CN101367863A - 获得植物蛋白质和/或肽的方法、根据所述方法生产的蛋白质和/或肽、及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及获得植物蛋白质和/或肽的方法,以及根据该方法制备的蛋白质、肽和/或其混合物,及其用途,所述方法包括以下步骤:a)制备在含水基质中包含植物蛋白质和/或肽的起始材料;b)任选地从所述含水基质除去固体组分和/或净化所述含水基质;c)通过吸附到至少一种由合成聚合物制成的离子交换膜上从含水基质分离蛋白质和/或肽;d)任选地漂洗离子交换膜,以便除去杂质;e)用至少一种洗脱液从离子交换膜解吸蛋白质和/或肽;f)从洗脱液分离蛋白质和/或肽;和g)任选地干燥分离的蛋白质和/或肽。

Description

获得植物蛋白质和/或肽的方法、根据所述方法生产的蛋白质和/或肽、及其用途
技术领域
本发明涉及获得植物蛋白质和/或肽的方法、根据所述方法生产的蛋白质和/或肽及其混合物、及其用途。
背景技术
动物蛋白质和植物蛋白质二者都已知用于人类消耗。然而,动物蛋白如鸡肉蛋白质和牛奶蛋白质如酪蛋白或乳清可能涉及BSE、禽流感和其它疾病的问题。动物蛋白还经常涉及触发变态反应,即使有些本身不是基于蛋白质,例如在乳糖不耐受的情况中。
植物蛋白质涉及基因修饰生物体(GMO)的问题、它们的营养价值问题和同样地具有触发变态反应的问题。公知的植物蛋白质是大豆蛋白质。植物蛋白质经常涉及的另一个问题是味道的问题,例如在大豆情况中,使得它们用于食物的可能性受到严格限制。同样地,其它植物蛋白质例如得自油菜籽、羽扇豆或马铃薯的那些植物蛋白质的用途至今尚未广泛展开。在油菜籽和豆科植物的情况中,这种尚未广泛展开的原因可能尤其是因为这些起始原料的脂肪含量引起酸败。
从化学的观点,标准商用产品(其还包含许多其它期望的和不期望的物质)的蛋白质内含物由许多不同的蛋白质和肽分子组成,其首先可以从现象学上粗略分为球蛋白和白蛋白。球蛋白的形状为球形,使得它们相当紧凑并且不溶于水,或者至少是不易溶解。白蛋白是开放的,形状上更加不规则,因此可溶于水。可溶性蛋白质通常被归入白蛋白。另外,标准的商用蛋白质天然地还包括具有不同分子量的蛋白质和肽分子。这使得它们在处理时相当复杂,例如,从食品工艺学的观点,只能根据氨基酸谱进行健康评价。
标准的商用蛋白质的一个共有特征在于它们包括不同的蛋白质和肽分子的混合物,并且它们另外包含来自最初的植物起始材料的与蛋白质不同的组分。这些包括例如糖苷、毒素(配糖生物碱、胰蛋白酶抑制剂等)、抗营养物质例如植酸,其从人和动物消化的范围中除去钙和铁矿物质,因为它们被排除并且不能在肠道中吸收。还包括脂肪和油类(其中有一些是化学结合于脂蛋白),和矿物质。
至今,足够廉价以得到更广泛应用的纯的蛋白质或肽没有多少,例如对于健康营养或作为非处方药物。其原因特别地在于使用了来自药物工业的昂贵的加工方法。价格昂贵和可用性非常有限的另一个原因是得自哺乳动物或人类分泌的蛋白质分子(例如,血清)的出处,其所有都包含低浓度的期望的作用蛋白质并且它们自己只以有限量可用。
US 2003113829,US 2003092151,US 2003092152,US 2003092150和US 2003077265首次描述了如何从来自植物原料的蛋白质混合物以相对纯的形式分离单独的蛋白质组,在这种情况中,植物原料是马铃薯。
