CN101415437A - 用于家禽疫苗接种的干粉组合物和系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过吸入进行家禽疫苗接种的干粉组合物，所述组合物包含有效量的家禽疫苗物质和支持量的用于所述家禽疫苗物质的载体，所述载体包含还原糖或非还原糖和生物相容聚合物的组合，所述干粉组合物采取平均粒径为2－30μm和粒径多分散性为1.1－4.0的颗粒形式。本发明还涉及制备所述干粉组合物的方法和通过吸入进行家禽疫苗接种的系统。

Description

用于家禽疫苗接种的干粉组合物和系统

发明领域

本发明涉及用于在家禽中诱导抵御禽类疾病的保护性应答的兽医疫苗接种干粉组合物，所述禽类疾病例如但不限于：新城疫和禽流感。本发明还涉及利用这些干粉组合物经吸入对禽类实施疫苗接种的系统。

发明背景

熟知禽类传染性疾病对家禽生产有不利的经济影响，对直接或间接接触受感染鸟类的其它动物(特别是哺乳动物)和人的健康也可能有不利影响。

例如，具体禽类病原体，例如但不限于新城疫病毒(下文简写为NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性粘液囊病病毒(IBDV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、减蛋综合征(egg drop syndrome)(EDS)病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheleisisvirus)、禽痘病毒、禽腺病毒、传染性鼻炎、禽伤寒、禽霍乱、禽流感、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门菌属(Salmonella spp)等可从受感染的家禽传播开来。

更具体地说，新城疫是导致家禽工业大量经济损失的地理分布广泛的家禽病毒感染。NDV是所述疾病的病原体，其代表了副粘病毒属的原型病毒。禽类副粘病毒有9种血清型，称为APMV-1到APMV-9。新城疫的复杂之处在于不同的NDV毒株诱导的疾病严重程度明显不同。通过吸入或摄入可发生传染，然后该病毒的传染性形式可从一只鸟类传播至另一只。

禽流感或“鸟类流感”是甲型流感病毒导致的动物传染病，该病毒通常只感染鸟类和猪(不常见)。禽流感病毒倾向于具有物种特异性，但能跨越物种屏障而感染哺乳动物和人类。甲型流感病毒具有16种H亚型。已知只有H5和H7亚型的病毒能导致高病原形式的疾病。现已证实导致当前全球禽流感流行的H5N1病毒尤其顽固，就人类健康而言该病毒是目前特别关注的。

大量疫苗接种技术(mass vaccination techniques)通常采用喷雾和气溶胶疫苗接种(分别含粗的和细小的液滴)来保护家禽免遭呼吸道病毒传染。喷雾和气溶胶疫苗接种中，雾化方法和装置对于家禽疫苗接种特别重要，因为要求特殊，例如该装置必须用外部能源操作。

按照生产商的说明书或定制程序，在鸟类一生中通常要多次接种疫苗以最佳防止疾病爆发。通常对约2-3周龄以下的鸡实施所谓的初次疫苗接种(致敏)。该初次疫苗接种后一般进行一次或多次所谓的二级疫苗接种(加强)。

家禽疫苗接种约48小时后，一些呼吸道病毒，特别是NDV会出现接种反应。受影响的家禽(例如鸡)可表现出呼吸道症状、食欲减退、抑郁、生长迟滞和死亡率升高。继发性大肠杆菌病(colibacilosis)(大肠杆菌感染)会使接种反应更复杂。为防止该情况，疫苗接种后36小时给予鸟类抗生素治疗，这往往证明是有效的。然而，过度使用或错误使用抗生素可诱导细菌耐药性，这在多药耐药菌株加重接种反应时会妨碍充分的治疗。

通常根据疾病情况而利用低毒力(低毒(lentogenic))或中等毒力(中强毒(mesogenic))的活病毒来接种家禽以抵御新城疫。然而，中强毒ND疫苗病毒只适合加强疫苗接种。但是低毒群的毒力也有很大差异。常规使用的活疫苗包括低毒毒株，例如V4、Hitchner B1、F和La Sota，以及中产毒株，例如毒株H、Mukteswar、Koinarov和Roakin。

活NDV疫苗的主要优点是可通过廉价的大量应用技术，例如喷雾、气溶胶和饮用水应用而给予。然而，如上所述，活疫苗可导致严重的接种反应，特别是在气溶胶疫苗接种后的下呼吸道反应。为尽可能降低该缺陷，利用极其温和的病毒，特别是用作初次疫苗接种的物质至关重要。然而，即使是常规使用的温和活NDV毒株Hitchner B1和La Sota仍能导致中等呼吸道接种反应。因此，本领域急需改善NDV疫苗接种以避免接种动物中的接种反应，但仍能产生抵御疾病的有效免疫力。

气溶胶颗粒要有效，已知应考虑以下参数而使吸入颗粒沉积在鸟类呼吸道的特定区域，所述参数是例如但不限于鸟的种类、其年龄、吸入颗粒的大小和对接种后反应(post-vaccination reactions)的易感性。

