KR20080083199A - 면역 애쥬번트 - Google Patents

Abstract

강력한 면역 자극작용을 발휘할 수 있는 안전성이 높은 면역 애쥬번트로서, 2종 이상의 상이한 미립자상 면역 자극물질 담체에 각각 담지된 1종 또는 2종 이상의 면역 자극물질을 포함하고, 이 미립자상 면역 자극물질 담체로서 (a) 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘 등의 무기물 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션(coacervation)에 의한 침전물의 조합을 포함하는 면역 애쥬번트.

Description

면역 애쥬번트{Immune adjuvant}

본 발명은 면역 애쥬번트에 관한 것이다.

종래, 다용되고 있는 대부분의 면역 애쥬번트는 생체에 투여한 국소에 있어서, (1) 항원이 급속하게 확산되지 않도록 수성 또는 유성 에멀젼의 성상(性狀)으로 유지하면서, 항원을 서서히 방출하여 면역담당 세포에 효율적으로 공급하고, (2) 염증반응을 야기하여 염증 국소에 집합되는 면역담당 세포를 활성화한다고 하는 2개의 역할을 하고 있다. 최근, 항체생산을 유도하는 액성 면역반응 및 킬러 T 세포를 유도하는 세포성 면역반응 중 어느 것에 있어서도 항원 제시세포가 면역반응의 중심적 역할을 담당하는 것, 및 항원 제시세포로서 수상(樹狀)세포, 마크로파지, 및 B 세포가 있는 것이 명확해졌다. 이들 중에서 수상세포가 가장 강력한 항원 제시능을 가지고 있다(Dendritic Cells, second edition, ed. Lotze, M. T. and Thomson, A. W., Academic Press, San Diego, 2001). 항원 제시세포를 효과적으로 활성화할 수 있는 물질을 항원과 함께 생체에 투여하면, 이 물질은 면역 애쥬번트로서 작용하여, 액성 면역반응 및 세포성 면역반응 중 어느 것에 있어서도 효율적으로 항원에 대한 면역반응을 유도·증강할 수 있다.

종래부터 다양한 면역 애쥬번트가 알려져 있지만, 인간 종양의 치료나, 전이 및 재발의 예방 목적으로 종양 면역요법에 사용 가능한 안전하고 저가격의 면역 애쥬번트는 적다. 예를 들면, 배양 수상세포를 이용한 종양 면역요법에서는, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)이 면역 애쥬번트로서 사용되고 있지만(Geiger, J. D., et al., Cancer Res., 61, pp. 8513-8519, 2001), 이 물질은 고가이다. 수상세포를 직접 활성화하는 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor: 이하, 「GM-CSF」라고 약칭하는 경우가 있다) 등의 사이토카인류를 면역 애쥬번트로서 투여하는 방법도 제안되어 있지만, 사이토카인류는 더욱 고가이다.

감염증 대책을 위한 백신의 제조에 있어서, 안전하고 저가격의 면역 애쥬번트로서 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide), 프로인트의 불완전 애쥬번트(Freund's incomplete adjuvant, 이 애쥬번트는 유성이기 때문에 독성이 염려되고 있다), 또는 몬타나이드(Montanide) 등과 같이, 활성이 불충분한 면역 애쥬번트가 사용되고 있다. 이들은 동물실험에서 사용되고 있는 프로인트의 완전 애쥬번트(Freund's complete adjuvant: 이하, 「FCA」라고 약칭하는 경우가 있다)나 리비 애쥬번트 시스템(Ribi Adjuvant System)에 비하면, 독성이 낮지만 면역 애쥬번트 활성도 약하다.

결핵균 감염력 검출용 투베르쿨린(tuberculin), 특히 투베르쿨린 중의 단백성분을 황산암모늄 침전법에 의해 정제한 정제 투베르쿨린(이하, 「PPD」라고 약칭하는 경우가 있다)은 반복해서 인간에 투여해도 매우 안전하고, 또한 저렴하기 때문에 전세계에 보급되고 있다. 본 발명자 등은 PPD가 면역 애쥬번트로서 사용 가능 한 것을 발견하였다(PCT/JP00/00692). 또한, 본 발명자 등은 PPD를 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물로 하고, 물리적 수단으로 변성시킨 종양조직 내에 투여함으로써 항종양 면역반응을 유도하기 위한 유효한 면역 애쥬번트로 되는 것도 발견하였다(일본국 특허 제3492671호). 이 면역 애쥬번트는 용해상태의 PPD에 비해 높은 면역 애쥬번트 활성을 가지고 있고, 용해상태의 PPD와 동일하게 매우 높은 안전성을 가지고 있다. 다만, FCA나 엔도톡신의 주성분인 리포폴리사카라이드(이하, 「LPS」라고 약칭하는 경우가 있다)와 비교하면, 그 면역 애쥬번트 활성은 불충분하였다.

말초혈 중에는 미립자상의 항원을 탐식(貪食)할 수 있는 미성숙한 항원 제시세포가 흐르고 있다. 인 비트로(in vitro)에서 배양 중의 미숙한 항원 제시세포에 LPS를 첨가하면, 성숙이 진행되어, 강력한 항원 제시능을 나타내게 되는 것이 알려져 있다. 이 과정에서 활성화된 항원 제시세포는 GM-CSF, 인터류킨(이하, 「IL」이라고 약칭하는 경우가 있다)-12, 인터페론γ(이하, 「IFNg」라고 약칭하는 경우가 있다) 등의 각종 사이토카인을 방출한다. GM-CSF 자체는 수상세포의 생존에 필수인 세포 성장인자이기 때문에, 일단 활성화된 수상세포는 GM-CSF의 오토클라인(autocline) 메커니즘에 의해서 장기간 활성화 상태를 유지하여 생존을 계속해 가는 것이 가능해진다. 수상세포뿐 아니라 마크로파지도 동일한 조혈 간세포(幹細胞)로부터 분화되는 동일 계통의 항원 제시세포로서, 면역 자극을 받으면 수상세포와 마찬가지로 GM-CSF 등의 사이토카인을 생산한다.

실제로, 고체화되어 미립자화된 종양조직을 항원으로서 GM-CSF 등의 사이토 카인과 함께 체내에 투여함으로써 효율적으로 종양세포에 대한 항종양 면역반응을 유도할 수 있다(PCT/JP00/00692). 이 사실은 GM-CSF 자체가 면역 애쥬번트로 되어 있는 것을 나타내고 있는 동시에, 면역 애쥬번트의 자극을 받은 항원 제시세포로부터 생산된 GM-CSF의 양이 원래의 면역 애쥬번트의 활성을 나타내는 지표가 될 수 있는 것을 나타내고 있다. 즉, 인간 유래의 항원 제시세포가 생산하는 GM-CSF를 정량함으로써, 인간 개체를 사용하지 않고 인 비트로 실험계에서 인간에 있어서의 면역 애쥬번트 활성을 추정할 수 있게 된다.

본 발명자 등은 상기의 수단을 이용하여, 미생물에 유래하는 가용성 성분[Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin(이하, 「BCG균」이라고 약칭하는 경우가 있다) 등의 유기용매 추출 가용성 성분]을 면역 자극물질 담체인 고체화 조직에 고정함으로써 강한 면역 애쥬번트 작용이 얻어지는 것을 인간 말초혈 유래의 항원 제시세포를 포함하는 말초혈 부착성 세포를 사용하여 나타내었다(WO2003/074079).

이 면역 애쥬번트에 있어서 면역 자극물질 담체로서 사용되는 고체화 조직은 항원 제시세포를 포함하는 탐식세포 내에서 소화되어, 체내에 잔존하지 않고 소실되는 생분해성 재료이다. 다만, 인간 개체에 이 면역 애쥬번트를 적용하는 경우, 주요조직 적합성 항원이 완전히 일치하는 본인 또는 유전자적으로 일치하는 일란성 쌍둥이의 조직을 사용하지 않으면, 면역 자극물질 담체가 그 인간 개체에 대해 항원성을 갖게 되어, 면역 자극물질 담체 또는 그 소화 단백 단편에 대한 항원항체 반응을 야기하는 경우가 있다. 이 점은, 상기 면역 애쥬번트를 범용의 면역 애쥬번 트로서 사용하는 경우에(면역 애쥬번트에 목적의 항원을 첨가하여 이 항원에 대한 면역반응을 유도하는 경우에), 면역 자극물질 담체 자체에 대한 여분의 항원항체 반응이 일어나, 이 항원에 대한 면역반응이 전체의 면역반응 중에 매몰되어 버려 분명히 드러나기 어렵다는 문제를 일으킨다.