它们还描述了原料的选择;通过加热、冷却、离心和过滤马铃薯汁从马铃薯蛋白除去Kunitz、Bowman-Birk和羧肽酶抑制剂的方法;通过使用酸提取剂以及将提取溶液中的植物性材料磨碎扩展该方法,以便得到蛋白酶抑制剂II;在提取过程中通过滤除马铃薯碎片、加热提取溶液、监控温度、时间和盐浓度、离心和薄膜过滤控制蛋白酶抑制剂II的收率和纯度的方法;在该工艺的变体中分离和纯化蛋白酶抑制剂II。
然而,已知的工艺中的一个缺点在于尽管制备了单独的蛋白质或至少较窄限定的蛋白质组,但是这些工艺仍然是非常复杂的、耗时的、费力的和昂贵的。另一个缺点在于需要专门选择马铃薯。结果,不仅原料的可用性受到限制,而且由于需要分析控制,必须有另外的、复杂的、耗时的和昂贵的中间步骤。此外,后勤工作是复杂的和耗时的,因为马铃薯必须在新鲜的情况下加工而不能储存。此外,在已知的工艺中蛋白质可以遭到破坏,因为需要大量的热能,因为在稀释的提取溶液中进行加工,并且必须长时间维持高温,使得另外需要大的容器。同样地,在随后的步骤中,需要额外的能量,因为要加工的材料必须被冷却到大约室温,以进行随后的工艺步骤。提取需要有机酸,这在流出物中对环境造成负担。另外,植物性材料必须麻烦地被切碎为大小约100μm到1,500μm的颗粒。在提取以及加热阶段之后,需要多个步骤分离固体,以便从蛋白质溶液中除去凝固的或不溶的植物性材料和进行超过滤的最终分离阶段。已知的方法最终只得到很少的蛋白质,尤其是在约3小时的时间内经过100℃加热作用后仍不变性的那些。最后,已知的方法只是主要得到满足上述标准的蛋白质,即,蛋白酶抑制剂II和羧肽酶抑制剂。
发明内容
本发明要解决的问题是提供可以克服现有技术缺点的获得植物蛋白质和/或肽的方法。同样地,意在提供有可能在更广泛的原料基础上得到植物蛋白质和/或肽的方法,即,不仅可以得自马铃薯,而且可以得自通常包含蛋白质的植物。特别地,目的在于实施该方法的方式应该有可能对环境有很小影响,不消耗许多能量,并且简单和廉价,在工艺中得到任何蛋白质和肽(纯物质或者混合物)而对方法本身不会施加任何限制。
其它问题在于提供根据该方法制备的蛋白质和/或肽,以及在于说明可能的用途。
这些问题通过权利要求1的方法;权利要求19的蛋白质、肽、或其混合物;和权利要求20的可能的用途得以解决。优选的实施方案可以从各自的从属权利要求得到。
附图说明
附图1表示在根据本发明处理之前马铃薯汁中全部蛋白质在凝胶上进行SDS-PAGE的表现
已经意外地发现,与现有技术的方法形成对比,本发明的方法完全不需要将植物切碎、加热和冷却步骤、和用有机添加剂提取而可以实施。特别地,对于要得到的蛋白质和肽的选择没有限制。特定的蛋白质和/或肽的目标选择可以通过控制用于所选目的的方法、通过设置精确的工艺参数来实现。由于该方法,可以得到没有任何比例的异源蛋白的纯蛋白质、或者蛋白质的任何广泛的混合物,其在吸附工艺过程中行为相似。因此,根据本发明可以通过解吸步骤随意调整蛋白质的纯度,例如,以渗析步骤的形式进行。这可能是有利的,尤其是当初产品的质量足以用于医学应用,并且只是最后的包装必须在无菌的GMP条件下进行,其为该方法的操作者不能或者不希望满足的操作。
换句话说,使用本发明的方法,可以用非常温和的加工步骤实现将植物起始材料的蛋白质和/或肽分级为单独的蛋白质或肽或相似蛋白质的小组,但是仍有可能得到非常广泛的产品种类,并且不需要昂贵的或者复杂的工艺步骤。
显而易见的一个特别的优点在于,根据本发明,将离子交换剂组固定在膜而非聚合物珠上。离子交换膜的使用引起高的流速、没有或者很少淤塞、和非常迅速的装填,因为不需要扩散、由于缓冲溶液和洗脱液的化学品的用量降低、容易处理和简单的按比例扩大、和有可能同时改变阴离子和阳离子交换剂,因为它们结合于本发明的不同膜。
