ES2353032T3 - Procedimiento para la obtención de proteínas y/o péptidos vegetales, proteínas y/o péptidos producidos con el mismo, y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la obtención de proteínas y/o péptidos vegetales que comprende las etapas: a) colocar previamente un material de partida vegetal que contiene proteínas y/o péptidos en una matriz acuosa; b) separar opcionalmente los componentes sólidos de la matriz acuosa y/o clarificar la matriz acuosa; c) aislar al menos una parte de las proteínas y/o péptidos a partir de la matriz acuosa mediante adsorción en al menos una membrana de intercambio iónico de polímero sintético; d) lavar opcionalmente la membrana de intercambio iónico para eliminar impurezas; e) desorber las proteínas y/o péptidos de la membrana de intercambio iónico con al menos un eluyente; f) aislar las proteínas y/o péptidos a partir del eluyente; y g) secar opcionalmente las proteínas y/o péptidos aislados, en el que la desorción de las proteínas y/o péptidos individuales o grupos de los mismos en la etapa e) tiene lugar de manera sucesiva y selectiva con el uso de varios eluyentes diferentes y, antes de la etapa c) se precipita y se separa una parte de las proteínas y/o péptidos a partir de la matriz acuosa mediante desnaturalización/coagulación.

Description

1

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de proteínas y/o péptidos vegetales, a proteínas, péptidos y mezclas de los mismos producidos con el mismo, así como a usos de los mismos.

Para el consumo humano se conocen proteínas tanto animales como vegetales. Sin embargo, las proteínas animales, tales como por ejemplo proteínas de pollo, proteínas de la leche, tales como caseína o suero de la leche, pueden presentar problemas con respecto a EEB, gripe aviar y otras enfermedades. Las proteínas animales se relacionan también con frecuencia con el desencadenamiento de alergias, incluso cuando éstas, tal como en el caso de una intolerancia a la lactosa, no se basan en la proteína en sí.

Las proteínas vegetales tienen problemas con los organismos modificados genéticamente (OMG), su valor nutricional y asimismo con el desencadenamiento de alergias. La proteína vegetal más conocida es la proteína de soja. En el caso de las proteínas vegetales además se presenta frecuentemente el problema del sabor, por ejemplo en el caso de la soja, de modo que la aplicabilidad en alimentos se ve fuertemente limitada. Hasta el momento tampoco se ha impuesto la utilización de otras proteínas vegetales, tales como por ejemplo de colza, altramuces o patatas. En el caso de la colza y las leguminosas esto podría deberse, sobre todo, a que el contenido en grasa de estos materiales de partida genera ranciedad.

Desde el punto de vista químico, el porcentaje de proteína de productos habituales en el mercado, que contienen además muchas otras sustancias deseadas y no deseadas, consiste en muchas moléculas de proteína y péptido individuales, que pueden subdividirse en primer lugar a grosso modo de manera fenomenológica en globulinas y albúminas. Las globulinas presentan una forma esférica, por tanto son bastante compactas e

insolubles en agua o al menos escasamente solubles. Las albúminas presentan una forma abierta, más irregular y, por tanto, son solubles en agua. En general, las proteínas solubles se engloban bajo albúminas . Además, la proteína habitual en el mercado consiste naturalmente en moléculas de proteína y péptido que presentan diferente peso molecular. Esto hace bastante complicado su manipulación, por ejemplo desde el punto de vista de la tecnología de los alimentos, y sólo puede llevarse a cabo una valoración sanitaria basándose en el espectro de aminoácidos.

Por consiguiente, las proteínas habituales en el mercado tienen en común que consisten en una mezcla de distintas moléculas de proteína y péptido, y además contienen componentes ajenos a las proteínas, que proceden del material de partida vegetal original. A éstos pertenecen por ejemplo glucósidos, toxinas (glicoalcaloides, inhibidores de tripsina, etc.), sustancias antinutritivas, tales como por ejemplo el ácido fítico, que retira los minerales de calcio y hierro de la digestión de seres humanos y animales, dado que éstos se eliminan y no se reabsorben en el conducto intestinal. Asimismo están incluidas grasas y aceites que en parte están químicamente unidas a lipoproteínas, así como minerales.