한편, 본 발명자 등은 1 또는 2 이상의 피담지 분자를 담지한 인산칼슘 미립자의 제조방법을 제안하고 있다(일본국 특허공개 제2005-126335호 공보). 이 인산칼슘 미립자는 Ca/P 몰비 1.3 이상의 히드록시 아파타이트이다. 또한, 비결정질 인산칼슘 미립자 및 저결정성 아파타이트는 친수성 단백 분자 뿐 아니라 소수성 저분자도 담지할 수 있기 때문에, 면역 자극물질 담체로 될 수 있는 것이 나타내어져 있다(일본국 특허공표 제2002-524491호 공보). 그러나, 물리화학적 성상이 전혀 상이한 2종 이상의 면역 자극물질 담체에 1종 또는 2종 이상의 면역 자극물질을 담지시켜, 그들을 혼합한 면역 애쥬번트는 종래 알려져 있지 않다.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 과제는, 안전성이 우수하고, 또한 강한 면역 애쥬번트 활성을 효율적으로 발휘할 수 있는 면역 애쥬번트를 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자 등은 투베르쿨린을 서방성(徐放性) 제제로 함으로써 높은 면역 애쥬번트 활성이 얻어지는 것, 알부민과 헤파린을 혼합하여 코아세르베이션에 의한 침전을 형성할 때 투베르쿨린 단백을 혼합해 두면 투베르쿨린 단백이 이 침전 중에 말려들어 불용성 미립자가 형성되어 서방성 제제로 되는 것, 및 이 불용성 미립자를 가용성의 정제 투베르쿨린과 함께 면역 애쥬번트로서 종양세포를 항원으로 하여 체내에 투여하면 강력한 종양 방어효과를 나타내고, 열변성된 체내 종양조직에 투여하면 강력한 항종양 면역반응을 유도할 수 있는 것을 발견하였다(일본국 특허 제3492671호).

한편, 인산칼슘 미립자는 면역 자극물질 담체로 될 수 있는 것이 나타내어져 있지만(일본국 특허공표 제2002-524491호 공보), 인산칼슘 미립자의 제조방법(일본국 특허공개 제2005-126335호 공보)에 의해 생성되는 인산칼슘 미립자는 Ca/P 몰비 1.3 이상의 히드록시 아파타이트로서, 최대 직경이 1 ㎛에 못미치는 나노미터 사이즈의 미립자를 대량으로 포함하고, 매우 생체 적합성이 높아 안전하다. 이와 같은 항원 제시세포가 탐식 가능한 사이즈의 인산칼슘 미립자에 PPD를 담지시킴으로써, 면역 애쥬번트를 제조할 수 있다.

본 발명자 등은 상기의 과제를 해결하기 위해 더욱 연구를 계속한 결과, 투베르쿨린에 포함되는 가용성 단백이나 미생물에 유래하는 가용성 성분 등을 면역 자극물질로서 사용하고, 이 면역 자극물질을 미립자상의 면역 자극물질 담체인 (a) 무기물, 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물에 각각 담지시켜, 그들 담체의 혼합물을 면역 애쥬번트로서 사용하면, 1종류의 면역 자극물질 담체를 단독으로 사용한 경우에 비해 상승적(相乘的)인 매우 강한 면역 애쥬번트 작용이 얻어지는 것을 발견하였다. 예를 들면, 알부민과 헤파린을 혼합하여 코아세르베이션에 의한 침전을 형성할 때 투베르쿨린 단백을 혼합하여 얻어지는 불용성 미립자와, 일본국 특허공개 제2005-126335호 공보에 기재된 방법으로 얻어지는 Ca/P 몰비 1.3 이상의 히드록시 아파타이트인 인산칼슘 미립자에 PPD를 담지시킨 미립자를 포함하는 혼합물을 면역 애쥬번트로서 사용하면, 각각의 성분을 단독으로 사용한 경우에 얻어지는 면역 애쥬번트 활성을 훨씬 능가하는 상승적으로 높은 면역 애쥬번트 작용이 얻어지는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들의 지견(知見)을 토대로 하여 완성되었다.

즉, 본 발명에 의해 2종 이상의 상이한 미립자상 면역 자극물질 담체에 각각 담지된 1종 또는 2종 이상의 면역 자극물질을 포함하는 면역 애쥬번트로서, 이 미립자상 면역 자극물질 담체로서 적어도 (a) 무기물 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물의 조합을 포함하는 면역 애쥬번트가 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 2종류의 면역 자극물질 담체의 조합이 (a) 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물인 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

더욱 바람직한 태양에 의하면, 상기 (a)의 미립자상 인산칼슘이 최대 직경 1 ㎛ 이하의 인산칼슘인 상기의 면역 애쥬번트; 상기 (a)의 미립자상 인산칼슘이 하기: Ca/P 몰비가 1.3 이상으로서 탄산기 CO₃ ^{2 -}를 3~6 중량% 함유하고, 그 결정성이 CuKα선에 의한 XRD 스펙트럼에 있어서 2θ값으로 26°, 32°, 및 34°에 중심이 있는 넓은 피크가 출현하고, 33°에 300의 밀러지수(Miller index)의 숄더(shoulder)가 출현함으로써 규정되는 결정성 이상이며, 또한 26°, 28.1°, 29°, 32°, 33°, 및 34°에 중심이 있는 피크 또는 숄더가 출현하는 것에 추가로 211 밀러지수와 112 밀러지수의 피크가 분리됨으로써 규정되는 결정성 이하의 결정성인 미립자상 인산칼슘인 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

다른 더욱 바람직한 태양에 의하면, 상기 (b)의 가용성 단백이 알부민인 상기의 면역 애쥬번트; 상기 (b)의 뮤코다당이 헤파린인 상기의 면역 애쥬번트; 상기 (b)의 불용성 물질의 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물이 단백 분자간 가교제에 의해 가교된 침전물인 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

또한, 면역 자극물질이 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 및 호르몬의 유도제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 면역 자극물질인 상기의 면역 애쥬번트; 투베르쿨린, 정제 투베르쿨린(PPD), 미생물에 유래하는 가용성 성분, 트레할로스 6,6'-디미콜레이트, LPS, 리피드 A(lipid A), 올리고뉴클레오티드, β-글루칸, 키홀 림펫 헤모시아닌, 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 베스타틴(bestatin), 레바미솔(levamisole), 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 면역 자극물질인 상기의 면역 애쥬번트; 미생물에 유래하는 가용성 성분이 미생물의 알코올 추출물, 아세톤 추출물, 피리딘 추출물, 및 열수 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 추출물인 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

다른 관점에서는, 항원과 함께 인간을 포함하는 포유류 동물의 체내에 투여하여 이 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도하기 위한 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 항원이 진균, 방선균, 세균, 바이러스, 파지, 리케차(rickettsia), 원충, 이들 미생물의 성분, 종양조직, 종양세포, 종양세포성분, 종양항원 단백, 및 종양항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 항원인 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

또한, 다른 관점에서는, 인간을 포함하는 포유류 동물의 종양조직을 물리적 수단으로 변성시킨 후 이 종양조직 내에 투여함으로써 항종양 면역반응을 유도하기 위한 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 물리적 수단이 마이크로파 조사, 고주파 응고법(radiofrequency ablation), 동결 응고법, 전기메스 가열, 열수 주입, 알코올 주입, 색전법, 방사선 조사, 레이저광 조사, 및 초음파 파괴로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 수단인 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

또 다른 관점에서는, 체외에서 면역 담당세포와 혼합한 후에 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여함으로써 이 동물의 생체내에 있어서 전신성 면역반응을 유도하기 위한 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 면역 담당세포가 수상세포, 마크로파지, B 림프구, T 림프구, 내츄럴 킬러 세포, 내츄럴 킬러 T 세포, 및 조혈 간세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 세포인 상기의 면역 애쥬번트가 제공된다.

또한, 상기의 면역 애쥬번트와 항원을 포함하는 백신이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 항원이 진균, 방선균, 세균, 바이러스, 파지, 리케차, 원충, 또는 이들 미생물의 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 항원으로, 감염증의 예방 및/또는 치료에 사용하는 상기 백신; 및 항원이 종양조직, 종양세포, 종양세포성분, 종양항원 단백, 또는 종양항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 항원으로서, 종양의 치료 및/또는 예방에 사용하는 상기의 백신이 제공된다.

또한, 항원으로서 예를 들면 이종동물 단백을 사용함으로써, 상기의 면역 애쥬번트에 의해 인간 이외의 포유류 동물에 있어서 효율적으로 이 항원에 대한 항체를 생산시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 항체 생산동물, 및 이 항체 생산동물에 유래하는 항체 생산세포 또는 항체 유전자가 제공된다.

또한, 인간을 포함하는 포유류 동물의 종양을 물리적 수단으로 변성시킨 후 이 종양조직 내에 투여함으로써 항종양 면역반응을 유도하기 위한 상기의 면역 애쥬번트를 포함하는 종양 백신; 체외에서 면역 담당세포와 혼합한 후에 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여함으로써 이 동물의 생체내에 있어서 항종양 면역반응을 유도하기 위한 상기의 면역 애쥬번트를 포함하는 종양 백신; 체외에서 면역 담당세포 및 항원과 혼합한 후에 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여함으로써 이 동물에 생체내에 있어서 항종양 면역반응을 유도하기 위한 상기 면역 애쥬번트를 포함하는 종양 백신이 본 발명에 의해 제공된다.

