CN101392032B - 膜分离制备竹叶多糖提取物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，包括以下步骤：先用亲脂性溶剂对筛选的竹叶进行提取，再用C₁-C₃的脂肪醇或丙酮对剩下的竹叶残渣进行提取，然后用反渗透膜纯化的去离子水提取剩下的竹叶残渣，再碱性离心沉降，获得离心清液和沉淀物，将离心清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜处理，最后得到通过纳滤膜的浓缩液。将纳滤膜的浓缩液通过脱色树脂吸附，多糖溶液真空浓缩至比重为1.03-1.14，再用C₁-C₃的脂肪醇沉淀多糖，沉淀物离心，真空微波干燥沉淀物，固体部分用微波真空干燥，获得多糖高含量的竹叶多糖提取物。

Description

膜分离制备竹叶多糖提取物的方法

技术领域

本发明涉及一种竹叶多糖的分离方法，特别涉及一种膜分离制备高纯度竹叶多糖的方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，回归自然，天然健康食品，绿色食品的概念越来越深入人们的生活理念，天然食品和药品已经成为国际食品和药品发展的潮流和时尚。竹叶提取物作为一种天然的、具有多种生理功能的提取物正不断被人们所认识。

竹子是属于禾本科竹亚科(Bambusadea)的一类植物，全球约有70属，1225种。竹类植物分布于地球的北纬46°至南纬47°之间的热带，亚热带和暖温带地区，主要集中分布于亚洲、非洲、南北美洲、大洋洲的热带、亚热带地区及太平洋相应位置的岛屿，东南亚的热带、亚热带为其分布的中心地区。竹林面积以每年3％的速度增加，如何合理高效利用竹林资源，推动竹产业的发展，已成为世界林业生产中一个高度关注的问题。我国是竹子中心产区之一，占世界竹林总面积的25％。开发利用竹类森林资源意义十分重大。竹叶在我国具有悠久的食用和药用历史，竹叶性淡、微涩、寒，味甘、苦，主治烦热口渴，小儿发热，小儿疳积，热病不眠，口舌生疮，目赤肿痛，疥癣，疮毒，咽喉炎，外伤出血等症。竹叶中含有大量的黄酮类化合物和生物活性多糖等有效成分，竹叶活性多糖通过增强免疫功能、促进免疫因子的生成和激活来实现抗肿瘤作用，具有良好的免疫调节、抗肿瘤、抗感染、抗炎症等多种功效。目前已受到国内外市场的广泛关注。日本人还从箬竹叶提取分离得一种活性多糖，经试验证明对S-180有很好的抑制和清除效果。

目前国内外对于制备高含量竹叶多糖的方法报道不多，尤其是多糖含量大于80％的竹叶多糖提取物。

发明内容

为了解决现有技术存在的竹叶多糖提取物中竹叶多糖的含量较低的缺陷，本发明提供了一种膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，可以制得多糖含量高于80％wt的竹叶多糖提取物。

本发明采用如下技术方案：一种膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，包括以下步骤：

第一步，先用亲脂性溶剂对筛选出的竹叶多糖含量大于5.0％wt的竹叶进行提取，其中亲脂性溶剂与竹叶的质量比例为(1—30)：1，提取温度为20℃-100℃，提取时间为0.5h-72h；提取方式可选择热回流提取、微波提取、超声波提取中的任意一种或者其组合。热回流提取温度80℃-100℃，时间为0.5-10小时；微波提取功率100-2000W，时间10-120分钟，温度50℃-70℃；超声波提取功率300W-3KW，时间10-120分钟，温度50℃-70℃。竹叶多糖含量大于5.0％wt的竹叶的筛选方法为：以硫酸-蒽酮法，以葡萄糖为标准，建立葡萄糖标准曲线，然后以葡萄糖为标准品，610nm下对收集的竹叶进行比色测定竹叶多糖含量，筛选出竹叶多糖含量大于5.0％wt的竹叶。优选南京的鹅毛竹、铺地竹、毛竹、唐竹或金丝慈竹下部的竹叶，或者安徽池州毛竹的竹叶。亲脂性溶剂为C₅-C₇的脂肪烷烃或沸程60℃-120℃的石油醚。所述的C₅-C₇的脂肪烷烃为正戊烷、正已烷或正庚烷中的任意一种。

