CN101380338B - 富含原花色素的提取物和相关制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从富含原花色素的水果或植物或已经预纯化的提取物获得包含高含量原花色素的提取物的方法，以及用该方法制备的提取物。所述方法包括以下步骤：用含水乙醇处理富含原花色素的压碎的水果或植物或已经预纯化的提取物；过滤所得的混合物；真空浓缩所述过滤溶液；用去离子水稀释浓缩的产物；过滤稀释的产物；将过滤溶液上样到大网络的脂肪族交联聚合树脂上；用去离子水冲洗所述树脂；用含水乙醇洗脱所述树脂；浓缩洗脱溶液并干燥浓缩的产物。本发明所述的方法可以容易地在工业化规模上实现。

Description

富含原花色素的提取物和相关制备方法
技术领域
本发明涉及包含高含量原花色素的提取物和使用富含原花色素的压碎的水果、植物或已经预纯化的提取物作为起始反应物的相关制备方法。
背景技术
原花色素，即缩合的鞣酸是广泛存在的，并且是最丰富的自然酚衍生物之一。原花色素是包含通过C4-C8或C4-C6键相连的黄烷-3-醇的重复单元的寡聚物和聚合物的混合物。黄烷-3-醇单元可能还通过C2-O7(A型)间另外的双键双连接。原花色素的大小通过聚合程度(DP)来确定。
原花色素中最常见的黄烷-3-醇是阿夫儿茶素(Afzalechin)、表阿夫儿茶素(epiafzalechin)、儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素。完全由儿茶素和表儿茶素构成的原花色素称为原花青定(procyanidin)，其中包含阿夫儿茶素和表阿夫儿茶素或没食子茶素和表没食子儿茶素的是原天竺葵定(propelargonidin)和原翠雀定(prodelphinidin)。原花青定在自然中是最丰富的。
在文献中报道的原花色素的生物活性包括抗癌，抗炎症，抗衰老，抗氧化，抗过敏，抗菌特别是泌尿道的，促进头发生长等(Bart Schwitters/JackMasquelier“21st century Biophylaxis substance OPC”，Fragrance Journal，50-135(1997).；Tomoya Takajashi et al.，Journal of inverstigative dermatology112(310.316(1999)))。
已有很多方法用来从植物或不同来源的水果如酸果蔓(Vacciniummacrocarpon)、葡萄籽、茶叶、花生、松树皮制备富含原花色素的提取物。
这些方法中一些包括利用无机酸存在下以含水醇性溶剂进行的提取步骤，比如CN1454896中方法，或者它们包括如在CN174923中公开的超临界的溶剂如CO2的使用，或者它们需要使用超滤膜或包括在JP63267774方法中公开的反向渗透过滤。其它方法需要多步提取步骤的结合，使用要么单独要么彼此结合的几种有机溶剂，与至少一步结合，在其中包含提取物的溶液被吸附到大网络的多聚树脂上，吸附的液体随后如在US6608102、US 6,440,471中描述的方法来洗脱、浓缩并雾化。
根据其它的方法，可能获得含有很高含量原花色素的提取物。如利用CA2539724中公开的方法可能获得从80％到90％的总原花色素含量和其中寡聚物原花色素(OPC)含量从23％到45％的提取物，其中CA2539724包括利用至少两种的吸附树脂处理像松树皮或提取物或其汁液的植物，其中两种树脂在至少一个下列特点方面不同，即材料种类、孔径、特定的表面面积和分子质量分布范围，或利用在EP1602653中公开的方法可能获得具有从67％到85％的总原花色素含量和从12.5％到51％的OPC含量的提取物，所述EP1602653包括使一种提取物或压榨出的植物汁液与一种盐或生物碱处理和合成吸附树脂处理相结合。
尽管能获得具有高滴度的原花色素的现有技术方法有很多，商业可获得的提取物具有不超过7％的原花色素滴度。
所以这意味制备具有高滴度的原花色素提取物的现有技术方法并不容易在工业化规模上实现，因为很多原因，如毒性提取物的使用，溶剂或长时间(大约24h)的极端提取温度(大约100℃)，在加压仪器下如超临界的液体下的使用，或超滤膜的使用。
因此需要有一种不受现有技术方法缺点影响的高原花色素滴度的提取物的制备方法，而且因此可以容易的在工业化规模上可实现。
