CN101413008A - 地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法，该基因由811个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中1－672位核苷酸是地鳖虫纤溶酶基因成熟肽序列，编码224个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明的基因是通过先mRNA反转录得到cDNA，PCR扩增得到基因5’端序列，然后用3’RACE的方法获得基因的3’端序列，最后将5’端序列和3’端序列拼接即得地鳖虫纤溶酶基因。本发明的基因序列扩充了纤溶酶基因的基因库，同时根据本发明的核苷酸序列，通过基因工程的方法大量获得纤溶酶蛋白，应用于抑制血栓形成和溶解血栓方面，具有可观的医用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法。
背景技术
地鳖虫Eupolyphage sinensis Walker，又名土元、土鳖，属节肢动物门昆虫纲蜚蠊科动物，是传统的活血化瘀类动物药。医学记载和丰富的临床实践均早已证明其具有破血逐瘀、续筋接骨、消炎散结、舒经活血和疗伤止痛等重要药用功效。现代药理学试验也充分证明地鳖虫具有溶解脉血栓，抑制血小板聚集，抗凝血等药用疗效。
通过对地鳖虫研究发现，其体内含有多种纤溶酶成分。纤溶酶具有溶解纤溶蛋白的作用，在抑制血栓形成和溶解血栓的过程中起重要作用，具有可观的医用前景。
现在国内外对地鳖虫体内的纤溶酶成分多是通过分离纯化等技术获得，然而从生物体内分离纯化纤溶酶的过程非常繁琐，而且生物体来源的蛋白质也容易在纯化过程中失活，因此不能大量获得纤溶酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种地鳖虫纤溶酶基因。
本发明的进一步目的在于提供上述地鳖虫纤溶酶基因的制备方法。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一种地鳖虫纤溶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，由811个核苷酸组成，其中1—672位核苷酸是地鳖虫纤溶酶基因成熟肽序列，编码224个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，673—675位核苷酸是终止子序列TAA。
上述地鳖虫纤溶酶基因的制备方法为：
(1)提取地鳖虫总RNA，mRNA反转录得到cDNA；
(2)以上述cDNA为模板，PCR扩增得到本发明地鳖虫纤溶酶基因的5’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
(3)根据上述已得到的5’端序列设计引物，用3’RACE的方法获得本发明地鳖虫纤溶酶基因的3’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
(4)将步骤(2)得到的5’端序列和步骤(3)得到的3’端序列拼接即得完整的地鳖虫纤溶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述步骤(2)中，首先是以mRNA反转录得到cDNA为模板，根据来源于不同物种的纤溶酶所获得的同源氨基酸序列设计简并引物(其序列如SEQID NO：7和SEQ ID NO：8所示)，PCR扩增得到一个基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，然后根据这个基因片段设计下游引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)，同时根据同源序列设计的地鳖虫纤溶酶基因成熟肽N端引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)，PCR扩增得到本发明目的基因的5’序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
上述步骤(3)中，3’RACE的方法是本领域技术人员通用的方法，3’RACE时所用到的引物，一条是根据参考文献设计的接头引物，其核苷酸序列如SEQID NO：11所示，另一条引物是根据上述得到的5’序列设计的，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
上述步骤(1)中的总RNA提取，以及mRNA反转录，其实验步骤都是采用本领域技术人员通用的常规做法。
上述步骤(4)中所述的将5’端序列和3’端序列拼接的实验方法也是本领域技术人员通用的常规做法。
步骤(4)中，将5’端序列和3’端序列拼接后，进行T载体连接、转染感受态细胞、菌液PCR鉴定和酶切鉴定等本领域常规实验后，将重组质粒的菌株送去测试，测试所得核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，进行同源比较后，确定所得核苷酸序列为地鳖虫纤溶酶基因。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明从地鳖虫体内获得了完整的纤溶酶基因序列及其部分编码氨基酸序列，这极大地扩充了纤溶酶基因的基因库；
2、本发明得到的地鳖虫纤溶酶基因序列，可以通过基因工程的方法大量获得纤溶酶蛋白，应用于抑制血栓形成和溶解血栓方面，具有可观的医用价值。
具体实施方式
实施例1 土鳖虫总RNA提取
取活健壮雌土鳖虫一只，0.1体积％的焦磷酸二乙酯(DEPC)溶液清洗，用无RNA酶的剪刀剖开腹部，剪取土鳖虫消化腔及中肠肌肉约30mg，加1.2ml冰冷Trizol溶液(分两次加入)充分研磨，将匀浆液放入1.5ml Eppendorf离心管中，冰浴放置5min使其充分裂解。4℃，12000rpm离心5min，取上清，加入0.2ml氯仿，振荡20sec后冰浴放置10min。4℃，12000rpm离心15min，小心吸取上层水相，至另一离心管中。每管加入0.5ml异丙醇混匀，冰浴放置10min。4℃，12000rpm离心15min，弃上清。沉淀用1ml 75％乙醇洗涤一次，超净台中晾干，加30μl RNase-free水溶解即得RNA样品。
实施例2 mRNA的反转录
20μl的反转录反应体系，含1μg实施例1制备得到的总RNA，2.0μgoligo(dT)18，无RNA酶双蒸水补至11μl，70℃加热5min后冰浴10min，再加入5×buffer(250mmol/LTris-HCl，250mmol/LKCl，20mmol几MgCl2，50mmol/L二硫苏糖醇DTT)4μl，10mmol/L dNTP mix 2μl，无RNA酶双蒸水补至19μl，37℃保温5min，再加入M-MuLV反转录酶1μl(200U)，42℃保温1h，70℃加热10min终止反转录反应，冰浴冷却后放入-20℃冰箱保存。
