CN101355964A - 免疫佐剂 - Google Patents

Abstract

一种可以发挥强免疫刺激作用的安全性高的免疫佐剂，其含有在两种以上的不同的微粒状免疫刺激物载体上分别承载1种或2种以上的免疫刺激物质，作为该微粒状免疫刺激物质载体包括(a)可以被细胞吞噬的尺寸的微粒状磷酸钙等无机物和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物的组合物。

Description

免疫佐剂

技术领域

本发明涉及一种免疫佐剂。

背景技术

以往，常用的大部分免疫佐剂在生物体中给药的部位起两种作用：(1)抗原保持以不快速扩散的水性或油性乳剂的性状，且抗原缓缓释放，有效地供给免疫载体细胞，(2)引起炎症反应，使集合于炎症部位的免疫载体细胞活化。近年来，清楚了抗原提呈细胞在诱导产生抗体的液性免疫反应和诱导杀伤T细胞的细胞性免疫反应任意一种均起到免疫反应中心的作用，并且作为抗原提呈细胞，有树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。其中，树突状细胞具有最强的抗原提呈能力(DendriticCells，second edition，ed.Lotze，M.T.and Thomson，A.W.，Academic Press，SanDiego，2001)。将可有效活化抗原提呈细胞的物质与抗原一起施加给生物体，该物质作为免疫佐剂作用，在液性免疫反应和细胞性免疫反应任意一种均可以有效诱导增强针对抗原的免疫反应。

尽管以往已经了解了很多种免疫佐剂，然而在人肿瘤的治疗和以预防转移和复发为目的的肿瘤免疫疗法中可以使用的安全且价格低廉的免疫佐剂却很少。例如，在利用培养树突状细胞的肿瘤免疫疗法中，使用了钥孔嘁血蓝蛋白作为免疫佐剂(Geiger，J.D.，等人，Cancer Res.，61，pp.8513-8519，2001)，但该物质价格很高。现在也提出了施以直接活化树突状细胞的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor：以下简称为“GM-CSF”的情况)等细胞因子类作为免疫佐剂的方法，但是细胞因子类的价格更高。

在用于针对传染病的对抗措施的疫苗的制备中，作为安全且价格低廉的免疫佐剂，一直使用的是像氢氧化铝(Alum)、弗氏不完全佐剂(Freund’s imcompleteadjuvant，这种佐剂由于是油性，因此一直担心毒性问题)，或Montanide等这样的活性不充分的免疫佐剂。这些佐剂如果与动物实验中使用的弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant：以下将其简称为“FCA”的情况)和Ribi佐剂系统(Ribi Adjuvant System)相比，毒性低的免疫佐剂活性也低。

通过硫酸铵沉淀法纯化结核菌感染例检测用结核菌素，尤其是结核菌素中的蛋白成分获得的纯化结核菌素(以下存在简称为“PPD”的情况)，由于即使对人重复给药也极为安全，而且便宜，因此在全世界普及。本发明人发现可以使用PPD作为免疫佐剂使用(PCT/JP00/00692)。而且，本发明人还通过将PPD制成经可溶性蛋白与粘多糖的凝聚获得的沉淀物，在经物理手段使之变性的肿瘤组织内给药，发现制成用于诱导抗肿瘤免疫反应的有效免疫佐剂(日本专利第3492671号)。该免疫佐剂具有比溶解状态的PPD更高的免疫佐剂活性，与溶解状态的PPD同样具有极高的安全性。可是，若与FCA和内毒素的主要成分-脂多糖(以下存在将其简称为“LPS”的情况)相比，其免疫佐剂活性并不充分。

可以吞噬微粒状的抗原的未成熟的抗原提呈细胞在末梢血中流动。已知的是，如果在体外培养中的未成熟的抗原提呈细胞中添加LPS，则成熟增进，显示出强力的抗原提呈能力。该过程中活化的抗原提呈细胞释放出GM-CSF、白细胞介素(以下，存在简称为“IL”的情况)-12、干扰素γ(以下存在将其简称为“IFNg”的情况)等各种细胞因子。GM-CSF自身为树突状细胞的生存所必需的细胞生长因子，因此一旦活化的树突状细胞由于GM-CSF的自分泌机制，因此长期保持活化状态而可继续存活下去。树突状细胞以及巨噬细胞是由相同的造血干细胞分化的同一系统的抗原提呈细胞，一旦受到免疫刺激，则与树突状细胞一样产生GM-CSF等细胞因子。

实际上，通过以固体化微粒化的肿瘤组织作为抗原，与GM-CSF等细胞因子一起在体内给药，可以有效诱导针对肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应(PCT/JP00/00692)。该事实表明，在GM-CSF自身形成免疫佐剂的同时，受到免疫佐剂的刺激的抗原提呈细胞所产生的GM-CSF的量可以作为表示原免疫佐剂的活性的指标。也就是说，通过定量人来源的抗原提呈细胞产生的GM-CSF，可以在不使用人个体的体外实验系统中推定在人体中的免疫佐剂活性。

本发明人公开了通过利用上述方法，使用含有人末梢血来源的抗原提呈细胞的末梢血附着性细胞，通过在免疫刺激物质载体的固体化组织中固定微来源于生物的可溶性成分[牛分枝杆菌Bacillus Calmette-Guein(以下称为“BCG菌”)等有机溶剂提取可溶性成分]，可以获得强免疫佐剂作用(WO2003/074079)。

可以在该免疫佐剂中作为免疫刺激物质载体使用的固体化组织是在包括抗原提呈细胞在内的吞噬细胞内被消化，不残留于体内而消失的生物分解性材料。而且，在人个体中使用这种免疫佐剂时，如果不使用主要组织相容性抗原完全一致的本人或遗传上一致的同卵双胞胎的组织，则免疫刺激物质载体具有对该人个体具有抗原性，引起针对免疫刺激物质载体或其消化蛋白片段的抗原抗体反应。这一点，在使用上述免疫佐剂作为广泛使用的免疫佐剂时(在免疫佐剂中添加理想的抗原诱导针对抗原的免疫反应时)，可引起对于免疫刺激物质载体自身的额外的抗原抗体反应，产生针对该抗原的免疫反应埋没于整体的免疫反应中而难以显现这样的问题。

另一方面，本发明人提出了承载了1种或2种以上的被承载分子的磷酸钙微粒的制备方法(特开2005-126335号公报)。这种磷酸钙微粒是Ca/P摩尔比在1.3以上的羟基磷灰石。而且，还公开了由于非晶体磷酸钙微粒和低结晶性磷灰石不仅可以承载亲水性蛋白质分子，还可以承载疏水性低分子，因此可成为免疫刺激物质载体(特表2002-524491号公报)。然而，以往并不知道使1种或2种以上的免疫刺激物质承载于物理化学性质完全不同的两种以上的免疫刺激物质载体之上，将其混合的免疫佐剂。

发明内容

本发明的课题在于提供一种安全性优异且可以有效发挥强免疫佐剂活性的免疫佐剂。

本发明人发现，通过以结核菌素作为缓释性制剂，可以获得高免疫佐剂活性，通过与白蛋白和肝素混合、凝聚形成沉淀时，预先混合结核菌素蛋白，结核菌素蛋白卷入于该沉淀中形成不溶性微粒，形成缓释性制剂，以及如果将该不溶性微粒与可溶性的纯化结核菌素一起作为免疫佐剂，以肿瘤细胞作为抗原在体内给药，则显示出强力的肿瘤防御效果，如果在热变性的体内肿瘤组织中给药可以诱导强力的抗肿瘤免疫反应(日本专利第3492671号)。

另一方面，公开了磷酸钙微粒可以作为免疫刺激物质载体(特表2002-524491号公报)，通过磷酸钙微粒的制备方法(特开2005-126335号公报)生成的磷酸钙微粒是Ca/P摩尔比在1.3以上的羟基磷灰石，含有大量最大直径不到1μm的纳米尺寸的微粒，生物体适应性极高且安全。通过使PPD承载于其大小可以吞噬这种抗原提呈细胞的磷酸钙微粒，因此可以制备免疫佐剂。

本发明人为了解决上述问题，继续进行研究，其结果发现，若使用结核菌素中所含的可溶性蛋白或来源于微生物的可溶性成分等作为免疫刺激物质，使该免疫刺激物质分别承载于微粒状的免疫刺激物质(a)无机物，和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物之上，使用这些载体的混合物作为免疫佐剂，则发现，与单独使用一种免疫刺激物质载体时相比，可以获得协同的极强的免疫作用。例如，若使用含有混合白蛋白和肝素，通过凝聚形成沉淀时通过混合结核菌素获得的不溶性微粒，和在通过特开2005-126335号公报中记载的方法获得的Ca/P摩尔比在1.3以上的羟基磷灰石-磷酸钙微粒上承载有PPD的微粒的混合物作为免疫佐剂，则获得了远远高于单独使用各个成分时获得的免疫佐剂活性的协同的高免疫佐剂作用。本发明基于以上认识而完成。

也就是说，通过本发明，免疫佐剂含有在两种以上的不同的微粒状免疫刺激物载体上分别承载1种或2种以上的免疫刺激物质，其中免疫佐剂可以提供的作为该微粒状免疫刺激物质载体至少包括(a)无机物和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物的组合物。

如果根据本发明的优选方式，可以提供上述免疫佐剂为两种免疫刺激物质载体的组合为(a)可以被细胞吞噬的尺寸的微粒状磷酸钙和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物。

按照更为优选的方式，上述的免疫佐剂，其中上述(a)的微粒状磷酸钙的最大直径在1μm以下的磷酸钙；提供的上述的免疫佐剂，其中上述(a)的微粒状磷酸钙如下：Ca/P摩尔比在1.3以上，含有3-6重量％的碳酸根CO₃ ²-，其结晶性为通过CuKα射线产生的XRD光谱中，出现2θ值26°、32°和34°为中心的宽峰，33°中出现米勒指数300的肩峰为规定的结晶性以上，且不仅在以26°、28.1°、29°、32°、33°和34°为中心的峰或肩峰出现，而且米勒指数为211和112的峰分离为规定的结晶性以下的结晶性微粒状磷酸钙。

如果按照其它的更为优选的方式提供，上述(b)的可溶性蛋白为白蛋白的上述免疫佐剂；上述(b)的粘多糖为肝素的上述免疫佐剂；上述(b)的不溶性物质的通过可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物是通过蛋白分子间交联剂交联的沉淀物的上述免疫佐剂。

而且，还可以提供，免疫刺激物质为选自于细胞因子，趋化因子，细胞生长因子和激素的诱导剂中的1种或2种以上的免疫刺激物质的上述免疫佐剂；免疫刺激物质为选自于结核菌素，纯化结核菌素(PPD)，源于微生物的可溶性成分，6，6-双分枝菌酸藻糖(Trechalose-6，6’-dimycolate)，LPS，脂质A，寡核苷酸(oligodeoxyribonucleotide)，β-葡聚糖，钥孔嘁血蓝蛋白，胞壁酰基二肽，贝他定(bestatin)，左旋咪唑，细胞因子，趋化因子，细胞生长因子和激素中的1种或2种以上的免疫刺激物质的上述的免疫佐剂；源于微生物的可溶性成分为选自于微生物的醇提取物，丙酮提取物，吡啶提取物和热水提取物中的1种或2种以上的提取物的上述的免疫佐剂。

从其它方面来说，可以提供用于通过在包括人在内的哺乳动物体内与抗原一起给药来诱导针对该抗原的全身性免疫反应的上述的免疫佐剂。

根据本发明的优选方式，可以提供抗原为选自于真菌，放线菌，细菌，病毒，噬菌体，立克次氏体，原生动物，这些微生物的成分，肿瘤组织，肿瘤细胞，肿瘤细胞成分，肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽中的1种或2种以上的抗原的上述的免疫佐剂。

而且，从其它方面来说，可以提供用于通过用物理方法使包括人在内的哺乳类动物的肿瘤组织变性后，在该肿瘤组织内给药来诱导抗肿瘤免疫反应的上述免疫佐剂。

根据本发明的优选方式，可以提供物理方法为选自于微波照射，射频凝固法，冷冻凝固法，电刀加热，热水注入，醇注入，栓塞法、放射线照射，激光照射和超声波破坏中的1种或2种以上的方法的上述免疫佐剂。

从其它方面来说，可以提供用于通过在体外与免疫载体细胞混合后，给药于包括人在内的哺乳动物，诱导全身性免疫反应的上述免疫佐剂。

根据本发明的优选方式，可以提供免疫载体细胞为选自于树突状细胞，巨噬细胞，B淋巴细胞，T淋巴细胞，自然杀伤T细胞和造血干细胞中的1种或2种以上的细胞的上述免疫佐剂。