用于产生粗喷雾的目前市售雾化器产生的颗粒中大部分沉积在较深的气道中，即围绕最佳大小的粒径分布太宽。虽然此效应对于加强疫苗接种是理想的，但在较年幼的鸟中可导致有害接种反应。

新产生的空气传播液滴会蒸发至其原始大小的约10％。如果用目前可用的喷雾技术产生，该现象会妨碍充分的疫苗接种结果，原因在于：

-在初次疫苗接种期间，一定百分比的疫苗颗粒会沉积在不应沉积的鸟类较深的气道中，因此解释了观察到呼吸道接种后反应的发生率高；

-由于粒径分布宽且不受控，在次级疫苗接种中，只有少部分由液滴蒸发得到的颗粒被吸入下呼吸道。

除了液滴大小不合适外，因生产、重建和雾化期间灭活所致的疫苗病毒损失是已知喷雾和气溶胶疫苗接种效率低的另一主要原因。首先，冻干保存一般在液体环境，例如无特定病原体(SPF)鸡蛋的尿囊腔中培养的疫苗病毒。虽然干燥形式时病毒对环境灭活因子不敏感，虽然可在干燥前加入稳定赋形剂，但在活疫苗的生产和保存期间病毒浓度仍有些许损失。雾化前，疫苗饼(vaccinecake)需要重建，病毒浓度会因重建所用水中存在痕量消毒剂以及病毒在液体环境中的温度敏感性而进一步降低。疫苗液滴在分散后蒸发时，这种灭活作用更甚。喷雾和气溶胶疫苗接种期间疫苗浓度的极大降低会危及对充分免疫应答的诱导。此外，目前的液体悬浮液疫苗还极其缺乏稳定性。

Allan等(Avian Pathology(1980)9：153-162)指导了利用含有溶解于水的山梨醇的新城疫病毒溶液，以极高速度从最高旋振(top spinning)表面产生湿气溶胶颗粒，这些颗粒可以通过一系列柱子在接触室之前干燥，从而产生粒径1-4μm的几乎单分散气溶胶用于接种鸡。

WO 97/36578披露喷雾干燥的微粒，这些微粒中至少90％的体积中值粒径为1-10μm，含有用于基因治疗的试剂和赋形剂(如碳水化合物)的基本均一混合物。可用大尺寸载体配制这些微粒，利用干粉吸入器给予得到的制剂。WO 97/36578未记载疫苗接种、兽医应用以及微粒大小多分散性。

WO 99/52550披露了用于掺入水不可溶性蛋白质抗原的聚合物颗粒疫苗递送系统，所述系统用生物可降解的丙交酯-乙交酯共聚物乳液产生，其中按照体积大小分布，所得聚合物颗粒的平均直径是0.05-20μm。图2显示了平均粒径为10μm的示范性颗粒的大小分散性。WO 99/52550未记载禽类病毒和雾化作用，也未指明疫苗递送系统中存在糖。

美国专利号6,651,655披露利用不含任何推进剂气体(即，呼吸驱动的)的干粉吸入器在患者中产生免疫应答的方法。加载于所述干粉吸入器中的疫苗制剂包含空气动力学粒径小于50μm的干粉疫苗颗粒，图1显示示范性的研磨疫苗粉末的粒径分布。一旦产生了这种用于深肺沉积的小颗粒，将该微粉化的物质与乳糖大颗粒(即，约100μm或比研磨疫苗颗粒大约50倍的颗粒)混合。美国专利号6,651,655的干粉吸入器因其构建原理而明显不适用于家禽疫苗接种。

WO 2005/123131披露了用于喷雾干燥抗体或疫苗的制剂，其包含4％-10重量％的抗体或疫苗抗原，0.1mM-50mM一种或多种氨基酸，0.5-4重量％的糖和水。根据所用的高压喷雾设备，液滴产生的干粉粒径范围是0.5-100μm。WO 2005/123131未记载微粒大小多分散性，也未考虑除氨基酸和糖组合以外的其它配方。

Meszaros等(Acta Veterinaria Hungaria(1992)40：121-127)披露了利用能提供小于10μm的液滴的Masterdrop MD-2500设备，通过气溶胶疫苗接种来免疫1-10日龄的鸡以抵御新城疫。该出版物添加了液滴稳定剂以防止液滴蒸发成干颗粒，但未记载液滴的平均大小和多分散性。

本发明的目的是克服这些缺点。

发明概述

本发明通过提供兽医疫苗接种，特别是家禽疫苗接种用的有效干燥固体粉末组合物而能以简单而廉价的方式克服目前家禽疫苗接种技术中的缺陷，所述组合物既可用于初次接种，也可用于加强疫苗接种。

