CN104640553A

CN104640553A - 肿瘤的疫苗接种

Info

Publication number: CN104640553A
Application number: CN201380044773.3A
Authority: CN
Inventors: G·翁多奇; A·萨斯; O·萨斯; N·伊卢里
Original assignee: XAX Kft
Current assignee: XAX Kft
Priority date: 2012-08-26
Filing date: 2013-08-26
Publication date: 2015-05-20
Also published as: MX2015002578A; CA2879739A1; MX357648B; HUE030407T2; EP2780024B1; CA2879739C; KR20150043375A; AU2013307344A1; EP2780024A1; JP2015530379A; AU2013307344B2; ES2586234T3; KR101714281B1; EP2703001A1; RU2015110690A; US20150217099A1; US10792483B2; WO2014033097A1; SG11201500396TA

Abstract

本发明涉及由至少一种免疫刺激物和使用电容耦合的射频波组成的疫苗以及涉及用于治疗原发性癌及其转移瘤(甚至处于散布性细胞状态下的，其不能通过目前可获得的成像方法来检测)或用于预防癌症疾病的复发和特别地用于使得和支持患者自身的免疫系统能够识别和杀死癌细胞并建立记忆以预防癌症疾病复发的方法，特别是原位和体内疫苗接种方法。

Description

肿瘤的疫苗接种

说明书

本发明涉及由至少一种免疫刺激物和使用电容耦合的射频波组成的疫苗，并且涉及用于治疗原发性癌及其转移瘤(甚至处于散布性细胞状态下的，其不能通过目前可获得的成像方法来检测)或用于预防癌症疾病的复发和特别地用于使得和支持患者自身的免疫系统能够识别和杀死癌细胞并建立记忆以预防癌症疾病复发的方法，特别是原位和体内疫苗接种方法。

本发明使用患者自身的独特的肿瘤特异性抗原。然而，这些抗原不能被免疫细胞和后续反应识别(它们是隐藏起来的)。这阻止恶性疾病受到免疫攻击，并且身体将肿瘤识别为其自身的组织修复。免疫系统针对肿瘤细胞不起作用。本发明提供了一种疫苗，其能够释放肿瘤抗原以便它们被抗原呈递细胞(APC)识别以起始针对恶性疾病的特异性免疫反应。这是本发明的疫苗所提供的特殊效应，即暴露隐藏的抗原、促进由APC(特别是树突细胞)的识别和使所述APC和整个免疫系统准备好建立特异性免疫反应以清除肿瘤。因此，本发明的疫苗产生天然的过程。

简要地，由本发明的疫苗引起的免疫原性细胞死亡导致适应性免疫系统的激活以对抗癌细胞。作为本发明疫苗的组分的免疫刺激物支持这样的对抗以便效应是完全全身性的并具有长期记忆。

发明背景

定义

如本文中所用，术语“隐藏的肿瘤细胞”或“非免疫原性肿瘤”包括通过减少肿瘤特异性抗原(TSA)在其表面上的表达或不在其表面上表达所述抗原来逃避免疫系统检测的肿瘤和肿瘤细胞。隐藏的肿瘤细胞包括“休眠肿瘤细胞”、散布性细胞和微转移瘤。休眠肿瘤细胞在被研究的时候不显示恶性特征并且是化疗抗性的，但其并不耐热。散布性细胞以低浓度在血液中循环。它们在血液中低的抗原呈递和浓度使得其检测是不可能的。微转移瘤通常是恶性发育的最危险且不可见的部分。目前使用的成像系统的分辨率仅允许在微转移瘤形成由几百万的细胞组成的聚集体之后被检测到。

本申请中使用的术语“体内-疫苗接种”意指免疫所必需的抗原是在患者体内产生的。大多数肿瘤-疫苗接种使用人工产生的抗原或利用体外实验室条件制备并再注射给患者的患者自身的抗原。然而，在本发明中，免疫所必需的适当抗原是在体内即通过患者的身体产生的。因此，本发明的疫苗接种方法还可被称作体内疫苗接种方法。