Hasta el momento, existen pocas proteínas o péptidos puros, por ejemplo para una alimentación sana o como fármacos de venta libre, que sean suficientemente baratos, para una aplicación más amplia. El motivo se basa especialmente en que se utilizan procedimientos de tratamiento caros, procedentes de la industria farmacéutica. Un motivo adicional para el elevado precio así como una disponibilidad extremadamente limitada es el origen de las moléculas de proteína, que se obtienen a partir de mamíferos

o de secreciones humanas, por ejemplo suero sanguíneo, que todas contienen las proteínas de acción deseadas en concentración reducida y se encuentran en sí disponibles también sólo en cantidad limitada.

En los documentos US 2003113829, US 2003092151, US 2003092152, US 2003092150 y US 2003077265 se describe por primera vez cómo pueden asilarse de manera relativamente pura

grupos de proteínas individuales, a partir de una mezcla de proteínas de una materia prima vegetal, en este caso de la patata.

En estos documentos se describen la elección de la materia prima; el método para la eliminación de inhibidores de Kunitz y de Bowman-Birk así como de carboxipeptidasa de proteína de patata mediante calentamiento, enfriamiento, centrifugación y filtración del jugo de patata; la ampliación del método mediante la utilización de un agente de extracción ácido junto con una pulverización del material vegetal en la disolución de extracción, de modo que se obtiene el inhibidor de proteasa II; el método para controlar el rendimiento y la pureza del inhibidor de proteasa II durante la extracción mediante lixiviación de pedazos de patata, calentamiento de la disolución de extracción, control de la temperatura, el tiempo y la concentración de sal, centrifugación y filtración con membrana; aislamiento y purificación de los inhibidores de proteasa II en una variante del procedimiento.

Sin embargo, en el caso de los procedimientos conocidos es desventajoso que, aunque se preparen proteínas individuales o al menos grupos de proteínas estrechamente definidos, estos procedimientos son sin embargo extremadamente complicados, laboriosos y caros. También ha de contemplarse como desventaja una selección especial de las patatas. De esta manera no se limita sólo la disponibilidad de la materia prima, sino que mediante un control analítico necesario se requiere una etapa intermedia adicional, complicada y cara. Además, la logística es complicada, dado que las patatas deben tratarse frescas y no pueden almacenarse. También, las proteínas pueden dañarse en los procedimientos conocidos, dado que se necesitan grandes cantidades de energía calorífica, dado que se trabaja en disolución de extracción diluida y debe mantenerse una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo, lo que hace necesarios adicionalmente recipientes grandes. Asimismo, en una etapa posterior se necesita energía adicional, dado que la cantidad de sustancia que va a tratarse debe enfriarse hasta aproximadamente temperatura ambiente para las demás etapas de

procedimiento. Para la extracción se necesitan ácidos orgánicos, que cargan el medio ambiente de aguas residuales. Además, el material vegetal se desmenuza de manera laboriosa en partículas

de desde aproximadamente 100 m hasta 1.500 m. Tras la extracción y adicionalmente tras el calentamiento se necesitan etapas para la separación de sólidos, para separar el material vegetal coagulado o no disuelto de la disolución de proteínas y poder realizar la última etapa de aislamiento de la ultrafiltración. Los procedimientos conocidos proporcionan finalmente sólo muy pocas proteínas, sobre todo aquéllas que tras una acción de calentamiento a 100ºC a lo largo de un tiempo de aproximadamente 3 horas no se han desnaturalizado todavía. Finalmente, a partir de los procedimientos conocidos sólo se obtienen principalmente aquellas proteínas que cumplen los criterios anteriormente mencionados, es decir, inhibidor de proteasa II e inhibidores de carboxipeptidasa.

La invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento para la obtención de proteínas y/o péptidos vegetales, con el que pueden superarse las desventajas del estado de la técnica. Asimismo, se proporciona un procedimiento, con el que es posible la obtención de proteínas y/o péptidos vegetales en una base de materia prima más amplia, es decir, que puede utilizarse no sólo para la obtención a partir de patatas, sino a partir plantas que contienen proteínas en general. Especialmente, el procedimiento podrá realizarse de manera inofensiva para el medio ambiente, con ahorro de energía, sencilla y económica, y a este respecto se obtendrá cualquier proteína y péptido, puro o en mezclas, sin limitaciones condicionadas por el procedimiento.

Otros objetivos consisten en proporcionar proteínas y/o péptidos producidos según el procedimiento así como indicar posibilidades de uso.

Estos objetivos se solucionan mediante un procedimiento según la reivindicación 1, proteínas, péptidos o mezclas de los mismos según la reivindicación 19 así como posibilidades de uso

según la reivindicación 20. Formas de realización preferidas se desprenden de las reivindicaciones dependientes respectivas.

Sorprendentemente se determinó que el procedimiento según la invención, al contrario que los procedimientos del estado de la técnica puede llevarse a cabo completamente sin una trituración adicional de las plantas, etapas de calentamiento y enfriamiento así como una extracción con aditivos orgánicos. Especialmente no se limita la elección de las proteínas y los péptidos que se obtendrán. La elección dirigida de determinadas proteínas y/o péptidos puede conseguirse mediante el control del procedimiento de selección mediante el ajuste preciso de los parámetros de procedimiento. Como resultado del procedimiento se obtienen o bien proteínas puras sin porcentaje de proteínas extrañas o bien cualquier mezcla extensa de proteínas que se comportan de manera similar en el proceso de adsorción. Por tanto, la pureza de las proteínas puede ajustarse a voluntad según la invención mediante la etapa de desorción, por ejemplo en forma de una diálisis. Esto puede ser ventajoso especialmente cuando la calidad de un producto previo es suficiente para aplicaciones médicas y sólo la confección final debe tener lugar en condiciones de BPF estériles que el operario del procedimiento dado el caso no puede o quiere cumplir.

En otras palabras, con el procedimiento según la invención puede conseguirse el fraccionamiento de las proteínas y/o péptidos del material de partida vegetal en proteínas o péptidos individuales o pequeños grupos de proteínas similares con etapas de procedimiento extraordinariamente suaves, pudiendo proporcionarse todavía una gran multitud de productos y no siendo necesaria ninguna etapa de procedimiento cara o complicada.

Ha demostrado ser especialmente ventajoso que según la invención tiene lugar una fijación de los grupos de intercambio iónico sobre una membrana en lugar de sobre perlas poliméricas. El uso de membranas de intercambio iónico conduce a una velocidad de flujo elevada, de ninguna a pocas incrustaciones, a una carga extraordinariamente rápida, dado que no se necesita ninguna difusión, un consumo de productos químicos reducido para

disolución tampón y eluyentes, un manejo sencillo así como un aumento de escala sencillo y la posibilidad de interconectar intercambiadores de aniones y de cationes, dado que según la invención éstos están unidos a membranas distintas.

Especialmente, con el procedimiento según la invención es posible utilizar sólo una membrana de intercambio iónico, que puede ser una membrana de intercambio catiónico o aniónico. Naturalmente, también pueden utilizarse combinaciones de membranas de intercambio aniónico y catiónico. Éstas pueden ser en cada caso en cualquier combinación fuerte o débilmente ácidas

o alcalinas. Es concebible que puedan conectarse varias membranas de intercambio catiónico y/o varias membranas de intercambio aniónico de manera sucesiva o en paralelo. Asimismo es concebible una conexión en serie de todas las membranas de intercambio catiónico y de todas las membranas de intercambio aniónico, estando conectados sin embargo estos dos grupos después en paralelo. También puede concebirse el modo de proceder inverso, estando conectadas las membranas de intercambio catiónico y las membranas de intercambio aniónico en sus grupos respectivos en paralelo, conectándose sin embargo los dos grupos en serie. Por consiguiente son posibles todas las variaciones concebibles y están incluidas dentro del alcance de la invención.