首先，本发明涉及兽医疫苗接种用的粉末组合物，特别是通过吸入用于家禽疫苗接种的干粉组合物，所述组合物包含有效量的兽医疫苗，特别是家禽疫苗，所述疫苗含有一种或多种微生物或其诸部分和一种或多种用于所述兽医(特别是家禽)疫苗的载体，其中所述粉末采取平均粒径约2-30μm和/或粒径多分散性为1.1-4.0的颗粒形式。所述载体设置优选包含还原性或非还原性糖和生物相容聚合物的组合，并任选包含其它载体。其次，本发明涉及在家禽中实施疫苗接种的方法和系统，所述方法包括将干粉疫苗接种组合物在所述家禽上方雾化，特别是其中所述干粉疫苗接种组合物采取平均粒径约2-30μm和/或粒径多分散性为1.1-4.0的颗粒形式。再次，本发明涉及采用便捷而廉价的方式，同时利用配制干粉剂型的标准生产设备制备上述干粉家禽疫苗接种组合物的方法和工艺。

在一方面，本发明提供家禽疫苗接种用的干粉组合物，所述组合物适合于在家禽上方直接雾化而无需重建成疫苗溶液从而克服了任何重建步骤固有的疫苗浓度损失并克服了液滴干燥不受控的明显风险，而这些缺点与家禽工业中先将疫苗组合物溶解再在家禽上方雾化的当前实践相关。在本发明的该方面，雾化干粉疫苗组合物而无需事先重建成疫苗溶液能简单而有效地分布，并避免了颗粒凝聚从而造成粒径不适于吸入的明显风险。

附图简述

图1显示了以各组分(左标尺)和累积组分(右标尺)的体积百分比计，本发明的示范性兽医疫苗接种用干粉组合物的粒径分布(以微米为单位)。

图2显示了经激光衍射技术检测，与现有技术的雾化液体疫苗的累积液滴大小分布相比，本发明的雾化干粉疫苗的累积粒径分布。

图3显示了与现有技术的雾化细微液体疫苗相比，本发明的雾化细干粉疫苗的病毒浓度，以每m³空气中的EID₅₀表示。

图4显示了用雾化干粉疫苗进行疫苗接种后第2和第4周获取的平均血凝抑制(HI)血清滴度。误差线表示标准差。

发明详述

本发明第一方面的最相关特征是：

-兽医疫苗接种用粉末组合物，优选经吸入的家禽疫苗接种用干粉组合物中存在合适量，优选支持量的一种或多种用于兽医疫苗的载体，所述一种或多种载体优选含有还原性或非还原性糖和生物相容聚合物的组合，并任选包含其它类型的载体；和/或

-疫苗接种粉末采取平均粒径约2-30μm的颗粒，优选基本上干燥的颗粒形式，和/或

-疫苗接种粉末具有相对狭窄的粒径多分散性，例如约1.1-4.0。

除非另有表述，涉及干燥疫苗接种粉末的粒径时，本文所用的术语“多分散性”指比例d(84％)/d(50％)，即基于体积的粒径分布累积曲线上对应于84％的直径除以基于体积的粒径分布累积曲线上对应于50％的直径。

虽然均符合本发明的目的，但可根据待接种家禽的类型(物种)和年龄，通过组合上述重要参数的具体子范围来适当选择有用的疫苗接种组合物。就此而言，家禽的类型(物种)不是本发明的关键参数，所述类型不只包括鸡，还包括家养的鸟类，例如火鸡、鹅、野鸡(feasant)、小鸭子等和宠物鸟类。例如，平均粒径约10-30μm，优选约15-25μm，甚至更优选约20μm的粉末组合物对于1日龄到约3周龄的鸡的首次免疫接种特别理想。在另一方面，平均粒径约3-9μm，例如约3-6μm，或约5μm的粉末疫苗接种组合物适宜家禽的次级(加强)疫苗接种。

尽可能低的粒径多分散性是精确控制本发明的干粉疫苗接种组合物和系统的重要参数，其是相应疫苗接种方法成功与否的决定性参数。利用本发明的干粉组合物已能获得合适的疫苗接种效率，其中粒径多分散性低于3.0，优选低于2.5，甚至更优选低于2.0。由于粒径较低时难以控制多分散性，还由于疫苗接种效率和多分散性控制成本之间应合理平衡，在许多情况中，考虑到生产再现性和成本的矛盾以及疫苗接种效率，干粉疫苗接种组合物的粒径多分散性为至少1.3，或至少1.5，甚至至少1.7便足够了。因此，本发明的干粉组合物的粒径多分散性的合适工作范围是约1.3-约3.0，优选1.5-2.5。

干粉组合物中存在的一种或多种载体的比例不是本发明的限制性特征，该比例通常不影响组合物的生产可行性。依据各种参数，技术人员可利用本领域的标准知识选择该比例，所述参数例如但不限于：载体的技术功能和数量，它们相互的相容性、兽医(特别是家禽)疫苗物质的类型和浓度，即微生物(或其诸部分)的类型，和(任选地)要达到的目标平均粒径(例如，依据待接种家禽的类型和年龄)。以所述干粉组合物的重量计，所述一种或多种载体所占比例可以宽泛至0.1％-99.999％，例如0.1％-99.9％，如0.5％-99.5％，或1％-99％，或2％-98％，例如90％-99.999重量％。因此，以所述干粉组合物的重量计，疫苗物质所占比例可以是0.001％-99.9重量％，例如0.001％-10％。