如本文中所用，术语“原位疫苗接种”意指免疫(即特定TSA的识别)实际上是在肿瘤中进行的。在大多数“经典的”肿瘤-疫苗接种中，被置于身体中的抗原远离期望的活性分子作用的位置。然而，根据本发明，免疫过程在原位即在肿瘤的部位进行。因此，本发明的疫苗接种方法还可被称作原位疫苗接种方法。

如本文中所用，术语“中度的全身热疗(hyperthermia)”是指在38℃至39℃的温度的全身加热。其也被本领域技术人员已知为“发热温度范围全身加热”并且通常被用于增强免疫系统。可区分三种类型的全身热疗：

－轻度的全身热疗是指在约38℃的温度的全身加热；

－中度的全身热疗如上定义；

－极度的全身热疗是指在40℃至41℃的温度的全身加热，其在一些时候可扩展至高至42℃。

如本文中所用，术语“具有增加的癌症风险的人”是指因遗传了遗传突变而天生具有显著增加的对癌症的易感性的人。遗传突变可足以极大地增加个人对一种或多种类型的癌症的易感性，并且该易感性可在代与代之间传递。这样的突变的遗传产生了其中许多个体发生某一/某些类型的癌症的家族。已知的与遗传性癌症相关的基因包括增加乳腺癌风险的异常BRCA1和BRCA2基因以及与结肠癌相关的HNPCC基因。此外，术语“具有增加的癌症风险的人”还指通过暴露于环境致癌物而发生或最可能发生一些突变从而具有增加的癌症风险的人。暴露于癌症的风险因素可包括长期或反复暴露于辐射、使用烟草、暴露于致癌化学药品和感染癌症病毒例如人乳头瘤病毒(HPV)。能够触发癌症发生的化学药品和辐射被称作“致癌物”。致癌物通过起始一系列遗传改变(“突变”)和刺激细胞增殖来起作用。在暴露于致癌物与癌症发作之间可存在几十年的延迟。暴露与疾病发作之间的该时期是迟滞期。因此本申请的一个方面是在迟滞期的终点处或终点附近治疗由暴露于致癌物而导致的具有增加的癌症风险的人。因此，根据本发明的疫苗接种对于此类人是特别重要的。

基于射频的方法和癌症

目前，将射频电流用于治疗癌症的方法是射频消融(RFA)法，其与本发明显著不同。RFA法是将RF用于烧坏病损的有创性方法。RFA法应用针形的“天线”(参见图1)，其被瘤内地插入实体瘤中，并且施用的局部电流变得如此大以致于肿瘤被烧伤从而引起剧烈的坏死。

本发明严格地避免了这样的条件。RFA法是其中使用从高频交流电产生的热来烧蚀心脏、肿瘤或其它功能失调组织的电传导系统的部分以治疗医学障碍的医疗程序。RF电流的优势(相较于先前使用的低频AC或DC的脉冲)是其不直接刺激神经或心肌并因而可通常在不需要全身麻醉剂的情况下使用。RFA程序由介入疼痛专家例如麻醉科医师、介入放射科医师或心脏电生理专家(心脏病专家的分科)在影像引导(例如X射线屏检查、CT扫描或超声)下进行。

将射频电流用于治疗癌症的另一种医疗程序是使用脉冲射频的血管内刺激(参见WO 2011/078676)。该方法可用于治疗实体瘤和血源性瘤并包括具有低于1000Ω的阻抗的针样电极至血管中的插入和具有10-80V的电压以持续时间为0.1-100ms的脉冲猝发(pulse burst)和1/s-20/s的猝发频率(burst frequency)的射频范围内的电流脉冲的电信号的递送。据记载，血管内脉冲射频刺激通过刺激和诱集淋巴细胞来增强免疫系统，这导致肿瘤细胞的攻击。血管内射频刺激是有创性的并导致整个身体中的血液的加热。此外，由血管内射频刺激诱导的免疫应答是非特异性的。因此，没有免疫反应靶向“隐藏的”肿瘤细胞，所述肿瘤细胞不受这样的医疗程序的影响。

