CN101406458B

CN101406458B - 过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球

Info

Publication number: CN101406458B
Application number: CN2008100514527A
Authority: CN
Inventors: 汤钧; 林航; 王敏楠; 栗磊; 李惟; 王丽萍; 赵晓亮; 任辉
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2028-11-21
Also published as: CN101406458A

Abstract

本发明涉及一种过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球。所采用的包覆材料为聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸，所采用的过氧化物酶模拟物为亚血红素六肽或亚红素六肽的聚乙二醇偶联物。其是将聚酯充分溶解于二氯甲烷中，在高速搅拌下，将过氧化物酶模拟物的明胶溶液注入到二氯甲烷溶液中，均匀分散，形成W/O的初乳液，将该初乳液在搅拌下注入聚乙烯醇的水溶液中，经乳化形成W/O/W乳液，搅拌至二氯甲烷全部挥发，使微球固化后冻干。本发明制备的过氧化物酶模拟物载药微球，包封率达到90％以上，载药量为0.5％～13％(质量)，而且微球表面光滑，不粘连，微球尺寸为10～35μm，直径分布均匀，并具有显著的缓释作用。

Description

过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球

技术领域

本发明涉及一种过氧化物酶模拟物的载药微球，特别是涉及一种可生物降解的聚酯包裹的过氧化物酶模拟物的载药微球。

背景技术

亚血素六肽(Deuterohemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys，DhHP-6)是以微酶和天然抗坏血酸过氧化物酶结构为依据，设计的一种含亚血红素的短肽模拟酶，(中国专利：02144902.3，授权公告号CN1199986C)是一种较好的过氧化物酶模拟物。该短肽模拟酶分子量小于3000，可发展成高效的抗氧化药物。但是，其生物利用率低，易受蛋白酶降解。

聚乙二醇(PEG)是一种亲水性、生物相容性好的无毒聚合物，其结构通式为H(OCH₂CH)nOH，其中50≥n≥4，其分子量为200至20000道尔顿不等。经PEG化学偶联修饰的DhHP-6能够有效的提高其生物利用率，延长其在生物体内的半衰期。随着PEG-DhHP-6偶联物中PEG分子量的增加，PEG-DhHP-6半衰期可由几小时延长至几天。如果想进一步延长药物作用时间，则需要考虑进一步使用其它技术，如将药物制成缓释剂型。

乳化-溶剂挥发法因其设备要求低，操作方法简单等优点，被广泛用于药物缓释剂型的制备当中，目前国内外有大量相关专利及报道。其中使用较多的聚合物包括聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好的生物相容性和生物降解性的过氧化物酶模拟物聚酯载药微球，其是以聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)作为包覆材料，所载过氧化物酶模拟物以微区形式分布于整个微球之中，所制得的载药微球表面光滑，微球之间不粘连，直径分布均匀中，载药微球中过氧化物酶模拟物的包封率超过90％，载药量0.5％～13％(wt％)，载药微球的平均粒径为10～35μm。其中平均粒径通过测量扫描电镜照片中不同区域的100个微球的直径，通过计算求得。

本专利所述的生物可降解过氧化物酶模拟物载药微球，是以聚酯即聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸为包覆材料。过氧化物酶模拟物为亚血红素六肽DhHP-6或亚红素六肽的聚乙二醇偶联物PEG-DhHP-6，其结构如下，其制备方法详见中国专利：200810050307.7，公开号：CN101220084A。

其中R＝H或聚乙二醇(PEG)，聚乙二醇链的分子量为2000～20000。

作为优选的实施方式，上述生物可降解过氧化物酶模拟物聚酯载药微球所用的聚乳酸的分子量为5000～40000g/mol，所制得的载药微球中，过氧化物酶模拟物的包封率超过90％，载药量0.5％～13％(wt％)，载药微球的平均粒径为10～35μm，缓释时间20～60天；

所用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5000～40000g/mol，共聚物中乳酸占乳酸和羟基乙酸链段总摩尔数和的10～90％，所制得的载药微球中，过氧化物酶模拟物的包封率超过90％，载药量0.5％～13％(wt％)，载药微球的平均粒径为10～35μm，缓释时间16～48天；

更优选的实施方式中，共聚物中聚乳酸与羟基乙酸链段的摩尔比为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10；