第二步，再用C₁-C₃的脂肪醇或丙酮为提取剂对第一步的竹叶残渣进行提取，提取剂与竹叶的质量比例为(1—20)：1，提取温度为20℃-100℃，提取时间为0.5h-72h；C₁-C₃的脂肪醇为甲醇、乙醇、正丙醇中的任意一种。

第三步，用去离子水提取第二步的竹叶残渣，去离子水与竹叶的质量比例为(1—20)：1，提取温度为80℃-110℃，提取时间为0.5h-5h；

第四步，离心沉降：将第三步去离子水的提取液调节pH至8-9，用6000-20000r/min速度离心沉降，获得离心清液和沉淀物；

第五步，膜藕合分离：将第四步得到的离心清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜处理最后得到浓缩液，其中，陶瓷膜平均孔径为0.1—0.5μm，超滤膜截留分子量为5000—200000道尔顿，纳滤膜截留分子量200—1000道尔顿，物料通过超滤膜及纳滤膜通量1-10m³/m²·h·Mpa；

第六步，脱色，将第五步得到的浓缩液通过脱色树脂吸附，加入的树脂的质量与加入的浓缩液的体积的比例为1-50：100，搅拌时间为5-60min，温度5℃-80℃；脱色树脂，指D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296中任意一种。

第七步，醇析，将第六步树脂脱色后的竹叶多糖溶液抽真空浓缩至比重为1.03-1.14，如比重1.12，加入C₁-C₃的脂肪醇搅拌，脂肪醇与多糖溶液体积比例为4-20：1，再用160目滤布过滤得到沉淀物；

第八步，真空干燥，将第七步得到的沉淀物离心，用3000-10000r/min速度离心沉降，获得离心固体部分用600-2000W微波真空干燥，温度25℃-60℃，真空度250-700mmHg，获得竹叶多糖含量大于80％wt的竹叶多糖提取物。

本发明获得如下技术效果：

1.通过对不同产地不同部位的30种竹叶所含的竹叶多糖含量进行分析，筛选出高含量竹叶多糖的品种，有利于高含量竹叶多糖的制备。

2.根据相似相溶原理，采用分极性溶剂依次提取，尽量除去脂溶物、色素、醇溶物等杂质，提高了去离子水提取物中竹叶多糖浓度，也有利于保护膜设备的使用。

3.首次采用不同类型膜分离藕合技术和脱色吸附藕合技术代替传统的溶剂萃取法，不仅能使竹叶多糖提取物中竹叶多糖的含量大于80％wt，而且节省能源、清洁环保。

4.首次采用pH沉降离心法纯化，不仅能除去高分子蛋白、胶质、叶绿素、高分子单宁等杂质，提高竹叶多糖提取物的纯度，而且有利于藕合膜组件的保护和再生，延长其寿命。

5.选择脱色吸附树脂代替溶剂萃取去蛋白，既省溶剂，又能有效的提高竹叶多糖的含量。

附图说明

图1陶瓷膜流速曲线。

图2超滤膜流速曲线。

具体实施方式

竹叶多糖含量大于5.0％wt的竹叶的筛选方法如下：

(1)以硫酸-蒽酮法，以葡萄糖为标准，建立葡萄糖标准曲线，如表1

                表1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖含量C(mg)对吸光度A线性回归，得回归方程A＝5.8137C-0.00473(R＝0.9987)。表明葡萄糖在0.0μg/mL～96.0μg/mL范围内与吸光度呈较好的线性关系。

2)样品多糖重复测定试验

分别取4份相同绿竹叶多糖提取液，重复测定竹叶多糖的结果如表2。试验结果表明，以葡萄糖为标准品，610nm下比色测定竹叶多糖的方法可行，有较好的重复性。

    表2 多糖测定重复性试验数据

3)样品多糖加样回收率测定

各组中加入的竹叶多糖样品量为0.06mg/mL×10mL＝0.6mg，加入的葡萄糖标准品分别为0.12mg/mL×4mL＝0.48mg，0.12mg/mL×5mL＝0.6mg，0.12mg/mL×6mL＝0.72mg。回收率分别为101.92％、101.68％、99.89％，标准偏差为0.0110，符合要求，证明了该方法的可靠性。