发明内容
本申请创立了一种在工业化规模上可容易实现的方法，能够获得具有高滴度的原花色素的提取物。
这个方法能够获得富含原花色素的提取物，起始于已经预纯化的富含原花色素的提取物或水果或植物，并包括以下的步骤：
a)在室温以乙醇含量为以体积计50％到80％的含水乙醇提取包含高含量原花色素的压碎的水果或植物或已经预纯化的富含原花色素的提取物，
b)过滤来自步骤(a)的混合物，
c)在真空下浓缩过滤的来自步骤(b)的溶液，
d)在从5到24小时的时间范围内，任选的存贮来自步骤(c)的浓缩的产物，所述产物预先任选的用去离子水稀释，
e)用去离子水稀释来自步骤(c)的浓缩存贮产物，如果用水稀释在步骤(d)中没有进行，则用去离子水稀释来自步骤(d)的浓缩存贮产物，
f)过滤来自步骤(e)中的混合物，
g)将溶液上样在大网络的脂肪族交联聚合树脂上，
h)用水冲洗所述树脂，
i)用具有乙醇含量为以体积计50％到80％的含水乙醇洗脱来自步骤(h)的大网络的脂肪族交联聚合树脂，
j)在真空下浓缩来自前一步骤的洗脱溶液，
k)真空干燥或喷雾干燥来自步骤(j)的浓缩产物。
本方法允许包含超过10％的原花色素的提取物，优选的超过15％，更优选的超过20％，通过利用通过含水乙醇的温和的提取条件和同时在解吸附步骤使用像含水乙醇的非毒性溶剂的仅一种利用大网络的聚合树脂吸附法。
附图说明
图1记录了HPLC层析，
图2用每个峰的mg/ml表示的保留时间、面积、相应的浓度，和最后在实施例1中描述制备的分析样品的终浓度。
具体实施方式
本发明的富含原花色素的水果或植物，我们指如酸果蔓、苹果、黑莓、葡萄、李子、石榴、覆盆子、草莓、蚕豆、扁豆、茶。
优选的根据本发明的方法，酸果蔓(vaccinium macrocarpon)用作起始材料。
在步骤(a)中提取溶剂优选具有以体积计从60％到75％的乙醇浓度，更优选的70％。
提取时间优选的在10分钟到2小时间，更优选的30分钟。
当在步骤(a)中压碎的水果或植物用作起始材料，根据本发明的方法包括进一步的步骤，其中来自提取步骤(a)所述的压碎的水果或植物在进行步骤(b)利用含水乙醇的过滤前被压榨。
步骤(d)是任选的步骤，不管怎样，当进行此步骤时，存贮时间优选地为8小时至20小时，更优选地15小时。
利用去离子水冲洗包括吸附的溶液的树脂，即进行本发明方法的步骤(h)是为了去除糖和酚酸。
如果水果也富含花色素，本方法在利用水冲洗的步骤后可能包括进一步的冲洗步骤，以具有乙醇含量为60％(体积/体积)的含水乙醇来去除树脂中的花色素。
在步骤(i)洗脱溶剂的浓度，即含水乙醇具有以体积计从60到75％的乙醇浓度，更优选的以体积计70％。在所述步骤中使用的大网络的脂肪族的交联树脂可选自已知的和商业可获得的。
步骤(j)优选地在真空下包括35到45℃间，更优选地在40℃的温度下实行。
本申请也优化了在最终提取物中利用HPLC确定原花色素的滴度的分析方法。
本方法包括两步单独的步骤：
1.待分析的提取物的纯化
2.分析。
步骤1：待分析的提取物的纯化
葡聚糖凝胶LH20柱的制备
10g的葡聚糖凝胶LH20用去离子水(约50ml)在至少3小时后膨胀，然后导入Pharmacia Biotech出售的C16玻璃柱。树脂用约130ml的去离子水冲洗。
待上样到葡聚糖凝胶LH20树脂的溶液的制备
为了获得上样到柱上的在λ＝280nm处吸收的化合物的主旨(tenor)通常大约相同，进行分光光度计测量。
提取物或溶液在20％的甲醇中稀释来获得在λ＝280nm从32到48的吸收值(或在1/50ABS＝0.8±20％处稀释之后)。
在葡聚糖凝胶LH20上的纯化
用20％的甲醇稀释吸收值包括在前述范围内的溶液，在4000rpm下离心15min。
20ml慢慢倒出的这种溶液被上样到上述的树脂并且进行后面三步洗脱：
洗脱1，80ml 20％的甲醇，
洗脱2，160ml 60％的甲醇，
洗脱3，240ml 100％的甲醇，
这些洗脱溶液在约2ml/min的流速下操作。来自洗脱1和洗脱2的洗脱溶液被舍弃。
来自洗脱3的第一个20到30ml溶液被舍弃，然后收集剩余的洗脱溶液。
溶剂通过从洗脱溶液的蒸发来去除，并且干燥获得的残留物。
干燥的提取物为了通过HPLC来分析在具有以体积计79∶29.5∶0.5的丙酮/水/醋酸混合物中被稀释，为了获得包括在1到1.7ml间的终浓度，该体积用V1表示。
