CN1132758A - 一种高分子微球及其制法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可生物降解高分子微球及其制备方法和用途。该微球基质成分为聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物。以聚乙烯醇-聚乙二醇(PVA-PEG)混合溶液为分散介质，通过乳液分散溶剂蒸发法，在机械搅拌作用下制备出该微球。微球粒径在10微米以下可控。该微球表面光滑、颗粒规则无粘连对生物体网状内皮系统具有优良的靶向性，能携载药物和蛋白，可生物降解，用于药物及疫苗的靶向缓释体系。

Description

一种高分子微球及其制法和用途
本发明涉及一种药物及蛋白载体，可用于制备靶向缓释药物或疫苗，属生物医学领域。
可生物降解高分子微球用作药物载体可实现药物的靶向性及控制释放性，从而起到提高药物的生物利用度、增强治疗效果的作用；用作疫苗载体可减少免疫次数，产生佐剂效应，增强免疫效果，提高有效免疫覆盖率。世界卫生组织(WHO)将研制微球疫苗作为新一代疫苗剂型的方向。(J.Med.Vird.1990，31(1)，62～66)。
微球所用材料一般采用可生物降解的高分子，主要有白蛋白、明胶、淀粉等天然高分子及聚乳酸类合成高分子。聚乳酸类合成高分子具有生物相容性好、可生物降解、在体内较稳定等优点，是最早被认可为安全使用于人体内的合成材料(Polymer in Medicene and Surgery，R.L Kronen thal etal Eds.，Plenum，New York，1975，pp.119-137)。现在用得较多的是乳酸与乙醇酸或ε-已内酯的共聚物(Polymer，1979，20，1459-1466)。然而，最近一种新型的嵌有亲水性链段的聚乳酸—聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物被制备出来并受到关注(J.Appl Polym.Scl.1990，39，1-9)。该种聚乳酸类材料由于嵌入了亲水性的聚乙二醇，使材料的亲水性及结晶性得到了改善，成为一种作为药物载体的优良材料。
作为药物载体的高分子微球，它的靶向效果及控释能力与其粒径密切相关。Jani等的研究(J.Pharm.Pharmacol 1989，41，809-812)表明，粒径小于3μm的微粒通过口服或静注可实现网状内皮系统组织的靶向性。Lewis的研究(J.Pharm.Pharmaool.1992，44：271-274)认为粒径小于10μm的微粒口服后将进入血液循环，并进入炎症组织，Eldridge(Molecular Immunology，1991，28，287-292)及Ohagan(Immunology，1991，73，239)的研究均表明了粒径小于10μm的聚乳酸微球无论口服或静注均可实现对淋巴系统组织等的网状内皮组织靶向给药。从以上文献可知，对生物体网状内皮系统产生靶向的药物载体系统最关键的技术指标是粒径。国内曾制备过10μm以上粒径的聚乳酸微球(中国生物医学工程学报，1987，6(2))。华西医大药学院曾制备过微米级的白蛋白微球(药学学报，1993，28(1)，68-74)，以实现对动物肝脏的靶向，但未见有10μm以下的聚乳酸类微球的报道。
由于聚乳酸微球的制备须在油/水乳液体系中完成，微球的粒径通常与乳液分散剂与输入能有关。国外文献提供的制备10μm以下聚乳酸微球的工艺参数，存有以下缺陷：
①工艺条件不稳定；
②特定分子量的分散介质及乳化设备增加产品成本，难以放大；
③产品微球后处理困难，难以保证具生物活性的蛋白或药物不丧失活性；
④产品微球表面光洁度差、粒子之间粘连严重。
本发明的目的在于提供一种以聚乳酸—聚乙二醇为基质材料、粒径在10μm以下可控，表面光滑无粘连、蛋白含量为10％，能对生物体网状内皮系统产生靶向性的微球及其缓和的制备方法。
本发明的技术内容：微球制备采用乳液溶剂蒸发技术，将微球基质材料乳酸类聚合物溶于油性溶剂，所得到的油性溶液逐滴加入水相分散介质溶液中，在搅拌条件下形成乳液，并通过控制前期转速来控制微球粒径。后期在室温条件下，连续搅拌12-14小时，缓慢蒸干溶剂，用蒸馏水洗除分散介质，便得到产物微球。
在包裹蛋白或药物时，应采用二次乳化技术，即聚合物基质溶液未加入水相分散介质之间将蛋白或药物的溶液加入聚合物基质溶液中，通过超声乳化技术使蛋白或药物均匀地分散在聚合物基质材料中，再将此乳液加入到水相分散介质中，并按微球制备过程进行。
本发明微球基质材料选用分子量(Mη)50，000、聚乙二醇(PEG)嵌段为10％(W/W)的PLA-PEG共聚物。其它乳酸共聚物也可适用。作为本发明的微球，无论选用何种聚乳酸共聚物，分子量(Mn)应在以下范围5×103～6×104。