干粉组合物中所述一种或多种载体的类型和性质不是本发明的限制性特征，只要它们参与疫苗的稳定性和以粉末形式直接雾化的便利性，依据各种参数，技术人员可以利用本领域的标准知识作出选择，所述参数例如但不限于：各载体要执行的技术功能，其与一种或多种其它载体(如果有多种载体的话)的相容性和成本因素。所述一种或多种载体优选兽医学可接受的级别，可以从下组中适当选择，但不限于此：

-还原糖，例如但不限于：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、核糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖等，

-非还原糖，例如但不限于：海藻糖、蔗糖等，

-多元醇，例如但不限于：甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇、赤藓醇、肌醇等，

-生物相容的聚合物，例如但不限于：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、脂族聚酯、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己酸内酯、丙交酯-己内酯共聚物、聚丙烯酸、角叉聚糖、脱乙酰壳多糖、纤维素衍生物、葡聚糖、化学改性的葡聚糖、菊粉、麦芽糖糊精、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、淀粉等，

-蛋白质，例如但不限于：白蛋白、奶粉、血清、酪蛋白等，和

-脂质，例如但不限于：DPPC、DSPC等。

然而，与家禽疫苗接种领域已知的其它类型兽医学可接受载体相比，出乎意料地发现还原糖或非还原糖与生物相容聚合物的组合对于疫苗稳定性和以粉末形式直接雾化有优秀的作用。因此，优选用这种组合构成本发明干粉组合物中存在的载体的基本部分。在具体的情况中，宜用上文所述的其它类型载体，例如但不限于多元醇、脂质、蛋白质等补充该特定的载体组合。

在本发明干粉组合物中，与还原糖相比载体优先采用非还原糖。利用它们的混合物也可实现这种优先性，所述混合物中非还原糖的比例占优。

这些一种或多种优选的兽医学可接受载体可以单独使用，或优选以任何适当的比例联用，从而优化粉末特性。例如，合适的稳定性载体在干燥后易变成无定形，和/或用作替代水的物质和/或通过包裹作用而保护(核心)物质，这些性能有利于保留干粉组合物中所含微生物(例如，病毒)的原始结构，并促进粉末随时间的稳定性。

可适当地选择常规活疫苗、减毒疫苗和灭活疫苗以及重组、亚单位、肽和DNA疫苗作为本发明兽医疫苗接种(优选家禽疫苗接种)用粉末组合物的兽医疫苗接种活性物质。

可通过任何已知的常规方法获得可适当掺入本发明兽医疫苗接种用粉末组合物，特别是用于经吸入的家禽疫苗接种用干粉组合物中的疫苗物质，例如减毒病毒。简言之，可用相关病毒接种易感物(susceptible substrate)并增殖直至该病毒复制达到所需浓度，然后收集含病毒的物质。能维持病毒复制的任何基料均适合用于实施本发明，包括原代(禽类)细胞培养物，例如鸡胚成纤维细胞(CEF)或鸡肾细胞(CK)，或哺乳动物细胞系，例如VERO细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。优选在无特定病原体(SPF)鸡胚中增殖病毒。

更具体地说，可用于繁殖相关病毒的合适基料是SPF含胚卵。每个含胚卵可接种，例如0.2ml含NDV的尿囊液，所述尿囊液包含至少10²胚感染剂量₅₀(本文缩写为EID₅₀)。优选用约10⁵EID₅₀接种9-12日龄的含胚卵，然后在37℃培育2-4天，随后优选通过收集尿囊液收集ND病毒产物。然后以2500g离心该液体约10分钟，再经滤膜(100μm)过滤上清液。

本发明还涉及产生上述兽医疫苗接种用粉末组合物，特别是经吸入的家禽疫苗接种用干粉组合物的方法，所述方法包括冻干包含以下混合物的水性制剂：有效量的兽医(优选家禽)疫苗接种活性物质和适当量(优选支持量)的用于所述兽医疫苗接种活性物质的一种或多种载体(优选还原糖或非还原糖和生物相容聚合物的组合)的混合物；然后研磨所述冻干步骤的直接产物从而提供干颗粒形式的所述粉末组合物，所述颗粒的平均粒径约2-30μm，粒径多分散性任选约1.1-4.0。后一参数的子范围如上所述。

在还有另一方面，本发明涉及制备上述兽医疫苗接种用干粉组合物，特别是经吸入的家禽疫苗接种用干粉组合物的方法，所述方法包括喷雾干燥包含以下混合物的液相：有效量的兽医疫苗和支持量的用于所述兽医疫苗的一种或多种载体(优选还原糖或非还原糖和生物相容聚合物的组合)的混合物；从而提供干颗粒形式的所述粉末组合物，所述颗粒的平均粒径约2-30μm，粒径多分散性任选约1.1-4.0。温度，即下述约30-170℃，或甚至高达190℃的入口温度可影响本发明的制备方法(优选喷雾干燥)。技术人员知道，根据喷雾干燥设备的类型和采用的加料速度，喷雾干燥装置的入口和出口处的喷雾干燥温度极为不同。喷雾干燥温度不是本发明该方面的限制性特征，常规温度范围是约40℃-约160℃。本发明该方面所用的喷雾干燥设备不是本发明的关键特征，该设备可以是本领域任何类型的市售可得或标准的设备。