特别地,本发明的方法有可能只使用一种离子交换膜,并且可以是阳离子或。不言而喻,还可使用阴离子和阳离子交换膜的组合。这些可各自为任意组合的弱或强的酸或碱。可以想像,可以串联或并联布置多个阳离子交换膜和/或多个阴离子交换膜。然而,同样可以想象,可以将所有的阳离子交换膜和所有的阴离子交换膜窜联布置,然后将两组并联布置。还考虑了相反的方法,将阳离子交换膜和阴离子交换膜在它们的各自的组中并联布置,然后将两个组窜联布置。这意味着,根据本发明所有可以想象的变化都是可能的并且都包括在本发明的范围内。
将离子交换剂组结合于膜的其它优点如下:
-高的装料密度允许以小的体积包装,这意味着与例如固定在多孔性聚合物珠上(将其置于容器内的带孔板上,其中原料围绕它们流动)相比降低成本。
-待吸附的分子不需要发生毛细管扩散和Fick扩散到达离子交换剂分子,这些扩散发生在使用由合成或天然聚合物制成的多孔性聚合物珠的情况中。所有都是以对流形式发生,因为装载溶液直接流过具有电荷载体的膜。结果,吸附过程显著地更快发生。在循环操作时,有可能通过具有电荷载体的膜和孔若干次,其显著地促进了吸附过程以及解吸过程。吸附剂膜可以再利用若干次并且容易清理。
-根据要处理和吸附的液体和物质的特征,可以在普通过滤、微滤、超滤和纳米过滤之间随意调整膜的孔宽。因此有可能不出现在离子交换树脂的聚合物珠孔的情况中的阻塞或堵塞。
-有许多不同的合成膜材料可用,选择几乎是不受限制的,使得有可能在宽范围内调整压力(跨膜的)、温度和pH的工艺参数组合。
-可以使组件结构适应方法,所述组件由膜构成并且决定膜工艺的技术结构:板式、交叉流动式或盘绕式组件。尤其是可以就保留在膜上的固体的粘性方面进行选择。如果太低,则优选使用盘绕结构类型的组件,其中可以以小体积方式安装大的膜面积,因此使其为最廉价的组件类型。
-组件可以分批或循环方式操作。在第一种情况中,只能泵入作为渗透物从系统出来的相同量的载荷溶液。如果渗透流停止,则必须从膜将残余物除掉,例如,通过漂洗。在循环模式中,载荷溶液在回路形式的组件和贮藏容器之间运转,使得载荷溶液可以通过膜若干次。连续地从贮藏容器取出包含在残余物中的固体,使得在两个清理周期之间组件中存在静态情况。
在下文中,参考优选实施方案描述本发明方法的单独的工艺步骤,尽管不希望将本申请的主题限制于优选实施方案。
以马铃薯作为植物起始材料描述本发明的获得植物蛋白质和/或肽的方法。在全世界约2,000种马铃薯中,有约50种适合得到淀粉,因为它们包含不成比例的大量淀粉,通常为17到22重量%。然而,原则上,任何马铃薯种都适合于根据本发明的方法得到蛋白质和肽。
在将马铃薯清理之后,获得淀粉的第一个工艺步骤是将马铃薯磨成细浆料。然后,从该浆料的固体、淀粉和纤维中分离包含蛋白质和/或肽的马铃薯汁(马铃薯果实水)。可以通过例如离心或者在水力旋流器中分离淀粉和纤维。得到的马铃薯汁包含约20g/L的马铃薯蛋白质,其中约40%是patatin(其是主要的贮藏蛋白,糖蛋白的一种),约50%是蛋白酶抑制剂(PI),和10%是高分子量蛋白质(包括多酚氧化酶、激酶和磷酸酶)。patatin具有40到44kDa的分子量,并且包括363个氨基酸。在7到9的pH条件下,其形成80到88kDa大小的二聚体。PI是具有不同蛋白质的七个亚类的不同类。它们在马铃薯中的功能是蛋白质降解,因此它们在保卫块茎免受微生物害虫和昆虫方面有重要的作用。已经观察到蛋白质降解的预防在动物模型中为生长抑制;在抗癌效果正在讨论,并且在一些情况中商业上宣传通过PI II促进饱食感。PI的主要类别是PI I、PI II、马铃薯半胱氨酸PI(PCPI)、Kunitz PI(PKPI)、羧肽酶(PCI)、丝氨酸PI(OSPI)和马铃薯天冬氨酰PI(PAPI)。