          表3 加样回收率试验数据

本专利通过建立竹叶多糖的分析方法，对30个品种竹叶中竹叶多糖活性组分的含量进行了测定。结果表明，以质量百分比计：竹叶多糖含量在1.94％～7.69％之间，其中竹叶多糖含量在4％以上有南京地区小叶箬竹(4.59％)，矮箬竹(4.82％)，巴山木竹4.43％，鹅毛竹(7.69％)，铺地竹(5.69％)，毛竹(5.36％)，百夹竹(4.86％)，唐竹(5.30％)，金丝慈竹下部(5.73％)，福建省尤溪绿竹(4.36％)，毛竹(4.72％)，安徽池州(5.90％)，尤其是南京的鹅毛竹、铺地竹、毛竹、唐竹和金丝慈竹下部，安徽池州毛竹分布广、多糖含量高于5％，经过本专利的筛选成为工业上提取竹叶多糖活性组分的最佳原料。同品种的竹叶上下部位竹叶多糖含量有所不同，且含量都是下部老叶高于上部嫩叶子。结果如表4。

     表4 不同品种竹叶中多糖含量

由表4可知，竹叶多糖的含量范围为，以质量百分比计：1.94％～7.69％，即19.4mg/g～76.9mg/g，按含多糖的高低，将其分为含量在4％以上、3％～4％之间、2％～3％之间、2％以下四类。

4％wt以上：有南京地区小叶箬竹(4.59％)，矮箬竹(4.82％)，巴山木竹4.43％，鹅毛竹(7.69％)，铺地竹(5.69％)，毛竹(5.36％)，百夹竹(4.86％)，唐竹(5.30％)，金丝慈竹下部(5.73％)，福建省尤溪绿竹(4.36％)，毛竹(4.72％)，安徽池州(5.90％)；3％～4％之间：南林大的髯毛箬竹，细叶箬竹，苦竹下，细叶苦竹，长叶苦竹下，靓竹，孝顺竹，毛金竹，金丝慈竹上；林化所的水竹；福建尤溪苦竹；安徽池州的苦竹；2％～3％之间：南林大的箬竹，阔叶箬竹上、下，苦竹上，巴山木竹上，淡竹；福建尤溪的淡竹；2％以下：南林大的长叶苦竹上。

同品种的南京竹园中的毛竹、尤溪毛竹及池州毛竹多糖含量有所不同，分别为：5.36％、4.72％，5.90％；三个地方的苦竹含量分别为：南林大上2.81％，南林大下3.21％，尤溪3.35％，池州3.25％。因此，同品种的竹叶上下部位多糖含量有所不同，且含量都是下部老叶高于上部嫩叶子。因而，多糖更多富集在下部老叶片中。

提取方式说明：

本发明中第一步中的提取方式可选择热回流、微波提取、超声波提取中的一种。热回流提取温度80℃-100℃，时间为0.5-10小时；微波提取功率100-2000W，时间10-120分钟，温度50℃-70℃；超声波提取功率300W-3KW，时间10-120分钟，温度50℃-70℃。

在本发明方案中，用极性溶剂提取前，先用非极性溶剂，如石油醚、正已烷、乙醚等对筛选的竹叶进行提取，质量比例为(1—30)：1，提取温度为20℃-100℃，提取时间为0.5h-72h，目的是除去脂溶性杂质，包括叶绿素等色素。实验多次的结果表明，可除去1-3％wt的杂质。再用C₁-C₃的脂肪醇，如甲醇、乙醇或丙酮对剩下的竹叶残渣进行提取，目的除去醇溶性的多酚、单宁、黄酮、萜类、皂苷、生物碱等杂质，实验多次的结果表明，可除去5-15％wt的杂质。用反渗透膜制备去离子水，提取剩下的竹叶残渣，去离子水与竹叶的质量比例为(1—20)：1，提取温度为80℃-110℃，提取时间为0.5h-5h；多糖类活性成分溶于水，提取率大于95％。

本发明中按L₉(3⁴)正交表分别采用水提、超声波浸提、微波浸提方法，对竹叶多糖提取工艺参数进行试验，用硫酸一苯酚法测定多糖含量。

        表2  水提取工艺因子设计

    表3 L₉(3⁴)水提正交实验结果

影响竹叶多糖提取率因素的主次关系为：提取固液比对多糖提取率影响最大，其次为提取次数，温度和时间的影响相对较小.其最佳浸提参数为A₂B₃C₃D₃，即80℃下，浸提100min，固液比1：25，浸提3次.在最佳条件下，多糖得率为0.661％.