根据其平均粒径和/或粒径多分散性特征，本发明的兽医疫苗接种干粉组合物可为鸟类吸入，因此可有效用于家禽，例如任何类型的鸡类家禽的预防性或治疗性免疫接种，合适的给药途径包括但不限于：在所述家禽上方雾化干粉疫苗接种组合物。

在另一方面，本发明提供用于家禽疫苗接种的干粉组合物，该组合物适合纳入在家禽上方直接雾化的系统而无需重建成研磨溶液，从而能避免疫苗浓度损失和颗粒凝聚。本发明的该方面不限于本发明上述诸方面的干粉组合物，还可用于家禽疫苗接种的任何干粉组合物，但对于避免疫苗浓度损失和颗粒凝聚却具有相同的有益作用。

本发明的另一方面涉及包含上述用于兽医疫苗接种，优选家禽疫苗接种的干粉组合物的疫苗接种系统，例如雾化设备。更具体地说，本发明涉及通过吸入在家禽中实施疫苗接种的系统，该系统包括：

-装有干粉疫苗接种组合物的小室，所述组合物包含有效量的一种或多种家禽疫苗和支持量的一种或多种用于所述家禽疫苗的载体，所述干粉组合物采取平均粒径为2-30μm和粒径多分散性为1.1-4.0的颗粒形式，和

-将所述干粉疫苗接种组合物在所述家禽上方雾化的装置。

该设备优选包括将所述干粉组合物与气体一起向家禽喷出的装置。所述气体优选空气。就优选实施本发明而言，无需利用被鸟类吸入后可能导致呼吸道问题的特殊推进剂气体。

本发明还有另一方面涉及在家禽中实施疫苗接种的方法，所述方法包括将干粉组合物，例如所述组合物在家禽上方雾化。如果该疫苗接种步骤是在2-3周龄以下家禽中的初次疫苗接种(初免)，所述干粉组合物优选采取平均粒径为约10-30μm，更优选约15-25μm，或甚至更优选约20μm的颗粒形式。如果该疫苗接种是在2-3周龄以上家禽中的次级疫苗接种(加强免疫)，所述干粉组合物优选采取平均粒径为约3-9μm，更优选约5μm的颗粒形式。

本文所用的“兽医(特别是家禽)疫苗接种组合物”指含有至少一种蛋白质或其片段的组合物，将有效量的该组合物给予动物，特别是鸟类后能引起保护所述动物免患疾病的免疫应答。就在本发明疫苗接种组合物中的应用而言，兽医活性物质可适当地包含活的减毒微生物、灭活或重组微生物，例如但不限于：病毒、细菌、支原体或衣原体(chlamydophyla)。

特别适合的疫苗是，例如来自以下微生物的活的、减毒的或灭活的微生物和重组、亚单位、肽和DNA疫苗：

-病毒，例如但不限于，副粘病毒科(例如，新城疫病毒、肺炎病毒)、正粘病毒科(例如，流感病毒)、冠状病毒科(例如，传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、火鸡环曲病毒)、小RNA病毒科(例如，禽脑脊髓炎病毒、鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒)、呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒)、双RNA病毒科(例如，传染性粘液囊病病毒)、逆转录病毒科(例如，禽类白细胞增生/肉瘤病毒)、星状病毒科、细小病毒科(例如，鹅细小病毒)、腺病毒科、疱疹病毒科(例如，禽传染性喉气管炎病毒、马雷克病病毒)、痘病毒科、肝DNA病毒科(例如，鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒)、环病毒科、乳多空病毒科(例如，鹅出血性多瘤病毒(Goose Hemorrhagic Polyomavirus))、杯状病毒科、披膜病毒科、动脉炎病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、纤丝病毒科、沙粒病毒科，

-细菌，例如但不限于，沙门菌属、弯曲杆菌属、大肠杆菌、巴斯德菌属(禽霍乱)、鸭瘟立默菌(Rimerella anatipestifer)、鼻腔鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、副鸡嗜血菌(Hemophilusparagallinarum)、鸟博德特菌(Bordetella avium)(火鸡鼻炎)、支原体(特别是鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum))、梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌、链球菌、肠球菌、螺旋体、分枝杆菌和衣原体(Chlamydophila)(鹦鹉热、鸟疫)，

-真菌，例如但不限于，曲霉等，和

-寄生虫，例如但不限于，线虫、棘头虫、球虫、隐孢子虫和螺壳鞭毛虫。

以下新城疫病毒株可用于说明本发明特别有用的实施方式：

-低毒疫苗，例如但不限于：Hitchner-B₁、La Sota、Clone30、V4、NDW、I2和F，和

-中强毒疫苗，例如但不限于Roakin、Lukteswar和Komarov。

以下禽流感毒株可用于说明本发明另一种特别有用的实施方式：H5N1亚洲株。

按照本发明，家禽通过吸入本发明的干粉组合物而得到免疫。例如，鸡与具有所选平均粒径和/或所选载体组合和/或任选具有所选粒径多分散性的干粉组合物粉尘接触。免疫力的持续时间取决于所选的疫苗接种程序。影响疫苗接种程序的最重要因素是幼鸡中母体免疫力的水平，该水平在农场之间、批次之间以及每只鸡之间极为不同。鉴于该原因，可采用以下一种或多种方案。通过应用粗喷雾，鸟类要么在大部分易感的2-4周龄作疫苗接种，要么在1-日龄作疫苗接种。然后在3-4周后再次进行疫苗接种。