然后将得到的马铃薯汁在微滤膜装置中净化。在该工艺中,膜的孔宽可以随意选择,并且可以适合于要得到的期望的产品。还有可能通过任何类型的离心机对得到的马铃薯汁进行净化处理,例如,条件是获得专门包含溶解的组分的净化离心液。除步骤g)中的干燥之外,这些和以下步骤在低于蛋白质和/或肽的凝固温度或变性温度进行,优选在低于30℃的温度下进行。
本发明方法的要素是通过吸附在至少一种由合成聚合物制成的离子交换膜上而从含水基质分离蛋白质和/或肽,在这种情况中含水基质为马铃薯汁。这种膜的实例是可以在Sartorius公司的名称下商购。
根据本发明,有可能在步骤c)中通过吸附只从含水基质分离蛋白质和/或肽的一部分。这与使用的阳离子或阴离子交换膜密切相关。同样可以想象的是,在步骤c)之前,可能已经通过变性/凝固分离了不需要的或不需要更精确分离的一些蛋白质和/或肽。变性/凝固可以通过例如使用有机溶剂改变pH或通过盐析进行。
同样重要的是,在已经预先从膜上任选地漂洗掉马铃薯汁的残余物之后,通过特别改造的洗脱液将结合于离子交换膜的蛋白质和/或肽靶向解吸。
为了固定阴离子型蛋白质,可使用具有阳离子基团(例如三甲基)的离子交换膜,而对于阳离子性的蛋白质,在离子交换膜中应该存在有阴离子基团,例如磺甲基。
为了对吸附剂膜提供机械性保护,并且,还为了延长其使用寿命,作为预备步骤,建议如上所述除去固体以及悬浮或分散的颗粒。这可以通过离心机或通过过滤进行,后者(过滤)的标准孔径可以达到微滤。使用0.2μm适当孔径大小的微滤的优点在于允许所有的蛋白质通过,但是同时同样地除去还存在于包含蛋白质的溶液中的任何微生物,由此使介质被消毒。然后,通过在膜吸附剂组件中泵送滤液、渗透液或澄清的蛋白质溶液使蛋白质和/或肽吸附在膜上。在这方面,各种各样的工艺变体都是可能的。首先,阳离子和阴离子交换膜组件可以并联或串联布置。吸附剂膜可以构成为板式、交叉流动式或盘绕式组件系统。包含蛋白质的载荷溶液可以在一端闭塞的工艺或循环循环工艺中递送。前者不可避免地是分批次工艺,而后者可以分批和连续地进行。吸附剂膜的孔宽可以随意选择,尽管建议其不小于预过滤阶段的孔,因为否则的话有材料以残余物的形式积累在吸附剂上的危险,其随后必须在另外的漂洗步骤中除去,因为其包括可能的产品,这也意味着收率损失。当吸附剂膜完全地被蛋白质分子占据时(这可以容易地通过分析测定,例如通过测量膜的流出物的导电率,或者在一端闭塞的操作中,测量流出物本身的导电率),间断载荷溶液的供应,并且可以任选地清洗膜以除去杂质。清洗也可以用水或清洁液进行,但是后者不应使蛋白质变性。
然后,如在常规的色谱法过程中的,使用一种或多种洗脱液选择性地解吸附着于膜的产品。这优选使用盐溶液进行,其组成和浓度根据要被洗脱的蛋白质和肽而定。典型地,使用氯化钠和氯化铵溶液,尽管此处的选择实质上是不受限制的并且由蛋白质的特征决定。还有可能加入缓冲盐或缓冲溶液,例如,磷酸盐缓冲液。为了不使蛋白质变性,它们只应当以低浓度存在于洗脱液中。因此,干燥之前的浓缩步骤是有利的。此外,可以通过用蒸馏水或自来水漂洗随意调整用这种方法分离的蛋白质的纯度。如果将循环模式的板式、交叉流动式或盘绕式组件系统中的超滤膜用于这些这两种工艺步骤,则在这种情况下可以同时地进行过滤和浓缩,例如通过连续不断地向贮藏容器中加入一定量的漂洗水,其量至多为通过超滤膜孔的渗透液。可以通过测量渗透液的电导率有效地监控纯度。
在随后的工艺步骤中,从洗脱液分离产品,例如通过在具有适当孔宽的膜上干燥或分离洗脱液和蛋白质分子,优选其扩展到超滤或纳米过滤的范围,甚至扩展到反向渗透、渗滤(diafiltering)和浓缩或只是浓缩或只是渗滤。