또 다른 관점에서는, 전신성 면역반응의 유도방법으로서, 인간을 포함하는 포유류 동물에 상기의 면역 애쥬번트를 투여하는 공정을 포함하는 방법; 항종양 면역반응을 유도하는 방법으로서, 인간을 포함하는 포유류 동물의 종양조직을 물리적 수단으로 변성시킨 후, 이 종양조직 내에 상기의 면역 애쥬번트를 투여하는 공정을 포함하는 방법; 및 전신성 면역반응의 유도방법으로서, 미리 상기의 면역 애쥬번트와 면역 담당세포를 체외에서 혼합하여 인간을 포함하는 포유류 동물의 생체내에 투여하는 공정을 포함하는 방법이 본 발명에 의해 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 2종류의 면역 자극물질을 각각 상이한 2종류의 면역 자극물질 담체에 담지시킨 본 발명의 면역 애쥬번트의 항원 제시세포 자극효과를 나타낸 도면이다. 인산칼슘(이하, 「CaP」라고 약칭하는 경우가 있다)을 담체로 하여 BCG균 추출물을 면역 자극물질로서 담지시켰다. 또한, 코아세르베이션 침전 미립자를 담체로 하여 PPD를 담지시킨 TuMP를 사용하였다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 명세서에 있어서 사용되는 용어의 의미는 이하와 같다.

「면역 자극물질」은 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여한 경우에 체내에서 어떠한 면역반응을 야기 및/또는 증강하는 물질로서, 인간을 포함하는 포유류 동물의 항원 제시세포에 체외에서 첨가한 경우에는 이 세포의 어떠한 활성화를 야기 및/또는 증강하는 물질이다. 따라서, 항원 자체도 어떠한 면역 자극작용이 있는 한 면역 자극물질에 포함된다.

「면역 자극물질 담체」란, 상기의 면역 자극물질을 담지하기 위한 물질이다. 면역 자극물질 담체 그 자체는 면역 자극작용을 전혀 갖지 않거나, 또는 매우 낮은 면역 자극작용을 갖는 경우가 많지만, 담체 자체가 면역 자극작용을 갖는 경우도 있다.

「2종 이상의 상이한 면역 자극물질 담체」 또는 그의 유의어에는, 상이한 화학물질 또는 상이한 조성물로 되는 2종 이상의 면역 자극물질 담체 외에, 동일한 화학물질 또는 조성물로 되며, 상이한 물리화학적 성상을 갖는 면역 자극물질 담체도 포함된다. 예를 들면, 동일 성분을 포함하고, 또한 이 성분의 비율이 상이한 2종류의 조성물을 2종류의 면역 자극물질 담체로서 사용할 수 있다. 또는, 동일한 화학물질 또는 조성물로 되는 미립자로서, 입자 표면의 물리화학적 성상이 상이한 경우 등도 이 용어에 포함된다. 본 명세서에 있어서 이 용어를 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안되고, 가장 넓은 정의로 해석할 필요가 있다.

「면역 애쥬번트」란, 항원에 대한 면역반응을 야기 및/또는 증강할 수 있는 물질 또는 조성물이다. 면역 자극작용의 거의 없는 면역 자극물질 담체만을 면역 애쥬번트라고 부르는 경우도 있지만, 통상은 이 담체와 어떠한 면역 자극물질의 조합을 의미하는 경우가 많다. 또한, 면역 자극물질만으로도 면역 애쥬번트라고 불리는 경우도 있다. 본 발명의 면역 애쥬번트는 2종류 이상의 면역 자극물질 담체에 각각 담지된 1종 또는 2종 이상의 면역 자극물질을 의미하고 있어, 면역 자극물질 담체와 면역 자극물질의 조합을 반드시 포함하는 것이다.

본 발명의 면역 애쥬번트는, 2종 이상의 상이한 미립자상의 면역 자극물질 담체에 각각 담지된 1종 또는 2종 이상의 면역 자극물질을 포함하고, 이 미립자상 면역 자극물질 담체 중 1종 이상이 무기물, 다른 1종이 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물인 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 면역 애쥬번트는 미립자상 면역 자극물질 담체로서 (a) 무기물 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물의 조합을 포함하고, 상기 (a) 및 (b)의 각각의 미립자상 면역 자극물질 담체에는 동일 또는 상이한 면역 자극물질이 담지된다. 면역 자극물질은 1종류여도 되지만, 2종류 이상을 사용해도 된다. 예를 들면, 전형적으로는 상기 (a) 및 (b)의 미립자상 면역 자극물질 담체의 각각에 1종류씩의 상이한 면역 자극물질을 담지시켜도 되고, 또는 상기 (a) 및 (b)의 미립자상 면역 자극물질 담체의 각각에 동일한 면역 자극물질을 담지시켜도 된다. 또는, 상기 (a) 및 (b)의 미립자상 면역 자극물질 담체 중 하나에 2종류의 상이한 면역 자극물질을 담지시키고, 또 하나의 면역 자극물질 담체에는 그들의 면역 자극물질 중 1종류 또는 양쪽의 면역 자극물질을 담지시켜도 된다.

상기 (a) 및 (b)의 미립자상 면역 자극물질 담체는, 각각 상이한 화학물질 또는 상이한 조성물로 되는 2종 이상의 미립자상 면역 자극물질 담체를 포함하고 있어도 되고, 또는 각각 동일한 화학물질 또는 조성물로 되며, 상이한 물리화학적 성상을 갖는 면역 자극물질 담체의 혼합물이어도 된다. 예를 들면, 상기 (b)의 침전물인 미립자상 면역 자극물질 담체로서는 동일 성분의 조합으로 되고, 또한 이 성분의 비율이 상이한 2종류의 조성물의 혼합물을 사용해도 된다. 또는, 상기 (a)의 무기물인 미립자상 면역 자극물질 담체로서, 동일한 무기물로 되는 미립자이고, 입자 표면의 물리화학적 성상이 상이한 미립자의 혼합물을 사용해도 된다.

본 발명의 면역 애쥬번트는, 각각 면역 자극물질이 담지된 상기 (a) 및 (b)의 미립자상 면역 자극물질 담체의 조합을 포함하지만, 면역 자극물질을 담지하고 있지 않은 면역 자극물질 담체를 추가로 포함하는 것도 가능하다. 이와 같은 경우, 면역 자극물질 담체로서, 그 자체가 면역 자극작용을 갖는 면역 자극물질 담체를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 면역 애쥬번트는 면역 자극물질 담체에 담지시키지 않은 면역 자극물질을 추가로 포함하는 것도 가능하다.

바람직한 태양으로는, 2종류의 미립자상 면역 자극물질 담체의 조합으로서, (a) 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘, 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물을 포함한다. 이하, 이 특정의 태양에 대해서 상세하게 설명하지만, 본 발명의 면역 애쥬번트는 이 특정의 태양에 한정되는 것은 아니다. 상기의 (a) 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘과 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물의 조합은 특별히 한정되지 않고, 그들 성분의 종류, 비율, 및 조제방법 등도 포함하여 임의로 선택할 수 있다. 또한, 상기 태양의 면역 애쥬번트에는 제3 성분이 추가로 혼합되어 있어도 된다. 이 제3 성분으로서는 항원 외에, 담지되어 있는 면역 자극물질과는 상이한 면역 자극물질 등을 사용해도 된다. 항원은 고체의 담체에 담지되어 있어도 되고, 담체로서는 상기 (a) 또는 (b)의 미립자상 면역 자극물질 담체를 이용할 수 있다. 본 발명의 면역 애쥬번트는 성분 (a) 또는 성분 (b)에 담지되어 있는 면역 자극물질과 동일한 면역 자극물질을 담체에 담지되어 있지 않은 상태로 포함하고 있어도 된다.

세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘은, 예를 들면 일본국 특허공개 제2005-126335호 공보에 기재되어 있는 방법을 사용하여 조제할 수 있다. 미립자상 인산칼슘으로서는 임의의 미립자상 인산칼슘을 사용할 수 있다. 예를 들면, 당업자에게 주지의 방법으로 시판의 인산칼슘 분말을 잘게 분쇄하여, 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘을 선별한 것을 사용해도 되며, 인산 용액 및 칼슘 용액으로 제조한 것을 사용해도 된다.

또한, 인산칼슘을 미립자상의 기재 상에 침전 또는 석출시켜서 이 기재 표면에 인산칼슘 미립자의 피막을 형성한 것을 사용해도 된다. 이와 같은 태양도 미립자상 인산칼슘에 포함된다. 기재로서는 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 중성 영역에서 불용성 단백인 섬유상 단백의 콜라겐이나 수용성 당사슬 고분자인 콘드로이틴 황산을 수산화칼슘 현탁액과 인산 용액을 혼합하는 과정에서 저결정성 아파타이트와 공침(共沈)시켜, 나노미터 사이즈의 미소(微小) 결정을 포함하는 콜라겐/콘드로이틴 황산-아파타이트 콤퍼짓을 제작할 수 있으며(Rhee, S. H., et al., Biomaterials., 22(21), pp. 2843-2847, 2001), 이 미립자를 기재로서 사용하는 것도 가능하다. 다만, 미립자상 인산칼슘을 조제하기 위한 기재는 이들에 한정되는 것은 아니다.

