纳米；

油脂0.4～2.5ml，水6～96ml

胰岛素1g，乳化剂0.24～3.0g

生物凝胶粘附剂0.02～1g

甘露醇0～5g，甘油0～2.5g，防腐剂0.001～0.05g，抗氧剂0.01～0.045g，使体系的pH为3.5～8.5的pH调节剂；

所说的乳化剂为卵磷脂和吐温80的混合物，卵磷脂和吐温80的重量份数比例为：

卵磷脂    1份，吐温80    0.10～0.35份；

所说的油脂选自合成油脂、天然植物油脂或动物油脂，所说的合成油脂为辛癸酸甘油酯，所述的天然植物油脂为豆油、椰子油、茶油或花生油；

所说的生物凝胶粘附剂选自壳聚糖、海藻酸盐、阿拉伯胶、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素。

2.根据权利要求1所述的胰岛素经鼻给药制剂，其特征在于，所述的油滴的平均粒径为40-100纳米。

3.根据权利要1所述的胰岛素经鼻给药制剂，其特征在于，所说的pH调节剂为HCl、NaOH，有机酸、有机碱或氨基酸。

4.根据权利要求3所述的胰岛素经鼻给药制剂，其特征在于，所说的有机碱选自氨基丁三醇或乙醇胺；所说的有机酸为醋酸或柠檬酸；所说的氨基酸为甘氨酸或精氨酸。

5.根据权利要求1所述的胰岛素经鼻给药制剂，其特征在于，还包括0.001～0.05g的防腐剂。

6.根据权利要求5所述的胰岛素经鼻给药制剂，其特征在于，所说的防腐剂选自苯扎氯胺或尼泊金酯。

7.根据权利要求1所述的胰岛素经鼻给药制剂，其特征在于，还包括0.01～0.045g的维生素E。

8.权利要求1～7任一项所述的胰岛素经鼻给药制剂的制备方法，包括下列步骤：

(1)将生物凝胶粘附剂用水或盐酸溶解，获得生物凝胶粘附剂与水或盐酸的混合物；

(2)将油脂和乳化剂混合溶解，获得油相，然后与总体积25～50％的水混合，搅拌，得初乳，将初乳在乳匀机中，400-800bar压力下均质2～10个循环，得到半透明至透明的微乳液，其中，油滴的粒径为10～200纳米；

(3)称取处方量胰岛素，加入步骤(2)的微乳液与步骤(1)的水凝胶，滴加1-6mol/L盐酸或其他酸使胰岛素溶解；

(4)加入处方中其他组份，并用pH调节剂，调节步骤(4)溶液，使体系pH为3.5～8.5，最后加入余量的水，获得产品。

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