2.HPLC分析
校正表
用于原花色素分析的标准品是原花青定B2(表儿茶素4β→8)。
下列溶液如在下表中记录地制备
  溶液   原花青定B2   丙酮/水/醋酸(79∶29.5∶0.5)(ml)
  1   0.15   10
  2   0.75   5
  3   1.7   5
  4   0.6   1
  5   0.9   1
原花青定B2浓度的校正
CB2＝(m×1000)/V
其中CB2是单位为mg/l的原花青定B2浓度
m是单位为mg的原花青定重量
V是单位为ml的丙酮/水/醋酸的体积
HPLC条件
柱：
Luna silica 5μm(250×4.6mm)Phenomenex
探测套筒(？Cartouche de garde)3mm
洗脱溶剂：
溶剂(A)：甲醇
溶剂(B)：二氯甲烷
溶剂(C)：醋酸/水(1∶1)(V/V)
  洗脱时间   溶剂(A)(％)1   溶剂(B)(％)1   溶剂(C)(％)1
  0   14.0   82.0   4
  20   23.6   72.4   4
  50   35.0   61.0   4
  55   86.0   10.0   4
  65   86.0   10.0   4
  70   14.0   82.0   4
1以体积计
洗脱流速：1ml/min
柱温度：37℃
光谱范围：200-700nm
波长：λ＝280nm
注入体积＝5μl
标准溶液分析
前述的标准溶液利用HPLC分析。
在分析后，校正表被插入HPLC软件(作为原花青定B2浓度函数的面积)
样品分析
在丙酮/水/醋酸(79∶29.5∶0.5)中稀释的样品利用HPLC分析。
层析分析
在纯化和HPLC分析后获得的酸果蔓vaccinium macrocarpon利用质谱法鉴定，原花色素为具有从13.5到50分钟的保留时间的峰。
整合方法来自于“Fraction of polymeric from low bush blueberry andquantification of procyanidins in selected foods with optimized normal phaseHPLC MS fluorescent detection method”(利用优化的正常相HPLC.MS荧光探测方法对来自灌木南方越橘的多聚物分馏和在选定的食物中原花青定的定量)，(Gu L.Kelm et al J.Agr，Food Chem.2002，50，4852-4860)。
从试验的开始到终点，它存在于水平的基线。从相邻的寡聚物的峰间的谷底的最低点画一条垂直的线到水平基线。曲线包围的面积在两个相邻的垂直线达到峰值，与水平基线结合在一起。这个面积必须包括在上述的校正表内。
获得数据的分析
HPLC软件允许计算分析溶液的原花色素浓度(mg/l)。
原花青定B2的校正表允许具有相应于每一个峰面积的原花色素浓度。
每一个峰的原花色素的浓度被加和，结果对应分析溶液的原花色素的浓度(mg/l为单位的CLUE)。
即，上样到葡聚糖凝胶上溶液的原花色素C(mg/l)的浓度，以原花青定B2的当量表示，应用下述方程可以获得：
C＝(CLUE×V1)/20
其中V1：分析溶液的体积(1-1.7ml)
我们这里以下记录用于说明但不是局限目的制备的实施例，其从压碎的酸果蔓(实施例1)开始和从已预纯化的提取物(实施例2)开始。
实施例1-来自压碎的酸果蔓的富含原花色素的提取物
50kg的压碎的酸果蔓(vaccinium macrocarpon)、100l的含水乙醇70％(V/V)搅拌30min，此后压榨压碎的水果并且全混合物在25μm的筛下过滤，从而获得重约120kg的清澈乙醇提取物。
在真空下40℃的温度浓缩乙醇提取物，从而获得重约10kg的残留物。然后其用10l的去离子水稀释从而获得重约20kg的稀释的提取物，其存贮于室温15小时。
稀释的提取物然后在10μm的筛下过滤。
25l商业化的大网络的脂肪族交联聚合树脂利用75l的去离子水冲洗，然后它们被上样到玻璃柱并且添加20kg前述的过滤的含水溶液。具有吸收提取物的树脂用100l的去离子水冲洗，然后用100l的以体积计70％的乙醇洗脱。
洗脱的溶液然后在真空下在40℃浓缩，获得大约20kg的浓缩提取物，其最后被雾化来获得粉末。