인산칼슘의 종류는 특별히 한정되지 않고, 무수물, 무수염, 또는 함수염 중 어느 것이어도 되며, 결정질 또는 비결정질 중 어느 것이어도 된다. 또한, 칼슘의 일부 또는 인산의 일부가 다른 원자나 원자단으로 치환되어 있어도 된다. 이와 같은 인산칼슘으로서는, 구체적으로는, 예를 들면 아파타이트(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), 칼슘 결손 아파타이트, 금속이온이 일부 Ca를 치환한 아파타이트, 황산이온이 인산이온의 일부를 치환한 아파타이트, 비결정질 인산칼슘, 금속이온이 일부 Ca를 치환한 비결정질 인산칼슘, 인산팔칼슘(Ca₈H₂(PO₄)₆·5H₂O), 및 인산삼칼슘(Ca₃(PO₄)₂), 금속이온이 일부 Ca를 치환한 인산삼칼슘 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 바람직하게는 탄산기 CO₃ ^{2 -}를 1 중량%~15 중량% 함유하는 탄산 함유 인산칼슘이어도 된다. 탄산 함유 인산칼슘의 종류는 특별히 한정되지 않고, 무수물, 무수염, 또는 함수염 중 어느 것이어도 되며, 결정질 또는 비결정질 중 어느 것이어도 된다. 탄산 함유 인산칼슘의 예로서는, 탄산 함유 아파타이트나 탄산 함유 비결정질 인산칼슘 등을 들 수 있다. 탄산기가 점유하는 자리는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인산 사이트, 수산기 사이트, 그 밖에 이른바 비(非)아파타이트 사이트나 표면 흡착 사이트여도 된다. 특히 바람직하게는 Ca/P 몰비가 1.3 이상으로서 탄산기 CO₃ ^{2 -}를 3~6 중량% 함유하고, 그 결정성이 CuKα선에 의한 XRD 스펙트럼에 있어서 2θ값으로 26°, 32°, 및 34°에 중심이 있는 넓은 피크가 출현하고, 33°에 300의 밀러지수의 숄더가 출현함으로써 규정되는 결정성 이상이며, 또한 26°, 28.1°, 29°, 32°, 33°, 및 34°에 중심이 있는 피크나 숄더가 출현하는 것에 더하여 211 밀러지수와 112 밀러지수의 피크가 분리됨으로써 규정되는 결정성 이하의 결정성인 미립자상 인산칼슘을 들 수 있다.

세포에 의한 탐식 가능한 미립자의 사이즈는 일반적으로 최대 직경 10 ㎛ 이하인 것이 바람직하고, 최대 직경 1 ㎛ 이하인 것이 특히 바람직하다. 인간의 세포 자체의 사이즈는 일반적으로는 구형인 경우 직경 20 ㎛ 정도이지만, 부착된 세포나 장기간 분열되지 않아 거대화된 세포에서는 긴 직경이 100 ㎛를 초과하는 경우도 있다. 탐식 능력이 높은 마크로파지는 직경 20 ㎛ 이상의 미립자를 탐식하는 경우도 있다. 따라서, 세포에 의한 탐식 가능한 미립자의 사이즈는 특별히 한정되는 것은 아니다.

세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘을 면역 자극물질 담체로서 사용하고, 여기에 면역 자극물질을 담지시키는 방법으로서는, 예를 들면 일본국 특허공개 제2005-126335호 공보에 기재되어 있는 방법을 사용할 수 있지만, 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 인산칼슘 중에서도 히드록시 아파타이트 미분말의 비표면적은 100 ㎡/g으로 크고, 흡착능이 우수하기 때문에, 히드록시 아파타이트 미분말은 각종 물질의 흡착제로서 사용되고 있다. 히드록시 아파타이트 미분말은 다양한 화합물을 사용하여 흡착형 서방성 의약을 조제하기 위한 기재로 될 수 있는 것으로 생각되어 있어, 흡탈착에 의한 확산 모델에 따른 서방성을 나타낸다고 여기어진다(Burgos, A.E., et al., Biomaterials., 23, pp. 2519-2526, 2002). 이 밖에, 저결정성 아파타이트나 비결정질 인산칼슘 등의 인산칼슘은 본래 생체내 물질이기 때문에 단백 등의 체내 생리활성 물질의 안전한 서방성 의약의 기재로 될 수 있는 것이 알려져 있다. 이들의 아파타이트류로 되는 미립자를 면역 자극물질 담체로서 사용하는 것도 가능하다.

세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘에 담지시키는 면역 자극물질의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기와 같이, 히드록시 아파타이트 미분말은 흡착능이 우수하기 때문에, 담지시키는 면역 자극물질로서 다양한 물질을 사용할 수 있다. 면역 자극물질로서는, 예를 들면 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 및 호르몬의 유도제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 사용하는 것도 가능하지만, 예를 들면 투베르쿨린, PPD, 미생물에 유래하는 가용성 성분, 트레할로스 6,6'-디미콜레이트, LPS, 리피드 A, 올리고뉴클레오티드, β-글루칸, 키홀 림펫 헤모시아닌, 무라밀 디펩티드, 베스타틴, 레바미솔, 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 미생물에 유래하는 가용성 성분으로서는, 예를 들면 미생물의 알코올 추출물, 아세톤 추출물, 피리딘 추출물, 및 열수 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 추출물을 사용할 수 있다. 또한, 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 및 호르몬의 유도제에는 세균의 균체 또는 세균의 균체 성분이 포함된다. 다만, 인산칼슘 미립자에 담지되는 면역 자극물질은 이들에 한정되는 것은 아니다.

사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 또는 호르몬으로서는, 항원 제시세포를 자극하여 그 사이토카인 생산을 유도할 수 있는 물질이면 어떠한 것을 사용해도 된다. 예를 들면, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨(IL)류(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-11, IL-12, IL-18, IL-27 등), 콜로니 자극인자(CSF)(예를 들면 G-CSF, GM-CSF, M-CSF 등), 상피세포 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF)(예를 들면 FGF-1, FGF-2, FGF-7 등), 인슐린, 또는 인간 성장 호르몬 등이 포함된다.

미생물에 유래하는 가용성 성분을 조제하는 공정에 있어서, 유기용매 및/또는 열수로 가용성 성분을 추출하는 방법도 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 주지의 방법을 사용하면 된다. 예를 들면 에탄올을 사용하여 추출물을 조제하는 것이 바람직하다. 미생물에 유래하는 가용성 성분을 조제하는 공정에 있어서 사용하는 미생물로서는, 예를 들면 세균, 진균, 또는 방선균 등을 예시할 수 있지만, 바람직하게는 세균을 사용할 수 있다. 보다 바람직한 세균의 예를 이하에 나타낸다. 이들의 세균군 중, 어느 1종류, 또는 복수 종류를 조합하여 사용해도 된다.

코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diphtheriae); 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis); 코리네박테리움 제로시스(Corynebacterium xerosis); 코리네박테리움 레날레(Corynebacterium renale); 코리네박테리움 쿠췌리(Corynebacterium kutscheri); 코리네박테리움 슈도디프테리티컴(Corynebacterium pseudodiphtheriticum); 코리네박테리움 에쿠이(Corynebacterium equi); 코리네박테리움 보비스(Corynebacterium bovis); 코리네박테리움 파르범(Corynebacterium parvum); 코리네박테리움 파우로메타볼럼(Corynebacterium paurometabolum); 코리네박테리움 피오게네스(Corynebacterium pyogenes); 코리네박테리움 엔지미컴(Corynebacterium enzymicum); 코리네박테리움 호아기이(Corynebacterium hoagii); 코리네박테리움 스트리아텀(Corynebacterium striatum); 코리네박테리움 무리셉티컴(Corynebacterium murisepticum); 코리네박테리움 네프리디이(Corynebacterium nephridii); 코리네박테리움 포케(Corynebacterium phocae); 코리네박테리움 바기날리스(Corynebacterium vaginalis); 미크로박테리움 플라범(Microbacterium flavum); 코리네박테리움 파시안스(Corynebacterium fascians); 코리네박테리움 라타이(Corynebacterium rathayi); 코리네박테리움 아그로피리(Corynebacterium agropyri); 코리네박테리움 트리티시(Corynebacterium tritici); 코리네박테리움 이라니컴(Corynebacterium iranicum); 코리네박테리움 세페도니컴(Corynebacterium sepedonicum); 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미크로모노스포라 칼세아(Micromonospora chalcea); 미크로모노스포라 할로피티카(Micromonospora halophytica); 미크로모노스포라 카르보나세아(Micromonospora carbonacea); 미크로모노스포라 나라시노엔시스(Micromonospora narashinoensis); 미크로모노스포라 멜라노스포레아(Micromonospora melanosporea); 미크로모노스포라 에키노스포라(Micromonospora echinospora); 미크로모노스포라 푸르푸레아(Micromonospora purpurea); 미크로모노스포라 푸르푸레오크로모게네스(Micromonospora purpureochromogenes); 미크로모노스포라 비칼라(Micromonospora bicolor); 미크로모노스포라 케룰레아(Micromonospora coerulea); 미크로모노스포라 글로보사(Micromonospora globosa); 미크로모노스포라 엘롱가타(Micromonospora elongata); 미크로모노스포라 파르바(Micromonospora parva); 미크로모노스포라 갈리카(Micromonospora gallica); 미크로모노스포라 아세토포르미시(Micromonospora acetoformici); 미크로모노스포라 프로피오니시(Micromonospora propionici); 서모액티노마이세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris); 서모액티노마이세스 사카리(Thermoactinomyces sacchari); 액티노비피다 디코토미카(Actinobifida dichotomica); 액티노비피다 알바(Actinobifida alba); 액티노비피다 크로모게나(Actinobifida chromogena); 서모모노스포라 커바타(Thermomonospora curvata); 서모모노스포라 비리디스(Thermomonospora viridis); 미크로비스포라 로세아(Microbispora rosea); 미크로비스포라 에라타(Microbispora aerata); 미크로비스포라 아메시스토게네스(Microbispora amethystogenes); 미크로비스포라 비스포라(Microbispora bispora); 미크로비스포라 크로모게네스(Microbispora chromogenes); 미크로비스포라 디아스타티카(Microbispora diastatica); 미크로비스포라 파르바(Microbispora parva); 미크로비스포라 서모디아스타티카(Microbispora thermodiastatica); 미크로비스포라 서모로세아(Microbispora thermorosea); 미크로폴리스포라 브레비카테나(Micropolyspora brevicatena); 미크로폴리스포라 안기오스포라(Micropolyspora angiospora); 미크로폴리스포라 케시아(Micropolyspora caesia); 미크로폴리스포라 페니(Micropolyspora faeni); 미크로폴리스포라 렉티비르굴라(Micropolyspora rectivirgula); 미크로폴리스포라 루브로브루네아(Micropolyspora rubrobrunea); 미크로폴리스포라 서모비리다(Micropolyspora thermovirida); 및 미크로폴리스포라 비리디니그라(Micropolyspora viridinigra).