WO 2011/078676还公开了将利用脉冲射频的血管内刺激与疫苗接种组合使用的可能性。然而，在WO 2011/078676中利用脉冲射频的血管内刺激用于此的作用是增强免疫系统，以便由疫苗接种疗法诱导的免疫反应被放大。据本申请人所知，到目前为止，几种癌症疫苗处在由公司进行的开发过程中，但仅一种产品得到了用于晚期前列腺癌的完全许可(由FDA通过)。(或sipuleucel-T)是用于前列腺癌的免疫疗法，其由已用PAP-GM-CSF融合蛋白进行“离体”温育的患者自身的血细胞的混合物组成。迄今为止，没有针对“隐藏的”肿瘤细胞的癌症疫苗接种被开发。因此，WO 2011/078676公开的方法没有提供任何关于以无创方式应用的脉冲射频可如何提供针对癌细胞的记忆和全身性免疫应答和可如何用作疫苗接种疗法的信息。

免疫系统和癌症

免疫系统是复杂的结构并且其过程保护有机体抵抗紊乱和疾病。其具有两个基本的子系统，固有免疫系统和适应性免疫系统。固有免疫系统发现于几乎所有的活体中，其不产生免疫记忆并且作用(应答)是非特异性和即时的。固有免疫系统的主要细胞结构是巨噬细胞(能够进行吞噬)、肥大细胞(释放炎症性促进分子)；粒细胞(响应炎症的三种细胞类型的组)、树突细胞(呈递抗原的适应性免疫细胞)、天然杀伤细胞(破坏感染了病原体的细胞)。发现于颚口类(具有颚的脊椎动物)中的适应性系统具有免疫记忆并通常具有应答的滞后时间。属于适应性系统的主要的细胞组是产生中和侵入物的抗体的B细胞和专门用于破坏感染细胞或协调免疫应答的T细胞。

免疫系统的一个作用是鉴定或破坏肿瘤。识别可因在肿瘤细胞表面上但不存在于健康细胞上的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原而是可能的。在肿瘤细胞中产生的具有改变的结构(因遗传突变而导致的)的任何蛋白可用作肿瘤抗原。可选择地，通常以非常低的量产生但其产生在肿瘤细胞中增加的蛋白可在一些时候触发免疫应答。这样的蛋白的一个实例是酪氨酸酶。由于这些蛋白是内源蛋白，因此免疫应答是罕有的，但如果细胞膜上的抗原密度足够高，癌细胞可被特异性T细胞识别并破坏。

肿瘤抗原的另一个重要的种类是通常仅在免疫系统完全发育之前在胚胎发育的早期产生以便针对这些蛋白或抗原的自身耐受性不能发生的蛋白。此外，被肿瘤病毒例如EBV和HPV感染的细胞包含病毒DNA，所述病毒DNA被转录并且所产生的蛋白或DNA本身可导致免疫应答。

针对肿瘤细胞的特异性免疫应答使用T细胞。肿瘤细胞通常表达减少量的可识别的结构或甚至隐藏可识别的结构，所述可识别的结构可被APC识别。一些肿瘤例如通过分泌TGF-β来抑制免疫应答。此外，可发生免疫耐受性并没有针对癌细胞的其它免疫反应。肿瘤还可产生奇异现象，例如在一些情况下巨噬细胞促进肿瘤生长。

一种基本的理论体系提出了癌症免疫监视，其阻断致癌作用并保持有效的细胞动态平衡。通过个体自身的免疫系统来保护其抵抗癌生长的过程被称作免疫编辑。炎症可以是老年受试者中肿瘤发育的一个主要的促进因子。

本癌症疗法主要集中于所谓的“黄金标准(gold standard)”，例如化疗(药物产品)、放疗(电离射线)、手术及其组合。用于癌症治疗的新方法在不断出现，其中免疫疗法是有前景的一个。