Otras ventajas de la unión de los grupos de intercambio iónico a una membrana son las siguientes:

-Una elevada densidad de carga permite el empaquetamiento en volúmenes pequeños, que significan costes menores que, por ejemplo, en la fijación sobre perlas poliméricas porosas que se encuentran en un recipiente sobre una placa perforada y de este modo experimentan un flujo a su alrededor.

- No se necesita ninguna difusión capilar ni ninguna difusión de Fick para que las moléculas que van a adsorberse alcancen las moléculas de intercambio iónico, tal como por ejemplo en el caso de perlas poliméricas porosas de polímeros sintéticos o naturales. Únicamente tiene lugar una convección, dado que la disolución

objetivo fluye directamente sobre la membrana con los portadores de carga. De esta manera el procedimiento de adsorción es claramente más rápido. En el funcionamiento de circulación es posible pasar varias veces las membranas y los poros con los portadores de carga, lo que acelera claramente el procedimiento de adsorción y asimismo el procedimiento de desorción. Las membranas de adsorción pueden usarse de nuevo o varias veces y son fáciles de limpiar.

-El ancho de poro de la membrana puede ajustarse a cualquiera entre filtración normal, micro, ultra y nanofiltración, según las propiedades del fluido y de las sustancias que van a tratarse y adsorberse. Por tanto no es posible un bloqueo u obstrucción tal como en el caso de los poros de perlas poliméricas de resinas de intercambio iónico.

-Existen los más diversos materiales de membrana sintéticos en casi cualquier elección, que permiten extensas combinaciones de parámetros de procedimiento de presión (transmembrana), temperatura y valor de pH.

-El tipo de construcción de los módulos en los que están confeccionadas las membranas y que determinan el tipo de construcción técnico del procedimiento de membrana puede adaptarse al procedimiento: módulos de placa, de flujo transversal o enrollados. La elección puede tener lugar entre otras cosas respecto a la viscosidad del sólido que se retiene en las membranas. Si es reducida, se usa preferiblemente un módulo del tipo de construcción enrollado, en el que en un pequeño volumen puede incorporarse una gran superficie de membrana y, por tanto, es el tipo de construcción de módulo más económico.

-El funcionamiento del módulo es posible en funcionamiento por lotes o de circulación. En el primer caso puede introducirse mediante bombeo sólo tanta disolución objetivo como permeado salga de la instalación. Si se termina el flujo de permeado, debe retirarse de la membrana el retenido, por ejemplo mediante lavado. En el

funcionamiento de circulación la disolución objetivo circula entre el módulo y un recipiente de almacenamiento, de modo que la disolución objetivo puede aplicarse varias veces sobre la membrana. El sólido contenido en el retenido se extrae de manera continua del recipiente de muestra, de modo que en los módulos gobierna un estado estacionario entre dos ciclos de purificación. A continuación se describen las etapas de procedimiento

individuales del procedimiento según la invención con respecto a una forma de realización preferida, sin desear limitar sin embargo el objeto de la presente solicitud a la misma.

El procedimiento según la invención para la obtención de proteínas y/o péptidos vegetales se describe mediante las patatas como material de partida vegetal. De las de alrededor de

2.000 clases de patata a nivel mundial, aproximadamente 50 clases son adecuadas para la obtención de almidón, dado que contienen una cantidad desproporcionadamente grande de almidón, por regla general del 17 al 22% en peso. En cambio, en principio todas las clases de patata son adecuadas para la obtención de proteínas y péptidos según el procedimiento según la invención.