또한, 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘에는 면역 자극물질과 함께, 또는 그것과는 별도로, 항원을 담지시켜도 된다. 이와 같은 목적으로 사용되는 항원은 미립자상 인산칼슘에 담지 가능한 것이면 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 수용성으로 용해도가 매우 높은 소 혈청 알부민을 항원으로서 담지시킬 수 있다(일본국 특허공개 제2005-126335호 공보). 또한, 상기의 미생물에 유래하는 가용성 성분과 동일하게 하여, 소수성 물질을 항원으로서 담지시키는 것도 가능하다. 항원은 진균, 방선균, 세균, 바이러스, 파지, 리케차, 원충, 이들 미생물의 성분, 원충성분, 종양조직, 종양세포, 종양세포성분, 종양항원 단백, 및 종양항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질인 것이 바람직하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 미립자상의 침전물의 조제방법은, 예를 들면 미국특허 제5,759,582호 명세서에 상세하게 기재되어 있어, 당업자는 용이하게 상기 침전물을 조제하는 것이 가능하다. 예를 들면 (i) 가용성 단백으로서 알부민, (ii) 뮤코다당으로서 헤파린, 및 (iii) 면역 자극물질로서 PPD를 사용하는 방법에 대해서는 일본국 특허 제3492671호 명세서에 상세하게 기술되어 있고, 이 방법을 사용하는 것이 가장 바람직하지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 가용성 단백 및 뮤코다당의 조합은 상기의 조합에 한정되는 것은 아니다. 면역 자극물질로서, 예를 들면 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백을 사용하는 것도 가능하고, 또는 당업자에게 주지의 방법으로 투베르쿨린으로 조제한 가용성 단백의 전부 또는 그의 일부를 사용하는 것도 가능하다. 상기의 (i), (ii), 및 (iii)의 3성분을 교반함으로써 성분 (i) 및 성분 (ii)의 코아세르베이션에 의한 침전이 생성되고, 이 때 성분 (iii)가 그 침전에 흡수되어 공침전하여 침전물을 부여한다. 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물은, 투여의 간편함에서 주사바늘을 통과할 수 있는 크기의 미립자상으로 조제되는 것이 바람직하다. 이 미립자의 입경은 통상 1 ㎛ 이하가 바람직하다. 침전물을 미립자상으로 조제하는 방법은 당업자에게 주지의 방법을 사용하면 되고, 특정 방법에 한정되는 것은 아니다.

면역 자극물질에 함유되는 가용성 단백과 (i)의 가용성 단백의 비율은 특별히 한정되지 않고, (i)의 가용성 단백 및 (ii)의 뮤코다당이 코아세르베이션을 일으키는 범위 내이면 어떠한 비율이어도 된다. 일례를 들면, pH 2.5의 2.5% 인간 혈청 알부민 용액을 가용성 단백으로서 사용하는 경우, 뮤코다당으로서 약 5 ㎎/㎖의 시판 헤파린 용액을 사용하여, 600 ㎕의 뮤코다당에 대해 PPD를 2.5 ㎍ 용해한 후, 이 혼합물을 교반하면서 상기 인간 혈청 알부민 용액을 적하하여, 코아세르베이션에 의한 미립자를 형성한다. 이 현탁액을 원심하고, 그 상청의 단백질 함량을 정량하여, 혼합한 단백질의 대부분이 미립자에 흡수되는 용량비를 선택하는 것이 바람직하다. 다만, 성분 (i) 내지 (iii)의 비율이나 코아세르베이션의 조건 등은 당업자가 적절히 선택할 수 있는 것을 물론이다. 얻어지는 침전에 포함되는 미립자의 입경은 통상 1 ㎛ 정도이지만, 특정 사이즈에 한정되는 것은 아니다.

얻어진 미립자상 침전은 면역 자극물질을 담지한 담체로서 그대로 본 발명의 애쥬번트의 1 성분으로서 사용할 수 있지만, 필요에 따라서 침전을 증류수로 세정해도 된다. 또한, 침전을 안정화하기 위해, 단백 분자간 가교제를 작용시킴으로써 가교를 형성하여 불용성 미립자를 형성해도 된다. 단백 분자간 가교제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 주지의 가교제를 주지의 방법으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 20 ㎎/㎖의 수용액으로 하고, 종농도 0.8~1.5 ㎎/㎖가 되도록 보텍스 믹서(vortex mixer)로 혼합하면서 첨가한 후, 실온에서 15분간 정치하면, 침전 중의 단백 분자간에 충분히 안정한 가교가 형성된다. 다만, 가교형성은 상기의 특정 조건 또는 특정 단백 분자간 가교제에 한정되는 것은 아니다. 상기와 같이 하여 얻어지는 미립자상 침전, 바람직하게는 가교처리된 미립자상 침전은 물로 세정해도 용해되지 않아, 본 발명의 애쥬번트의 성분으로서 적합하게 사용할 수 있다.

바람직한 태양에 의하면, 항원성이 있는 가용성 단백과 면역 애쥬번트 활성이 있는 투베르쿨린 가용성 단백을 혼합해 두고, 상기 (iii)로 바꾸어 이 혼합물을 사용하여 상기와 동일하게 하여 침전물을 얻을 수 있다. 이 침전물은 면역 자극물질과 항원을 담지한 담체로서, 본 발명의 애쥬번트의 1 성분으로서 사용하는 것도 가능하다.

가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물에는 면역 자극물질과 함께, 또는 그것과는 별도로 항원을 담지시켜도 된다. 항원으로서는, 예를 들면 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 또는 호르몬의 유도제를 사용하는 것도 가능하다. 또한, 항원으로서 투베르쿨린, PPD, 미생물에 유래하는 가용성 성분, 트레할로스 6,6'-디미콜레이트, LPS, 리피드 A, 올리고뉴클레오티드, β-글루칸, 키홀 림펫 헤모시아닌, 무라밀 디펩티드, 베스타틴, 레바미솔, 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 또는 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 항원으로서 미생물의 알코올 추출물, 아세톤 추출물, 피리딘 추출물, 및 열수 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 추출물을 사용하는 것도 가능하다. 미생물로서는 세균이 바람직하고, 이 추출물이 가용성 단백에 결합되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 미생물로서는 상기에 예시한 것이 바람직하게 사용된다. 다만, 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물에 담지되는 항원은 상기의 특정 예에 한정되는 것은 아니다.

가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물과 다른 불용성 단백 분자나 항원을 단백 분자간 가교제에 의해 가교하고, 면역 자극물질을 담지한 담체를 불용성 미립자 형태로 조제하는 것도 가능하다. 단백 분자간 가교제의 종류는 특별히 한정되지 안고, 당업자에게 주지의 가교제를 주지의 방법으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 면역 애쥬번트의 면역 애쥬번트 활성은, 본 발명의 명세서에 구체적으로 설명한 방법 및 이하에 설명하는 방법으로 당업자가 용이하게 측정 가능하다. THP-1 세포주는 인간 유래의 마크로파지 계통의 수립 세포주로, 배양 중에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)(이하, 「PMA」라고 약칭하는 경우가 있다)를 작용시켜서 분화 유도하면 탐식능을 나타내고(Kurosaka, K., et al., J. Immunol., 161, pp. 6245-6249, 1998), 항원 제시세포로 되는 것이 알려져 있다(Hu, P. Q., et al., J. Immunol., 172, pp. 1595-1601, 2004). 또한, 이 세포를 IFNg로 전처리하면 T 세포로의 항원 제시능이 증강된다(Brett, S. J., et al., J. Immunol. 150, pp. 2869-84, 1993). 따라서, THP-1 세포주를 분화시키고, 생산하는 GM-CSF를 정량함으로써, 인간 항원 제시세포를 포함하는 말초혈 유래 부착성 세포를 사용하지 않고 인간 항원 제시세포의 활성화 정도를 측정하는 것이 가능해진다. THP-1 세포는 수립 세포주이기 때문에, 인간 개체차와는 관계없이 질적으로 안정한 시험재료를 확보할 수 있다.