作为最后的步骤,任选地随后进行干燥,优选使用温和的冷冻干燥或喷雾干燥。其它类型的干燥同样是可能的,尽管应该避免强烈的加热效应,因为这可以导致对产品产生破坏。
具体实施方式
以下实施例进一步更详细地说明本发明的方法。
实施例1
结合能力为0.4mg蛋白质/cm2的表面积80m2的阴离子交换剂组件可以结合320g蛋白质。马铃薯汁中有50%的蛋白质是PI,为约10g/l。在施加321马铃薯汁之后,容量则耗尽。以典型的300l/h的流速,这需花费约6.5分钟。然后,可以洗脱PI蛋白质。
实施例2
结合能力为0.25mg蛋白质/cm2的表面积80m2的阳离子交换剂组件可以结合200g蛋白质。马铃薯汁中有40%的蛋白质是patatin,为约8g/l。完全结合来自11马铃薯汁的patatin需要3.3m2的膜。因此,在330m2的膜上可以吸附来自1251马铃薯汁的1kg patatin。然后,可以洗脱patatin。
实施例3
本发明的一个主要优点是膜吸附剂以及冲洗液和洗脱液都可以再利用的可能性。
表面积15cm2的阳离子交换剂组件加载1.5ml浓度为10mg/ml的BSA溶液(BSA=牛血清白蛋白)。这略低于约20mg的最大载荷。通过加载、漂洗、洗脱和漂洗进行确定长期稳定性的方案。漂洗液体是pH7的50mM磷酸钾缓冲液,洗脱液是在相同缓冲液中的1M NaCl溶液。一个循环需要21.5分钟。在该时间过程中,自然地发生洗脱峰变宽,并且直到65次循环是可能的,膜没有堵塞,并且没有发生任何破裂。如果漂洗步骤延长5分钟,则有可能不经清理进行超过100次循环。在第108次循环时发生堵塞。在用0.5M氢氧化钠溶液清理之后,膜再次得到释放,使得有可能再启动生产过程。这样,使用一个吸附剂组件,在其用坏之前有可能进行几千次循环。
实施例4
一个缺点是在漂洗和洗脱时水和盐的用量高。因此溶液再利用几次是非常有利的。在一个循环和加载0.4mg蛋白质/ml之后的洗脱液被再次用于洗脱,并且现在的载荷是0.86mg/ml。在第四次洗脱之后,浓度升高到1.2mg/ml。因此节约的洗脱液(水、盐和缓冲剂)是75%。
附图1表示在根据本发明处理之前马铃薯汁中全部蛋白质在凝胶上进行SDS-PAGE的表现,根据本发明方法得到的蛋白质和蛋白质级分,其被固定在阳离子和阴离子交换剂吸附剂膜上并且再次洗脱。
从图1可以看出,有可能通过阴离子交换膜实现patatin的靶向分离,和通过阳离子交换膜实现PI的靶向分离,并且有可能以实质上纯的形式分离它们,其再一次昭显本发明方法的优点。
根据本发明的方法得到的蛋白质和/或肽可用于例如功能食物,即,具有积极生理作用的食物。它们还可以用于对抗和预防疾病和用于改善行为和幸福感。根据本发明的方法制备的蛋白质和/或肽的一个优选的用途可能是用于药物形式,例如胶囊形式。在这种情况下,蛋白酶抑制剂II特别受关注,因为已知其食欲抑制效果并且其可以容易地包装为例如硬明胶胶囊。
上述说明书中、在权利要求中、在附图中公开的本发明的特征对于实施本发明的单独地和任何组合的各种实施方案可能是必要的。

Claims (22)

1.获得植物蛋白质和/或肽的方法,包括以下步骤:
a)制备在含水基质中包含植物蛋白质和/或肽的起始材料;
b)任选地从所述含水基质除去固体组分和/或净化所述含水基质;
c)通过吸附到至少一种由合成聚合物制成的离子交换膜上从含水基质分离蛋白质和/或肽的至少一部分;
d)任选地漂洗离子交换膜,以便除去杂质;
e)用至少一种洗脱液从离子交换膜解吸蛋白质和/或肽;