喷雾干燥能直接递送平均粒径合适和/或粒径多分散性合适的可分散干粉颗粒，而无需在喷雾干燥步骤后研磨它们。在此工艺中，液体病毒悬液通过在热的干燥气体介质，例如但不限于空气中雾化而快速转化成平均粒径合适且平均分布合适的干燥颗粒形式。在几秒中时间内即可形成气-水界面区域，水快速蒸发进而完成干燥。在干燥的早期阶段期间，液滴表面维持100％的相对湿度，表面温度维持于显著低于热空气温度的湿球温度。病毒自身不会接触高温，因而造成得到的粉末制剂具有所需稳定性。当水蒸发时，含病毒的固体颗粒周围的空气早已因摄取水分而冷却。利用稳定不稳定物质常规使用的载体还可避免病毒变性，所述载体例如优选还原糖或非还原糖和生物相容聚合物，以及任选的多元醇、蛋白质或脂质的组合，或它们任何比例的混合物，如上所述。

技术人员熟知除非提供专门和常规的昂贵生产和/或保存条件，否则不易实现粉末组合物的完全干燥或者不易长时间维持。因此，本文所用的术语“干燥”不指完全不含水分的严格条件。如果适当地执行所有标准工业注意事项并采用市售可得的设备，上述喷雾干燥和冻干制备方法在生产时能可再现地获得含水量不超过约4重量％，优选不超过约3重量％，更优选不超过约2重量％的粉末组合物。对于将所述粉末组合物纳入本发明疫苗接种系统和实施本发明疫苗接种方法而言，粉末疫苗接种组合物中这种水平的残留水分含量完全可以接受。如果在实际使用前常规保存(即，在保存时避免过高的温度和/或过高的湿度)，这种干粉疫苗接种组合物的含水量不会随时间显著增加，特别是在保存12周后不会超过约6重量％。

本发明的兽医疫苗粉末组合物的给药剂量一般是每只动物约10³-10⁸EID₅₀，优选剂量范围是约10⁵-10⁷EID₅₀。

以下实施例描述了本发明的具体实施方式，但本发明不限于这些实施例而受权利要求的限制。

实施例1-通过喷雾干燥制备干粉疫苗接种组合物

利用Mobile Minor喷雾干燥仪将含有4重量％海藻糖和1重量％聚乙烯吡咯烷酮作为载体以及新城疫病毒(每克固体2.10¹² E1D₅₀)的水溶液喷雾干燥。在1巴的雾化气压下操作1mm双流喷嘴。入口温度设置为160℃，进料速度为26ml/分钟，从而获得出口温度为70℃。

评估所得粉末的以下参数：

-采用卡尔费歇尔滴定(Karl Fischer titration)评估含水量和水吸收，

-采用差分扫描量热法评估热动力学特性，和

-采用激光散射评估粒径分布(参见图1)，所用的设备是马尔文公司的Mastersizer S长台型设备(Mastersizer S long bench version，Malvern)。制备后所得粉末的即时含水量是3.1重量％，22℃和42％相对湿度下，在用含二氧化硅的塞子封闭的玻璃小瓶中保存一周后含水量增加至5.9重量％。所得物质是玻璃化温度为65℃的完全无定形物质。如图1所示，所述干粉的粒径多分散性(如上文所述)是1.8，平均粒径是6μm。

干燥后立即将等份粉末接种在SPF鸡蛋中，培育后采用血凝集检验测定尿囊液中的病毒含量。这显示每克喷雾干燥粉末可保留2.10¹¹ E1D₅₀。

实施例2-比较评估细干粉疫苗和液体疫苗雾化后空气中的病毒浓度

根据本发明，利用装有1mm双流喷嘴的便携式小型中试干燥仪(Mobile Minor pilot plant dryer)(入口温度160℃，出口温度70℃，进料速度25ml/分钟，干燥气体流速80kg/小时，雾化气压2巴)从水溶液制备含水量为3.8重量％，粒径适于家禽次级疫苗接种(即，用于沉积在下气道中)的疫苗细干粉。进行喷雾干燥的进料溶液含有蒸馏水配制的3％(w/w)海藻糖二水合物、1％(w/w)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1％(w/w)牛血清白蛋白(BSA)，每ml进料溶液中加入10⁷EID₅₀ Clone 30疫苗病毒。

出于比较目的，用5ml蒸馏水重建市售的Clone 30疫苗，将其中的30μl再稀释至5ml，以实验性应用细微二级气溶胶疫苗常用的沃茨尔中试I型喷雾头(Walther Pilot Ispray-head)将其雾化。