Tras la limpieza de las patatas, la primera etapa de procedimiento para la obtención de almidón es que se trituran las patatas dando una pulpa fina. A partir de esa pulpa se separa a continuación el jugo de patata (zumo de patata), que contiene la proteína y/o el péptido, de los sólidos, del almidón y de las fibras. La separación del almidón y las fibras puede tener lugar por ejemplo mediante centrifugación o hidrociclones. El jugo de patata obtenido contiene aproximadamente 20 g/l de proteína de patata, de las que aproximadamente el 40% es patatina, una proteína de reserva principal que pertenece a las glicoproteínas, aproximadamente el 50% son inhibidores de proteasa (IP) así como el 10% son proteínas de alto peso molecular, a las que pertenecen las polifenoloxidasas, cinasas y fosforilasas. La patatina tiene un peso molecular de desde 40 hasta 44 kDa y consiste en 363 aminoácidos. A un valor de pH de desde 7 hasta 9 se forma un dímero con un tamaño de desde 80 hasta 88 kDa. Los IP son una clase heterogénea con siete

subclases de distintas proteínas. Su función en la patata es la degradación de proteínas, y por consiguiente desempeñan un papel importante en la defensa del tubérculo contra insectos y plagas microbianas. La prevención de la degradación de proteínas se observó en el modelo animal como inhibición del crecimiento, se discute una acción anticarcinógena y se promociona en parte comercialmente la sensación de saciedad del IP II. Las clases principales de los IP son IP I, IP II, inhibidor de cisteína proteasa de patata (PCPI), inhibidor de proteasa de Kunitz (PKPI), carboxipeptidasa (PCI), inhibidor de serina proteasa (OSPI) e inhibidor de aspartil proteasa de patata (PAPI).

A continuación se separa una parte de las proteínas y/o péptidos mediante desnaturalización/coagulación, parte que no se desea o no es necesaria para una separación precisa. Una desnaturalización/coagulación puede tener lugar por ejemplo mediante desplazamiento del valor de pH, disolventes orgánicos o mediante precipitación con sales.

El jugo de patata obtenido se clarifica a continuación en un dispositivo de membrana de microfiltración. A este respecto puede seleccionarse libremente el ancho de poro de la membrana y puede adaptarse a los productos deseados que se obtendrán. Es posible una clarificación del jugo de patata obtenido por ejemplo mediante centrífugas de toda clase de tipos de construcción, siempre que se obtenga un centrifugado claro con componentes exclusivamente disueltos. Estas y todas las etapas siguientes, a excepción del secado en la etapa g), tienen lugar a una temperatura por debajo de la temperatura de coagulación o temperatura de desnaturalización de las proteínas y/o péptidos, preferiblemente a una temperatura inferior a 30ºC.

Una parte esencial del procedimiento según la invención es el aislamiento de las proteínas y/o péptidos a partir de la matriz acuosa, en este caso el jugo de patata, mediante adsorción en al menos una membrana de intercambio iónico, que está compuesta por un polímero sintético. Ejemplos de tales membranas pueden adquirirse en el mercado con el nombre Sartobind® de la empresa Sartorius.

Según la invención es posible que en la etapa c) se aísle únicamente una parte de las proteínas y/o péptidos a partir de la matriz acuosa mediante adsorción. Esto depende considerablemente de las membranas de intercambio catiónico o aniónico utilizadas.

Asimismo, es de importancia similar la desorción dirigida de las proteínas y/o péptidos unidos a la membrana de intercambio iónico mediante eluyentes especialmente adaptados, después de que restos opcionales del jugo de patata se hayan eliminado previamente mediante lavado de la membrana.

Para la fijación de proteínas aniónicas pueden utilizarse membranas de intercambio iónico con grupos catiónicos, por ejemplo con grupos trimetilo, mientras que para proteínas catiónicas deben estar presentes en la membrana de intercambio iónico grupos aniónicos, tales como grupos sulfometilo.