      表4  超声波提取工艺因子设计

       表5  L₉(3⁴)超声波提取正交实验结果

从表试验结果可知，提取次数对提取率的影响最大，其次为温度，时间和固液比对提取率的影响较小.其最佳浸提参数为A₃B₂C₁D₃，即70℃下，浸提20min，固液比1：20，浸提3次，多糖得率为0.695％。考虑到后续加工的成本问题，优选1：15的固液比，浸提10min。

      表6  微波辅助提取工艺因子设计

   表7  L₉(3⁴)微波辅助提取正交实验结果

从表试验结果可知，微波功率和提取次数对提取效果的影响最大，其次为时间和固液比.其最佳浸提参数为A₃B₂C_ID₃，即在微波功率800W的条件下，按固液比1：15，提取10min，浸提3次，多糖得率为0.658％。

结果表明：微波浸提5-10min的多糖提取率与水提相当，超声波浸提的提取率高于水提和微波浸提。

本发明中将微波和超声波浸提液，用0.5％-5％碱液调节pH为8-9，有大量的沉淀产生。选择转速3000-10000转/分离心机离心沉降，沉淀物中加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1：1-10，优选1：4，除去沉淀物，合并两次的清液。采用本方法处理不仅除掉大量不溶性固体、胶质、叶绿素、高分离蛋白质等杂质，提高提取液中多糖的含量，而且保护膜组件和脱色树脂，有利于提高生产效果。

在本发明中，采用膜藕合分离技术，将离心沉降的清液依次通过陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜藕合装置，最后得到浓缩液。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜选择截留分子量为5000~200000道尔顿(Dalton)的聚砜膜(PS)，优选100000-15000Dalton，纳滤膜截为留分子量200~1000Dalton聚酰亚胺膜，物料通过超滤膜及纳滤膜通量1-10m³/m²·h·Mpa。与传统真空转鼓过滤机、硅藻土过滤机相比，采用陶瓷膜过滤技术，不仅可除去细小不溶固体、大量高分子单宁、蛋白质、胶质、纤维、细菌及叶绿素等杂质，而且大大降低了后续超滤膜、纳滤膜及脱色树脂的污染，在一定的压力下，当物料滤液流过膜表面时，只允许水及比膜孔径小的小分子物质通过，达到溶液的净化、分离、与浓缩的目的，从而提高浓缩液中多糖的含量。如表8所示。

         表8  多糖含量和截留率

    Tab.6-2The content and removal of polysaccharide

图1为中试提取多糖液过陶瓷膜时测得的膜流速，操作条件：提取液浓度为9.32g/L，温度为30℃～40℃，压力小于0.2MPa。可以看出，陶瓷膜在20分钟后流速已经基本稳定。

图2为中试提取多糖液过超滤膜时测得的膜流速，提取液浓度为7.08g/L，温度为26.5℃，压力为0.24MPa。可以看出，超滤膜在5分钟后流速已经基本稳定。

本发明中，经过无机陶瓷膜、10Dalton超滤膜和200Dalton纳滤膜处理，浓缩液中多糖的含量可达到38.24％，大大地改善了传统的水提醇析方法得到的粗多糖提取物中多糖含量低，酒精用量大，能耗大的问题。

本发明采用大孔类树脂D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296等中一种或几种介质为填料对纳滤膜的浓缩液进行选择性吸附，树脂与纳滤膜的浓缩液体积比为1：5-20。优选D845、D941、D280、、D392，它们对多糖提取物的脱色率大于85％，多糖的损失率小于10％。

本发明将大孔树脂脱色后的竹叶多糖溶液抽真空浓缩至比重为1.03-1.14，优选比重1.10-1.12，加入85％以上C₁-C₃的脂肪醇搅拌，如甲醇、乙醇等，脂肪醇与多糖溶液体积比例为420：1，优选4-6：1，目的是将多糖沉淀，再用160目滤布过滤得到多糖沉淀物；再经过3000-10000r/min速度离心沉降，优选6000-10000r/min，获得离心固体部分用600-2000W微波真空干燥，温度25℃-60℃，优选30℃-40℃，真空度250-700mmHg，获得竹叶多糖含量大于80％wt的竹叶多糖提取物。