作为本发明的水相分散介质，采用水解度88％～90％链节数为1700～1750的聚乙烯醇(PVA)与分子量(Mw)6×103～3×104的聚乙二醇(PEG)的混合水溶液，PVA的浓度范围是4％～10％。PEG的浓度范围是4％～6％。
作为本发明分散介质的商品PVA，需经下法处理：将原始商品PVA装入透析袋(透析膜，截留分子量5,000)，在蒸馏水中透析三天以除去盐类及小分子杂质，透析过的PVA按10％的浓度配成溶液。置于高压釜中，于2.03×105N/M2压力条件下，120℃保持30分钟。
作为本发明基质材料的有机溶剂是二氯甲烷(DCM)或其与丙酮(AC)的混合溶剂DCM--AC，其体积百分比为70～100∶0～30。
作为本发明的功能输入装置采用普通电磁搅拌器，其搅拌速度范围为600-1000转/分。
作为本发明微球制备前期乳化时间至少应为15分钟。
采用本发明可以制得具有优良生物相容性及可生物降解，能携载蛋白和药物，能通过口服或静脉注射实现对生物体网状内皮系统组织产生靶向性的高分子微球。该微球粒径在10μm以下可控，表面光洁、无粘连，粒径可在以下数个区域：＜3μm、＜5μm、＜10μm(图1、图2)。经同位素示踪及组织断裂显微照像证实了本发明微球的靶向作用(图3、图4)。
本发明的积极效果是：由于本发明采用了新型的PLA-PEG嵌段共聚物改善了聚乳酸类材料对药物及蛋白的包接性能，所制备的微球粒径小于10μm，并对生物体网状内皮系统产生靶向作用，能在不影响生物活性的条件下，携载药物或蛋白，故而本微球将成为一种新的药物剂型，实现对肝、脾、淋巴系统的靶向缓释给药。本微球的制备方法温和、现实可行。PVA-PEG复合分散介质增强分散体系的均匀性，微球后期洗涤方便，在室温下即可进行，乳化装置采用电磁搅拌器，改善工艺的适用性，可方便地实现工艺放大。
下面为本发明的实施例：
实施例1：粒径小于10μm的共聚物微球的制备。准确称量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DCM中，完全溶解。量取PVA水溶液(10％)80ml，PEG水溶液(10％)60ml，装入500ml广口瓶中，用电磁搅拌器以100转/分的转速搅拌混匀。搅拌10分钟后，转速增至400转/分。将完全溶解的PLA-PEG溶液逐滴加入混匀的PVA-PEG水相分散介持中。加料完毕后，转速增至600转/分，维持此速度搅拌20分钟，然后将速度降至300转/分，持续搅拌12小时。待溶剂蒸发完毕，将乳液产物离心分离，离心速度5000转/分，时间5分钟，倒掉上层清液，用玻棒将下层白色沉淀搅匀，再加入蒸馏水，重新分散，离心洗涤，倒掉上层清液。重复洗涤过程，洗涤八次，收集白色沉淀，冻干贮存，产率80％。用扫描电子显微镜测试粒径及其分布。
实施例2：粒径小于5μm的共聚物微球的制备。准确称量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DCM-AC混合液(90/10)，完全溶解。量取PVA水溶液(10％)100ml，PEG水溶液(10％)40ml，装入500ml广口瓶中，按实施例1混匀。将完全溶解的PLA-PEG溶液逐滴加入混匀的PVA-PEG溶液中。转速增至800转/分，维持此速度搅拌20分钟，将速度降至300转/分，持续搅拌12小时，待溶剂蒸发完毕，按实施例1洗涤，离心速度7000转/分，时间5分钟，产率81％。
实施例3：粒径小于3μm的共聚物微球的制备。准确称量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DM-Aetlon混合液(80/20)，完全溶解。量取PVA水溶液(10％)110ml，PEG水溶液30ml，装入500ml广口瓶中，按实施例1混匀。将完全溶解的PLA-PEG溶液逐滴加入混匀的PVA-PEG溶液中。转速增至800转/分，维持此速度搅拌20分钟，将速度降至300转/分，持续搅拌12小时，待溶剂蒸发完毕，按实施例1法洗涤，离心速度9000转/分，离心时间5分钟，产率75％。
实施例4，人血清蛋白含量8％，粒径小于3μm的共聚物微球的制备。准确称量人血清的蛋白0.9g，溶于12ml蒸馏水中。准确称量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DCM-AC混合液中。将PLA-PEG溶液置于超声振荡装置中，用直径10mm振头振荡。逐滴加入白蛋白水溶液于PLA-PEG溶液中，在输入功率为150W条件下，超声振荡10分钟，得到蛋白在PLA-PEG均匀分散的水/油乳液。按实施例3将该乳液液加入PVA-PEG溶液中。转速增至800转/分，维持此速度搅拌20分钟，将速度降至300转/分，持续搅拌12小时后，按实施例1法洗涤处理。冻干微球称重8.34g产率84％。