Para la protección mecánica de la membrana de adsorción, pero también para prolongar su duración, se recomienda como etapa previa una separación de los sólidos y las partículas suspendidas o dispersas, tal como se mencionó anteriormente. Esto puede tener lugar mediante una centrífuga o mediante una filtración, la última en tamaños de poro habituales de hasta una microfiltración. La utilización de una microfiltración de tamaño

de poro adecuado de 0,2 m tiene la ventaja de dejar pasar todas las proteínas, pero eliminar simultáneamente los microorganismos asimismo contenidos en la disolución que contiene proteína y por consiguiente hacer que el medio sea estéril. A continuación se adsorben las proteínas y/o péptidos sobre las membranas, bombeándose el filtrado, permeado o disolución de proteínas clarificada hacia el interior del módulo de adsorción de membrana. Con esto son posibles muchas variantes de procedimiento. A continuación pueden conectarse los módulos de membrana de intercambio catiónico y aniónico en paralelo o en serie. Las membranas de adsorción pueden confeccionarse en modos de construcción de módulo de placa, de flujo transversal o enrollado. La alimentación de la disolución objetivo que contiene proteína puede tener lugar en un procedimiento terminal

(Dead End) o en un procedimiento de circulación. El primero es obligatoriamente un procedimiento por lotes, el último puede tener lugar tanto por lotes como de manera continua. El ancho de poro de la membrana de adsorción puede seleccionarse libremente, pero es recomendable que no sea más pequeño que los poros de la filtración previa, dado que en caso contrario se corre el peligro de acumular en los adsorbedores material en forma de un retenido que debe eliminarse adicionalmente a continuación en la etapa de lavado, y, dado que consiste en un producto potencial, significa también pérdidas de rendimiento. Si las membranas de adsorción están completamente cargadas con moléculas de proteína, lo que puede determinarse analíticamente de manera sencilla por ejemplo mediante medición de la conductividad en el efluente de las membranas o en el caso del funcionamiento terminal en el permeado, se interrumpe el suministro de la disolución objetivo, y la membrana puede lavarse opcionalmente para eliminar impurezas. El lavado puede tener lugar mediante agua o una disolución de lavado, pero ésta no debe desnaturalizar las proteínas.

Los productos que se adhieren a las membranas pueden desorberse tal como en el caso de un procedimiento de cromatografía habitual de manera sucesiva y selectiva con varios eluyentes. Esto se produce preferiblemente con una disolución salina, cuya composición y concentración depende de las proteínas y péptidos que van a eluirse. Normalmente se usan disoluciones de cloruro de sodio y de cloruro de amonio, sin embargo, en este caso la elección es casi ilimitada y viene predeterminada por las propiedades de las proteínas. También es posible la adición de sales tampón o disoluciones tampón, por ejemplo tampón fosfato. Para que las proteínas eluidas no se desnaturalicen deben encontrarse en el eluyente sólo en una concentración reducida. Por tanto, antes del secado es ventajosa una etapa de concentración. Además, mediante el lavado con agua destilada o agua del grifo puede ajustarse a voluntad la pureza de las proteínas aisladas de este modo. Si se toma para estas dos etapas de procedimiento una membrana de ultrafiltración en un modo de construcción de módulo de placa, de flujo transversal

o enrollado, en funcionamiento de circulación, pueden realizarse en este caso la filtración y concentración simultáneamente, por ejemplo rellenando continuamente como máximo tanta agua de lavado en la muestra como permeado sale por los poros de la membrana de ultrafiltración. El control de la pureza puede controlarse de manera eficaz mediante la medición de la conductividad eléctrica en el permeado.

En la etapa de procedimiento siguiente tiene lugar un aislamiento del producto a partir del eluyente, por ejemplo mediante secado o mediante separación del eluyente y las moléculas de proteína sobre una membrana con ancho de poro adecuado, que preferiblemente se extiende en el intervalo de desde ultra o nanofiltración hasta ósmosis inversa, se someten a diafiltración y concentración o sólo se someten a concentración

o sólo a diafiltración.