实施例1 高含量竹叶多糖的筛选方法

(1)硫酸-恩酮溶液配制：称取蒽酮0.2g，浓硫酸定容于100mL容量瓶中，混匀即可，现配现用。

(2)标准葡萄糖溶液的配制：精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖配制成浓度为0.1200mg/mL的溶液，备用。

(3)葡萄糖标准曲线绘制：精确吸取0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL于10mL具塞试管中，用蒸馏水补足1.0mL，以1.0mL蒸馏水做空白对照，然后各加入4mL硫酸-恩酮溶液，摇匀，放入冰水中冷却，后置于沸水中煮沸10min，迅速冷却至室温，于620nm测定吸光度A。

(4)样品多糖重复测定试验：分别取4份相同质量(2g)经粉碎的南京的鹅毛竹、铺地竹、毛竹、唐竹和金丝慈竹下部，安徽池州毛竹等30个样品中的任意一种，竹叶粉置于回流烧瓶中，提取条件同为料液比1:30(g:mL)，温度80℃，提取3h，提取两次，合并提取液浓缩，定容于25mL容量瓶中，分别取1.0mL于10mL具塞试管中，以1.0mL蒸馏水做空白对照，然后各加入4mL硫酸-恩酮溶液，摇匀，放入冰水中冷却，后置于沸水中煮沸10min，迅速冷却至室温，于620nm测定吸光度A。

(5)样品多糖加样回收率测定：配备0.06mg/mL的南京的鹅毛竹竹叶多糖提取液，分别向10mL样品液中加入4mL、5mL、6mL的0.1200mg/mL的葡萄糖标准溶液，定容于25mL容量瓶中，取1mL测定吸光值。每个试验号做3个点，共9点。

(5)按葡萄糖标准回归方程A＝5.8137C-0.00473计算30个品种中多糖的含量，经分析筛选，多糖含量在1.94％～7.69％之间，其中多糖含量在4％以上有南京地区小叶箬竹(4.59％)，矮箬竹(4.82％)，巴山木竹4.43％，鹅毛竹(7.69％)，铺地竹(5.69％)，毛竹(5.36％)，百夹竹(4.86％)，唐竹(5.30％)，金丝慈竹下部(5.73％)，福建省尤溪绿竹(4.36％)，毛竹(4.72％)，安徽池州(5.90％)，尤其是南京的鹅毛竹、铺地竹、毛竹、唐竹和金丝慈竹下部，安徽池州毛竹分布广、多糖含量高于5％，成为工业上提取竹叶多糖活性组分的最佳原料。

实施例2

一种膜分离制备高纯度竹叶多糖的方法，，包括以下步骤：

第一步，先用亲脂性溶剂对筛选的竹叶细粉进行提取，其中亲脂性溶剂与干燥的竹叶细粉的质量比例为(1—30)：1，例如比例可以选取为：1：1，4：1，7：1，8：1，10：1，14：1，17：1，20：1，22：1，24：1，27：1，28：1，29：1，29.5：1，30：1，提取温度为20℃-100℃，例如可以选取为：25℃，35℃，40℃，50℃，60℃，70℃，75℃，80℃，90℃，98℃；提取时间为0.5h-72h，提取时间为0.5h，1h，3h，5h，6h，8h，9.5h，12h，14h，15h，16h，17h，18h，20h，30h，35h，40h，55h，60h，70h，71h。

第二步，再用C₁-C₃的脂肪醇或丙酮对剩下的竹叶残渣进行提取，提取剂与竹叶的质量比例为(1—20)：1，例如比例可以选取为：1：1，4：1，7：1，8：1，10：1，14：1，17：1，20：1，提取温度为20℃-100℃，例如可以选取为：25℃，35℃，40℃，50℃，60℃，70℃，75℃，80℃，90℃，98℃；提取时间为0.5h-72h；提取时间为0.5h，1h，3h，5h，6h，8h，9.5h，12h，14h，15h，16h，17h，18h，20h，30h，35h，40h，55h，60h，70h，71h。