通过激光衍射检测本发明干粉疫苗的粒径分布和雾化的比较液体疫苗的液滴大小分布(喷嘴水平)。结果示于图2，其中曲线(1)涉及本发明的海藻糖-PVP-BSA细干粉疫苗，曲线(2)涉及比较性细微液体气溶胶。本发明干粉疫苗接种组合物的粒径多分散性是2.0，其平均粒径是7μm。比较性液体气溶胶的平均液滴大小是24μm。

在1.3m³分离室(28℃和40％RH)中雾化1g粉末疫苗和5ml稀释的液体疫苗，雾化后立即用明胶滤膜收集空气样品以评估空气中的病毒浓度(在10-提领的含胚卵中培育，然后进行血凝集试验)。

结果示于图3，其中术语“雾化的病毒剂量”表示如果没有病毒因沉积而从空气中消失或因雾化过程而灭活时病毒的理论剂量，其中列(1)涉及海藻糖-PVP-BSA细干粉疫苗，列(2)涉及雾化的比较性细微液体疫苗。这些结果显示雾化后粉末疫苗立即在空气中获得高病毒浓度，该浓度只比理论雾化浓度略低(从10^6.5降低至10^6.1)。然而，雾化后细微液体疫苗的病毒滴度因在上述气候条件(climatic condition)下疫苗液滴蒸发而降低很多(从10^7.4降低至10^3.4以下)。

实施例3-用平均粒径为7μm的干粉疫苗接种组合物免疫鸡

将实施例2制备和表征的疫苗接种细干粉给予4周龄无特定病原体的雏鸡(即无NCD抗体)，这些雏鸡安置在体积为1.3m³的分离室内。一组接受细干粉疫苗，一组用作未接种疫苗的空白对照。

接种疫苗两周和四周后，采集血样，通过血凝抑制(HI)试验评估抗NCD病毒的抗体。结果示于图4，其中列(1)涉及海藻糖-PVP-BSA细粉末。接种疫苗后2周时，本发明的干粉组合物导致充分的免疫应答，其HI滴度高于通常单次应用低毒NCD疫苗所获得的HI滴度2⁴-2⁶。通过重复检测ANOVA设计的统计学分析显示接种疫苗后2-4周滴度明显升高。

实施例4-用粗干粉疫苗接种组合物免疫鸡

如实施例2所示，从相同的进料水溶液制备含水量为3.3重量％和粒径适合于初次疫苗接种(即，用于沉积在上气道中)的疫苗接种粗干粉，但利用装有30μm压力驱动(piezo-actuated)喷嘴(入口温度90℃，出口温度70℃，进料速度30ml/分钟，干燥气体流速25kg/小时，液滴产生频率50kHz)的喷雾干燥仪。

采用与实施例2(激光衍射)相同的方法和设备评估粒径分布，结果示于图2，其中曲线(3)涉及海藻糖-PVP-BSA粗干粉疫苗。粒径多分散性是1.2，平均粒径是29μm。

将疫苗给予4周龄无特定病原体的雏鸡(即，无NCD抗体)，这些雏鸡安置在体积为1.3m³的分离室内。一组接受粗干粉疫苗，一组用作未接种疫苗的空白对照。

接种疫苗两周和四周后，采集血样，通过血凝抑制(HI)试验评估抗NCD病毒的抗体。结果示于图4，其中列(3)涉及海藻糖-PVP-BSA粗粉末。接种疫苗后2周时，本发明的干粉组合物导致充分的免疫应答，其HI滴度落入通常单次应用低毒NCD疫苗所获得的HI滴度范围2⁴-2⁶。通过重复检测ANOVA设计的统计学分析显示接种疫苗后2-4周滴度明显升高。与实施例3的海藻糖-PVP-BSA细粉末相比，明显较低的免疫应答与疫苗的沉积部位不同(即，粗粉末沉积在上气道，而细粉末沉积在下气道)有关。

Claims (25)

1.一种通过吸入用于家禽疫苗接种的干粉组合物，所述组合物含有有效量的家禽疫苗物质和支持量的用于所述家禽疫苗物质的载体，所述载体包含还原糖或非还原糖和生物相容聚合物的组合，所述干粉组合物采取平均粒径2-30μm和粒径多分散性1.1-4.0的颗粒形式。

2.如权利要求1所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述疫苗物质选自：病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的诸部分。

3.如权利要求2所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述病毒选自：副粘病毒科、新城疫病毒、肺炎病毒、正粘病毒科、流感病毒、冠状病毒科、传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、火鸡环曲病毒、小RNA病毒科、禽脑脊髓炎病毒、鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒、呼肠孤病毒科、轮状病毒、双RNA病毒科、传染性粘液囊病病毒、逆转录病毒科、禽类白细胞增生/肉瘤病毒、星状病毒科、细小病毒科、鹅细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科、禽传染性喉气管炎病毒、马雷克病病毒、痘病毒科、肝DNA病毒科、鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒、环病毒科、乳多空病毒科、鹅出血性多瘤病毒、杯状病毒科、披膜病毒科、动脉炎病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、纤丝病毒科、沙粒病毒科。

