发明内容
本发明的目的在于提供一种新型饲料添加剂——凝结芽孢杆菌饲料添加剂,本发明的另一目的是提供该凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法。
本发明的技术方案如下:
本发明提供一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法,包括下述的步骤:
1)凝结芽孢杆菌的一级斜面培养:
将凝结芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上,于30~40℃培养24~36小时,得到一级凝结芽孢杆菌单菌落;
所述的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨5.0~15.0,酵母膏5.0~15.0,葡萄糖3.0~10.0,MgSO4.7H2O 0.5~1.5,K2HPO41.0~4.0,MnSO420~70ppm,CaCO35.0~15.0,琼脂20~30,pH为7.0;
2)凝结芽孢杆菌的二级液体培养:
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中,装液量20~100ml/500ml,在35~45℃、180~300rpm/min条件下培养25~36小时,得到二级凝结芽孢杆菌种子液;
所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨5.0~15.0,酵母膏5.0~15.0,葡萄糖3.0~10.0,MgSO4.7H2O 0.5~1.5,K2HPO41.0~4.0,MnSO420~70ppm,CaCO35.0~15.0,pH为7.0;
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养:
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.5~5%,在培养基上于35~45℃、180~300rpm/min条件下培养25~36小时,得到凝结芽孢杆菌;
所述的培养基同于步骤2)中的培养基;
4)凝结芽孢杆菌的液体发酵:
发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):氮源2~50,碳源50~150,K2HPO41.0~3.0,CaCO35.0~15.0;培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至105~121℃,并保温20~40min,自然冷却5~15min,通冷却水冷却至35~45℃,接入步骤3)中所述种子液,接种量0.5~5%,罐压0.02~0.10MPa,搅拌转速180~300rpm,通风量1∶0.2~1.0,发酵时间20~40h,直至菌数达到10亿CFU/ml。
上述步骤中所述的发酵培养基氮源为鱼粉、豆粕粉、棉籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、大豆蛋白胨、酵母膏中的一种或几种。其中,所述的鱼粉、豆粕粉、棉籽粕在使用前,本发明优选用40%甲醛蒸汽灭菌20~40分钟,粉碎至60~120目。所述的碳源为葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、麸皮中的一种或几种。
本发明所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法,进一步包括下述步骤:将步骤4)中的凝结芽孢杆菌的发酵液采取离心、微滤浓缩、添加载体保护直接离心喷雾干燥工艺,发酵液经负压真空浓缩到原体积的20~60%后,加入预先混合好的载体中,控制混合液固形物含量在10%~50%,喷雾干燥,最终物料水分3~10%。最终物料菌体得率为90%,制剂的活菌数≥1×1010CFU/g。
其中,所述的载体为有机载体和/或无机载体。所述的有机载体包括玉米芯粉、脱脂米糠、玉米蛋白粉、变性淀粉、葡萄糖中的一种或几种的混合物。所述的无机载体为石粉、沸石粉、硫酸铝钾中的一种或几种的混合物。
本发明还包括由上述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法所制得的饲料添加剂。
本发明提供的饲料添加剂及其生产工艺与现有技术相比,有明显的优点:
1)采用新型高效耐酸的凝结芽孢杆菌,耐受加工与耐受肠道生境;
2)改固体发酵为液体发酵,避免固体发酵过程中杂菌污染严重的现象,但不增加生产成本;
3)采用的凝结芽孢杆菌抗逆性好,活菌数高,可以避免贮存和运输中的活菌急速下降问题;
4)该方法采用多种物质作为碳源、氮源以及载体的来源,大大扩大了实际应用范围;
5)本方法生产成本低廉,具有显著的经济效益、社会效益和生态效益;
6)该法制备的凝结芽孢杆菌活菌制剂可以促进动物生长,提高饲料转化率,以及降低动物腹泻率的发生。
本发明上述主题范围不仅仅局限于以下实施例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范畴。
具体实施方式
实施例1制备新型芽孢杆菌液剂-Y1
1)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS 1.2407)一级斜面培养:
将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上,于30℃培养24小时,得到一级凝结芽孢杆菌单菌落;所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L):大豆蛋白胨:5.0,酵母膏:15.0,葡萄糖:3.0,MgSO4·7H2O:0.5,K2HPO4:1.0,MnSO4:20ppm,CaCO3:5.0,琼脂20;pH:7.0;