第三步，用反渗透膜纯化自来水制备去离子水，再用去离子水提取剩下的竹叶残渣，去离子水与竹叶的质量比例为(1—20)：1，，例如比例可以选取为：1：1，4：1，7：1，8：1，10：1，14：1，17：1，20：1，提取温度为80℃-110℃，例如可以选取为：80℃，85℃，90℃，95℃，100℃，105℃，110℃；提取时间为0.5h-5h；例如可以选取为0.5h，1h，2h，3h，4h，5h。

第四步，离心沉降：将提取液调节PH至8-9，例如8，8.5，9，用高速离心沉降，离心机的转速为6000—20000转/分，可以选取为6000转/分，7000转/分，20000转/分，获得离心清液和沉淀物；本实施例中可直接将该清液进行膜耦合分离，也可再在沉淀物中加入去离子水离心沉降，除去沉淀物，合并两次的离心清液，其中，沉淀物和去离子水的质量比例是1：(1-10)，可以选取为1：1.5，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，

第五步，膜藕合分离：将离心清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜处理，最后得到通过纳滤膜的浓缩液，其中，无机陶瓷膜材质可以为三氧化二铝，陶瓷膜平均孔径0.1—0.5μm，可以为，0.2微米，0.4微米，超滤膜截留分子量为5000—200000Dalton(道尔顿)，如5000，20000，50000，80000，100000，150000，180000，200000，纳滤膜截留分子量200—1000Dalton(道尔顿)，物料膜通量1-10m³/m²·h·MPa，可以选取为2m³/m²·h·MPa，3m³/m²·h·MPa，5m³/m²·h·MPa，8m³/m²·h·MPa，

第六步，脱色，将纳滤膜的浓缩液通过脱色树脂吸附，树脂加入质量与纳滤膜的浓缩液体积比例为1-50：100，例如1：100，5：100，8:100，25:100，30:100，40:100，45:100，50:100，搅拌时间为5-60min，例如可以选取为5min，10min，20min，35min，40minh，50min，55min，60min，温度5℃-80℃；例如可以选取为：10℃，15℃，25℃，35℃，50℃，55℃，60℃，75℃，80℃；

第七步，醇析，将树脂脱色后的多糖溶液真空浓缩至比重为1.03-1.14，如1.04，1.08，1.10，1.12，1.14；用C₁-C₃的脂肪醇加入搅拌，如甲醇、乙醇中的任一种，脂肪醇与多糖溶液体积比例为4-20：1，例如可以选取为5：1，7：1，10：1，15：1，18：1，20：1；用160目滤布过滤得到多糖沉淀物，再经过3000-10000r/min速度离心沉降，优选6000-10000r/min，获得离心多糖沉淀物；第八步，真空干燥，将上述多糖沉淀物用600-2000W微波真空干燥，如600W，800W，1200W，1500W，1800W，干燥温度25℃-60℃，例如，25℃，35℃，50℃，55℃，60℃，真空度250-700mmHg，例如，250mmHg，300mmHg，350mmHg，450mmHg，550mmHg，650mmHg，700mmHg，获得总多糖含量大于80％的竹叶多糖提取物。

本实施例中，本技术方案中第一步中的亲脂性溶剂为C₅-C₇(碳原子数为5-7，可以为5，6，7)的脂肪烷烃或沸程60℃-120℃石油醚，优选石油醚、正已烷。第二步和第七步中C₁-C₃的脂肪醇指甲醇、乙醇、丙醇，优选甲醇。脱色树脂为D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296等，优选D845、D280、D392。第一步中的筛选的竹叶，特指多糖含量大于4.0％南京地区鹅毛竹(7.69％)、小叶箬竹(4.59％)、矮箬竹(4.82％)、巴山木竹(4.43％)、铺地竹(5.69％)、百夹竹(4.86％)、唐竹(5.30％)、金丝慈竹下部(5.73％)、毛竹(5.36％)，尤其是南京的鹅毛竹、铺地竹、毛竹、唐竹和金丝慈竹下部，安徽池州毛竹分布广、多糖含量高于5％，成为工业上提取竹叶多糖活性组分的最佳原料。

本技术方案中，以硫酸-蒽酮法，以葡萄糖为标准，建立竹叶中多糖的分析方法。无水葡萄糖配制成浓度为0.1200mg/mL的溶液，精确吸取0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL于10mL具塞试管中，用蒸馏水补足1mL，以1.0mL蒸馏水做空白对照，然后各加入4mL硫酸-恩酮溶液，摇匀，放入冰水中冷却，后置于沸水中煮沸10min，迅速冷却至室温，于620nm测定吸光度A。回归方程A＝5.8137C-0.00473(R＝0.9987)，葡萄糖在0.0～96.0μg/ml范围内与吸光度呈较好的线性关系。