在热化疗(与化疗组合的全身热疗)中伴侣蛋白的作用是重要的。伴侣分子(例如应激(stress)蛋白或热激蛋白)是高度保守的蛋白，其存在于几乎每一个活细胞中并且帮助其它大分子结构的非共价折叠或解折叠和装配或解装配。伴侣分子发现于基本上所有的活有机体中，不论其演化的阶段。伴侣分子在正常和病理-生理条件下无所不在地表达，但细胞生命的动态平衡的任何类型的改变(环境应激例如热、各种病原体过程、疾病等)调节(主要激活)其合成。伴侣分子的分泌是细胞使其本身适应于新的攻击的‘应激-回答’。由于恶性细胞的上调的细胞生长和从而增加的蛋白表达，分子伴侣在癌性细胞中是高度表达的并且对于这些细胞类型的存活是必需的。热激蛋白(HSP)是当细胞暴露于升高的温度或其它应激时具有增加的表达的一组伴侣分子。此外，在许多转移瘤中观察到多种HSP(HSP27、HSP70和HSP90)的诱导，并且HSP90的同源物GRP94可用作转移瘤产生的介导因子。此外，应激蛋白和热激蛋白被意欲消除恶性疾病的每一种肿瘤治疗方法诱导。因此，在常规的热疗、化疗、放疗或甚至光动力疗法后检测到加强的伴侣分子合成。在应激适应的过程中，应激蛋白的诱导或过表达通常提供细胞的有效保护以避免凋亡。然而，应激蛋白的细胞外表达相反地作用并且还将现行细胞(actual cell)的缺陷传信号至免疫系统。此外，热处理还可导致多药物抗性。

非温度依赖性效应(主要是电磁场应激)也可产生伴侣分子合成。癌组织的活组织检查中的HSP表现可给出治疗反应的良好临床指征。

在另一方面，伴侣分子HSP70帮助冻结现行动态平衡(actualdynamic equilibrium)(“现状”)和从而设法再建立细胞外电解质中的细胞通信。已知伴侣分子HSP70在细胞膜上的表达增加凋亡信号并增强免疫反应。HSP70参与p53肿瘤抑制子的活化并与肿瘤抑制子视网膜母细胞瘤蛋白相关。

HSP70的膜再定位促进凋亡，并且具有在膜“流体”中保持其功能性的非常重要的作用(比其它伴侣分子更重要)。HSP70主要在膜的胆固醇富集微区域中的肿瘤特异性膜定位导致免疫应答中NK细胞的有效活化。宽频带(0.2-20MHz)的电磁场增加HSP70表达。通过温度产生HSP70表达的相同增加会需要14个数量级更大的扰动，这概括了电场的非温度依赖性效应相对于温度依赖性效应在HSP70表达上的巨大优势。细胞外HSP70的作用在生物系统的总体免疫反应中是一个越来越感兴趣的课题。

细胞裂解和细胞坏死特征性的毒素的释放可必然导致变形过程的限制。然而，凋亡细胞死亡或任何其它的全身性免疫作用会更天然并使系统免于毒性并发症。热诱导的凋亡和天然杀伤细胞的活化都适合于解决该任务。

因此，在癌症治疗中，提供支持免疫系统以容易地识别肿瘤细胞和尤其非免疫原性肿瘤细胞(其表达减少量的可被APC识别的可识别结构或隐藏所述结构)的可能性是非常有用的。这样的可能性还会允许成功地治疗转移瘤和发生转移瘤的患者，其通常是不可治愈的。

本发明的目的是提供上述可能性。

该目的通过独立权利要求的教导得到解决。其它的有利特征和实施方案根据本说明书、实施例和从属权利要求是明显的。

发明描述

本发明涉及用于无创治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防患者中已被成功治疗的癌症疾病的复发的方法，所述方法通过给患者施用免疫刺激物和使用电容器布置中的电容耦合的射频波来进行。

因此，患有原发性癌和/或患有转移瘤的患者或经过成功的癌症治疗后具有复发风险的患者利用免疫刺激物来局部地或全身性地治疗并且另外接受利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波的热疗治疗。利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波的热疗治疗可一天一次或两天一次或一周一次地施用或按需施用或按执业医师所安排地施用，并且每次治疗期间通常花费一至几个小时。

如本文中所用，术语“电容耦合”是指通过使用构成类似电容器的布置的电场支配将电磁能传递至负载的事实。在本文的情况下负载是待被治疗的患者，其是电容器的部分并用作电容器较差(lousy)的电介质材料。电极通过其阻抗被匹配。本发明中使用的方法具有“传导性”的电容耦合、支配不完美电介质材料中的电介质功能的传导性部分、主要地产生焦耳热。当电极松散连接时，耦合变得越来越具有辐射性，从而丢失其焦耳热容。