而且，还可以提供含有上述免疫佐剂和抗原的疫苗。

按照本发明的优选方式，可以提供抗原为选自于真菌，放线菌，细菌，病毒，噬菌体，立克次氏体，原生动物，这些微生物的成分中的1种或2种以上的抗原的用于预防和/或治疗传染病的上述疫苗；和抗原为选自于肿瘤组织，肿瘤细胞，肿瘤细胞成分，肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽中的1种或2种以上的抗原的用于预防和/或治疗肿瘤的上述疫苗。

而且，通过使用例如异种动物蛋白作为抗原，上述的免疫佐剂可以使在人以外的哺乳动物中有效产生针对该抗原的抗体。因此，本发明可以提供抗体产生动物和来源于该抗体产生动物的抗体产生细胞或抗体基因。

进而，本发明还可以提供含有用于通过用物理方法使包括人在内的哺乳类动物的肿瘤变性后在该肿瘤组织中给药来诱导抗肿瘤免疫反应的上述免疫佐剂的肿瘤疫苗；含有用于通过在体外与免疫载体细胞混合后，在包括人在内的哺乳类动物中给药，在该动物的活体内诱导抗肿瘤免疫反应的上述免疫佐剂的肿瘤疫苗；含有用于通过在体外与免疫载体细胞和抗原混合后，在包括人在内的哺乳类动物给药，在该动物的活体内诱导抗肿瘤免疫反应的上述免疫佐剂的肿瘤疫苗。

从其它方面来说，本发明还可以提供：全身性免疫反应的诱导方法，该方法包括在包括人在内的哺乳类动物中给药上述免疫佐剂的步骤；诱导抗肿瘤免疫反应的方法，该方法包括用物理方法使包括人在内的哺乳类动物的肿瘤组织变性后，再将上述免疫佐剂给药于该肿瘤组织内的步骤；和全身性免疫反应的诱导方法，该方法包括预先在体外混合上述免疫佐剂和免疫载体细胞，再给药于包括人在内的哺乳类动物的生物体内的步骤。

附图说明

图1：是表示使两种免疫刺激物质分别承载于不同的两种免疫刺激物质载体的本发明的免疫佐剂的抗原提呈细胞刺激效果图。以磷酸钙(以下存在简称为“CaP”的情况)作为载体，使之承载BCG菌提取物作为免疫刺激物质。而且，使用以凝聚沉淀微粒作为载体，使之承载PPD的TuMP。

具体实施方式

本说明书中使用的术语的含义如下所示。

“免疫刺激物质”是在包括人在内的哺乳类动物中给药时引起和/或增强任意免疫反应的物质，在体外，向包括人在内的哺乳类动物的抗原提呈细胞中添加时引起和/或增强该细胞的任意活化的物质。因此，只要抗原自身具有任何的免疫刺激作用，就包含于免疫刺激物质。

所谓“免疫刺激物质载体”是用于承载上述的免疫刺激物质的物质。免疫刺激物质载体自身完全没有免疫刺激作用或大多具有极低免疫刺激作用，但也有载体自身具有免疫刺激作用的情况。

“2种以上的不同的免疫刺激物质载体”或其同义词中，除了由不同的化学物质或不同的组合物构成的2种以上的免疫刺激物质载体之外，还包括由同样的化学物质或组合物构成的具有不同物理化学性状的免疫刺激物质载体。例如，可以使用含有相同成分并且该成分的比率不同的两种组合物作为两种免疫刺激物质载体。或者，由相同化学物质或组合物构成的微粒，其粒子表面的物理化学性状不同的情况等也包括于该术语中。本说明书中，该术语在任何一种意思中都没有限定性解释，需要以最广义解释。

所谓“免疫佐剂”是可以引起和/或增强针对抗原的免疫反应的物质或组合物。也存在只将几乎没有免疫刺激作用的免疫刺激物质载体称为免疫佐剂的情况，但通常情况下多指该载体和任意的免疫刺激物质的组合。而且，也存在即使只是免疫刺激物质也称为免疫佐剂的情况。本发明的免疫佐剂是指在两种以上的免疫刺激物质载体上分别承载1种或2种以上的免疫刺激物质，必然包括免疫物质载体和免疫刺激物质的组合。

本发明的免疫佐剂的特征在于，包括在两种以上的不同的微粒状的免疫刺激物质载体上分别承载1种或2种以上的免疫刺激物质，该微粒状免疫刺激物质载体中至少一种为无机物，其它一种为由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物。本发明的免疫佐剂，作为微粒状免疫刺激物质载体，含有(a)无机物和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物的组合物，在上述(a)和(b)的各个微粒状免疫刺激物质载体上承载同样的或不同的免疫刺激物质。免疫刺激物质可以是1种，可以使用两种以上。例如，典型的是，可以分别在上述(a)和(b)的各个微粒子状免疫刺激物质载体上各承载1种不同的免疫刺激物质，或者也可以分别在上述(a)和(b)的微粒状免疫刺激物质载体上分别承载相同的免疫刺激物质。或者，可以在上述(a)和(b)的微粒状免疫刺激物质载体中的1种上承载两种不同的免疫刺激物质，再在1种免疫刺激物质载体上承载这些免疫刺激物质中的1种或两种免疫刺激物质。

上述(a)和(b)的微粒状免疫刺激物质载体可以含有由各个不同的化学物质或不同的组合物构成的两种以上的微粒状免疫刺激物质载体，或者可以是由各个相同的化学物质或组合物构成的具有不同的物理化学性质的免疫刺激物质载体的混合物。例如，作为上述(b)的沉淀物的微粒状免疫刺激物质载体，可以使用由同一成分的组合构成的且该成分比率不同的两种组合物的混合物。或者，作为上述(a)的无机物的微粒状免疫刺激物质载体，可以使用微粒表面的物理化学的性状不同的由相同的无机物构成的微粒的混合物。

本发明的免疫佐剂含有承载了各个免疫刺激物质的上述(a)和(b)的微粒状免疫刺激物质载体的组合，还可以进一步含有不承载免疫刺激物质的免疫刺激物质载体。这种情况，理想的是，作为免疫刺激物质载体，选择其自身具有免疫刺激作用的免疫刺激物质载体。而且，本发明的免疫佐剂还可以再含有免疫刺激物质载体上所不承载的免疫刺激物质。

在优选的方式中，作为两种微粒状免疫刺激物质载体的组合，包括(a)大小为可以被细胞吞噬的微粒状磷酸钙，和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物。以下，对这种特定方式进行详细说明，但本发明的免疫佐剂不限于该特定方式。上述的(a)大小为可以被细胞吞噬的微粒状磷酸钙，和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物的组合没有特别限定，它们的成分的种类，比率和制备方法等可以任意选择。而且，上述的方式的免疫佐剂中还可以再混合第3成分。作为该第3成分，除了抗原之外，还可以使用与承载的免疫刺激物质不同的免疫刺激物质等。抗原可以在固体的载体上承载，也可以利用上述(a)或(b)的微粒状免疫刺激物质载体作为载体。本发明的免疫佐剂还可以以不由载体承载的状态含有与由成分(a)或成分(b)承载的免疫刺激物质相同的免疫刺激物质。

大小为可以被细胞吞噬的微粒状磷酸钙，可以使用例如特开2005-126335号公报中记载的方法进行制备。作为微粒状磷酸钙，可以使用任意的微粒状磷酸钙。例如，可以使用由本领域技术人员按照公知的方法，精细地粉碎市售的磷酸钙粉末，选择出的大小为可以被细胞吞噬的微粒状磷酸钙，也可以使用从磷酸溶液和钙溶液中制备的微粒状磷酸钙。

而且，也可以使用使磷酸钙在微粒状的基材上沉淀或析出，在该基材表面上形成磷酸钙微粒皮膜的微粒状磷酸钙。这种方式也包含于微粒状磷酸钙中。作为基材，如果是大小为可以被细胞吞噬的微粒状，则没有特别的限定。例如，在将中性范围内不溶性蛋白质-纤维性蛋白质的胶原和水溶性糖链高分子-硫酸软骨素与氢氧化钙悬浮液和磷酸溶液混合的过程中，使之与低结晶性磷灰石共沉淀，可以制备含有纳米大小的微小结晶的胶原/硫酸软骨素-磷灰石复合粒子(Rhee，S.H.等，Biomaterials.，22(21)，pp.2843-2847，2001)，也可以使用该微粒作为基材。而且，用于制备微粒状磷酸钙的基材也不限于这些物质。

磷酸钙的种类没有特别的限定，可以是无水物，无水盐或含水盐中的任意一种，可以是结晶体或非结晶体中的任意一种。而且，还可以用其它原子或原子团取代钙的一部分或磷酸的一部分。作为这种磷酸钙，具体而言，可以列举，例如磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)、缺少钙的磷灰石、金属离子取代了一部分Ca的磷灰石、硫酸离子取代磷酸离子的一部分的磷灰石，非结晶体磷酸钙、金属离子取代了一部分Ca的非结晶体磷酸钙、磷酸八钙(Ca₈H₂(PO₄)₆5H₂O)和磷酸三钙(Ca₃(PO₄)₂)、金属离子取代了一部分Ca的磷酸三钙等，但不限于这些物质。

而且，优选也可以是含有1重量％-15重量％的碳酸根CO₃ ^2-的含有碳酸的磷酸钙。含有碳酸的磷酸钙的种类没有特别的限定，可以是无水物，无水盐或含水盐中的任意一种，可以是结晶体或非结晶体中的任意一种。作为含有碳酸的磷酸钙的例子，可以列举含有碳酸的磷灰石和含有碳酸的非晶体磷酸钙等。碳酸根的占有位点没有特别的限定，例如，可以是磷酸位点、氢氧根位点，以及所有的非磷灰石位点和表面吸附位点。特别优选的是，可以列举Ca/P摩尔比在1.3以上，含有3-6重量％的碳酸根CO₃ ²-，其结晶性为由在经CuKα射线产生的XRD光谱中2θ值中出现以26°，32°和34°为中心的宽峰，33°中出现300的米勒指数的肩为所规定的结晶性以上，而且在出现以26°，28.1°，29°，32°33°和34°为中心的峰或肩的基础上，分离米勒指数为211和112的峰为所规定的结晶性以下的结晶性的微粒状磷酸钙。

可以被细胞吞噬的微粒的大小，一般最大直径在10μm以下为优选，最大直径在1μm以下特别优选。人的细胞自身的尺寸，一般球形时的直径在20μm左右，但附着的细胞和不长期分裂的巨大细胞中也存在长径超过100μm的情况。还存在吞噬能力高的巨噬细胞吞噬直径在20μm以上的微粒的情况。因此，可以被细胞吞噬的微粒的大小没有特别的限定。

作为使用大小为可以被细胞吞噬的微粒的微粒状磷酸钙作为免疫刺激物质载体，使之承载免疫刺激物质的方法，可以使用例如特开2005-126335号公报中记载的方法，但不限于该方法。在磷酸钙中，由于羟基磷灰石微粉末的比表面积大为100m²/g，吸附能力优异，因此羟基磷灰石微粉末可以作为各种物质的吸附剂来使用。人们认为羟基磷灰石微粉末可以作为使用于各种化合物制备吸附型缓释性药物的基材，通过吸脱附来显示随着扩散模型的缓释性(Burgos，A.E.等人，Biomaterials.，23，pp.2519-2526，2002)。此外还知道，由于低结晶型磷灰石和非晶体磷酸钙等磷酸钙原本就是生物体内的物质，因此可以形成蛋白等体内生理活性物质的安全缓释性药物的基材。还可以使用由这些磷灰石构成的微粒作为免疫刺激物质载体。

使之承载于大小为可以被细胞吞噬的微粒的微粒状磷酸钙上的免疫刺激物质的种类没有特别的限定。如上所述，由于羟基磷灰石微粉末吸附能力优异，因此可以使用多种物质作为承载的免疫刺激物质。作为免疫刺激物质，还可以使用例如选自于细胞因子，趋化因子，细胞生成因子和激素的诱导剂中的1种或2种以上的物质，例如，优选使用选自于结核菌素，PPD，源于微生物的可溶性成分，6，6-双分枝菌酸藻糖(Trechalose-6，6’-dimycolate)，LPS，脂质A，寡核苷酸，β-葡聚糖，钥孔嘁血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)，胞壁酰基二肽，贝他定(bestatin)，左旋咪唑，细胞因子，趋化因子，细胞生长因子和激素中的1种或2种以上的免疫刺激物质。作为来源于微生物的可溶性成分，可以使用例如选自于微生物的乙醇提取物，丙酮提取物，吡啶提取物和热水提取物中的1种或2种以上的提取物。而且，在细胞因子，趋化因子，细胞生长因子和激素诱导剂中还包括细菌的菌体或细菌的菌体成分。而且，由磷酸钙微粒承载的免疫刺激物质并不限于这些物质。