最优选的实施方式中，共聚物中聚乳酸与羟基乙酸链段的摩尔比为为50∶50；

用于制备上面所述的生物可降过氧化物酶模拟物载药微球的方法，具体步骤如下：

a)以二氯甲烷为溶剂，将聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物充分溶解于二氯甲烷中，配制成100～500mg/ml的溶液；

b)将过氧化物酶模拟物固体粉末溶解于浓度为0.1～1g/ml的明胶溶液中，形成浓度为10～200mg/ml的过氧化物酶模拟物明胶溶液；

c)在12000～15000rpm的高速搅拌下，将步骤b所得到的过氧化物酶模拟物明胶溶液注入到步骤a所得到的聚合物溶液中，均匀分散，形成W/O的初乳液，过氧化物酶模拟物明胶溶液与聚合物溶液的体积比为1∶5～10；

d)将聚乙烯醇溶解于蒸馏水中，制成1～2.5wt％的聚乙烯醇水溶液；

e)将步骤c所得的W/O初乳液在2000～3000rpm的搅拌速度下，注入到步骤d所得的聚乙烯醇水溶液中，该水溶液与W/O初乳液的体积比为20～50∶10，经乳化形成W/O/W乳液，500～1000rpm下搅拌至二氯甲烷全部挥发，使微球固化形成微球悬浮液；将获得的微球悬浮液离心，收集，并用蒸馏水洗涤数次，经冻干后即可得到过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球。所得微球于冰箱内冷冻保存。

本发明的优点在于：

1.本发明所载药物过氧化物酶模拟物是一种水溶性生物药物，并采用明胶作为辅料，有利于提高载药微球的包封率。

2.可通过调节所用聚合物的分子量来控制载药微球的药物释放时间以及载药微球的粒径大小。

3.本发明方法采用水包油包水(W/O/W)乳化-溶剂挥发法，操作简单。

4.本发明所述的DhHP-6及PEG-DhHP-6的用途是用于制备抗氧化药物，抗衰老药物。

本发明制备的过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球，过氧化物酶模拟物的包封率超过90％，达到了《中华人民共和国药典》中对于微球缓释制剂中对药物包封率的要求。在保证一定的包封率的前提下，通过制备工艺的控制，制得了表面光滑的微球，且微球之间不粘连，微球尺寸为10～35μm，直径分布均匀，并具有显著的缓释作用。

附图说明

图1：DhHp-6的标准曲线；图中直线为对实验点进行线性拟合所得直线，拟合得到的直线方程为：Y＝0.07109+37.71505X，r＞0.999；

图2：PEG₅₀₀₀-DhHP-6的标准曲线；图中直线为对实验点进行线性拟合所得直线，拟合得到的直线方程为：Y＝0.06105+35.2413X，r＞0.999；

图3：PLA(5000)载PEG₅₀₀₀-6P微球(实施例3)的扫描电镜照片；图中所用扫描模式为LEI，标尺为10μm；

图4：DhHP-6在PLA(5000)微球中的体外缓释曲线；其缓释时间为20天，其中第一天释放了所载药量的约50％，其后开始匀速释放，最终累积释放量约90％

图5：DhHP-6在PLGA(2500-2500)微球中的体外缓释曲线；其缓释时间为17天，其中第一天释放了所载药量的约50％，其后开始匀速释放，最终累积释放量约90％

图6：PEG₅₀₀₀-DhHP-6在PLA(5000)微球中的体外缓释曲线；其缓释时间为31天，其中第一天释放了所载药量的约10％，其后开始匀速释放，最终累积释放量约98％

图7：PEG₅₀₀₀-DhHP-6在PLGA(2500-2500)微球中的体外缓释曲线；其缓释时间为21天，其中第一天释放了所载药量的约10％，其后开始匀速释放，最终累积释放量约98％

具体实施方式

本专利中所用聚乳酸，聚乳酸-羟基乙酸购自山东医疗器械研究所；

所用过氧化物酶模拟物DhHP-6由吉林大学生命科学学院提供(制备方法参见中国专利：02144902.3，授权公告号CN1199986C)，PEG-DhHP-6为本实验室合成，(其制备方法参见中国专利：200810050307.7，公开号：CN101220084A)。上述产品来源稳定，质量均一。