2)凝结芽孢杆菌二级液体培养
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中,装液量20ml/500ml,在35℃、180rpm/min条件下培养25小时,得到二级凝结芽孢杆菌种子液;所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨:5.0,酵母膏:5.0,葡萄糖:3.0,MgSO4·7H2O:0.5,K2HPO4:1.0,MnSO4:20ppm,CaCO3:5.0;pH:7.0;
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养:
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液0.5%(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于35℃、180rpm/min条件下培养25小时,得到凝结芽孢杆菌;所述的培养基同于步骤2)中的培养基;
4)凝结芽孢杆菌液体发酵培养
所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):豆粕2.0,葡萄糖50.0,K2HPO41.0,CaCO3:5.0;豆粕先经40%甲醛蒸汽灭菌20min,粉碎到60目后使用,发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至105℃,并保温20min,灭菌时间到后自然冷却5min,通冷却水冷却至35℃,无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子,接种量0.5%,发酵pH自然,罐压0.02MPa,搅拌转速180rpm,通风量1∶0.2,发酵时间20h。直至菌数达到10亿CFU/mL。
实施例2制备新型芽孢杆菌液剂-Y2
1)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS 1.2407)一级斜面培养:
将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上,于40℃培养36小时,得到一级凝结芽孢杆菌单菌落;所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L):大豆蛋白胨:15.0,酵母膏:5.0,葡萄糖:10.0,MgSO4·7H2O:1.5,K2HPO4:4.0,MnSO4:70ppm,CaCO3:15.0,琼脂30,pH:7.0;
2)凝结芽孢杆菌二级液体培养
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中,装液量100ml/500ml,在45℃、300rpm/min条件下培养36小时,得到二级凝结芽孢杆菌种子液;所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨:15.0,酵母膏:15.0,葡萄糖:10.0,MgSO4·7H2O:1.5,K2HPO4:1.0,MnSO4:70ppm,CaCO3:15.0,pH:7.0;
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养:
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液5%(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于45℃、300rpm/min条件下培养36小时,得到凝结芽孢杆菌;所述的培养基同于步骤2)中的培养基;
4)凝结芽孢杆菌液体发酵培养
所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):豆粕50.0,葡萄糖150.0,K2HPO44.0,CaCO3:5.0;豆粕先经40%甲醛蒸汽灭菌40min,粉碎到60目后使用,发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至121℃,并保温40min,灭菌时间到后自然冷却15min,通冷却水冷却至45℃,无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子,接种量5%,发酵pH自然,罐压0.10MPa,搅拌转速300rpm,通风量1∶1,发酵时间40h。直至菌数达到10亿。
实施例3制备新型芽孢杆菌液剂-Y3
1)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS 1.2407)一级斜面培养:
将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上,于36℃培养30小时,得到一级凝结芽孢杆菌单菌落;所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L):大豆蛋白胨:10.0,酵母膏:10.0,葡萄糖:5.0,MgSO4·7H2O:1.0,K2HPO4:0.4,MnSO4:40ppm,CaCO3:10.0,琼脂25,pH:7.0;
2)凝结芽孢杆菌二级液体培养