作为细胞因子，趋化因子，细胞生长因子或激素，还可以使用通过刺激抗原提呈细胞可以诱导其产生细胞因子的物质。例如，包括干扰素α，干扰素β，干扰素γ，白细胞介素(IL)类(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-27等)、集落刺激因子(CSF)(例如G-CSF、GM-CSF、M-CSF等)、上皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)(例如FGF-1、FGF-2、FGF-7等)、胰岛素或人生长激素等。

在制备来源于微生物的可溶性成分的工序中，用有机溶剂和/或热水提取可溶性成分的方法没有特别的限定，可以使用本领域技术人员公知的方法。例如，优选使用乙醇制备提取物。作为在制备来源于微生物的可溶性成分的工序中使用的微生物，可以列举例如细菌，真菌或放线菌等，优选可以使用细菌。更优选的细菌的例子如下所示。这些细菌中，可以使用任意一种，或组合使用多种。

白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)；干燥棒杆菌(Corynebacteriumxerosis)；牛肾盂炎棒杆菌(Corynebacterium renale)；库氏棒杆菌(Corynebacterium kutscheri)；假白喉棒杆菌(Corynebacteriumpseudodiphtheriticum)；马棒杆菌(Corynebacterium equi)；牛棒杆菌(Corynebacterium bovis)；短小型棒杆菌(Corynebacterium parvum)；微代谢棒杆菌(Corynebacterium paurometabolum)；化脓棒杆菌(Corynebacteriumpyogenes)；产酶棒杆菌(Corynebacterium enzymicum)；霍克氏棒杆菌(Corynebacterium hoagii)；纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)；鼠败血棒杆菌(Corynebacterium murisepticum)；肾棒杆菌(Corynebacteriumnephridii)；海豚棒杆菌(Corynebacterium phocae)；阴道棒杆菌(Corynebacterium vaginalis)；黄小杆菌(microbacterium flavum)；缠绕帮杆菌(Corynebacterium fascians)；雷塞氏棒杆菌(Corynebacterium rathayl)；麦禾棒杆菌(Corynebacterium agropyri)；小麦蜜穗病棒杆菌(Corynebact eriumtritici)；伊朗棍状杆菌(Corynebacterium iranicum)；马铃薯环腐棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)；栖甜菜棒杆菌(Corynebacterium beticola)；冬青节杆菌(Corynebacterium ilicis)；土生棒杆菌(Corynebacteriumhumiferum)；Corynebacterium humuli；增生棒杆菌(Corynebacteriumhypertrophicans)；嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)；嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)；桔色棒杆菌(Corynebacteriumaurantiacum)；帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)；柠檬色运动棒杆菌(Corynebacterium citreum-mobilis)；嗜乙醇胺棒杆菌(Corynebacteriumethanolaminophilum)；菜豆萎蔫棒杆菌(Corynebacterium flaccumfaciens)；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)；裂烃棒杆菌(Corynebacterium hydrocarboclastus)；百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)；藤黄棒杆菌(Corynebacterium luteum)；中毛棒杆菌(Corynebacterium mediolanum)；Corynebacterium melassecola；类真菌棒杆菌(Corynebacterium mycetoides)；黄色分枝杆菌甲烷变种(Corynebacteriumnubilum)；玫瑰色棒杆菌(Corynebacterium roseum)；血球棒杆菌(Corynebacterium sanguinis)；球形节杆菌(Corynebacterium globiformis)；简单节杆菌(Arthrobacter simplex)；肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescenes)；柠檬色节杆菌(Arthrobacter citreus)；需土节杆菌(Arthrobacter terregens)；浅黄色节杆菌(Arthrobacter flavescens)；肠肿节杆菌(Arthrobacterduodecadis)；藤黄节杆菌(Arthrobacter luteus)；海节杆菌(Arthrobactermarinus)；可变节杆菌(Arthrobacter variabilis)；粘节杆菌(Arthrobacterviscosus)；多色节杆菌(Arthrobacter polychromogenes)；Arthrobacterconsociatus；噬尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorus)；扩展短杆菌(Brevibacterium linens)；乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)；产红短杆菌(Brevibacterium erythrogenes)；希氏短杆菌(Brevibacterium healii)；溶脂短杆菌(Brevibacterium lipolyticum)；棕色短杆菌(Brevibacteriumbrunneum)；暗黄短杆菌(Brevibacterium fulvum)；暗褐短杆菌(Brevibacteriumfuscum)；微黄短杆菌(Brevibacterium helvolum)；静止短杆菌(Brevibacteriumimmotum)；海鱼短杆菌(Brevibacterium marinopiscum)；伴生短杆菌(Brevibacterium sociovivum)；停滞短杆菌(Brevibacterium stationis)；海洋短杆菌(Brevibacterium maris)；蛾微杆菌(Brevibacterium imperiale)；未定短杆菌(Brevibacterium incertum)；嗜虫假单细胞菌(Brevibacteriuminsectiphilium)；小杆短杆菌(Brevibacterium minutiferula)；何类短杆菌(Brevibacterium quale)；臭虫短杆菌(Brevibacterium tegumenticola)；嗜氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)；硫磺节杆菌(Brevibacteriumsulfureum)；原玻璃蝇短杆菌(Brevibacterium protophormiae)；天牛金杆菌(Brevibacterium saperdae)；黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)；Brevibacterium immariophilum；谷氨酸棒杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)；玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)；解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)；谷氨酸棒杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)；噬亮氨酸短杆菌(Brevibacterium leucinophagum)；液化短杆菌(Brevibacterium liquefaciens)；戊糖丙氨酸短杆菌(Brevibacteriumpentoso-alanicum)；戊糖氨基酸短杆菌Brevibacterium pentoso-aminoacidicum；溶解短杆菌(Brevibacterium lyticum)；白色短杆菌(Brevibacterium albidum)；柠檬色短杆菌(Brevibacterium citreum)；藤黄短杆菌(Brevibacterium luteum)；砖红色短小杆菌(Brevibacterium testaceum)；极小短小杆菌(Brevibacteriumpusillum)；丙氨酸短杆菌(Brevibacterium alanicum)；产氨基短杆菌(Brevibacterium aminogenes)；产色短杆菌(Brevibacterium chromogenes)；耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)；耐盐短杆菌(Brevibacteriumhalotolerans)；发酵短杆菌(Brevibacterium fermentans)；氧化短杆菌(Brevibacteriu moxydans)；乳微杆菌(Microbacterium lacticum)；液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)；黄色微杆菌(Microbacterium flavum)；热杀索丝菌(Microbacterium thermosphactum)；产黄纤维单胞菌(Cellulomonasflavigena)；微酸假杆菌(Cellulomonas acidula)；生金黄色纤维单胞菌(Cellulomonas aurogena)；鲜黄纤维单胞菌(Cellulomonas galba)；极小纤维单胞菌(Cellulomonas pusilla)；佐氏库特氏菌(Kurthia zopfii)；可变库特氏菌(Kurthia variabilis)；贝氏库特氏菌(Kurthia bessonii)；费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)；特氏丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)；产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidi-propionici)；詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii)；贪婪丙酸杆菌(Propionibacteriumavidum)；疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)；II型疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes Type II)；嗜淋巴丙酸杆菌(Propionibacteriumlymphophilum)；颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)；生污假杆菌(Eucobacterium feodans)；不解乳真杆菌(Eucobacterium alactolyticum)；直肠真杆菌(Eucobacterium rectale)；粘液真杆菌(Eucobacterium limosum)；啮齿真杆菌(Eucobacterium ruminantium)；砂真杆菌(Eucobacterium saburreum)；比氏真杆菌(Eucobacterium budayi)；产亚硝酸真杆菌(Eucobacteriumnitritogenes)；凸腹真杆菌(Eucobacterium ventriosum)；多形真杆菌(Eucobacterium mutiforme)；柱状真杆菌(Eucobacterium cylindroids)；念珠形真杆菌(Eucobacterium moniliforme)；黄色分枝杆菌多曲变种(Eucobacteriumtortuosum)；溶纤维真杆菌(Eucobacterium cellulosolvens)；孔氏真杆菌(Eucobacterium combesii)；纤细真杆菌(Eucobacterium tenue)；断链真杆菌(Eucobacterium fissicatena)；扭曲真杆菌(Eucobacterium contortum)；产气假杆菌(Eucobacterium aerofaciens)；迟缓真杆菌(Eucobacterium lentum)；心内膜炎真杆菌(Eucobacterium endocarditidis)；蠕虫状真杆菌(Eucobacteriumhelminthoides)；假多曲真杆菌(Eucobacterium pseudotortusum)；奥氏假杆菌(Eucobacterium obstii)；乙基假杆菌(Eucobacterium ethylicum)；赫氏真杆菌(Eucobacterium helwigiae)；溶脲真杆菌(Eucobacterium ureolyticum)；小型真杆菌(Eucobacterium parvum)；牛型放线菌(Actinomyces bovis)；龋齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)；衣氏放线菌(Actinomyces israelii)；内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)；粘放线菌(Actinomyces viscosus)；埃氏放线菌(Actinomyces eriksonii)；腐质生放线菌(Actinomyces humiferus)；猪放线菌(Actinomyces suis)；丙酸蛛菌(Arachnia propionica)；双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)；青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)；婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)；短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)；假长双歧杆菌假长亚种(Bifidobacterium pseudolongum)；嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)；猪双歧杆菌(Bifidobacterium suis)；星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroids)；蜜蜂双歧杆菌(Bifidobacterium indicum)；棒状双歧杆菌(Bifidobacterium coryneforme)；马氏棒杆菌(Bacterionemamatruchotii)；龋齿罗氏菌(Rothia dentocariose)；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；田鼠结核分枝杆菌(Mycobacterium microti)；牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)；牛结核分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)；非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)；堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)；海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)；猿分枝杆菌(Mycobacteriumsimiae)；胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)；无色分枝杆菌(Mycobacteriumnonchromogenicum)；土分枝杆菌(Mycobacterium terrae)；次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)；戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)；瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)；石蜡分枝杆菌(Mycobacteriumparaffini cum)；胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)；鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium))；蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)；溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)；草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)；母牛分枝杆菌(Mycobacterium vacce)；迪氏分枝杆菌(Mycobacterium diernhoferi)；耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)；蛇分枝杆菌(Mycobacterium thamnopheos)；微黄分枝杆菌(Mycobacterium flavescens)；偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)；外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrium)；龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)；副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis)；麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)；鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)；桤木弗兰克氏菌(Frankia alni)；胡颓子弗兰克氏菌(Frankia elaeagni)；Frankia discariae；美洲茶弗兰克氏菌(Frankiaceanothi)；马桑弗兰克氏菌(Frankia coriariae)；仙女木弗兰克氏菌(Frankiadryadis)；羚羊木弗兰克氏菌(Frankia purshiae)；腊果弗兰克氏菌(Frankiacercocarpi)；布氏弗兰克氏菌(Frankia brunchorstii)；木麻黄弗兰克氏菌(Frankia casuarinae)；菲律宾游动放线菌(Actinoplanes philippinensis)；阿美尼亚链霉菌(Actinoplanes armeniacus)；密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)；犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)；微白螺孢菌(Spirillosora albida)；玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)；普通链孢囊菌(Streptosporangium vulgare)；产紫晶链孢囊菌(Streptosporangiumamethystogenes)；假普通链孢囊菌(Streptosporangium pseudovulgare)；无淀粉酶链孢囊菌(Streptosporangium nondiastaticum)；长孢链孢囊菌(Streptosporangium longisporum)；灰绿库茨涅尔氏菌(Streptosporangiumviridogriseum)；白色链孢囊菌(Streptosporangium album)；白色库茨涅尔氏菌(Streptosporangium albidum)；绿白链孢囊菌(Streptosporangiumviridialbum)；红色链孢囊菌(Streptosporangium rubrum)；橙色无定形孢囊菌(Amorphosphorangium auranticolor)；规则小瓶菌(Ampullariella regularis)；钟形小瓶菌(Ampullariella campanulata)；裂叶小瓶菌(Ampullariella lobata)；指状小瓶菌(Ampullariella digitata)；陶器发仙菌(Pilimelia terevasa)；环状列发仙菌(Pilimelia anulata)；排孢游动单胞菌(Planomonosporaparontospora)；委内瑞拉游动单胞菌(Planomonospora venezuelensis)；长孢游动双孢菌(Planobispora longispora)；玫瑰游动双孢菌(Planobispora rosea)；桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)；泰国指孢囊菌(Dactylosporangium thailandense)；刚果嗜皮菌(Dermatophilus congolensis)；昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilus obscurus)；皮诺卡氏菌(Nocardia farcinica)；豚鼠耳炎诺卡氏菌(Nocardia otitidus-caviarum)；巴西诺卡氏菌(Nocardiabrasilliensis)；星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids)；南非诺卡氏菌(Nocardiatransvalensis)；蚂蚁诺卡氏菌(Nocardia formicae)；空腔诺卡氏菌(Nocardiacoeliaca)；多产色诺卡氏菌(Nocardia polychromogenes)；石蜡诺卡氏菌(Nocardia paraffinae)；嗜石油诺卡氏菌(Nocardia petroleophila)；土星无枝酸菌(Nocardia saturnea)；黑石氏诺卡氏菌(Nocardia kuroishii)；粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)；椿象链霉菌(Nocardia rhodnii)；越桔诺卡氏菌(Nocardiavaccinii)；最小诺卡氏菌(Nocardia minima)；布氏链霉菌(Nocardiablackwellii)；盘卷诺卡氏菌(Nocardia