实施例3 EFE-1片段的获得
1)EFE-1片段引物的设计
参考NCBI上已发表的蚯蚓纤溶酶和蜈蚣纤溶酶激酶的序列，用Clustal 1.8软件分析序列间的保守区段，辅助Primer Premier 5软件设计一对简并引物：
上游引物：5’-CTN ACY GCW GCY CAY TG-3’，SEQ ID NO：7，简并度64，编码氨基酸序列LTAAHC；
下游引物：5’-CC NCC NGA RTC WCC CT-3’，SEQ ID NO：8，简并度64，编码氨基酸序列QGDSGG；
其中R＝A+G Y＝T+C W＝A+T N＝A+T+G+C。
2)EFE-1片段的PCR扩增
PCR扩增采用25ul反应体系：
实施例2得到的反转录产物1ul；
1×Ruffer(0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl，pH8.4)；
MgCl2 2.0mmol/L；
dNTPs 0.2mmol/L；
上游引物：1μmol/L；
下游引物：1μmol/L；
TaqDNA聚合酶1.5U。
PCR扩增反应条件：反应前先95℃变性2min，每个循环包括94℃变性1min，51℃复性1.5min，72℃延伸2min，共35个循环，最后一次循环结束时72℃延伸5min。
3)EFE-1片段的回收
参考UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工)的使用说明书进行，①PCR产物电泳后，在紫外灯下用洁净的手术刀割下含需回收DNA琼脂块；②按每400μl/100mg琼脂糖凝胶比例加入Binding Buffer，置50～60℃水浴10min，使胶彻底融化(每2min混匀一次)；③将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的UNIQ—10柱中，室温放置2min，8000rpm室温下离心1min；④取下UNIQ—10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ—10柱放入同一个收集管中，加入500μl Wash Solution，8000rpm室温离心1min。重复一次；⑤取下UNIQ—10柱，倒掉收集管中废液，将UNIQ—10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心20sec；将UNIQ—10柱放入一新1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer，室温放置3min；12000rpm室温离心1min，离心管中液体即为回收的DNA片段。
4)EFE-1片段的测序
EFE-1片段经UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒回收后，克隆至载体pUCm-T中，转化DH5α大肠杆菌，提取质粒酶切鉴定片段插入后，进行DNA测序，测序结果如SEQ ID NO：4所示。
实施例4 EFE-2片段的获得
1)EFE-2片段引物的设计
根据已获得的EFE-1片断序列，设计下游引物(SEQ ID NO：9)5’-CTC CCTGGC ATG CAT-3’，并参考NCBI上已发表的蚯蚓纤溶酶和蜈蚣纤溶酶激酶的序列，用Clustal 1.8软件分析序列间的保守区段，设计了地鳖虫纤溶酶基因成熟肽N端引物(SEQ ID NO：10所示)5’-ARRATY GTN GGW GGW-3’，简并度128，其中，R＝G+A，Y＝T+C，N＝A+T+G+C，W＝A+T。
2)EFE-2片段的PCR扩增
PCR扩增的总体系为25ul：
实施例2 制备得到的反转录产物1ul；
1×Buffer(0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl，pH8.4)；
MgCl2 2.0mmol/L；
dNTPs 0.2mmol/L；
下游引物：1μmol/L；
N端引物：1μmol/L；
TaqDNA聚合酶1.5U。
PCR扩增反应条件为：反应前先95℃变性2min，每个循环包括94℃变性1min，45℃复性1.5min，72℃延伸2min，共35个循环，最后一次循环结束时72℃延伸5min。
3)EFE-2片段的回收
同EFE-1。
4)EFE-2片段的测序
同EFE-1，测序结果如SEQ ID NO：5所示。
实施例5 用3’RACE的方法获得地鳖虫纤溶酶基因的3’序列(EFE-3片段)
1)EFE-3片段引物的设计
根据参考文献设计接头的接合体引物[d(T)16-adaptor]5′-CTG ATC TAGAGG TAC CGG ATC(T)16-3′，接头引物，SEQ ID NO：11，5′-CTG ATC TAGAGG TAC CGG ATC-3′；
根据实施例4所得EFE-2片段设计特异性引物，SEQ ID NO：12，5′-ACAAG TTATC CGTCA TGCCA GC-3′。
2)mRNA的反转录
以接头的接合体引物[d(T)16-adaptor]对土鳖的总RNA进行反转录，反转录条件与实施例2相同。
3)EFE-3片段的3’RACE扩增
3’RACE扩增25ul反应体系：
上述步骤(2)得到的反转录产物1ul，
1×Buffer(0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl，pH8.4)；
MgCl2 2.0mmol/L；
dNTPs 0.2mmol/L；
接头引物：1μmol/L；
特异性引物：1μmol/L，
TaqDNA聚合酶1.5U。
3’RACE扩增反应条件为：反应前先95℃变性2min，每个循环包括94℃变性1min，61℃复性50s，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后一次循环结束时72℃延伸5min。
4)EFE-3片段扩增产物的回收
同EFE-1。
5)EFE-3片段的测序
同EFE-1，测序结果如SEQ ID NO：6所示。
实施例6 地鳖虫纤溶酶基因全长序列的获得
将EFE-2片段的序列与EFE-3片段的序列进行拼接，即得地鳖虫纤溶酶基因全长序列，如SEQ ID NO：1所示。
将SEQ ID NO：1所示序列进行同源性比对，证明所得序列确实为纤溶酶基因序列。
该基因序列长度为811bp，单链，直链状(拓扑学)；
该基因成熟肽序列为1-672位核苷酸，编码224个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
该基因的终止子密码位于基因673-675位，终止密码为TAA；
该基因的676-811位核苷酸为3’末端非编码序列。
地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110>广东工业大学