본 발명의 면역 애쥬번트는 항원과 혼합한 후, 인간을 포함하는 포유류 동물의 체내에 투여함으로써 이 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도할 수 있어, 통상 사용되는 일반적인 면역 애쥬번트와 동일하게 사용할 수 있다. 항원으로서는 피투여 개체 내에 본래 존재하지 않는 생물 또는 물질을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로는, 예를 들면 진균, 방선균, 세균, 바이러스, 파지, 리케차, 원충, 이들 미생물의 성분, 종양조직, 종양세포, 종양세포성분, 종양항원 단백, 및 종양항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 항원으로서 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 항원으로서 작용 가능한 물질이면 어떠한 물질을 사용해도 된다. 또한, 항원을 독립의 제제로서 인간을 포함하는 포유류 동물의 체내에 투여하고, 본 발명의 면역 애쥬번트를 별개로 이 동물의 체내에 투여하여, 이 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도하는 것도 가능하다. 또는, 앞서 설명한 바와 같이 본 발명의 면역 애쥬번트의 성분인 2종 이상의 면역 자극물질 담체 중 어느 하나 또는 2종 이상에 항원을 담지시켜 두어도 되고, 또한 그 경우에 있어서도 항원을 별도로 투여하는 것도 가능하다.

항원이, 진균, 방선균, 세균, 바이러스, 파지, 리케차, 원충, 및/또는 이들 미생물의 성분인 경우는, 본 발명의 면역 애쥬번트와 항원을 투여함으로써, 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 백신요법을 행할 수 있다. 또한, 항원이 종양조직, 종양세포, 종양세포성분, 및/또는 종양항원 펩티드인 경우는, 본 발명의 면역 애쥬번트를 상기 항원과 함께 투여함으로써 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 백신요법을 행할 수 있다. 예를 들면, 환자로부터 분리하여 불활성화한 종양세포와 본 발명의 면역 애쥬번트를 혼합하여 환자에 투여함으로써, 환자의 생체내에 있어서 당해 종양세포에 대한 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 다만, 본 발명의 혼합 면역 애쥬번트 제제의 사용방법은 상기의 태양에 한정되는 것은 아니고, 면역 애쥬번트를 사용하는 통상의 형태 중 어떠한 방법을 사용해도 된다. 본 발명의 면역 애쥬번트의 투여량 및 투여방법은 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 통상 주사(피하주사 등)의 비경구 투여에 의해 면역반응이 충분히 야기되도록 투여할 수 있다.

또한, 환자의 체내에 있는 종양조직을 물리적 수단으로 변성시킨 후, 그 조직 내에 본 발명의 면역 애쥬번트를 투여함으로써, 환자의 체내에 생존해 있는 종양세포에 대해 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 종양조직의 물리적 변성의 수단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 마이크로파 조사, 고주파 응고법, 동결 응고법, 전기메스 가열, 열수 주입, 알코올 주입, 색전법, 방사선 조사, 레이저광 조사, 초음파 파괴 등의 수단을 채용할 수 있다. 다만, 물리적 변성수단은 이들에 한정되는 것은 아니고, 종양조직 내에 있는 종양세포의 세포사를 유도할 수 있는 수단이면 어떠한 것을 사용해도 된다. 2 이상의 물리적 수단을 적절히 조합해도 된다.

예를 들면, 종양조직을 마이크로파 조사에 의해 가열 응고하고, 그 응고조직 내에 본 발명의 면역 애쥬번트를 투여하면, 당해 종양조직 내부나 그 주변에 생존해 있는 종양세포에 대해 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 면역 애쥬번트를 투여할 때, 투베르쿨린 용액을 동시에 투여하는 것도 바람직하다. 다만, 본 발명의 면역 애쥬번트의 투여방법은 상기의 태양에 한정되는 것은 아니고, 당해 변성 종양조직에 모이는 항원 제시세포에 본 발명의 면역 애쥬번트가 변성 종양조직에 포함되는 종양항원과 함께 흡수되거나, 또는 본 발명의 면역 애쥬번트가 항원 제시세포를 직접 자극할 수 있는 환경을 부여하는 것이면, 어떠한 방법을 채용해도 된다.

또한, 미리 본 발명의 면역 애쥬번트와 면역 담당세포를 체외에서 혼합한 후 환자의 체내에 투여하여, 체내에 있어서의 면역반응을 자극하는 것도 가능하다. 그 면역 담당세포로서는 수상세포, B 림프구, T 림프구, 내츄럴 킬러 세포, 및/또는 조혈 간세포 등을 바람직하게 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

다른 관점에서는, 본 발명의 면역 애쥬번트 및 항원을 유효성분으로서 포함하는 백신이 본 발명에 의해 제공된다. 이 백신을 투여할 때는, 당업자에게 주지의 방법을 사용하면 되고, 면역 담당세포를 동시에 혼합해도 된다. 항원으로서, 예를 들변 바이러스나 바이러스 성분 등의 감염증을 일으킨 감염원 유래의 물질을 사용함으로써, 미감염 환자에 대한 감염예방 뿐 아니라, 이 감염증을 앓고 있는 환자의 치료를 행하는 것도 가능하다. 또한, 환자로부터 분리한 종양조직, 종양세포, 종양세포성분, 종양항원 단백, 및 종양항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 생체시료 및 상기 면역 애쥬번트를 포함하는 백신을 이 종양이 유래하는 환자에게 투여함으로써 종양을 치료하는 것도 가능하다.

또한, 항원이 예를 들면 이종동물 단백인 경우, 상기의 면역 애쥬번트와 함께 인간 이외의 동물에 투여함으로써 이 항원에 대한 항체를 숙주동물에 효율적으로 생산시킬 수 있다. 이 방법으로 항체생산 동물을 용이하게 제작할 수 있고, 이 항체생산 동물에 유래하는 항체생산 세포나 항체 유전자를 용이하게 입수하는 것도 가능하다. 항원은 숙주에 대해 항원성을 갖는 것이면 어떠한 물질이어도 되고, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

예 1: 1종류의 면역 자극물질을 2종류의 면역 자극물질 담체에 담지시킨 면역 애쥬번트의 항원 제시세포 자극효과

THP-1 세포주를 PMA로 분화시켜 항원 제시세포로 하고, PPD를 2종류의 면역 자극물질 담체에 담지시켜, 배양조건하에서 항원 제시세포에 첨가했을 때의 GM-CSF의 생산량을 측정하였다.

A. 재료 및 방법

1. 인산칼슘(이하, CaP라고 약칭한다) 미립자 핵액의 조제

탄산칼슘 CaCO₃(칼시드 주식회사제, 순도 99.99%) 2 ㏖ 상당량을 달아 고순도 알루미나 갑발(alumina sagger)에 넣고, 상자형 로(爐)에서 1000℃, 3시간 소성하고, 탈탄산을 행하여 고순도의 산화칼슘 CaO를 얻어, 이것을 비커에 넣었다. 공기 중의 수분과 CaO가 반응하여 이산화탄소와 추가적으로 반응하는 것을 최대한 억제하기 위해 비커 상부를 랩으로 막고, 반응조인 내용량 10 L의 폴리에틸렌 용기 중에 두었다. 용기 중에 질소가스를 가득 채운 후, 비커의 랩을 제거하고, 비커 중에 초순수를 적하하였다. 이 때 발열로부터 보호하기 위해 폴리에틸렌 용기에도 초순수를 채웠다. 반응열이 가라앉았을 때 비커 중의 반응물을 모두 초순수로 씻어 없애고 폴리에틸렌 용기 중으로 옮겼다. 여기서 사용한 초순수의 총량은 CaO량으로부터 계산되는 농도가 0.5 ㏖/L가 되도록 맞췄다. 이 단계에서 수산화칼슘 Ca(OH)₂ 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 교반기(EYELA사제, MAZELA Z-1000)에서 약 500 rpm으로 교반하면서, 그 속에 0.6 ㏖/L로 조제한 오르토인산 H₂PO₄(고쿠산화학 주식회 사제, 농도 85%) 2 L를, 25 mL/min을 초과하지 않는 속도로 적하하였다. 적하 종료 후 24시간 그대로 교반하여, CaP 핵액으로 하였다.

2. CaP 미립자액, CaP-PPD 미립자액의 조제

2.1 인산칼슘 과포화 용액과 CaP 미립자액의 조제

링거액(후소 약품공업 주식회사제)을 8.28 mL, 클리니잘츠(Klinisalz) B액(고바야시 제약공업 주식회사제)을 1.24 mL, 바이필 전용 탄산수소나트륨 보충액(시미즈 제약제)을 0.48 mL의 비율로 혼합하여, 10 mL로 하였다. 이 인산칼슘 과포화 용액 9 mL에 에탄올을 1 mL 첨가하고, 혼합액 10 mL당 CaP 미립자 핵액을 한방울 첨가하여, 하룻밤 방치하였다. 현탁액을 원심하고, 침전을 얻어, 그것을 주사용 생리식염수로 충분히 세정하고, 1 mL의 주사용 생리식염수에 현탁하였다. 이것을 CaP 미립자액으로 하였다.