convoluta)；纤维化纤维单胞菌(Nocardiacellulans)；藤黄诺卡氏菌(Nocardia lutea)；小球诺卡氏菌(Nocardiagloberula)；深红红球菌(Nocardia rubropertincta)；珊瑚诺卡氏菌(Nocardiacorallina)；鲑色诺卡氏菌(Nocardia salmonicolor)；红色诺卡氏菌(Nocardiarubra)；混浊红球菌(Nocardia opaca)；灰暗诺卡氏菌(Nocardia calcarea)；局限诺卡氏菌(Nocardia restricta)；红串红球菌(Nocardia erythropolis)；海洋诺卡氏菌(Nocardia marina)；大西洋诺卡氏菌(Nocardia atlantica)；气生菌落糖丝菌(Nocardia aerocolonigenes)；桔橙色链霉菌(Nocardia aurantia)；生丁基诺卡氏菌(Nocardia butanica)；达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiadassonvillei)；组织诺卡氏菌(Nocardia histidans)；马杜拉放线菌(Nocardiamadurae)；未浑浊诺卡氏菌(Nocardia neoopaca)；佩莱得诺卡氏菌(Nocardiapellegrino)；白乐杰马杜拉放线菌(Nocardia pelletieri)；木材气味诺卡氏菌(Nocardia sylvodorifera)；浑浊诺卡氏菌(Nocardia turbata)；细小诺卡氏菌(Nocardia tenuis)；变异诺卡氏菌(Nocardia variabilis)；嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)；刺假诺卡氏菌(Pseudonocardia spinosa)；白长链霉菌(Streptomyces albolongus)；微绿链霉菌(Streptomyces viridaris)；白黑链霉菌(Streptomyces albo-niger)；白孢链霉菌(Streptomycesalbosporeus)；白酒红链霉菌(Streptomyces albovinaceus)；金色辐旋链霉菌(Streptomyces aureocirculatus)；巴恩链霉菌(Streptomyces baarnensis)；钉斑链霉菌(Streptomyces calvifer)；加尔杰链霉菌(Streptomyces galtieri)；包比链霉菌(Streptomyces bobili)；长孢红色链霉菌(Streptomyceslongispororuber)；长孢链霉菌(Streptomyces longisporus)；草绿链霉菌(Streptomyces herbeus)；生白链霉菌(Streptomyces albofaciens)；白色链霉菌(Streptomyces albus)；白色链霉菌棕霉素亚种(Streptomyces albussubsp.bruneomycini)；白色链霉菌祛病亚种(Streptomyces albussubsp.pathocidicus)；阿木吉氏链霉菌(Streptomyces almquistii)；嗜氨基链霉菌(Streptomyces aminophilus)；可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)；冠霉素链霉菌(Streptomyces chrestomyceticus)；柔毛链霉菌(Streptomycesflocculus)；吉布森链霉菌(Streptomyces gibsonii)；浅草绿链霉菌(Streptomyces herbescens)；碘仿链霉菌(Streptomyces iodoformicus)；赫黄菌核链霉菌(Streptomyces ochraceiscleroticus)；仰光链霉菌(Streptomycesrangoon)；龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)；龟裂链霉菌巴龙霉素亚种(Streptomyces rimosus subsp.paromomycinus)；Streptomyces rimosussubsp.pseudoverticillatus；螺旋轮丝链霉菌(Streptomycesspiroverticillatus)；亚黄链霉菌(Streptomyces subflavus)；华沙链霉菌(Streptomyces varsoviensis)；黄石链霉菌(Streptomyces xantholiticus)；白色链霉菌抗真菌亚种(Streptomyces albus subsp.fungatus)；氢化链霉菌(Streptomyces hydrogenans)；Streptomyces vendargus；不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)；抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)；比链霉菌基尼(Streptomyces bikiniensis)；可可链霉菌阿亚苏亚种(Streptomycescacaoi subsp.asoensis)；烬灰红链霉菌(Streptomyces cinereoruber)；烬灰红链霉菌发酵果糖亚种(Streptomyces cinereoruber subsp.fructofermentans)；Streptomyces cylindrosporus subsp.piceus；埃德尔链霉菌(Streptomycesederensis)；暗黄紫链霉菌(Streptomyces fulvoviolaceus)；暗黄绿链霉菌(Streptomyces fulvoviridis)；加德那链霉菌(Streptomyces gardneri)；浑圆链霉菌(Streptomyces globosus)；灰锈赤链霉菌(Streptomycesgriseorubiginosus)；草绿色链霉菌(Streptomyces herbaricolor)；生靛链霉菌(Streptomyces indigoferus)；石蕊杀菌素链霉菌(Streptomyces litmocidini)；那波链霉菌(Streptomyces narbonensis)；纳士维尔链霉菌(Streptomycesnashvillensis)；登户链霉菌(Streptomyces noboritoensis)；暗绛红链霉菌(Streptomyces phaeopurpureus)；绛红褐链霉菌(Streptomyces purpeofuscus)；焦土链霉菌(Streptomyces showdoensis)；田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)；紫色直丝链霉菌(Streptomyces violaceorectus)；沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)；阿布拉链霉菌(Streptomycesaburaviensis)；青蓝链霉菌(Streptomyces caeruleus)；小串链霉菌(Streptomyces catenulae)；金羊毛链霉菌烟熏亚种(Streptomyces chrysomallussubsp.fumigatus)；杀黄胞菌素链霉菌(Streptomyces xanthocidicus)；不产色链霉菌赤红亚种(Streptomyces achromogenes subsp.rubradiris)；阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii)；橙灰链霉菌(Streptomyces aurantiogriseus)；Streptomycesbobili subsp.sporificans；烬灰产色链霉菌(Streptomycescinerochromogenes)；卷须链霉菌(Streptomyces cirratus)；山丘链霉菌(Streptomyces collinus)；泛温链霉菌(Streptomyces eurythermus)；绿黄链霉菌(Streptomyces galbus)；加利利链霉菌(Streptomyces galilaeus)；灰红链霉菌(Streptomyces griseoruber)；灰孢链霉菌(Streptomyces griseosporeus)；吸水链霉菌奥萨霉素亚种(Streptomyces griseosporeus subsp.ossamyceticus)；库尔萨诺夫链霉菌(Streptomyces kurssanovii)；藤黄灰链霉菌(Streptomycesluteogriseus)；堆孢链霉菌(Streptomyces massasporeus)；奇异链霉菌(Streptomyces mirabilis)；多旋链霉菌(Streptomyces multispiralis)长西氏链霉菌(Streptomyces naganishii)；根矢链霉菌(Streptomyces neyagawaensis)；野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)；橄榄产色链霉菌(Streptomycesolivochromogenes)；生暗链霉菌(Streptomyces phaeofaciens)；粉末链霉菌(Streptomyces pulveraceus)；枝链霉菌(Streptomyces rameus)；拒霉素链霉菌(Streptomyces resistomycificus)；利尻链霉菌(Streptomyces rishiriensis)；热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)；紫产色链霉菌(Streptomycesviolaceochromogenes)；阿富汗链霉菌(Streptomyces afghaniensis)；沙场链霉菌(Streptomyces arenae)；暗黑蓝链霉菌(Streptomyces attrocyaneus)；色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)；达勒姆链霉菌(Streptomycesdurhamensis)；多刺链霉菌(Streptomyces echinatus)；菲律宾链霉菌(Streptomyces filipinensis)；镶边链霉菌(Streptomyces fimbriatus)；灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)；绿青链霉菌(Streptomycesiakyrus)；鲁萨链霉菌(Streptomyces lucensis)；孔雀石链霉菌(Streptomycesmalachitofuscus)；孔雀石直丝链霉菌(Streptomyces malachitorectus)；毛链霉菌(Streptomyces pilosus)；微白褐链霉菌(Streptomyces albidofuscus)；白浅黄链霉菌(Streptomyces albogriseolus)；产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)；花青蓝链霉菌(Streptomyces anthocyanicus)；抗霉菌素链霉菌(Streptomyces antimycoticus)；银样链霉菌(Streptomyces argenteolus)；暗黑链霉菌(Streptomyces atratus)；金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)；榛色链霉菌(Streptomyces avellaneus)；青灰链霉菌(Streptomyces caesius)；肉质链霉菌(Streptomyces carnosus)；千叶链霉菌(Streptomyces chibaensis)；浅天青链霉菌(Streptomyces coelescens)；天蓝色链霉菌无色亚种(Streptomycescoelicolor subsp.achrous)；天蓝色链霉菌生天蓝亚种(Streptomycescoelicolor subsp.coelicofers)；天蓝色链霉菌近天蓝亚种(Streptomycescoelicolor subsp.coelicolatus)；天蓝色链霉菌变色天蓝亚种(Streptomycescoelicolor subsp.coelicovarians)；黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii)；产蓝链霉菌(Streptomyces cyanogeus)；淀粉酶链霉菌石板灰亚种(Streptomycesdiastaticus subsp.ardesiacus)；淀粉酶产色链霉菌短亚种(Streptomycesdiastatochromogens subsp.bracus)；内链霉菌(Streptomyces endus)；突发链霉菌(Streptomyces erumpens)；灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus)；灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus)；浅灰暗链霉菌(Streptomycesgriseolosuffuscus)；灰藤黄链霉菌(Streptomyces griseoluteus)；Streptomycesgriseus subsp.difficilis；湿链霉菌(Streptomyces humidus)；吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)；吸水链霉菌狭霉素亚种(Streptomyceshygroscopicus subsp.angustmyceticus)；吸水链霉菌德夸亚种(Streptomyceshygroscopicus subsp.decoyicus)；吸水链霉菌浑圆亚种(Streptomyceshygroscopicus subsp.glebosus)；黎巴嫩链霉菌(Streptomyces libani)；黎巴嫩链霉菌红黄亚种(Streptomyces libani subsp.rufus)；浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)；葡萄牙链霉菌(Streptomyces lusitanus)；利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)；生黑孢链霉菌(Streptomyces melanosporofaciens)；米修链霉菌(Streptomyces misionensis)；鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；易变链霉菌(Streptomyces mutabilis)；变黑链霉菌(Streptomyces nigrescens)；结节链霉菌(Streptomyces nodosus)；黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)；橄榄色硬膜链霉菌(Streptomyces olvaceisceiscleroticus)；橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)；橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)；微小链霉菌(Streptomyces parvullus)；普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)；褶链霉菌(Streptomyces plicatus)；普恩链霉菌(Streptomyces poonensis)；沙链霉菌(Streptomyces psammoticus)；成紫硬块链霉菌(Streptomycespurpurogeneiscleroticus)；累西飞链霉菌(Streptomyces recifenis)；娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)；Streptomyces rokugoensis；玫瑰淀粉酶链霉菌(Streptomyces roseodiastaticus)；鲁地链霉菌卡斯泰拉亚种(Streptomycesrutgersensis subsp.castelarense)；Streptomyces sayamaensis；Streptomycessendaiensis；盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)；唐德盐屋链霉菌(Streptomyces tendae)；热普通盐屋链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)；三色链霉菌(Streptomyces tricolor)；杀结核链霉菌(Streptomycestubercidicus)；解瘤链霉菌(Streptomyces tumemacerans)；广阔链霉菌(Streptomyces vastus)；紫阔链霉菌(Streptomyces vioaceolatus)；紫黑链霉菌(Streptomyces violaceus-niger)；Streptomyces violaceus-ruber；生绿链霉菌(Streptomyces viridifaciens)；暗黑橄榄链霉菌(Streptomycesatroolivaceus)；深蓝色链霉菌(Streptomyces cyanocolor)；禾生链霉菌(Streptomyces graminofaciens)；灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)；白丘链霉菌(Streptomyces albaduncus)；白刺链霉菌(Streptomycesalbospinus)；小白链霉菌(Streptomyces albulus)；异硫链霉菌(Streptomycesalthioticus)；阿拉伯链霉菌(Streptomyces arabicus)；暗黑橄榄链霉菌突变霉素亚种(Streptomyces atroolivaceus subsp.mutomycini)；暗灰链霉菌(Streptomyces canus)；恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)；氯生链霉菌(Streptomyces chlorobiens)；尖孢链霉菌(Streptomycescuspidosporus)；灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)；灰黄链霉菌(Streptomyces griseoflavus)；灰肉红链霉菌(Streptomycesgriseoincarnatus)；灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)；大孢子链霉菌(Streptomyces macrosporeus)；孔雀石链霉菌(Streptomyces malachiticus)；马特链霉菌(Streptomyces matensis)；诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)；橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivoviridis)；假浅灰链霉菌(Streptomycespseudogriseolus)；锈赤链霉菌(Streptomyces rubiginosus)；稀疏链霉菌(Streptomyces sparsogenes)；绿紫链霉菌(Streptomyces viridiviolaceus)；绿淀粉酶链霉菌(Streptomyces virido-diastaticus)；秃裸链霉菌(Streptomycescalvus)；蓝白链霉菌(Streptomyces cyanoalbus)；芬莱链霉菌(Streptomycesfinlayi)；浅黄链霉菌(Streptomyces flaveolus)；喷泉链霉菌(Streptomycesgeysiriensis)；生草绿链霉菌(Streptomyces herbiferis)；密旋链霉菌(Streptomyces pactum)；秋田链霉菌(Streptomyces akitaensis)；秋吉链霉菌(Streptomyces akiyoshiensis)；丙氨菌素链霉菌(Streptomyces alanosinicus)；微白链霉菌转化亚种(Streptomyces albidus subsp.invertens)；白色产色链霉菌(Streptomyces albochromogenes)；圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)；圈卷产色链霉菌浅色亚种(Streptomyces ansochromogenessubsp.pallens)；阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)；(Streptomycescarcinomycicus)；栗色球孢链霉菌(Streptomyces castaneglobisporus)；栗色链霉菌(Streptomyces castaneus)；兰黄链霉菌(Streptomyces cyanoflavus)；雅加达链霉菌(Streptomyces djakartensis)；暗红产色链霉菌成户亚种(Streptomyces erythrochromogenes subsp.narutoensis)；球团产色链霉菌(Streptomyces glomerochromogenes)；灰菌素链霉菌(Streptomyces grisinus)；原町链霉菌(Streptomyces haranomachiensis)；Streptomyces hygrostaticus；不寻常链霉菌(Streptomyces insulatus)；Streptomyces inversochromogenes；北泽链霉菌(Streptomyces kitazuwaensis)；玛里链霉菌(Streptomycesmariensis)；微菌核链霉菌(Streptomyces minutiscl eroticus)；三鹰链霉菌(Streptomyces mitakaensis)；黑浅灰链霉菌(Streptomyces nigrogriseolus)；相贺链霉菌(Streptomyces ogaensis)；皮达德链霉菌(Streptomycespiedadensis)；雷格链霉菌(Streptomyces regensis)；略红褐链霉菌(Streptomyces robefuscus)；褐棕链霉菌(Streptomyces robeus)；强壮链霉菌(Streptomyces robustrus)；玫瑰浅灰链霉菌(Streptomyces roseogriseolus)；玫瑰灰链霉菌(Streptomyces roseogriseus)；左八朗链霉菌(Streptomycessahachiroi)；濑野链霉菌(Streptomyces senoensis)；田无链霉菌抑脑炎霉素亚种(Streptomyces tanashiensis subsp.cephalomyceicus)；热硝化链霉菌(Streptomyces thermonitrificans)；热紫链霉菌不渗透亚种(Streptomycesthermoviolaceus