4.如权利要求1-3中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，以所述干粉组合物的重量计，所述载体所占比例是90％-99.999％。

5.如权利要求1-4中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述干粉采取平均粒径10-30μm的颗粒形式。

6.如权利要求1-4中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述干粉组合物采取平均粒径3-9μm的颗粒形式。

7.如权利要求1-6中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述还原糖选自：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、核糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖或它们的混合物。

8.如权利要求1-6中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述非还原糖选自：海藻糖、蔗糖或它们的混合物。

9.如权利要求1-8中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述生物相容聚合物选自：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖、化学改性的葡聚糖、脂族聚酯、聚丙烯酸、角叉聚糖、脱乙酰壳多糖、纤维素衍生物、菊粉、麦芽糖糊精、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、淀粉或它们的混合物。

10.如权利要求1-9中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述载体组合中所述生物相容聚合物与所述还原糖或非还原糖的重量比是1/1到1/8。

11.如权利要求1-10中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，所述载体还包含一种或多种蛋白质和/或多元醇。

12.如权利要求1-11中任一项所述用于家禽疫苗接种的干粉组合物，其特征在于，制备时所述干粉组合物的含水量不超过约4重量％。

13.一种制备干粉疫苗接种组合物的方法，所述方法包括喷雾干燥包含疫苗物质、液体载体和支持量的固体载体的混合物的液相，从而提供平均粒径为2-30μm的颗粒形式的所述干粉疫苗接种组合物，所述固体载体包含还原糖或非还原糖和生物相容聚合物的组合。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述疫苗物质选自：病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的诸部分。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒选自：副粘病毒科、新城疫病毒、肺炎病毒、正粘病毒科、流感病毒、冠状病毒科、传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、火鸡环曲病毒、小RNA病毒科、禽脑脊髓炎病毒、鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒、呼肠孤病毒科、轮状病毒、双RNA病毒科、传染性粘液囊病病毒、逆转录病毒科、禽类白细胞增生/肉瘤病毒、星状病毒科、细小病毒科、鹅细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科、禽传染性喉气管炎病毒、马雷克病病毒、痘病毒科、肝DNA病毒科、鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒、环病毒科、乳多空病毒科、鹅出血性多瘤病毒、杯状病毒科、披膜病毒科、动脉炎病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、纤丝病毒科、沙粒病毒科。

16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其特征在于，喷雾干燥在入口温度范围是30℃-190℃下进行。

17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其特征在于，用适合于提供粒径多分散性为1.1-4.0的干粉组合物的喷雾干燥设备进行喷雾干燥。

18.一种通过吸入在家禽中实施疫苗接种的系统，该系统包括：

-装有干粉疫苗接种组合物的小室，所述组合物包含有效量的家禽疫苗和支持量的一种或多种用于所述家禽疫苗的载体，所述家禽疫苗含有疫苗物质，所述干粉组合物采取平均粒径为2-30μm和粒径多分散性为1.1-4.0的颗粒形式，和

-将所述干粉疫苗接种组合物在所述家禽上方雾化的装置。

19.如权利要求18所述用于在家禽中进行疫苗接种的系统，其特征在于，所述疫苗物质选自：病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的诸部分。

20.如权利要求19所述在家禽中实施疫苗接种的系统，其特征在于，所述病毒选自：副粘病毒科、新城疫病毒、肺炎病毒、正粘病毒科、流感病毒、冠状病毒科、传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、火鸡环曲病毒、小RNA病毒科、禽脑脊髓炎病毒、鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒、呼肠孤病毒科、轮状病毒、双RNA病毒科、传染性粘液囊病病毒、逆转录病毒科、禽类白细胞增生/肉瘤病毒、星状病毒科、细小病毒科、鹅细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科、禽传染性喉气管炎病毒、马雷克病病毒、痘病毒科、肝DNA病毒科、鸭肝炎病毒、火鸡肝炎病毒、环病毒科、乳多空病毒科、鹅出血性多瘤病毒、杯状病毒科、披膜病毒科、动脉炎病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、纤丝病毒科、沙粒病毒科。

21.如权利要求18-20中任一项所述在家禽中进行疫苗接种的系统，其特征在于，所述干粉组合物的含水量不超过约4重量％。

22.如权利要求18-21中任一项所述在家禽中进行疫苗接种的系统，其特征在于，所述一种或多种载体选自：还原糖、非还原糖、生物相容聚合物、蛋白质或多元醇。

23.如权利要求18-22中任一项所述在家禽中进行疫苗接种的系统，其特征在于，所述一种或多种载体包含还原糖或非还原糖和生物相容聚合物的组合。

24.如权利要求23所述在家禽中进行疫苗接种的系统，其特征在于，所述组合中所述生物相容聚合物与所述还原糖或非还原糖的重量比是1/1到1/8。

25.如权利要求18-24中任一项所述在家禽中进行疫苗接种的系统，其特征在于，以所述干粉组合物的重量计，所述一种或多种载体所占比例是90％-99.999％。

Images