2.2 CaP-PPD 미립자액의 조제

링거액을 8.28 mL, 클리니잘츠 B액을 1.24 mL, 바이필 전용 탄산수소나트륨 보충액을 0.48 mL의 비율로 혼합하여, 10 mL로 하였다. 이 인산칼슘 과포화 용액 9 mL에 투베르쿨린 표준품(일본 BCG 제조 주식회사, 일반 진단용 정제 투베르쿨린(PPD))을 0.5 ㎍ 내지 10 ㎍ 용해하였다. 이 용액 9 mL에 에탄올을 1 mL 첨가하고, 혼합액 10 mL당 CaP 미립자 핵액을 한방울 첨가하여, 하룻밤 방치하였다. 현탁액을 원심하고, 침전을 얻어, 그것을 주사용 생리식염수로 충분히 세정하고, 1 mL의 주사용 생리식염수에 현탁하였다. 여기서 얻어진 CaP-PPD 미립자 현탁액은, 조제에 사용한 PPD량에 따라서 CaP-PPD(0.5 ㎍/mL) 내지 CaP-PPD(10 ㎍/mL)와 같이 표기하였다. 또한, 이들을 배양액(10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지)에 첨가했을 때 최종농도가 이것의 1/5일 때는 CaP-PPD(0.1 ㎍/mL) 내지 CaP-PPD(2.0 ㎍/mL)와 같이 표기하였다.

2.3 PPD액의 조제

투베르쿨린 표준품(일본 BCG 제조 주식회사제, 일반 진단용 정제 투베르쿨린(PPD)) 0.25 ㎍을 0.5 mL의 배양액에 용해하여, PPD액으로 하였다.

2.4 PPD 담지 코아세르베이션 침전 미립자(이하, TuMP라고 약칭한다)액의 조제

1) 25% 인간 혈청 알부민 용액(HSA, Baxter Albumac, Baxter사제)을 멸균수로 2.5%가 되도록 희석하고, 4N HCl로 pH 2.5로 맞추었다.

2) 미리 이 2.5% 인간 혈청 알부민 용액과 헤파린 용액(노보·헤파린주 1000, 1000 단위/mL, 약 7.69 ㎎/mL 이하, 아벤티스 파마 주식회사)을 다양한 비율로 혼합하고, 헤파린 용액의 적합 혼합비를 결정하였다. 적합 혼합비는 당초 적당한 혼합비로 마이크로 파티클을 제작하여, 2,500 rpm(1300 g)으로 15분 원심하고, 그 상청의 단백질 함량을 프로테인 어세이 키트 1(일본 바이오 래드 래버러토리즈, 도쿄)로 정량하여, 혼합한 단백질의 99.9% 이상이 마이크로 파티클에 흡수되는 조건으로 하였다.

3) PPD를 주사용 헤파린 용액에 현탁하고, 보텍스 믹서로 혼합하면서, 미리 정해둔 비율로 2.5% 인간 혈청 알부민 용액을 적하하였다.

4) 4,300 rpm(1300 g)으로 15분 원심하고, 증류수로 2회 세정하여, 증류수에 재현탁하였다.

5) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 용액(EDC, SIGMA사제, 물에 용해하여 20 ㎎/mL로 한 것)을 종농도 0.8~1.5 ㎎/mL가 되도록 보텍스 믹서로 혼합하면서 첨가한 후, 실온에서 15분간 정치하였다.

6) 0.1 M 글리신 수용액을 등량 첨가하고, 실온에서 15분간 정치하였다.

7) 4,300 rpm(1300 g)으로 15분 원심하고, 증류수로 3회 세정하여, PPD량으로 0.5 ㎍/mL의 농도가 되도록 생리식염수에 재현탁하였다.

이것을 TuMP액으로 하였다.

2.5 LPS액의 조제

리포폴리사카라이드(이하, LPS라고 한다)(시그마 알드리치 재팬 주식회사, 도쿄)를 칼슘·마그네슘을 포함하지 않는 둘베코 인산 완충 생리식염수(이하, PBS(-)라고 한다)(SIGMA사제)로 용해하여, 1 ㎎/mL로 하였다.

2.6 THP-1 세포주의 분화 유도배양과 GM-CSF 생산시험

인간 마크로파지 유사 세포주 THP-1을 원심 회수하여, PBS(-)로 2회 세정하고, 배양액(10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지)으로 세포수를 400만개/mL로 조정하여, 여기에 PMA 용액(SIGMA사제 PMA를 DMSO에 1.62 mM가 되도록 용해한 것)을 종농도 1.6 μM가 되도록 첨가하고, 24 웰 플레이트에 1 웰당 0.5 mL 파종하여 4일간 배양하였다. 배양 후, PBS로 2회 세정하고, 새로운 배양액으로 교환하여, 추가적으로 하룻밤 배양하였다. 그 후, 각종 자극용 배양액 0.5 mL로 교환하였다. 이 0.5 mL의 조제시, CaP 미립자액, CaP-PPD 미립자액은 1/5 용량을 첨가하였다. 또한, PPD는 배양액에 용해하여 0.5 ㎍/mL로 한 것의 1/5 용량을 첨가하였다. TuMP 액(2.5 ㎍/mL인 것)은 1/25 용량을 첨가하였다. LPS액은 종농도가 표 1에 기재된 농도가 되도록 배양액으로 희석하여 첨가하였다. 각각의 종농도는 표 1에 기재하였다.

2.6 GM-CSF의 측정시료

각종 자극용 배양액 0.5 mL로 교환한 후, 24시간 배양하고, 그 배양 상청을 회수하여, GM-CSF의 측정용 샘플로 하였다.

3. GM-CSF의 정량

인간 GM-CSF 정량용 키트(Human GM-CSF ELISA System Biotrak, AmershamLIFE SCIENCE사제)를 사용하여, 키트의 지시서에 따라서 사용하였다. GM-CSF의 정량은 듀플리케이트(duplicate)로 행하였다. 마이크로 플레이트 리더(BiotrakII, Amersham Biosciences사제)로 30분 이내의 450 ㎚의 흡광도를 측정, 검량선으로부터 GM-CSF의 값을 산출하였다.

B. 결과

표 1에 결과를 나타낸다. 표 중의 약호는 CaP, 인산칼슘 미립자; PPD, 정제 투베르쿨린(종농도는 괄호 안에 기재); TuMP, PPD 담지 코아세르베이션 침전 미립자(담지된 PPD의 종농도는 괄호 안에 기재); CaP-PPD, PPD 담지 인산칼슘 미립자(담지된 PPD의 종농도는 괄호 안에 기재); LPS, 리포폴리사카라이드(종농도는 괄호 안에 기재)이다. 본 시험계에서 생산된 GM-CSF의 양은 첨가한 LPS 농도에 대해 정량적인 용량반응성을 나타내었다. 따라서, 본 시험계의 정량성은 우수한 것이다. 분화되어 항원 제시세포가 된 THP-1 세포는 PPD, TuMP, 및 양자로 자극한 경우에 도, GM-CSF를 조금밖에 생산하지 않았다. 이에 대해, CaP-PPD는 0.1 ㎍/mL의 농도에서는 미자극인 경우의 3배, 2.0 ㎍/mL의 농도에서는 미자극인 경우의 13배의 GM-CSF를 생산시켰다. 또한 CaP-PPD에 PPD, TuMP를 추가하면, CaP-PPD, PPD, TuMP를 각각 단독으로 첨가한 경우의 생산 GM-CSF 농도를 단순히 가산한 경우보다도 많은 GM-CSF를 생산시켰다. 이와 같은 상가적(相加的) 효과를 초과하는 효과는 CaP-PPD의 농도가 0.1, 0.4, 2.0 ㎍/mL 중 어떤 경우에도 인정되고, CaP-PPD 농도가 높을수록 크게 발현되어, 상승적 효과가 되어 있는 것이 확인되었다.

예 2: 2종류의 면역 자극물질을 각각 다른 면역 자극물질 담체에 담지시킨 면역 애쥬번트의 항원 제시세포 자극효과

A. 재료 및 방법

시약의 조제, THP-1 세포주의 분화 유도 배양과 GM-CSF 생산시험, GM-CSF의 측정시료, 및 GM-CSF의 정량은 예 1에 따랐다. 그 밖의 시약조제는 이하와 같다.

1. BCG균 추출물 담지 인산칼슘 미립자(이하, CaP-Bx라고 약칭한다)액의 조제

1) 건조 BCG 백신 앰플 1개(일본 BCG 제조 주식회사, 12 ㎎ 들이)를 110℃에서 5분간, 오토 클레이브에 걸고, 에탄올 1 ㎖를 첨가하여, 6시간 이상 교반한 후, 그 현탁액을 채취하여 다른 건조 BCG 제제 1개에 첨가하고, 다시 충분히 교반한 후, 에펜도르프형 미량 고속원심기로 12,000 rpm에서 5분간 원심하고, 이 상청을 회수하여, BCG균체 유래 에탄올 가용성 성분 용액(이하 BCG 추출액이라고 한다)으로 하였다.

2) 링거액을 8.28 mL, 클리니잘츠 B액을 1.24 mL, 바이필 전용 탄산수소나트륨 보충액을 0.48 mL의 비율로 혼합하여, 10 mL로 하였다. 이 인산칼슘 과포화 용액 9 mL에 BCG 추출액을 1 mL 첨가하고, 혼합액 10 mL당 CaP 미립자 핵액을 한방울 첨가하여, 하룻밤 방치하였다. 현탁액을 원심하여, 침전을 얻고, 그것을 주사용 생리식염수로 충분히 세정하여, 1 mL의 주사용 생리식염수에 현탁하였다. 이것을 CaP-Bx액으로 하였다. GM-CSF 생산시험에 있어서는 1/5 용량을 자극용 배양액에 첨가하였다.