subsp.apingens)；绿黑链霉菌(Streptomyces viridoniger)；韦腊链霉菌(Streptomyces werraensis)；白黄链霉菌(Streptomycesalboflavus)；杆菌状链霉菌(Streptomyces bacillaris)；卡伍尔链霉菌(Streptomyces cavourensis)；蓝微褐链霉菌(Streptomyces cyaneofuscatus)；极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissmus)；灰棕褐链霉菌(Streptomycesgriseobrunneus)；密执安链霉菌(Streptomyces michiganensis)；津岛链霉菌(Streptomyces tsusimaensis)；黄质产色链霉菌(Streptomycesxanthochromogenus)；微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)；白绿链霉菌(Streptomyces alboviridis)；环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)；栗褐链霉菌(Streptomyces badius)；加州链霉菌(Streptomyces californicus)；淡灰链霉菌(Streptomyces canescens)；纤维黄链霉菌(Streptomyces celluloflavus)；纤维素链霉菌(Streptomyces cellulosae)；昌帕瓦特链霉菌(Streptomyceschampavatii)；金羊毛链霉菌(Streptomyces chrysomallus)；柠檬荧光链霉菌(Streptomyces citreofluorescens)；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)；苦胆链霉菌(Streptomyces felleus)；粪生链霉菌(Streptomyces fimicarius)；佛罗里达链霉菌(Streptomyces floridae)；荧光链霉菌(Streptomycesfluorescens)；球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)；球孢链霉菌高加索亚种(Streptomyces globisporus subsp.caucasicus)；黄棕色链霉菌(Streptomycesglobi sporus subsp.flavofuscus)；球孢链霉菌普通亚种(Streptomycesglobisporus subsp.vulgaris)；谷氏链霉菌(Streptomyces gougerotii)；灰菌素链霉菌(Streptomyces griseiuns)；浅灰白链霉菌(Streptomycesgriseoloalbus)；灰色链霉菌(Streptomyces griseus)；灰色链霉菌甲亚种(Streptomyces griseus subsp.alpha)；灰色链霉菌白垩亚种(Streptomycesgriseus subsp.cretosus)；灰色链霉菌溶解亚种(Streptomyces griseussubsp.solvifaciens)；中间型链霉菌(Streptomyces intermedius)；卡纳霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)；制酵母链霉菌(Streptomyces levoris)；淤泥链霉菌(Streptomyces limosus)；利波曼链霉菌(Streptomyces lipmanii)；细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)；土味链霉菌(Streptomyces odorifer)；小链霉菌(Streptomyces parvus)；浅多色链霉菌(Streptomycespluri colorescens)；抗肺炎链霉菌(Streptomyces pneumonicus)；早期链霉菌(Streptomyces praecox)；榴红链霉菌(Streptomyces puniceus)；棉子糖链霉菌(Streptomyces raffinosus)；鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)；桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)；西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)；仙台链霉菌(Streptomyces sindenensis)；硫磺链霉菌(Streptomyces sulphureus)；维摩氏链霉菌(Streptomyces willmorei)；夏威夷链霉菌(Streptomyceshawaiiensis)；白蜡黄链霉菌(Streptomyces albohelvatus)；微金链霉菌(Streptomyces aurigineus)；黄雀链霉菌(Streptomyces canaries)；浅金链霉菌(Streptomyces chryseus)；微黄绿链霉菌(Streptomyces flavidovirens)；淡蜡黄链霉菌(Streptomyces helvaticus)；长孢黄色链霉菌(Streptomyceslongisporoflavus)；雪白链霉菌(Streptomyces niveus)；寡淀粉酶链霉菌(Streptomyces paucidiastaticus)；类球形链霉菌(Streptomyces spheroides)；平普里链霉菌(Streptomyces pimprina)；上升岛链霉菌(Streptomycescapoamus)；朱红链霉菌(Streptomyces cinnabarinus)；晶体链霉菌(Streptomycescrystallinus)；黄三素链霉菌(Streptomyces flavotricini)；戈壁三素链霉菌(Streptomyces gobitricini)；林肯链霉菌(Streptomyces lincolenensis)；产黑链霉菌(Streptomyces melanogenes)；暗产色链霉菌(Streptomycesphaeochromogenes)；暗产色链霉菌氯霉素亚种(Streptomyces phaeochromogenessubsp.chloromyceticus)；假委内瑞拉链霉菌(Streptomyces pseudovenezuelae)；玫瑰绿链霉菌(Streptomyces roseoviridis)；壮观链霉菌(Streptomycesspectabillis)；亚黄红链霉菌(Streptomyces subrutilus)；赭褐链霉菌(Streptomyces umbrinus)；委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venzuelae)；黄暗色链霉菌(Streptomyces xanthophaeus)；金单枝链霉菌(Streptomycesauremonopodiales)；脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliates)；丝状链霉菌(Streptomyces filamentosus)；李色链霉菌(Streptomyces prunicolor)；玫瑰暗黄链霉菌(Streptomyces roseofulvus)；浅玫瑰链霉菌(Streptomycesroseolus)；玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseoporus)；锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus)；白蚁链霉菌(Streptomyces termitum)；肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)；哥伦比亚链霉菌(Streptomycescolombiensis)；五色链霉菌(Streptomyces goshikiensis)；卡特拉链霉菌(Streptomyces katrae)；淡紫灰叶链霉菌(Streptomyces lavendofoliae)；淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)；淡紫灰链霉菌不抗病亚种(Streptomyceslavendulae subsp.avireus)；淡紫灰链霉菌巴西亚种(Streptomyces lavendulaesubsp.brasilicus)；淡紫灰链霉菌蚕脓亚种(Streptomyces lavendulaesubsp.grasserius)；淡紫色链霉菌(Streptomyces lavendulcolor)；苍黄链霉菌(Streptomyces luridus)；兰花链霉菌(Streptomyces orchidaceus)；穗产色链霉菌(Streptomyces racemochromogenes)；丁香花链霉菌(Streptomycessyringae)；毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)；保护链霉菌(Streptomyces tuirus)；酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)；弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)；砖红链霉菌(Streptomyces lateritus)；黄变异链霉菌(Streptomyces flavovariabilis)；紫花链霉菌(Streptomycesjanthinus)；浅绛红链霉菌(Streptomyces purpurascens)；玫瑰刺链霉菌(Streptomyces roseospinus)；玫瑰紫链霉菌(Streptomyces roseoviolaceus)；紫色链霉菌(Streptomyces violaceus)；紫色链霉菌关联亚种(Streptomycesviolaceus subsp.cofinus)；紫色链霉菌邻近亚种(Streptomyces violaceussubsp.vicinus)；略紫链霉菌(Streptomyces violarus)；近紫链霉菌(Streptomyces violatus)；横须贺链霉菌(Streptomyces yokosukanensis)；白孢链霉菌(Streptomyces albosporeus)；桔橙链霉菌(Streptomycesaurantiacus)；金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)；金黄橙链霉菌(Streptomyces aurini)；乳脂链霉菌(Streptomyces cremeus)；达格斯坦链霉菌(Streptomyces daghestanicus)；弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)；脆弱链霉菌(Streptomyces fragilis)；烟熏链霉菌(Streptomyces fumanus)；球团橙色链霉菌(Streptomyces glomeroaurantiacus)；灰浅绿链霉菌(Streptomycesgriseoviridis)；雪白红链霉菌(Streptomyces niveoruber)；波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)；暗绿链霉菌(Streptomyces phaeoviridis)；玫瑰菌核链霉菌(Streptomyces roseiscleroticus)；玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)；玫瑰丁香链霉菌(Streptomyces roseolilacinus)；红蓝链霉菌(Streptomyces rubo-cyaneus)；公牛链霉菌(Streptomyces tauricus)；酒红土褐链霉菌(Streptomyces vinaceus-drappus)；杀病毒链霉菌(Streptomycesvirocidus)；红色糖多孢菌(Streptomyces erythraeus)；藤黄荧光马杜拉放线菌(Streptomyces luteofluorescens)；暗红灰链霉菌(Streptomyceserythrogriseus)；亮矛链霉菌(Streptomyces garyphalus)；淡紫灰直丝链霉菌(Streptomyces lavendularectus)；长崎链霉菌(Streptomyces nagasakiensis)；红淡紫灰链霉菌(Streptomyces rubrolavendulae)；肉桂链霉菌(Streptomycescinnamonensis)；阿什哈巴德链霉菌(Streptomyces ashchabadicus)；多产色链霉菌(Streptomyces polychromogenes)；天草链霉菌(Streptomycesamakusaensis)；天青链霉菌(Streptomyces caelestis)；远青链霉菌(Streptomyces azureus)；美丽链霉菌(Streptomyces bellus)；教酒链霉菌(Streptomyces chartreusis)；拟天蓝链霉菌(Streptomyces coeliatus)；似天蓝链霉菌(Streptomyces coerulatus)；Streptomyces coerulatussubsp.amylolyticus；天蓝褐链霉菌(Streptomyces coeruleofuscus)；天蓝微红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)；浅天蓝链霉菌(Streptomycescoerulescens)；古腊科链霉菌(Streptomyces curacoi)；深蓝链霉菌(Streptomyces cyaneus)；蓝球团孢链霉菌(Streptomyces cyanoglomerus)；靛蓝色链霉菌(Streptomyces indigocolor)；羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)；灰青链霉菌(Streptomyces lazureus)；瓦蓝链霉菌(Streptomyces valynus)；绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)；淡青链霉菌(Streptomycesgalucescens)；布鲁链霉菌(Streptomyces blensis)；(Streptomyces coerulatussubsp.anaseuli)；天蓝玫瑰链霉菌(Streptomyces coeruleoroseus)；甘薯链霉菌(Streptomyces ipomoesae)；刺链霉菌(Streptomyces spinosus)；灰色霉素链霉菌(Streptomyces griseomycini)；灰草黄链霉菌(Streptomycesgriseostramineus)；葱绿孢链霉菌(Streptomyces prasinosporus)；加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)；蓬刺链霉菌(Streptomyces hirsutus)；葱绿链霉菌(Streptomyces prasinus)；绿孢链霉菌(Streptomyces viridosporus)；吖啶霉素链霉菌(Streptomyces acrimycini)；班堡链霉菌(Streptomycesbambergiensis)；葱绿毛链霉菌(Streptomyces prasinopilosus)；何尔塘链霉菌(Streptomyces horton)；直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus)；丁香暗黄链霉菌(Streptomyces lilacinofulvus)；苯胺紫链霉菌(Streptomycesmauvecolor)；微紫链霉菌(Streptomyces violans)；浅紫链霉菌(Streptomycesviolascens)；巴尔达氏链霉菌(Streptoverticillium baldaccii)；热诚链轮丝菌(Streptoverticillium fervens)；红氯链轮丝菌(Streptoverticilliumrubrochlorinum)；双轮丝链轮丝菌(Streptoverticillium biverticillatum)；金轮生链轮丝菌(Streptoverticillium aureoversales)；五霉素链轮丝菌(Streptoverticillium pentaticum)；玫瑰轮丝链霉菌(Streptoverticilliumroseoverticillatum)；红色轮生链轮丝菌(Streptoverticilliumrubroverticillatum)；广岛链轮丝菌(Streptoverticillium hiroshimense)；鲑色链轮丝菌(Streptoverticillium salmonis)；藤黄轮丝链轮丝菌(Streptoverticillium luteoverticillatum)；橄榄网状链轮丝菌(Streptoverticillium olivoreticuli)；瓦氏链轮丝菌(Streptoverticilliumwaksmanii)；灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)；肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)；八丈岛链轮丝菌(Streptoverticillium hachijoense)；灰肉色链轮丝菌(Streptoverticilliumardum)；阿孙链轮丝菌(Streptoverticillium abikoense)；白网链轮丝菌(Streptoverticillium  albireticuli)；优洛杀菌素链轮丝菌(Streptoverticillium eurocidicum)；岸和田链轮丝菌(Streptoverticilliumkishiwadense)；马术链轮丝菌(Streptoverticillium mashuense)；橄榄轮丝链轮丝菌(Streptoverticillium olivoverticillatum)；奥里诺科链霉菌(Streptoverticillium orinoci)；少生孢链轮丝菌(Streptoverticilliumparvisporogenes)；肯塔基链轮丝菌(Streptoverticillium kentuckense)；灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium album)；偏端链轮丝菌(Streptoverticilliumdistallicum)；爱嫒链轮丝菌(Streptoverticillium ehimense)；黄桃链轮丝菌(Streptoverticillium flavopersicum)；灰轮丝链轮丝菌(Streptoverticilliumgriseoverticillatum)；纺锤链轮丝菌(Streptoverticillium netropsis)；直轮丝链霉菌(Streptoverticillium rectiverticillatum)；横膈链霉菌(Streptoverticillium septatum)；茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)；稻瘟霉素链轮丝菌(Streptoverticillium blastmyceticum)；熏衣草链轮丝菌(Streptoverticillium lavenduligriseum)；丁香链轮丝菌(Streptoverticillium lilacium)；克什米尔链轮丝菌(Streptoverticilliumkashmirense)；硫藤黄链轮丝菌(Streptoverticillium thioluteum)；多形鱼孢菌(Sporichthya polymorpha)；变灰链霉菌(Microellobosporia cinerea)；紫小荚孢囊菌(Microellobosporia violacea)；黄色链霉菌(Microellobosporiaflavea)；假刺孢链霉菌(Microellobosporia grisea)；Microellobosporiachalcea；盐生植小单孢菌(micromonospora halophytica)；炭样小单孢菌(micromonospora carbonacea)；酋志野小单孢菌(micromonosporanarashinoensis)；黑孢小单孢菌(micromonospora melanopra)；棘孢小单孢菌(micromonospora echinospora)；绛红小单孢菌(micromonospora purpurea)；绛红产色小单孢菌(micromonospora purpureochromogenes)；二色小单孢菌(micromonospora bicolor)；青蓝小单孢菌(micromonospora coerulea)；浑圆小单孢菌(micromonospora globosa)；长形小单孢菌(micromonospora elongata)；小小单孢菌(micromonospora parva)；高卢小单孢菌(micromonospora gallica)；醋蚁酸小单孢菌(micromonospora acetoformici)；丙酸小单孢菌(micromonosporapropionici)；普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)；糖高温放线菌(Thermoactinomyces sacchari)；双杈双岐放线菌(Actinobifada alba)；产色双岐放线菌(Actinobifada chromogena)；弯曲高温单孢菌(Thermomonsporacurvata)；绿色高温单孢菌(Thermomonspora viridis)；玫瑰小双孢菌(Microbispora rosea)；青铜样小双孢菌(Microbispora aerata)；产紫晶小双孢菌(Microbispora amethystogenes)；双孢小双孢菌(Microbispora bispora)；产色小双孢菌(Microbispora chromogenes)；淀粉酶小双孢菌(Microbisporadiastatica)；弱小双孢菌(Microbispora parva)；热淀粉酶小双孢菌(Microbispora thermodiastatica)；热玫瑰小双孢菌(Microbisporathermorosea)；短链诺卡氏菌(Micropolyspora brevicatena)；被孢小多孢菌(Micropolyspora angiospora)；青灰糖单孢菌(Micropolyspora caesia)；直杆干草菌(Micropolyspora faeni)；直逗号糖多孢菌(Micropolysporarectivirgula)；红棕褐小双孢菌(Microbispor a rubrobrunea)；热绿小双孢菌(Microbispora thermovirida)；和绿黑小双孢菌(Microbispora viridinigra)。