提取物用上面记录的分析方法分析，图1和2记录HPLC层析，每一个峰的保留时间、面积和以每个峰的以mg/ml表示的相应的浓度，和最后的为6824.24mg/l的原花色素或CLUE的总浓度。
V1＝1.7ml(通过HPLC总共分析的溶液)。
因而如果我们应用上述方程
C＝(CLUE×V1)/20
C＝6824.24×1.7/20＝580.06mg/l
含水乙醇(MeOH 20％)溶液利用201.5mg的最终提取物来制备，其体积V2等于72ml。
580.06×0.072＝41.76mg的原花色素
(41.76/201.5)×100＝20.73％
实施例2-从已经预纯化的提取物中制备的提取物
在本试验中使用的酸果蔓提取物是EXOCYAN CRAN 10，由Tournaytechnologies批次No L7015生产，用上述公开的方法分析。原花色素含量：7％
607.7mg的酸果蔓提取物利用100ml的70％(V/V)处理30分钟。过滤溶液，然后在真空下利用实施例1的方式浓缩，并贮存过夜。
浓缩的溶液用10ml的去离子水稀释然后过滤。
溶液被上样到商业大网络的脂肪族交联树脂，然后用水(200ml)冲洗并用70％的乙醇溶液洗脱，获得溶液在真空下浓缩。
干燥获得的浓度然后分析最终获得的提取物(158.2mg)。利用上述方法评价其原花色素含量为18.0％。
因而在最终提取物中的原花色素含量比在起始提取物中高2.6倍。

Claims (12)

1.一种从含原花色素的水果或水果的已经预纯化的提取物获得含原花色素的提取物的方法，其中所述水果是酸果蔓(Vaccinium macrocarpon)，该方法包括以下步骤：
a)用具有以体积计50％到80％乙醇浓度的含水乙醇处理压碎的酸果蔓或酸果蔓的已经预纯化的提取物，
b)过滤来自步骤(a)的混合物，
c)在真空下浓缩来自步骤(b)的过滤溶液，
d)任选地在从5到24小时时间范围内存贮来自步骤(c)的浓缩产物，所述产物预先任选地用去离子水稀释，
e)用去离子水稀释来自步骤(c)的存贮产物，或者在步骤(d)中没有进行用水稀释的情况下，则用去离子水稀释来自(d)的浓缩的存贮产物，
f)过滤来自步骤(e)的混合物，
g)将溶液上样到大网络的脂肪族交联聚合树脂上，
h)用去离子水冲洗所述树脂，
i)用具有以体积计从50％到80％乙醇含量的含水乙醇洗脱来自步骤(h)的大网络的脂肪族交联聚合树脂，
j)在真空下浓缩来自前一步骤的洗脱溶液，
k)真空干燥或喷雾干燥来自步骤(j)的浓缩产物，
其中所述的步骤(a)进行的时间在10分钟到2小时的范围内。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的所述含水乙醇具有以体积计从60％到75％的乙醇含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的含水乙醇具有以体积计70％的乙醇含量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将所述步骤(a)进行30分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其中经乙醇处理的压碎的水果在进行步骤(b)前被压榨。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(d)的存贮时间包括8小时到20小时之间。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的存贮时间是15小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)中使用乙醇含量为以体积计从60％到75％的含水乙醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的含水乙醇具有以体积计70％的乙醇含量。
10.一种含原花色素的提取物，其中所述提取物用权利要求1所述的方法制备。
11.根据权利要求10所述的提取物，其中所述原花色素的含量高于15％。
12.根据权利要求10所述的提取物，其中所述原花色素的含量高于20％。
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