实施例3

选择福建尤溪4月份收集的6年生新鲜毛竹叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风4hr，测含水率低于7.0％，多糖含量4.72％。取8kg干燥叶，破碎成细粉，加60kg石油醚(60℃-90℃)，70℃热回流提取，时间4小时，第二次提取加40kg石油醚(60℃-90℃)，重复以上操作。合并提取液，50℃下减压回收溶剂。用工业级甲醇约100L加入到石油醚提取后的残叶中提取，设定温度为50℃，浸提过夜；第二次加入50L甲醇提取3hr，温度70℃，过滤，合并甲醇提取液。残叶用直接蒸气吹干后，加入100L去离子水，提取温度100℃，提取时间2hr，过滤，重复提取3次，合并提取液200L。用NaOH碱溶液调节PH8.5，自然冷却至室温，用转速6000转/离心机离心沉淀，得到离心清液195L。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液10kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1μm，超滤膜截留分子量为100000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量400Dalton(道尔顿)，物料膜通量6m³/m²·h·Mpa。再将纳滤膜的浓缩液10kg，用10kg D845大孔树脂吸附60min后，过滤清液，温度80℃下真空浓缩至比重1.12，慢慢加入95％wt乙醇4L，搅拌沉淀，用转速6000转/离心机离心沉淀，得到将沉淀物，固体部分用微波真空干燥，温度45℃，真空度700mmHg，，得到白色粉末224g，即富含高纯度竹叶多糖提取物，其中多糖80.6％wt，干燥失重≤5.0％wt，灰分≤3.0％wt，重金属≤10mg/kg，砷≤2mg/kg。

实施例4

选择南京林业大学10月份收集的5年生新鲜鹅毛竹叶25kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3hr，测含水率低于7.0％，多糖含量7.69％。取10kg干燥叶，破碎成细粉，加100kg正已烷，70℃热回流提取，时间2小时，第二次提取加50kg正已烷，重复以上操作。合并提取液，50℃下减压回收溶剂。用工业级乙醇100L加入到正已烷提取后的残叶中提取，设定温度为70℃，时间2hu；第二次加入50L乙醇提取3hr，温度70℃，过滤，合并乙醇提取液。残叶用直接蒸气吹干后，加入150L去离子水，提取温度100℃，提取时间3hr，过滤，重复提取3次，合并提取液250L。用NaOH碱溶液调节PH8.5，自然冷却至室温，用转速6000转/离心机离心沉淀，得到离心清液240L。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液10kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.4μm，超滤膜截留分子量为150000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量300Dalton(道尔顿)，物料膜通量6m³/m²·h·Mpa。再将纳滤膜的浓缩液10kg，用8kg D280大孔树脂吸附40min后，过滤清液，温度80℃下真空浓缩至比重1.10，慢慢加入95％乙醇5L，搅拌沉淀，用转速6000转/离心机离心沉淀，得到将沉淀物，固体部分用微波真空干燥，温度50℃，真空度700mmHg，，得到白色粉末540g，即富含高纯度竹叶多糖提取物，其中多糖88.7％wt。

实施例5

选择南京林业大学10月份收集的8年生新鲜金丝慈竹下部叶25kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3hr，测含水率低于7.0％wt，多糖含量5.73％。取10kg干燥叶，破碎成细粉，多糖的提取分离方法与实施例4相同，大孔脱色树脂采用D392，得到白色粉末260g，即富含高纯度竹叶多糖提取物，其中多糖82.1％wt。

实施例6

选择安微池州3月份收集的15年生新鲜毛竹叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风5hr，测含水率低于7.0％，多糖含量5.90％。取10kg干燥叶，破碎成细粉，多糖的提取分离方法与实施例3相同，大孔脱色树脂采用D293，得到白色粉末249g，即富含高纯度竹叶多糖提取物，其中多糖81.4％。

实施例7

选择南京林业大学10月份收集的8年生新鲜铺地竹叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风5hr，测含水率低于7.0％，多糖含量5.69％。取10kg干燥叶，破碎成细粉，多糖的提取分离方法与实施例4相同，大孔脱色树脂采用D296，得到白色粉末220g，即富含高纯度竹叶多糖提取物，其中多糖80.2％wt。