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中,装液量700ml/500ml,在36℃、200rpm/min条件下培养30小时,得到二级凝结芽孢杆菌种子液;所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):10.0,酵母膏:10.0,葡萄糖:5.0,MgSO4·7H2O:1.0,K2HPO4:0.4,MnSO4:40ppm,CaCO3:10.0,pH:7.0;
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养:
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液3%(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于36℃、200rpm/min条件下培养30小时,得到凝结芽孢杆菌;所述的培养基同于步骤2)中的培养基;
4)凝结芽孢杆菌液体发酵
所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):棉籽粕50.0,淀粉150.0,K2HPO42.0,CaCO3:10.0;棉籽粕先经40%甲醛蒸汽灭菌25min,粉碎到60目后使用,发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至115℃,并保温25min,灭菌时间到后自然冷却10min,通冷却水冷却至36℃,无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子,接种量3%,发酵pH自然,罐压0.04MPa,搅拌转速250rpm,通风量1∶0.6,发酵时间36h。直至菌数达到10亿。
实施例4~20制备新型芽孢杆菌液剂-Y4~Y20
表1制备新型芽孢杆菌液剂Y4~Y20
芽孢杆菌液剂 |
制备方法 |
制备种子液所用菌种 |
氮源 |
碳源 |
活菌数(×109CFU/ml) |
Y-4 |
同实施例1 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕 |
乳糖 |
1.5 |
Y-5 |
同实施例 |
凝结芽孢杆 |
磷酸二氢铵 |
蔗糖 |
1.7 |
|
2 |
菌 |
|
|
|
Y-6 |
同实施例3 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕 |
淀粉 |
1.2 |
Y-7 |
同实施例1 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕 |
玉米粉 |
2 |
Y-8 |
同实施例2 |
凝结芽孢杆菌 |
硫酸铵 |
麸皮、葡萄糖 |
2.3 |
Y-9 |
同实施例3 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕、棉籽粕 |
淀粉 |
1.9 |
Y-10 |
同实施例1 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕、棉籽粕 |
玉米粉 |
1.4 |
Y-11 |
同实施例2 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕、棉籽粕 |
葡萄糖 |
1.5 |
Y-12 |
同实施例3 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕、磷酸二氢铵 |
蔗糖 |
3.2 |
Y-13 |
同实施例1 |
凝结芽孢杆菌 |
鱼粉、豆粕 |
葡萄糖 |
4.1 |
Y-14 |
同实施例2 |
凝结芽孢杆菌 |
棉籽粕、鱼粉 |
淀粉 |
3.1 |
Y-15 |
同实施例3 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕、硫酸铵 |
葡萄糖 |
2.5 |
Y-16 |
同实施例 |
凝结芽孢杆 |
鱼粉 |
玉米面 |
4.2 |
|
1 |
菌 |
|
|
|
Y-17 |
同实施例2 |
凝结芽孢杆菌 |
鱼粉 |
葡萄糖 |
4.8 |
Y-18 |
同实施例3 |
凝结芽孢杆菌 |
棉籽粕 |
葡萄糖 |
5.0 |
Y-19 |
同实施例1 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕、大豆蛋白胨 |
葡萄糖 |
1.3 |
Y-20 |
同实施例2 |
凝结芽孢杆菌 |
豆粕、大豆蛋白胨 |
玉米面 |
1.9 |
实施例21制备新型芽孢杆菌粉剂-F1
将实施例1得到的发酵液经负压真空浓缩到原体积的20%后,加入预先混合好的载体中,载体组成为:石粉80%、玉米蛋白粉20%,控制固形物含量在10%,喷雾干燥。最终物料水分3%,物料菌体得率为90%,制剂的活菌数≥1×1010CFU/g。
实施例22制备新型芽孢杆菌粉剂-F2
将实施例2得到的发酵液经负压真空浓缩到原体积的60%后,加入预先混合好的载体中,载体组成为:葡萄糖80%、玉米蛋白粉20%,控制固形物含量在50%,喷雾干燥。最终物料水分10%,物料菌体得率为90%,制剂的活菌数≥1×1010CFU/g。
实施例23制备新型芽孢杆菌粉剂-F3
将实施例3得到的发酵液经负压真空浓缩到原体积的40%后,加入预先混合好的载体中,载体组成为:石粉50%、玉米蛋白粉50%,控制固形物含量在30%,喷雾干燥。最终物料水分5%,物料菌体得率为90%,制剂的活菌数≥1×1010CFU/g。
实施例24~40制备新型芽孢杆菌制剂-F4~F20
表2制备新型芽孢杆菌粉剂F4~F20
芽孢杆菌粉剂 |