所用聚乙烯醇购自Aldrich；

扫描电镜照片使用岛津JSM-6700型扫描电子显微镜测量；

溶液吸光度使用UV2501PC型紫外可见光谱仪测量；

包封率和药物随时问累计释放量，分别根据用过氧化物酶模拟物粉末配制的标准溶液绘制的标准曲线算得(附图1，2)。

用于计算释药曲线的标准溶液的配制方式为：准确称取5mg过氧化物酶模拟物固体粉末，以pH＝7.4的磷酸缓冲液为溶剂。用容量瓶将过氧化物酶模拟物溶液准确定容至100ml，为标准溶液1，然后，将标准溶液1分别准确稀释至50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍，按顺序分别记为标准溶液2-6。用紫外可见光谱仪测标准溶液1-6的吸光度，绘制标准曲线(附图1，2)。

微球载药量及包封率的计算方法是，准确称取10mg载药微球，加5ml二氯甲烷振荡溶解微球，再加入10ml pH＝7.4的磷酸缓冲液振荡萃取，静置，待溶液分层后，取上层澄清溶液测吸光度，并根据标准曲线计算微球载药量。微球包封率＝(投入的药物总质量-微球载药量×得到微球的质量)/投入的药物总质量×100％。

绘制缓释曲线时，将制得的过氧化物酶模拟物载药微球分为若干份，每份10mg，分别置于透析袋中，加10ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，两端扎紧，放入90ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，每隔一定时间，将透析袋中微球取出，离心后，加5ml二氯甲烷振荡溶解微球，再加入10ml pH＝7.4的磷酸缓冲液振荡萃取，静置，待溶液分层后，取上层澄清溶液测吸光度，并跟据标准曲线计算释药量。累积释药百分率＝(微球载药量-微球中残留药品质量)/微球载药量X100％。至样品中过氧化物酶模拟物的浓度不再随着时间增加而增大时，认为释放完全。整个过程所持续的时间既为释放时间。

实施例1：

将PLA(5000g/mol)1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物溶液。将0.2g明胶加入1ml水中，加热溶解，向这一明胶溶液中，加入10mg DhHP-6，搅拌溶解。将得到的10mg/ml的DhHP-6明胶溶液注入到聚合物溶液中，在12000rpm高速搅拌下均匀分散，得到W/O的初乳液；搅拌下，将初乳液注入10ml含有1wt％PVA的水溶液中，乳化30min，形成W/O/W复乳液，500rpm旋转蒸发除去二氯甲烷，微球固化得到微球悬浮液，将获得的悬浮液离心，收集其中的微球并用蒸馏水洗涤数次后，冷冻干燥，得到过氧化物酶模拟物载药微球。根据图1，通过测量及计算得到，所制得的载药微球中，药物包封率为90％，载药量0.68％，微球平均粒径为12.7μm，释放时间为20天，如附图4所示。

实施例2：

将PLA(5000g/mol)1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物溶液。将0.2g明胶加入1ml水中，加热溶解，向这一明胶溶液中，加入50mg PEG₅₀₀₀-DhHP-6，PEG₅₀₀₀表示PEG的分子量为5000，搅拌溶解。将得到的50mg/ml的PEG₅₀₀₀-DhHP-6明胶溶液注入到聚合物溶液中，在高速搅拌下均匀分散，得到W/O的初乳液；搅拌下，将初乳液注入10ml含有1wt％PVA的水溶液中，乳化30min，形成W/O/W复乳液，旋转蒸发除去二氯甲烷，固化微球。将获得的悬浮液离心，收集其中的微球并用蒸馏水洗涤数次后，冷冻干燥，得到过氧化物酶模拟物载药微球。根据图1，通过测量及计算得到，所制得的载药微球中，药物包封率为91％，载药量2.71％，微球平均粒径为14.5μm。释放时间为31天(附图6)。