而且，可以使抗原与免疫刺激物质一起，或与其分别承载于在大小为可以被细胞吞噬的微粒状磷酸钙上。以这种目的使用的抗原，如果是可以在微粒状磷酸钙上承载的抗体，则其种类没有特别限定。例如，可以承载水溶性的溶解度极高的牛血清白蛋白作为抗原(特开2005-126335号公报)。而且，与上述来源于微生物的可溶性成分相同，还可以承载疏水性物质作为抗原。抗原，优选为选自于真菌，放线菌，细菌，病毒，噬菌体，立克次氏体，原生动物，这些微生物的成分，原生动物成分、肿瘤组织，肿瘤细胞，肿瘤细胞成分，肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽中的1种或2种以上的物质，但不仅限于这些物质。

由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的微粒状沉淀物的制备方法详细记载于例如美国专利第5759582号说明书中，本领域技术人员可以容易地制备上述沉淀物。例如，对于使用(i)白蛋白作为可溶性蛋白，使用(ii)肝素作为粘多糖，使用(iii)PPD作为免疫刺激物质的方法，详细记载于日本特许第3492671号说明书中，最优选使用该方法，但也不限于此。而且，可溶性蛋白和粘多糖的组合不限于上述组合。作为免疫刺激物质，还可以使用例如包含于结核菌素中的可溶性蛋白，或者还可以使用由本领域技术人员按公知的方法由结核菌素制备的可溶性蛋白的全部或一部分。通过搅拌上述的(i)(ii)和(iii)这3种成分，通过成分(i)和成分(ii)的凝聚生成沉淀，此时，上述成分(iii)埋入该沉淀后共沉淀，提供沉淀物。由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物，从给药的简便性考虑，优选制成大小为可以通过注射针的微粒状。该微粒的粒径通常优选1μm以下。将沉淀物制备成微粒状的方法可以使用本领域技术人员公知的方法，并不限于特定的方法。

免疫刺激物质中所含的可溶性蛋白和(i)的可溶性蛋白的比率没有特别限定，如果是在(i)的可溶性蛋白和(ii)的粘多糖发生凝聚的范围内，则可以是任何比率。如果举例，使用pH2.5的2.5％人血清白蛋白溶液作为可溶性蛋白时，使用约5mg/ml的市售的肝素溶液作为粘多糖，对于600μl的粘多糖，溶解2.5μg的PPD后，一边搅拌该混合物一边滴下上述人血清白蛋白溶液，通过凝聚形成微粒。优选选择，离心该悬浮液，定量该上清的蛋白质含量，混合的蛋白质大部分埋入微粒的容量比。而且，当然，成分(i)-(iii)的比率和凝聚条件等可以由本领域技术人员适当选择。获得的沉淀物中所含的微粒的粒径通常为1μm左右，但并不限定于特定大小。

获得的微粒状沉淀，作为承载免疫刺激物质的载体，可以直接作为本发明的佐剂的1种成分来使用，根据需要，还可以用蒸馏水清洗沉淀。而且，为了稳定沉淀，可以通过使蛋白分子间交联剂作用形成交联从而形成微粒。蛋白分子间交联剂的种类没有特别的限定，本领域技术人员可以按公知的方法使用公知的交联剂。例如，将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺制成20mg/ml的水溶液，用旋涡混合器一边混合一边加入使其最终浓度达0.8～1.5mg/ml，然后室温下静置15分钟，这时沉淀中的蛋白质分子间就形成了十分稳定的交联。当然交联的形成并不仅限于上述特定条件或特定蛋白分子间交联剂。按上述方法得到的微粒状沉淀，它即使用水清洗也不溶解，可以适用作本发明的免疫佐剂的成分。

如果按照优选的方式，还可以通过预先将具有抗原性的可溶性蛋白和具有免疫佐剂活性的结核菌素可溶性蛋白进行混合，用此混合物代替上述(iii)，采取与上述操作同样的方法来得到沉淀物。这种沉淀物是承载免疫刺激物质和抗原的载体，还可以作为本发明的佐剂的1种成分来使用。

可以使抗原与免疫刺激物质一起，或与其分别承载于在由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚形成的沉淀物上。作为抗原，可以使用例如细胞因子，趋化因子，细胞生长因子或激素的诱导剂。而且，作为抗原，还可以使用选自于结核菌素，PPD，源于微生物的可溶性成分，6，6-双分枝菌酸藻糖(Trechalose-6，6’-dimycolate)，LPS，脂质A，寡核苷酸，β-葡聚糖，钥孔嘁血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)，胞壁酰基二肽，贝他定(bestatin)，左旋咪唑，细胞因子，趋化因子，细胞生长因子和激素中的1种或2种以上的物质。而且，作为抗原，还可以使用选自于微生物的乙醇提取物，丙酮提取物，吡啶提取物和热水提取物中的1种或2种以上的提取物。作为微生物，优选细菌，更优选该提取物结合于可溶性蛋白。作为微生物，优选使用上述例示的微生物。而且，可在由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚形成的沉淀物上承载的抗原不限于上述的特定例子。

另外，还可以通过由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚形成的沉淀物与其它不溶性蛋白质分子或抗原经蛋白分子间交联剂交联，以不溶性微粒形态制备承载免疫刺激物质的载体。蛋白分子间交联剂的种类没有特别的限制，作为本领域技术人员可以按照常规的方法使用公知的交联剂。例如，可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺等。