f)从洗脱液分离蛋白质和/或肽;和
g)任选地干燥分离的蛋白质和/或肽。
2.权利要求1的方法,其特征在于以下事实:通过将植物起始材料磨成浆料或者将起始材料特别是干燥起始材料磨成粉和在水中膨胀并除去固体组分而得到含水基质。
3.权利要求2的方法,其特征在于以下事实:固体组分是来自植物起始材料的淀粉和纤维。
4.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:植物起始材料选自包含蛋白质的植物,优选马铃薯、豆科植物、大豆、油菜籽及其混合物,特别优选马铃薯。
5.权利要求4的方法,其特征在于以下事实:豆科植物选自豌豆、菜豆、羽扇豆、大豆及其混合物。
6.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:步骤b)的净化在微滤膜装置中进行。
7.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:至少步骤a)-f)在比蛋白质和/或肽的凝固温度或变性温度低的温度下进行,优选在低于30℃的温度进行。
8.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:步骤c)和/或e)以分批或循环的工艺操作。
9.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:在步骤c)中使用至少一种阳离子交换膜和至少一种阴离子交换膜。
10.权利要求9的方法,其特征在于以下事实:阳离子交换膜和阴离子交换膜以并联或串联的方式操作。
11.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:各个离子交换膜存在于吸收器组件中,吸收器组件优选板式、交叉流动式或盘绕式组件。
12.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:调整离子交换膜的孔宽以便实现微滤、超滤或纳米过滤。
13.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:步骤e)中单独的蛋白质和/或肽或其组合的解吸使用多种不同的洗脱液连续地和选择性地进行。
14.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:洗脱液选自盐水溶液,优选氯化钠溶液和氯化铵溶液。
15.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:步骤f)的分离通过膜滤法或干燥法进行。
16.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:步骤g)的干燥通过喷雾干燥或冷冻干燥进行。
17.前述权利要求中任一项的方法,其特征在于以下事实:在步骤c)之前,通过变性/凝固使一些蛋白质和/或肽沉淀并从含水基质中除去。
18.权利要求17的方法,其特征在于以下事实:变性/凝固通过改变pH、或者通过使用有机溶剂或通过盐析实现。
19.通过权利要求1到18的方法可得到的蛋白质、肽和/或其混合物。
20.权利要求19的蛋白质、肽和/或其混合物在食物、动物饲料和药物中的用途。
21.权利要求20的用途,用于健康食品、老年人和恢复期患者用食品、婴儿食品和功能食物。
22.权利要求19的用途,用作口服药物,优选胶囊形式的口服药物。
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