实施例3：

将PLGA(5000g/mol，2500-2500)1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物溶液。将0.2g明胶加入1ml水中，加热溶解，向这一明胶溶液中，加入10mg DhHP-6，搅拌溶解。将得到的10mg/ml的DhHP-6明胶溶液注入到聚合物溶液中，在高速搅拌下均匀分散，得到W/O的初乳液；搅拌下，将初乳液注入10ml含有1wt％PVA的水溶液中，乳化30min，形成W/ONV复乳液，旋转蒸发除去二氯甲烷，固化微球。将获得的悬浮液离心，收集其中的微球并用蒸馏水洗涤数次后，冷冻干燥，得到过氧化物酶模拟物载药微球。根据图1，通过测量及计算得到，所制得的载药微球中，药物包封率为90％，载药量0.52％，微球平均粒径为10.2μm。释放时间为16天(附图5)。

实施例4：

将PLGA(5000g/mol，2500-2500)1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物溶液。将0.2g明胶加入1ml水中，加热溶解，向这一明胶溶液中，加入50mgPEG₅₀₀₀-DhHP-6，搅拌溶解。将得到的50mg/ml的PEG₅₀₀₀-DhHP-6明胶溶液注入到聚合物溶液中，在高速搅拌下均匀分散，得到W/O的初乳液；搅拌下，将初乳液注入10ml含有1wt％PVA的水溶液中，乳化30min，形成W/O/W复乳液，旋转蒸发除去二氯甲烷，固化微球。将获得的悬浮液离心，收集其中的微球并用蒸馏水洗涤数次后，冷冻干燥，得到过氧化物酶模拟物载药微球。根据图1，通过测量及计算得到，所制得的载药微球中，药物包封率为94％，载药量2.88％，微球平均粒径为12.1μm。释放时间为21天(附图7)。

实施例5：

本实施例与实施例1基本相同，所不同的是采用的PLA的分子量为(40000g/mol)。所制得的载药微球中，药物包封率为90％，载药量0.75％，微球平均粒径为33.6μm。释放时间为53天。

实施例6：

本实施例与实施例2基本相同，所不同的是采用的PLA的分子量为(40000g/mol)。所制得的载药微球中，药物包封率为97％，载药量3.20％，微球平均粒径为35.3μm。释放时间为60天。

实施例7：

本实施例与实施例3基本相同，所不同的是采用的PLGA的分子量为(40000g/mol，20000-20000)。所制得的载药微球中，药物包封率为92％，载药量0.69％，微球平均粒径为29.5μm。释放时间为39天。

实施例8：

本实施例与实施例4基本相同，所不同的是采用的PLGA的分子量为(40000g/mol，20000-20000)。所制得的载药微球中，药物包封率为95％，载药量2.98％，微球平均粒径为31.6μm。释放时间为48天。

实施例9：

本实施例与实施例2基本相同，所不同的是采用的过氧化物酶模拟物为PEG₂₀₀₀₀-DhHP-6，药物用量为200mg。所制得的载药微球中，药物包封率为97％，载药量12.85％，微球平均粒径为17.7μm。释放时间为40天。

Claims

1.一种过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球，其特征在于：

是以聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸作为包覆材料，所载过氧化物酶模拟物以微区形式分布于整个微球之中，载药微球中过氧化物酶模拟物的包封率超过90％，载药量重量含量为0.5％～13％，载药微球的平均粒径为10～35μm；

过氧化物酶模拟物为亚红素六肽的聚乙二醇偶联物PEGDhHP-6；

聚乳酸的分子量为5000～40000g/mol；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5000～40000g/mol，共聚物中聚乳酸占聚乳酸和羟基乙酸链段总摩尔数和的10～90％；

并由如下步骤制备：

c)在12000～15000rpm的高速搅拌下，将步骤b)所得到的过氧化物酶模拟物明胶溶液注入到步骤a)所得到的聚合物溶液中，均匀分散，形成W/O的初乳液，过氧化物酶模拟物明胶溶液与聚合物溶液的体积比为1∶5～10；

e)将步骤c)所得的W/O初乳液在2000～3000rpm的搅拌速度下，注入到步骤d)所得的聚乙烯醇水溶液中，该水溶液与W/O初乳液的体积比为20～50∶10，经乳化形成W/O/W乳液，500～1000rpm下搅拌至二氯甲烷全部挥发，使微球固化形成微球悬浮液；将获得的微球悬浮液离心，收集，并用蒸馏水洗涤数次，经冻干后得到过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球。

2.如权利要求1所述的过氧化物酶模拟物的生物可降解聚酯载药微球，其特征在于：聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸与羟基乙酸链段的摩尔比为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20或90∶10。