B. 결과

도 1에 결과를 나타낸다. No. 10, 11, 및 12의 막대그래프 상의 세로선은 표준편차를 나타낸다. 도면 중의 약호는 CaP, 인산칼슘 미립자; PPD, 정제 투베르쿨린(종농도는 0.1 ㎍/mL); TuMP, PPD 담지 코아세르베이션 침전 미립자(담지된 PPD의 종농도는 0.1 ㎍/mL); CaP-Bx, BCG균 추출물 담지 인산칼슘 미립자(BCG균 추출물의 제작법 및 종농도는 상기 A 1.1)를 참조할 것); LPS, 리포폴리사카라이드(종농도는 괄호 안에 기재)이다. 도면 중 시료 중의 면역 자극물질을 이하의 표 2에 나타내었다.

담지담체인 CaP 미립자에는 항원 제시세포의 자극작용은 인정되지 않았다. TuMP, PPD는 예 1의 경우와 동일하게, 매우 약한 자극작용밖에 없어, CaP, TuMP, PPD를 혼합한 경우에도 그 자극작용은 약하여, 최대 생산 GM-CSF량은 12.4 ng/mL(No. 5)였다. CaP-Bx에서는 128.7 ng/mL(No. 9)가 되고, 여기에 PPD를 추가해도 거의 변화는 없지만, TuMP를 추가한 경우, 명료한 상승적 효과가 관찰되었다(No. 10 및 No. 12).

예 3: 2종류의 면역 자극물질을 1종류의 면역 자극물질 담체에 담지시키고, 다른 면역 자극물질 담체에 1종류의 면역 자극물질을 담지시킨 면역 애쥬번트의 항원 제시세포 자극효과

A. 재료 및 방법

시약의 조제, THP-1 세포주의 분화 유도 배양과 GM-CSF 생산시험, GM-CSF의 측정시료, 및 GM-CSF의 정량은 예 1에 따랐다. 그 밖의 시약조제는 이하와 같다.

1. PPD-BCG균 추출물 담지 인산칼슘 미립자(이하, 「CaP-PPD-Bx」라고 약칭한다)액의 조제

1) 링거액을 8.28 mL, 클리니잘츠 B액을 1.24 mL, 바이필 전용 탄산수소나트륨 보충액을 0.48 mL의 비율로 혼합하여, 10 mL로 하였다. 이 인산칼슘 과포화 용액 9 mL에 5 ㎍의 PPD를 용해하였다. 이 용액 9 mL에 BCG 추출액을 1 mL 첨가하고, 혼합액 10 mL당 CaP 미립자 핵액을 한방울 첨가하여, 하룻밤 방치하였다. 현탁액을 원심하고, 침전을 얻어, 그것을 주사용 생리식염수로 충분히 세정하고, 1 mL의 주사용 생리식염수에 현탁하였다. 이것을 CaP-PPD-Bx액으로 하였다. GM-CSF 생산시험에 있어서는 1/5 용량을 자극용 배양액에 첨가하였다.

B. 결과

표 3에 결과를 나타낸다. 표 중의 약호는 CaP, 인산칼슘 미립자; PPD, 정제 투베르쿨린(종농도는 0.1 ㎍/mL); TuMP, PPD 담지 코아세르베이션 침전 미립자(담지된 PPD의 종농도는 0.1 ㎍/mL); CaP-PPD, PPD 담지 인산칼슘 미립자(담지된 PPD의 종농도는 1.0 ㎍/mL); CaP-PPD-Bx, PPD와 BCG균 추출물을 동시에 담지한 인산칼슘 미립자(제작법 및 종농도는 상기 A 1.1)를 참조할 것. 담지된 PPD의 종농도는 1.0 ㎍/mL); LPS, 리포폴리사카라이드(종농도는 괄호 안에 기재)이다. 표 3 중, No. 8은 예 1의 결과의 재현성을 확인한 것으로, CaP-PPD에 PPD, TuMP를 추가하면, CaP-PPD, PPD, TuMP를 각각 단독으로 첨가한 경우의 생산 GM-CSF 농도를 단순히 가산한 경우보다도 많은 GM-CSF를 생산하였기 때문에, 재현성은 양호하다고 판단되었다. 이 시료로부터 PPD액을 제거한 No. 7에서도 동일하게 상승적 효과가 인정되었다. 또한, CaP-PPD-Bx에 TuMP를 첨가한 경우도 동일하게, 매우 강한 상승적 효과가 인정되었다.

본 발명의 면역 애쥬번트를 사용하면, 강력한 면역 자극작용이 있는 것이 알려져 있는 LPS를 사용하여 항원 제시세포를 자극한 경우와 동일한 정도 또는 그것을 초과하는 대량의 GM-CSF를 항원 제시세포로부터 방출시킬 수 있다. 따라서, GM-CSF가 오토클라인 세포성장인자로서 작용하고 있는 항원 제시세포의 강력한 활성화와 그 상태의 유지가 가능하다. 따라서, 본 발명의 면역 애쥬번트를 항원과 함께 인간을 포함하는 포유류 동물의 생체내에 투여함으로써, 활성화 항원 제시세포에 의존한 이 항원에 대한 액성 면역반응 및/또는 세포성 면역반응을 유도할 수 있어, 감염증이나 종양에 대해 매우 유효한 백신요법을 행하는 것이 가능해진다.

Claims (18)

1. 2종 이상의 상이한 미립자상 면역 자극물질 담체에 각각 담지된 1종 또는 2종 이상의 면역 자극물질을 포함하는 면역 애쥬번트로서, 이 미립자상 면역 자극물질 담체로서 적어도 (a) 무기물 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물의 조합을 포함하는 면역 애쥬번트.
2. 제1항에 있어서,

   2종류의 면역 자극물질 담체의 조합이 (a) 세포에 의한 탐식 가능한 사이즈의 미립자상 인산칼슘 및 (b) 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물인 면역 애쥬번트.
3. 제2항에 있어서,

   상기 (a)의 미립자상 인산칼슘이 최대 직경 1 ㎛ 이하의 인산칼슘인 면역 애쥬번트.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서,

   상기 (a)의 미립자상 인산칼슘이 Ca/P 몰비가 1.3 이상으로서 탄산기 CO₃ ^2-를 3~6 중량% 함유하고, 그 결정성이 CuKα선에 의한 XRD 스펙트럼에 있어서 2θ값으 로 26°, 32°, 및 34°에 중심이 있는 넓은 피크가 출현하고, 33°에 300의 밀러지수의 숄더가 출현함으로써 규정되는 결정성 이상이며, 또한 26°, 28.1°, 29°, 32°, 33°, 및 34°에 중심이 있는 피크 또는 숄더가 출현하는 것에 더하여 211 밀러지수와 112 밀러지수의 피크가 분리됨으로써 규정되는 결정성 이하의 결정성인 미립자상 인산칼슘인 면역 애쥬번트.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 (b)의 가용성 단백이 알부민인 면역 애쥬번트.
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 (b)의 뮤코다당이 헤파린인 면역 애쥬번트.
7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 (b)의 불용성 물질의 가용성 단백과 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전물이 단백 분자간 가교제에 의해 가교된 침전물인 면역 애쥬번트.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   면역 자극물질이 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 유도제인 면역 애쥬번트.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

   면역 자극물질이 투베르쿨린, 정제 투베르쿨린, 미생물에 유래하는 가용성 성분, 트레할로스 6,6'-디미콜레이트, 리포폴리사카라이드, 리피드 A, 올리고뉴클레오티드, β-글루칸, 키홀 림펫 헤모시아닌, 무라밀 디펩티드, 베스타틴, 레바미솔, 사이토카인, 케모카인, 세포성장인자, 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질인 면역 애쥬번트.
10. 제9항에 있어서,

    미생물에 유래하는 가용성 성분이 미생물의 알코올 추출물, 아세톤 추출물, 피리딘 추출물, 및 열수 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 추출물인 면역 애쥬번트.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,

    미생물이 세균인 면역 애쥬번트.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

    항원과 함께 인간을 포함하는 포유류 동물의 체내에 투여하여 이 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도하기 위한 애쥬번트.
13. 제12항에 있어서,

    상기 항원이 진균, 방선균, 세균, 바이러스, 파지, 리케차, 원충, 진균성분, 방선균성분, 세균성분, 바이러스성분, 파지성분, 리케차성분, 원충성분, 종양조직, 종양세포, 종양세포성분, 종양항원 단백, 및 종양항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질인 면역 애쥬번트.
14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

    인간을 포함하는 포유류 동물의 종양조직을 물리적 수단으로 변성시킨 후 이 종양조직 내에 투여함으로써 항종양 면역반응을 유도하기 위한 면역 애쥬번트.
15. 제14항에 있어서,

    물리적 수단이 마이크로파 조사, 고주파 응고법, 동결 응고법, 전기메스 가열, 열수 주입, 알코올 주입, 색전법, 방사선 조사, 레이저광 조사, 및 초음파 파괴로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 수단인 면역 애쥬번트.
16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

    체외에서 면역 담당세포와 혼합한 후에 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여함으로써 이 동물의 생체내에 있어서 전신성 면역반응을 유도하기 위한 면역 애쥬번트.
17. 제16항에 있어서,

    면역 담당세포가 수상세포, 마크로파지, B 림프구, T 림프구, 내츄럴 킬러 세포, 내츄럴 킬러 T 세포, 및 조혈 간세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 세포인 면역 애쥬번트.
18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 면역 애쥬번트와 항원을 포함하는 백신.

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