实施例5，外膜蛋白含量5％，粒径小于3μm的共聚物微球的制备，量取外膜蛋白水溶液(23mg/ml)15ml。称取PLA-PEG共聚物1.8g，溶于25mlDCM-AC(80/20)混合液中。将共聚物有机溶液，置于超声振荡装置中，在超声振荡条件下，逐滴加入外膜蛋白水溶液。将输出功率设置为150W，超声振荡15分钟，得到外膜蛋白在PLA-PEG中均匀分散的水油乳液。按实施例3将该乳液加入到30ml PVA-PEG溶液中。转速增至800转/分。维持此速度搅拌20分钟，将速度降至300转/分，持续搅拌12小时后，按实施例1法洗涤处理。冻干微球称重1.872g，产率87％。
实施例6：外膜蛋白微球蛋白含量的测试。
准确称量100mg冻干包裹外膜蛋白的PLA-PEG微球。将该微球溶于10ml DCM溶液中。加入磷酸盐缓冲溶液(PB，pH7.4，1/15M)10ml，在超声振荡器上分散10分钟(100W)，将形成的乳液倒入分液漏斗中，静置30分钟，分离出水相。再在微球有机溶液中加入磷酸盐缓冲溶液10ml，重复上述步骤一次。将两次分离出的水相淬取液倒在一起，留做蛋白含量测试。测试前配制碱性铜溶液：①配制4％的Na2CO3溶液200ml；②配制0.2N的NaOH溶液200ml；③配制0.04mol/ml的CuSO4溶液50ml；④配制2％的酒石酸钾溶液50ml。按50ml①；加50ml②；加1ml③；加1ml④配得碱性铜溶液，再配制5％的牛血清白蛋白标准溶液。
取样品1ml加5ml碱性铜溶液摇匀反应10分钟，再加入酚试剂0.5ml，摇匀后在室温下反应30分钟，用紫外—可见分光光度计(Shimadzu，UV-120-02)检测样品在650nm处吸收，查标准曲线，得到样品中外膜蛋白含量为4.973mg，微球中外膜蛋白浓度为5％，外膜蛋白包裹率为27.13％。
附图及其说明：图1.采用本工艺所制备的PLA-PEG微球的扫描电子显微镜照片：a.粒径
＜3μm，b.粒径5μm，c.粒径＜10μm。图2.各种粒径的PLA—PEG微球的粒径分布统计图。图3.静脉注射粒径＜5μm的PLA-PEG微球，2)分钟以后兔的活体显像。
a.20分钟后，仅有肝脏显影；b.30小时后，仅有肠部显影可见。图4.口服粒径＜5μm的PLA-PEG微球，10分钟后的兔活体显像。a.10分钟后，仅有胃部显影；b.30小时后，仅有肠部显影。图5.大白兔口服粒径小于5μm，外膜蛋白含量2％的PLA-PEG微球，一个月后摘取网状内皮系统器官，对其深冷断裂面的扫描电子显像照片，可清楚地看见微球在肝、脾、淋巴结中的存在。

Claims (13)

1.一种可生物降解、生物相容的高分子微球，其特征在于微球基质成分为聚乳酸—聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物，微球粒径在10微米以下，PLA-PEG的粘均分子量为5×103～6×104。
2.一种根据权利要求1的微球制备方法，依次包括以下步骤：
①PLA-PEG共聚物溶于有机溶剂中形成有机溶液；
②在搅拌下加入到水相分散介质中；
③连续搅拌待有机溶剂蒸发干；
④用水在离心条件下洗去水相分散介质，其特征是水相分散介质为聚乙烯醇—聚乙二醇(PVA-PEG)混合水溶液，溶液浓度为4％～10％，PVA与PEG的重量百分比组成为40～70∶30～60。
3.根据权利要求1的微球，其特征是PEG在微球基质中的重量百分比为5～15％，PEG的分子量为6×103～2×104。
4.根据权利要求2的方法，其特征是有机溶剂为二氯甲烷(DCM)和丙酮(AC)的混合液，DCM与AC的体积百分比为70～100∶0～30。
5.根据权利要求2的方法，其特性是有机溶剂为DCM。
6.根据权利要求2、4或5的方法，其特征是PVA的水解度为87～90％，聚合链节数为1700～1750。
7.根据权利要求2、4或5的方法，其特征是PVA的水解度为87～90％，重均分子量为10,000至20,000。
8.根据权利要求2、4或5的方法，其特征是搅拌速度为400～1000RPM。
9.根据权利要求1或3的微球的用途，其特征是通过口服或静注给药得到生物体内网状内皮系统组织的靶向性。
10.根据权利要求1或3的微球的用途，其特征是微球作为携载药物或蛋白的载体，用于对生物的靶向给药及缓慢控制释放。
11.根据权利要求1或3的微球的用途，其特征是微球携载人血清白蛋白，携载量为微球重量的1-10％。
12.根据权利要求1或3的微球的用途，其特征是微球携载外膜蛋白，携载量为微球重量的1-5％。
13.根据权利要求1或3所述的微球的用途，其特征是载蛋白微球可用于一次性给药长效免疫疫苗的制备。
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