实施例8

选择南京林业大学10月份收集的8年生新鲜箬竹叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风5hr，测含水率低于7.0％，多糖含量2.66％。取10kg干燥叶，破碎成细粉，加入150L去离子水，提取温度100℃，提取时间2hr，过滤，重复提取3次，合并提取液250L。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液10kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.5μm，超滤膜截留分子量为80000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量500Dalton(道尔顿)，物料膜通量6m³/m²·h·Mpa。再将纳滤膜的浓缩液10kg，用8kg D280大孔树脂吸附60min后，过滤清液，温度80℃下真空浓缩至比重1.10，慢慢加入95％乙醇5L，搅拌沉淀，用转速6000转/离心机离心沉淀，得到将沉淀物，固体部分用微波真空干燥，温度60℃，真空度700mmHg，，得到白色粉末345g，即富含高纯度竹叶多糖提取物，其中多糖48.3％wt。

Claims (7)

1.一种膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，先用亲脂性溶剂对筛选出的竹叶多糖含量大于5.0％wt的竹叶进行提取，其中亲脂性溶剂与竹叶的质量比例为(1-30)∶1，提取温度为20℃-100℃，提取时间为0.5h-72h；其中，竹叶多糖含量大于5.0％wt的竹叶的筛选方法为：以硫酸-蒽酮法，以葡萄糖为标准，建立葡萄糖标准曲线，然后以葡萄糖为标准品，610nm下对收集的竹叶进行比色测定竹叶多糖含量，筛选出竹叶多糖含量大于5.0％wt的竹叶；

第二步，再用C₁-C₃的脂肪醇或丙酮为提取剂对第一步的竹叶残渣进行提取，提取剂与竹叶的质量比例为(1-20)∶1，提取温度为20℃-100℃，提取时间为0.5h-72h；

第三步，用去离子水提取第二步得到的竹叶残渣，去离子水与竹叶的质量比例为(1-20)∶1，提取温度为80℃-110℃，提取时间为0.5h-5h；

第四步，离心沉降：将第三步得到的提取液调节pH至8-9，用6000-20000r/min速度离心沉降，获得离心清液和沉淀物；

第五步，膜藕合分离：将第四步得到的离心清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜处理最后得到浓缩液，其中，陶瓷膜平均孔径为0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为5000-200000道尔顿，纳滤膜截留分子量200-1000道尔顿，物料通过超滤膜及纳滤膜通量1-10m³/m²·h·MPa；

第六步，脱色，将第五步得到的浓缩液通过脱色树脂吸附，加入的树脂的质量与加入的浓缩液的体积的比例为1-50∶100，搅拌时间为5-60min，温度5℃-80℃；

第七步，醇析，将第六步树脂脱色后的竹叶多糖溶液抽真空浓缩至比重为1.03-1.14，加入C₁-C₃的脂肪醇搅拌，脂肪醇与多糖溶液体积比例为4-20∶1，再用160目滤布过滤得到沉淀物；

第八步，真空干燥，将第七步得到的沉淀物离心，固体部分用600-2000W微波真空干燥，温度25℃-60℃，真空度250-700mmHg，获得竹叶多糖含量大于80％wt的竹叶多糖提取物。

2.根据权利要求1所述的膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，其特征在于第一步中的竹叶，特指南京的鹅毛竹、铺地竹、毛竹、唐竹或金丝慈竹下部的竹叶，或者安徽池州毛竹的竹叶。

3.根据权利要求1所述的膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，其特征在于所述的C₁-C₃的脂肪醇为甲醇、乙醇、正丙醇中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，其特征在于第一步中亲脂性溶剂为C₅-C₇的脂肪烷烃或沸程为60℃-120℃的石油醚。

5.根据权利要求4所述的膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，其特征在于所述的C₅-C₇的脂肪烷烃为正戊烷、正己烷或正庚烷中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，其特征在于第六步中脱色树脂，指D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296中任意一种。

7.根据权利要求1所述的膜分离制备竹叶多糖提取物的方法，其特征在于第一步中的提取方式可选择热回流提取、微波提取、超声波提取中的任意一种或组合。

Images