芽孢杆菌液剂 |
制备方法 |
有机载体 |
无机载体 |
活菌数(1010CFU/g) |
F-4 |
同实例4 |
同实例21 |
玉米芯粉70% |
石粉30% |
2.0 |
F-5 |
同实例5 |
同实例21 |
玉米芯粉80% |
沸石粉20% |
4.5 |
F-6 |
同实例6 |
同实例23 |
玉米芯粉100% |
- |
3.6 |
F-7 |
同实例7 |
同实例21 |
脱脂米糠30% |
石粉70% |
2.3 |
F-8 |
同实例8 |
同实例22 |
葡萄糖30% |
沸石粉70% |
3.5 |
F-9 |
同实例9 |
同实例23 |
脱脂米糠30% |
硫酸铝钾70% |
4.2 |
F-10 |
同实例10 |
同实例22 |
葡萄糖70% |
石粉30% |
2.6 |
F-11 |
同实例11 |
同实例23 |
麦麸30% |
沸石粉70% |
2.9 |
F-12 |
同实例12 |
同实例21 |
- |
硫酸铝钾100% |
3.0 |
F-13 |
同实例13 |
同实例23 |
玉米蛋白粉50% |
石粉50% |
3.8 |
F-14 |
同实例14 |
同实例22 |
玉米蛋白粉50% |
沸石粉50% |
3.0 |
F-15 |
同实例15 |
同实例21 |
玉米蛋白粉100% |
- |
2.0 |
F-16 |
同实例16 |
同实例23 |
变性淀粉50% |
石粉50% |
2.1 |
F-17 |
同实例17 |
同实例21 |
变性淀粉70% |
沸石粉30% |
3.0 |
F-18 |
同实例18 |
同实例22 |
玉米蛋白粉20%,葡萄糖10% |
石粉70% |
2.7 |
F-19 |
同实例19 |
同实例23 |
葡萄糖20% |
石粉80% |
3.4 |
F-20 |
同实例20 |
同实例21 |
葡萄糖20% |
沸石粉80% |
2.9 |
实施例41新型芽孢杆菌制剂的耐高温性
将对酸具有良好耐受的菌株凝结芽孢杆菌添加到5%预混料和全价料中进行制粒处理,检测菌株的存活率;在80℃、90℃、100℃下制粒处理10分钟的芽孢存活率分别在100%、91.2%、83.6%,结果见表3;说明该新型芽孢杆菌可以耐受高温制粒处理而保持良好的活性。
表3新型芽孢杆菌剂在不同制粒温度下处理10min芽孢存活率结果
活菌数单位:CFU/g
实施例42新型芽孢杆菌制剂的耐酸性
凝结芽孢杆菌在人工模拟胃液(pH2.0、3.0、4.0)37℃处理2小时,菌株的存活率分别达到3.8%、24.9%和99.4%;在人工模拟胃液(pH2.0、3.0、4.0)37℃处理6小时,菌株的存活率分别达到2.1%、10.5%和52.3%;说明该新型芽孢杆菌制剂可以经过胃液后并保持相当高活性而到达肠道。
表4新型芽孢杆菌在人工模拟胃液中37℃处理2h和6h存活结果
活菌数单位:CFU/mL
实施例43新型芽孢杆菌制剂的储存稳定性
在5%的预混料中贮存6个月和12个月的存活率分别90.1%和80.6%,说明该新型芽孢杆菌储存性良好,可以在一定的时期内保持一定的活菌数量,保证活菌活性。
表5新型芽孢杆菌在5%预混料中贮藏6、12个月的存活率结果
活菌数单位:CFU/g
实施例44新型芽孢杆菌制剂在养猪中的应用
选择同批的杜×长×大三元杂保育出栏健康活泼小猪60头,根据体重及性别比例相近的原则,将小猪分为A、B、C三个组,其中A组为对照组,不设重复,B、C组为试验组,各设2个重复,每组12头,公母各半,分头编号;A组饲喂常规玉米-豆粕型日粮,不添加微生态制剂;B组在A组基础日粮的基础上添加0.1%的新型芽孢杆菌制剂;C组在A组基础日粮的基础上添加0.1%产酶益生素。试验猪处理及分组情况详见表6。
表6试验猪分组处理情况
试验结果与分析
(1)试验猪只体重和平均日增重(见表7)
表7各试验组猪只体重及增重
表7是各处理组猪只体重、净增重和平均日增重。从上表可见,在试验初期,各组猪只体重差异均不显著(P>0.05)。试验期间A组、B组、C组日增重分别为:579克、674克、607克,添加新型添加剂的试验B组平均日增重比对照组提高14.09%,添加产酶益生素的试验C组平均日增重比对照组提高4.61%。
(2)试验猪只耗料及饲料转化率
表8各试验组猪只的料肉比情况
由表8可知,添加新型芽孢杆菌剂的B组,料肉比优于对照组。
(3)试验期间小猪腹泻情况
表9小猪腹泻头数及腹泻率
*腹泻率=腹泻头数/总头数
由表9可知,试验期间腹泻率表现为对照组最多,试验C组其次,试验B组最少。
以上将新型芽孢杆菌剂添加入猪料中的饲喂效果表明该菌剂在增加体重、减少料肉比、特别是减少腹泻的发生具有良好的作用。
实施例45新型芽孢杆菌制剂在肉鸡中的应用
饲养肉鸡,在1日龄入雏时和4周龄末(28日龄)、7周龄末(49日龄)分别以重复为单位称重,并统计耗料量,计算0~4周和4~7周龄的死亡只数、增重、采食量以及料肉比。结果见表10。
表1049日龄添加新型芽孢杆菌剂对肉仔鸡生产性能的影响
组别 |
增重(kg) |
采食量(kg) |
料肉比 |
A(空白对照组) |
2.331±0.072 |
5.190±0.004Aa |
2.227±0.073 |
B(抗生素对照组) |
2.340±0.091 |
5.184±0.008Aa |
2.210±0.092 |
C(添加新型芽孢杆菌剂0.1%) |
2.380±0.118 |
5.184±0.004Bb |
2.178±0.121 |
表10的数据表明,C组鸡的体重比空白对照组提高49克,比抗生素组提高40克,同时,C组鸡的耗料量也明显低于其他组。说明添加新型芽孢杆菌添加剂可明显提高肉鸡的增重,也能提高饲料转化效率,节约饲料开支,提高经济效益。