<120>地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法
<130>
<160>12
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>811
<212>DNA
<213>地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)
<400>1
<210>2
<211>811
<212>DNA
<213>地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(672)
<400>2
<210>3
<211>224
<212>PRT
<213>地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)
<400>3
<210>4
<211>434
<212>DNA
<213>地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)
<400>4
<210>5
<211>532
<212>DNA
<213>地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)
<400>5
<210>6
<211>500
<212>DNA
<213>地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)
<400>6
<210>7
<211>17
<212>DNAA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n is a，c，g，or t
<400>7
<210>8
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>n is a，c，g，or t
<400>8
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
<210>10
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n is a，c，g，or t
<400>10
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
Claims (5)
1、一种地鳖虫纤溶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2、根据权利要求1所述地鳖虫纤溶酶基因，其特征在于所述核苷酸序列中的1—672位核苷酸是地鳖虫纤溶酶基因成熟肽序列，编码224个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，673—675位核苷酸是终止子序列TAA。
3、一种权利要求1所述地鳖虫纤溶酶基因的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)提取地鳖虫总RNA，mRNA反转录得到cDNA；
(2)以上述cDNA为模板，PCR扩增得到地鳖虫纤溶酶基因5’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
(3)根据上述已得到的5’端序列设计引物，用3’RACE的方法获得地鳖虫纤溶酶基因的3’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
(4)将步骤(2)得到的5’端序列和步骤(3)得到的3’端序列拼接即得地鳖虫纤溶酶基因。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中PCR扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
5、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中3’RACE所用引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008102194078A CN101413008A (zh) | 2008-11-25 | 2008-11-25 | 地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CNA2008102194078A CN101413008A (zh) | 2008-11-25 | 2008-11-25 | 地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101413008A true CN101413008A (zh) | 2009-04-22 |
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ID=40593747
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CNA2008102194078A Pending CN101413008A (zh) | 2008-11-25 | 2008-11-25 | 地鳖虫纤溶酶基因及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101413008A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102199584A (zh) * | 2011-03-07 | 2011-09-28 | 中国科学院昆明动物研究所 | 地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1及其基因和应用 |
| CN101693888B (zh) * | 2009-10-16 | 2011-11-09 | 广东工业大学 | 一种黄粉虫纤溶酶及其制备方法与应用 |
| CN110616151A (zh) * | 2019-09-18 | 2019-12-27 | 华中农业大学 | 一种分离的冬虫夏草菌及其在生产纤溶酶中的应用 |
-
2008
- 2008-11-25 CN CNA2008102194078A patent/CN101413008A/zh active Pending
Cited By (4)
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| CN110616151A (zh) * | 2019-09-18 | 2019-12-27 | 华中农业大学 | 一种分离的冬虫夏草菌及其在生产纤溶酶中的应用 |
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