Como última etapa sigue opcionalmente un secado, pudiendo utilizarse de manera ventajosa una liofilización moderada o un secado por pulverización. Igualmente son posibles otros tipos de secado, pero debe evitarse una acción de calor intensa que podría conducir a daños en el producto.

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente el procedimiento según la invención en mayor detalle.

Ejemplo 1

Un módulo de intercambio aniónico con una superficie de 80 m2 con una capacidad de unión de 0,4 mg de proteína/cm2 puede unir 320 g de proteína. El 50% de las proteínas en el jugo de patata son IP, es decir aproximadamente 10 g/l. Tras aplicar 32 l de jugo de patata se agota entonces la capacidad. Esto dura a una velocidad de flujo típica de 300 l/h aproximadamente 6,5 minutos. A continuación pueden eluirse las proteínas IP.

Ejemplo 2

Un módulo de intercambio catiónico con una superficie de 80 m2 con una capacidad de unión de 0,25 mg de proteína/cm2 puede unir 200 g de proteína. El 40% de las proteínas en el jugo de patata es patatina, es decir aproximadamente 8 g/l. Se necesitan

3,3 m2 de membrana para la unión completa de la patatina de 1 l de jugo de patata. Por tanto, sobre 330 m2 puede adsorberse 1 kg de patatina de 125 l de jugo. A continuación puede eluirse la patatina.

Ejemplo 3

Una gran ventaja del procedimiento según la invención es el uso múltiple tanto del adsorbedor de membrana como de la disolución de lavado y de los eluyentes.

Se carga un módulo de intercambio catiónico con una superficie de 15 cm2 con 1,5 ml una disolución de ASB (ASB = albúmina de suero bovino) con una concentración de 10 mg/ml. Esto se encuentra algo por debajo de la carga máxima de aproximadamente 20 mg. El esquema para la identificación de la estabilidad a largo plazo se realiza cargando, lavando, eluyendo y lavando. El líquido de lavado es un tampón fosfato de potasio 50 mM a pH 7, el eluyente es una disolución de NaCl 1 M en el mismo tampón. Un ciclo dura 21,5 minutos. Con el tiempo se ensanchan según su naturaleza los picos de elución, y son posibles hasta 65 ciclos, sin bloquear la membrana y sin que tenga lugar una rotura. Si la etapa de lavado se prolonga 5 minutos son posibles más de 100 ciclos sin limpiar la membrana. Se produce un bloqueo a partir del 108º ciclo. Tras limpiar con hidróxido de sodio 0,5 M la membrana estaba libre de nuevo, de modo que pudo comenzarse de nuevo con el procedimiento de producción. De este modo son posibles varios miles de ciclos con un módulo de adsorción, antes de que se desgaste.

Ejemplo 4

Una desventaja es el elevado consumo de agua y sal en el lavado y la elución. Por tanto, el uso múltiple de las disoluciones es muy ventajoso. Se utiliza el eluato tras un ciclo y una carga con 0,4 mg de proteína/ml de nuevo para la elución, y la carga ascendía ahora a 0,86 mg/ml. Tras la cuarta elución la concentración aumentó hasta 1,2 mg/ml. Por consiguiente, el ahorro de eluyente (agua, sal y tampón) asciende al 75%.

La figura 1 adjunta muestra un SDS-PAGE basado en gel con la representación de la proteína total en el jugo de patata antes del tratamiento según la invención así como de las proteínas y fracciones de proteínas unidas sobre las membranas de adsorción de intercambio catiónico y aniónico y eluidas de nuevo, que se obtienen según el procedimiento según la invención.

Tal como puede deducirse a partir de la figura 1, a través de la membrana de intercambio aniónico pudo aislarse patatina de manera dirigida y a través de la membrana de intercambio catiónico pudieron aislarse IP de manera dirigida y pudieron separarse de manera esencialmente pura, lo que pone de relieve una vez más espectacularmente las ventajas del procedimiento según la invención.