本发明的免疫佐剂的免疫佐剂活性，本领域技术人员可以通过本发明说明书中具体说明的方法和以下说明的方法容易地进行测定。已知THP-1细胞株是来源于人的巨噬细胞系统的建立的细胞株，一旦培养中使phorbol 12-Myristate13-Acetate(以下也存在简称为“PMA”的情况)作用分化诱导，则显示出吞噬能力(Kurosaka，K.，等，J.Immunol.，161，pp.6245-6249，1998)，成为抗原提呈细胞(Hu，P.Q.，等，J.Immunol.，172，pp.1595-1601，2004)。而且，若用IFNg前处理该细胞，则向T  细胞的抗原提呈能力增强(Brett.S.J.，等，J.Immunol.，150，pp.2869-84，1993)。因此，使THP-1细胞株分化，通过定量产生的GM-CSF，不使用包括人抗原提呈细胞在内的末梢血来源的附着性细胞，就可以测定人抗原提呈细胞的活性化程度。由于是THP-1细胞建立的细胞株，因此可以与人个体差异无关地确保质量稳定的试验材料。

本发明的免疫佐剂，与抗原混合后，通过在包括人在内的哺乳动物的体内给药，可以诱导针对该抗原的全身性的免疫反应，可以与通常使用的一般的免疫佐剂一样使用。作为抗原，可以使用原本不存在于被给药个体中的生物或物质，更具体的是，例如，可以使用为选自于真菌，放线菌，细菌，病毒，噬菌体，立克次氏体，原生动物，这些微生物的成分，肿瘤组织，肿瘤细胞，肿瘤细胞成分，肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽中的1种或2种以上的物质作为抗原，但不仅限于这些物质，只要是可以作为抗原作用的物质，则可以使用任意一种物质。而且，还可以将抗原作为独立的制剂在包括人在的哺乳动物体内给药，在该动物体内单独给药本发明的免疫佐剂，诱导针对该抗原的全身性免疫反应。或者，还可以，如前述说明，使抗原预先承载于本发明的免疫佐剂的成分-2种以上的免疫刺激物质载体中的任意一者或两种以上，再在这种情况下单独给药抗原。

抗原为真菌，放线菌，细菌，病毒，噬菌体，立克次氏体，原生动物，和/或这些微生物的成分时，通过将本发明的免疫佐剂和抗原一起给药，可以进行用于预防和/或治疗传染病的疫苗疗法。而且，抗原为肿瘤组织，肿瘤细胞，肿瘤细胞成分，肿瘤抗原蛋白和/或肿瘤抗原肽时，通过将本发明的免疫佐剂与上述抗原一起给药，可以进行预防和/或治疗肿瘤的疫苗疗法。例如，通过将从患者中分离的非活化地肿瘤细胞与本发明的免疫佐剂混合，给药给患者，可以在患者的活体内诱导针对该肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。而且，本发明的混合免疫佐剂制剂的使用方法不限于上述方式，可以使用采用免疫佐剂的常规方式的任意一种方法。本发明的免疫佐剂的给药量和给药方法没有特别的限定，但通常可以通过注射(皮下注射等)的非经口给药来进行给药以充分引起免疫反应。

再者，通过物理方法使存在于患者体内的肿瘤组织变性后，通过在该组织内给药本发明的免疫佐剂，可以在患者体内诱导针对肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。肿瘤组织的物理变性的方法没有特别的限定，可以采用例如微波照射、射频凝固法、冷冻凝固法、电刀加热、热水注入、醇注入、栓塞法、放射线照射、激光照射、超声波破坏等方法。当然物理的变性方法也并不仅限于这些方法，只要是可以诱导存在于肿瘤组织内的肿瘤细胞发生细胞凋亡，任何方法都可以。也可以将2种以上物理方法适当组合在一起使用。

例如，若通过对肿瘤组织进行微波照射，使其加热凝固，再将本发明的免疫佐剂对此凝固组织内给药，就可以诱导针对该肿瘤组织内部或其周边依然存活的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。同时也优选在本发明的免疫佐剂给药的同时进行结核菌素溶液给药。当然本发明的免疫佐剂的给药方法并不仅限于上述方式，只要是可以使本发明的免疫佐剂与变性肿瘤组织中所含肿瘤抗原一起被摄取至聚集到该变性肿瘤组织中的抗原提呈细胞、或者形成本发明的免疫佐剂能够直接刺激到抗原提呈细胞的环境，任何方法均可采用。

另外，还可以事先将本发明的免疫佐剂与免疫载体细胞在体外混合后再对患者体内给药，从而激发体内免疫反应。此免疫活性细胞可以优选使用树突细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞和/或造血干细胞等，但并不仅限于这些。

从其它方面来看，本发明还可以提供含有上述免疫佐剂和抗原作为有效成分的疫苗。此疫苗给药的时候，本领域技术人员可以使用公知的方法，也可以同时与免疫活性细胞混合使用。通过使用例如病毒或病毒成分等引起传染病的感染源来源的物质作为抗原，还可以不仅对未感染者进行感染预防，而且对于已经患有此症的患者进行治疗。而且，通过将含有选自于从患者分离的肿瘤组织，肿瘤细胞，肿瘤细胞成分，肿瘤抗原蛋白和/或肿瘤抗原肽中的1种或2种以上的生物体试样和上述免疫佐剂的疫苗在此肿瘤来源的患者中给药，还可以治疗肿瘤。

而且，抗原为例如一种动物蛋白时，通过在人以外的动物中与上述免疫佐剂一起给药，可以使针对该抗原的抗体在宿主动物中优选产生。通过该方法可以容易地制备产生抗体动物，还可以容易地获得来源于该产生抗体动物的抗体产生细胞和抗体基因。抗原只要是对于宿主具有抗原性的物质，则可以是任意物质，但并不仅限于这些物质。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的范围不限于下述实施例。

例1：1种免疫刺激物质承载于2种免疫刺激物质载体之上的免疫佐剂的抗原提呈细胞刺激效果

以THP-1细胞株作为用PMA使之分化的抗原提呈细胞，使2种免疫刺激物质载体承载PPD，在培养条件下测定在抗原提呈细胞中添加时的GM-CSF的产生量。

A.材料和方法

1.磷酸钙(以下简称为CaP)微粒核液的制备

量取2mol碳酸钙CaCO₃(カルシ一ド株式会社制，纯度99.99％)，装入高纯度的铝匣钵中，在箱式炉中1000℃，烧成3小时，进行脱碳酸，获得高纯度的氧化钙CaO，将其装入烧杯中。为了极力抑制空气中的水分与CaO反应，再与二氧化碳反应，用盖板盖在烧杯上部，置于反应槽内容量为10L的聚乙烯容器中。使氮气填充于容器中，然后除去盖板，在烧杯中滴下超纯水。此时，由于发热而保护，所以在聚乙烯容器中充满超纯水。获得反应热时，将烧杯中的反应物用超纯水全部流动洗涤，转移到聚乙烯容器中。其中使用的超纯水的总量，使根据CaO量计算的浓度调整为0.5mol/L。该阶段中氢氧化钙悬浮液。在搅拌机(EYELA社制，MAZELAZ-1000)中一边以约500rpm搅拌该悬浮液，一边以不超过25ml/min的速度在其中滴下2L的调制成0.6mol/L的磷酸H2PO4(国产化学株式会社制，浓度85％)。滴下终止后直接搅拌24小时，制成CaP核液。

2.CaP微粒液，CaP-PPD微粒液的制备

2.1磷酸钙过饱和溶液和CaP微粒液的制备

按8.28mL的林格液(扶桑药品工业株式会社制)，1.24mL的Klinisalz B液(小林制药工业株式会社制)，0.48mL的bifil专用碳酸氢钠补充液(清水制药制)的比率进行混合，成为10mL。在9ml的这种磷酸钙过饱和溶液中添加1ml乙醇，对应于10mL混合液滴加1滴CaP微粒核液，放置一夜。离心悬浮液，获得沉淀，将其用注射用生理盐水充分进行清洗，悬浮于1ml的注射用生理盐水中。将其作为CaP微粒液。

2.2CaP-PPD微粒液的制备

按8.28mL的林格液，1.24mL的Klinisalz B液，0.48mL的bifil专用碳酸氢钠补充液(清水制药制)的比率进行混合，成为10mL。在9mL这种磷酸钙过饱和溶液中溶解0.5μg-10μg结核菌素标准品(日本BCG制造株式会社，一般诊断用纯化结核菌素(PPD))。在9mL这种溶液中添加1mL乙醇，对应于10mL混合液滴加1滴CaP微粒核液，放置一夜。离心悬浮液，获得沉淀，将其用注射用生理盐水充分进行清洗，悬浮于1ml的注射用生理盐水中。这里获得的CaP-PPD微粒悬浮液，根据制备中使用的PPD量，表述为CaP-PPD(0.5μg/mL)-CaP-PPD(10μg/mL)。而且，在培养液(含有10％胎儿牛血清的RPMI1640培养基)中添加这些物质时，最终浓度为其1/5时，表述为CaP-PPD(0.1μg/mL)-CaP-PPD(2.0μg/mL)。

2.3PPD液的制备

将0.25μg结核菌素标准品(日本ビ一シ一ジ一制造株式会社制，一般诊断用纯化结核菌素(PPD))溶解于0.5mL的培养液中，制成PPD液。

2.4承载PPD的凝聚沉淀微粒(以下，简称为TuMP)液的制备

1)用灭菌水将25％人血清白蛋白溶液(HAS，Baxter Albumac，Baxter社制)稀释成2.5％，用4N HCL调整成pH2.5。

2)预先将该2.5％人血清白蛋白溶液和肝素溶液(ノボ·肝素注1000，1000单位/mL，约7.69mg/ml以下，アベンテイスフア一マ株式会社)，按各种比例进行混合，确定肝素溶液的最佳混合比。最佳混合比，按最初的适当混合比制成微粒，以2500rpm(1300g)离心15分钟，用蛋白检测试剂盒1(日本Bio-Rad Laboratories，Inc.，东京)定量其上清的蛋白质含量，混合的蛋白质的99.9％以上形成埋入微粒的条件。

3)将PPD悬浮于注射用肝素，在旋涡混合器中一边混合，一边以预先确定的比率滴下2.5％人血清白蛋白溶液。

4)以4300rpm(1300g)离心15分钟，用蒸馏水清洗2次，再悬浮于蒸馏水中。

5)在旋涡混合器中一边混合一边加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶液(EDC，SIGMA社制，溶解于水，制成20mg/mL的溶液)至终点浓度为0.8-1.5mg/mL，然后，室温下静置15分钟。

6)等量添加0.1M的甘氨酸水溶液，室温下静置15分钟。

7)以4300rpm(1300g)离心15分钟，用蒸馏水清洗3次，再悬浮于生理盐水，使PPD量达到0.5μg/mL的浓度。

将其作为TuMP液。

[01]2.5LPS液的制备

将脂多糖(以下称为LPS)(シグマアルドリツチジヤパン株式会社，东京)溶解于不含钙镁的Dulbecco磷酸缓冲生理盐水(以下称为PBS(-))(SIGMA社制)，制成1mg/mL。

2.6THP-1细胞株的分化诱导培养和GM-CSF产生试验

离心回收人巨噬细胞样细胞株THP-1，用PBS(-)清洗两次，用培养液(含有10％胎儿牛血清的RPMI1640培养基)将细胞数调整成400万个/mL，在其中按终浓度为1.6μM添加PMA溶液(将SIGMA社制PMA按1.62mM溶解于DMSO中形成的溶液)，在24孔板上，每孔接种0.5mL，培养4天。培养后，用PBS清洗2次，更换为新的培养液，再培养过夜。然后，更换为0.5mL各种刺激用培养液。在制备这种0.5mL的培养液时，添加1/5容量的CaP微粒液、CaP-PPD微粒液。而且，通过PPD溶解于培养液中，形成0.5μg/mL的溶液，添加1/5容量的这种溶液。添加1/25容量的TuMP液(2.5μg/mL)。在培养液中按终浓度形成表1中记载的浓度稀释添加LPS液。各终浓度记载于表1中。

2.6GM-CSF的测定试样

更换成0.5mL各种刺激用培养液后，培养24小时，回收其上清，作为GM-CSF的测定用试样

3.GM-CSF的定量

人GM-CSF定量用试剂盒(人GM-CSF ELISA System Biotrak、Amersham LIFESCIENCE社制)，按照试剂盒的说明书使用。GM-CSF的定量用双份进行。用微板读数器(Microplate reader)(BiotraII、Amersham Biosciences公司制)测定30分钟内的450nm的吸光度，通过校正曲线计算GM-CSF的值。