Las proteínas y/o péptidos obtenidos según la invención pueden utilizarse por ejemplo en alimentos funcionales, es decir, alimentos con acción fisiológica positiva. Pueden usarse también para la prevención y la lucha contra enfermedades así como para mejorar el rendimiento y el bienestar. Un uso preferido de las proteínas y péptidos producidos según la invención podría estar en una forma farmacéutica, por ejemplo en forma de cápsula. En este caso es de especial interés el inhibidor de proteasa II, dado que se conoce su efecto inhibidor del apetito y puede introducirse fácilmente por ejemplo en una cápsula de gel dura.

Las características de la invención dadas a conocer en la descripción anterior, en las reivindicaciones así como en el dibujo pueden ser esenciales tanto individualmente como en cualquier combinación para la puesta en práctica de la invención en sus distintas formas de realización.

Claims (16)

1. Procedimiento para la obtención de proteínas y/o péptidos vegetales que comprende las etapas:

a) colocar previamente un material de partida vegetal que contiene proteínas y/o péptidos en una matriz acuosa;

b) separar opcionalmente los componentes sólidos de la matriz acuosa y/o clarificar la matriz acuosa;

c) aislar al menos una parte de las proteínas y/o péptidos a partir de la matriz acuosa mediante adsorción en al menos una membrana de intercambio iónico de polímero sintético;

d) lavar opcionalmente la membrana de intercambio iónico para eliminar impurezas; e) desorber las proteínas y/o péptidos de la membrana de intercambio iónico con al menos un eluyente; f) aislar las proteínas y/o péptidos a partir del eluyente; y g) secar opcionalmente las proteínas y/o péptidos

aislados,

en el que la desorción de las proteínas y/o péptidos

individuales o grupos de los mismos en la etapa e) tiene

lugar de manera sucesiva y selectiva con el uso de varios

eluyentes diferentes y, antes de la etapa c) se precipita y

se separa una parte de las proteínas y/o péptidos a partir

de la matriz acuosa mediante desnaturalización/coagulación.

2.

Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz acuosa se obtiene triturando el material de partida vegetal para dar una pulpa o moliendo materiales de partida, especialmente secos, para dar una harina e hinchando en agua y separando los componentes sólidos.

3.

Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque los componentes sólidos son almidón y fibras del material de partida vegetal.

4.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el material de partida vegetal se selecciona de plantas que contienen proteínas,

preferiblemente patatas, leguminosas, soja, colza y mezclas de las mismas, de manera especialmente preferible patatas.

5.

Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque las leguminosas se seleccionan de guisantes, judías, altramuces, soja y mezclas de los mismos.

6.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la clarificación en la etapa b) tiene lugar en un dispositivo de membrana de microfiltración.

7.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos las etapas a)-f) se realizan a una temperatura por debajo de la temperatura de coagulación o desnaturalización de las proteínas y/o péptidos, preferiblemente a una temperatura inferior a 30ºC.

8.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa c) y/o e) se lleva o llevan a cabo en un procedimiento por lotes o de circulación.

9.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa c) se utilizan al menos una membrana de intercambio catiónico y al menos una membrana de intercambio aniónico.

10.

Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la membrana de intercambio catiónico y la membrana de intercambio aniónico se hacen funcionar en paralelo o en serie.

11.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cada membrana de intercambio iónico se encuentra en un módulo de absorción, preferiblemente un módulo de placa, de flujo transversal o enrollado.

12.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ancho de poro de la membrana de intercambio iónico se ajusta para obtener micro, ultra o nanofiltración.

13.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el eluyente se selecciona de una disolución acuosa salina, preferiblemente una disolución de cloruro de sodio y cloruro de amonio.

14.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el aislamiento en la etapa f) tiene lugar a través de una filtración con membrana o un secado.

15.

Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores,

5 caracterizado porque el secado en la etapa g) tiene lugar a través de un secado por pulverización o liofilización.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la desnaturalización/coagulación tiene lugar mediante desplazamiento del valor de pH, disolventes

10 orgánicos o mediante precipitación con sales.