B.结果

结果示于表1。表中的简略符号为：CaP为磷酸钙微粒；PPD为纯化结核杆菌(终浓度记载于括号内)；TuMP为承载PPD的凝聚沉淀微粒(承载的PPD的终浓度记载于括号内)；CaP-PPD为承载PPD的磷酸钙微粒(承载的终浓度记载于括号内)；LPS为脂多糖(终浓度记载于括号内)。表示了本试验系统中产生的GM-CSF的量，相对于添加的LPS浓度的定量的用量反应性。因此，本试验系统的定量性优异。形成分化的抗原提呈细胞的THP-1细胞，即使在PPD，TuMP和两者刺激时，也只产生GM-CSF。与之相对，CaP-PPD浓度为0.1μg/mL时，产生了未刺激时的3倍的GM-CSF，浓度为2.0μg/mL时产生了未刺激时的13倍的GM-CSF。而且，如果除CaP-PPD之外添加PPD、TuMP，比单纯加算分别添加P-PPD、PPD、TuMP时产生GM-CSF浓度时，产生更多的GM-CSF。在CaP-PPD的浓度为0.1，0.4，2.0μg/mL时均确认了超过这种相加的效果的效果，确认CaP-PPD浓度越高，越呈现协同的效果。

[表1]

No.	免疫刺激物质	GM-CSF(ng/mL)
			1	未刺激	1.7
2	PPD(0.1μg/mL)	2.9
			3	TuMP(0.1μg/mL)	2.5
4	PPD(0.1μg/mL)+TuMP(0.1μg/mL)	2.8
			5	CaP-PPD(0.1μg/mL)	5.1
6	CaP-PPD(0.4μg/mL)	6.4
			7	CaP-PPD(2.0μg/mL)	22.2
8	CaP-PPD(0.1μg/mL)+PPD(0.1μg/mL)+TuMP(0.1μg/mL)	12.4
			9	CaP-PPD(0.4μg/mL)+PPD(0.1μg/mL)+TuMP(0.1μg/mL)	14.3
10	CaP-PPD(2.0μg/mL)+PPD(0.1μg/mL)+TuMP(0.1μg/mL)	67.7
			11	LPS(10ng/ml)	34.1
12	LPS(100ng/ml)	65.2
			13	LPS(1000ng/ml)	131.3

例2：在另外的免疫刺激物质载体上分别承载2种免疫刺激物质的免疫佐剂的抗原提呈细胞刺激效果

A.材料和方法

试样的制备，THP-1细胞株的分化诱导培养和GM-CSF产生试验、GM-CSF的测定试样和GM-CSF的定量按照例1进行。其它的药剂制备如下所示。

1.承载BCG菌提取物的磷酸钙微粒(以下简称CaP-Bx)液的制备

1)将一支干燥BCG疫苗安培(日本日本ビ一シ一ジ一制造株式会社，装入12mg)置于高压灭菌釜，于10℃5分钟，添加1ml乙醇，搅拌6小时后，收集其悬浮液，添加到另外一支干燥BCG制剂种，再充分搅拌，然后，用Eppendorf型微量高速离心器于12000rpm离心5分钟，回收其上清，制成来源于BCG菌体的乙醇可溶性成分溶液(以下称为BCG提取液)。

2)按8.28mL的林格液，1.24mL的Klinisalz B液，0.48mL的bifil专用碳酸氢钠补充液的比率进行混合，形成10mL。在9ml的这种磷酸钙过饱和溶液中添加1ml BCG提取液，对应于10mL混合液滴加1滴CaP微粒核液，放置一夜。离心悬浮液，获得沉淀，将其用注射用生理盐水充分进行清洗，悬浮于1ml的注射用生理盐水中。将其作为CaP-Bx微粒液。在GM-CSF产生试验种添加1/5容量的刺激用培养液。

B.结果

结果示于图1。No.10、11和12的条形图上的垂直线表示标准偏差。图中的简略符号为：CaP为磷酸钙微粒；PPD为纯化结核杆菌(终浓度为0.1μg/mL)；TuMP为承载PPD的凝聚沉淀微粒(承载的PPD的终浓度为0.1μg/mL)；CaP-PPD为承载BCG菌提取物的磷酸钙微粒(BCG菌提取物的制备方法和终浓度参照上述A1.1)；LPS为脂多糖(终浓度记载于括号内)。图中的试样中的免疫刺激物质示于以下的表2。

[表2]

No.	免疫刺激物质
		1	未刺激
2	CaP

3	TuMP
		4	PPD
5	PPD+TuMP
		6	CaP+TuMP
7	CaP+PPD
		8	CaP+PPD+TuMP
9	CaP-Bx
		10	CaP-Bx+TuMP
11	CaP-Bx+PPD
		12	CaP-Bx+PPD+TuMP
13	LPS(10ng/mL)
		14	LPS(100ng/mL)
15	LPS(100ng/mL)

在承载载体-CaP微粒中没有发现抗原提呈细胞的刺激作用。TuMP、PPD，与例1的情况相同，只有极弱的刺激作用，即使在混合CaP、TuMP、PPD时，其刺激作用也很弱，最大时产生的GM-CSF量为12.4ng/mL(No.5)。CaP-Bx中为128.7ng/mL(No.9)，即使再添加PPD，也几乎没有变化，但再添加TuMP时，观察到了明显的协同效果(No.10和No.12)。

例3：在1种免疫刺激物质载体上承载2种免疫刺激物质，在另外的免疫刺激物质载体上承载1种免疫刺激物质的免疫佐剂的抗原提呈细胞刺激效果

B.材料和方法

试样的制备，THP-1细胞株的分化诱导培养和GM-CSF产生试验、GM-CSF的测定试样和GM-CSF的定量按照例1进行。其它的药剂制备如下所示。

1.承载PPD-BCG菌提取物的磷酸钙微粒(以下简称CaP-PPD-Bx)液的制备

1)按8.28mL的林格液，1.24mL的Klinisalz B液，0.48mL的bifil专用碳酸氢钠补充液的比率进行混合，形成10mL。在9ml的这种磷酸钙过饱和溶液中溶解5μg的PPD。在9mL该溶液中添加1mL的BCG提取液，对应于10mL混合液滴加1滴CaP微粒核液，放置一夜。离心悬浮液，获得沉淀，将其用注射用生理盐水充分进行清洗，悬浮于1ml的注射用生理盐水中。将其作为CaP-PPD-Bx微粒液。在GM-CSF产生试验种添加1/5容量的刺激用培养液。

B.结果

结果示于表3。表中的简略符号为：CaP为磷酸钙微粒；PPD为纯化结核杆菌(终浓度为0.1μg/mL)；TuMP为承载PPD的凝聚沉淀微粒(承载的PPD的终浓度为0.1μg/mL)；CaP-PPD为承载BCG菌提取物的磷酸钙微粒(承载的PPD的终浓度为1.0μg/mL)；CaP-PPD-Bx为同时承载PPD和BCG菌提取物的磷酸钙微粒(制备方法和终浓度参照A1.1)；LPS为脂多糖(终浓度记载于括号内)。表3中，No.8确认了例1的结果的再现性，如果向CaP-PPD中添加PPD，TuMP，则比单纯将单独添加CaP-PPD，PPD，TuMP时产生的GM-CSF浓度相加时产生了更多的GM-CSF，由此判断再现性良好。即使在从该试样中除去PPD液的No.7中也发现了同样的协同效果。而且，向CaP-PPD-Bx中添加TuMP时也相同，发现了极强的协同效果。

[02][表3]

No.	免疫刺激物质
			1	未刺激	1.0
2	PPD	0.3
			3	TuMP	0.6
4	PPD+TuMP	1.2
			5	CaP-PPD	11.4
6	CaP-PPD+PPD	12.0

7	CaP-PPD+TuMP	20.6
			8	CaP-PPD+PPD+TuMP	19.1
9	CaP-PPD-Bx	187.5
			10	CaP-PPD-Bx+PPD	231.9
11	CaP-PPD-Bx+TuMP	263.0
			12	CaP-PPD-Bx+PPD+TuMP	268.3
13	LPS(10ng/mL)	12.4
			14	LPS(100ng/mL)	26.0
15	LPS(100ng/mL)	50.9

工业上应用的可能性

如果使用本发明的免疫佐剂，可以从抗原提呈细胞中释放出与用已知具有强免疫刺激作用的LPS刺激抗原提呈细胞时相同或超过其的大量的GM-CSF。因此，GM-CSF可以维持作为自分泌细胞生长因子作用的抗原提呈细胞的强力活化和其状态。因此，本发明的免疫佐剂，通过与抗原一起给药到包括人在内的哺乳类动物的活体内，可以诱导依赖于活化抗原提呈细胞的针对该抗原的液性免疫反应和/或细胞系免疫反应，可以有效进行针对传染病和肿瘤的疫苗疗法。

Claims (18)

1、一种免疫佐剂，其为含有在两种以上的不同的微粒状免疫刺激物载体上分别承载1种或2种以上的免疫刺激物质的免疫佐剂，其中作为该微粒状免疫刺激物质载体至少包括(a)无机物和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物的组合物。

2、根据权利要求1中记载的免疫佐剂，所述两种免疫刺激物质载体的组合物为(a)可以为被细胞吞噬的尺寸的微粒状磷酸钙和(b)由可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物。

3、根据权利要求2中记载的免疫佐剂，上述(a)微粒状磷酸钙为最大直径在1μm以下的磷酸钙。

4、根据权利要求2或3中记载的免疫佐剂，上述(a)的微粒状磷酸钙为下述：Ca/P摩尔比在1.3以上，且含有3-6重量％的碳酸根CO₃ ²-，其结晶性为在由CuKα射线产生的XRD光谱中，2θ值中出现以26°，32°和34°为中心的宽峰，33°中出现300的米勒指数的肩所规定的结晶性以上，且不仅以26°，28.1°，29°，32°33°和34°为中心出现峰或肩，而且以米勒指数为211和112的峰分离为规定的结晶性以下的结晶性的微粒状磷酸钙。

5、根据权利要求2-4任意一项中记载的免疫佐剂，上述(b)的可溶性蛋白为白蛋白。

6、根据权利要求2-5任意一项中记载的免疫佐剂，上述(b)的粘多糖为肝素。

7、根据权利要求2-6任意一项中记载的免疫佐剂，上述(b)的不溶性物质的通过可溶性蛋白和粘多糖的凝聚产生的沉淀物是通过蛋白分子间交联剂交联的沉淀物。

8、根据权利要求1-7任意一项中记载的免疫佐剂，上述免疫刺激物质为选自于细胞因子、趋化因子、细胞生长因子和激素中的1种或2种以上的诱导剂。

9、根据权利要求1-8任意一项中记载的免疫佐剂，免疫刺激物质为选自于结核菌素、纯化结核菌素(PPD)、源于微生物的可溶性成分、6，6-双分枝菌酸藻糖、LPS，脂质A、寡核苷酸、β-葡聚糖、钥孔嘁血蓝蛋白、胞壁酰基二肽、贝他定(bestatin)、左旋咪唑、细胞因子、趋化因子，细胞生长因子和激素中的1种或2种以上的物质。

10、根据权利要求9中记载的免疫佐剂，来源于微生物的可溶性成分为选自于微生物的醇提取物，丙酮提取物，吡啶提取物和热水提取物中的1种或2种以上的提取物。

11、根据权利要求9或10中记载的免疫佐剂，所述微生物是细菌。

12、根据权利要求1-11任意一项中记载的免疫佐剂，其用于通过在包括人在内的哺乳动物体内与抗原一起给药来诱导针对该抗原的全身性免疫反应。

13、根据权利要求12中记载的免疫佐剂，所述抗原为选自于真菌，放线菌、细菌、病毒、噬菌体、立克次氏体、原生动物、真菌成分、放线菌成分、细菌成分、病毒成分、噬菌体成分、立克次氏体成分、原生动物成分、肿瘤组织，肿瘤细胞，肿瘤细胞成分，肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽中的1种或2种以上的物质。

14、根据权利要求1-11任意一项中记载的免疫佐剂，其用物理方法使包括人在内的哺乳类动物的肿瘤组织变性后，通过在该肿瘤组织内给药来诱导抗肿瘤免疫反应。

15、根据权利要求14中记载的免疫佐剂，物理方法为选自于微波照射，射频凝固法，冷冻凝固法，电刀加热，热水注入，乙醇注入，栓塞法、放射线照射，激光照射和超声波破坏中的1种或2种以上的方法。

16、根据权利要求1-11任意一项中记载的免疫佐剂，其用于通过在体外与免疫载体细胞混合后，给药于包括人在内的哺乳动物，在该动物的生物体内诱导全身性免疫反应。

17、根据权利要求16中记载的免疫佐剂，所述免疫载体细胞为选自于树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、天然杀伤细胞、自然杀伤T细胞和造血干细胞中的1种或2种以上的细胞。

18、一种疫苗，含有权利要求1-11任意一项中记载的免疫佐剂和抗原。

Images