根据本发明的免疫刺激物和利用使用电容耦合的射频波的热疗治疗的组合使得患者自身的免疫系统能够识别原发性癌细胞和转移瘤和转移的癌细胞和在复发期间形成的单个癌细胞并且在该识别后能够有效地杀死这些癌细胞。因此，本发明的优选实施方案涉及患者的原位和体内疫苗接种方法，所述患者患有癌症或被成功治疗了癌症(利用或未利用根据本发明的方法)或是具有增加的癌症风险的人。

在治疗癌症和转移瘤或预防癌症复发的本方法中，使用包含至少一个电极和对电极的电容器布置中的电容耦合来施用射频波，其中患者是两者之间的电介质材料。

本方法的无创治疗和预防癌症的一个优势是射频波的施用不需要使用类似具有辐射耦合的RF布置中的天线。本方法相对于现有技术的另一个显著的优势是施用的射频波不增加患者的体温或治疗区域的温度。

在本发明的优选实施方案中，治疗癌症和预防癌症复发的方法包括使用电容器布置中的电容耦合的射频波的全身施用。

在上述方法中，免疫刺激物优选选自包含下列或由下列所组成的组：细菌制剂、脂多糖、卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)提取物、毕西巴尼、Ancer、消癌平(Xiao-Aiping)、(沙格司亭；重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、杀死的短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)细菌及其提取物、细胞因子、中度的全身热疗、TLR受体激动剂、作用于TLR途径的任何天然的或合成的试剂、伊匹木单抗、草药化合物(herbal compound)(紫锥花属(echinacea)等)和左旋咪唑。

本方法可特别地用于具有增加的发生癌症的风险的人的疫苗接种，因为本方法产生免疫系统的记忆以识别癌细胞，特别是试图通过隐藏肿瘤特异性抗原逃避免疫系统的癌细胞。

此外，本方法对于假定成功治疗了癌症疾病的患者的疫苗接种是特别有用的，因为已知癌症的复发具有高的可能性。因此，术语“复发”是指在其中不可检测到癌症的改善期之后癌症疾病或癌症疾病的体征和症状的恢复。复发出现的可能原因是少数原始的癌细胞在最初的治疗中存活下来。一些情况下，这是因为癌细胞扩散至身体的其它部分并且太少以致于不能在治疗后立即进行的随访期间被检测到(微转移瘤)。本发明的方法可提供针对癌细胞，特别地还针对扩散细胞的记忆和全身性免疫应答并可用作疫苗接种疗法。因此，上述方法可特别用于预防癌症的假定成功的治疗(利用或未利用根据本发明的方法)后的复发。

根据本发明的发明适合用于治疗原发性癌及其转移瘤和用于预防癌症的复发，其中癌症、原发性癌、转移瘤或癌细胞选自：腺癌、脉络膜黑素瘤、急性白血病、听神经瘤、壶腹癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胰腺瘤、硬纤维瘤、膀胱癌、支气管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳癌、伯基特淋巴瘤、子宫体癌、CUP-综合征(原发灶不明的癌)、结直肠瘤、小肠癌、小肠肿瘤、卵巢瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌症类型、Ewing瘤、胃肠肿瘤、胃癌、胆囊瘤、胆囊癌、子宫癌、宫颈瘤、宫颈、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、耳、鼻和咽喉肿瘤、血液瘤、多毛细胞白血病、尿道癌、皮肤癌、皮肤睾丸癌、脑瘤(神经胶质瘤)、脑转移瘤、睾丸癌、脑下垂体瘤、类癌、卡波西氏肉瘤、喉癌、生殖细胞瘤、骨癌、结直肠癌、头颈部肿瘤(耳、鼻和咽喉区域的肿瘤)、结肠癌、颅咽管瘤、口癌(口腔区域中和唇上的癌)、中枢神经系统的癌症、肝癌、肝转移瘤、白血病、睑瘤、肺癌、淋巴结癌(霍奇金氏/非霍奇金氏)、淋巴瘤、胃肿瘤、恶性黑色素瘤、恶性瘤、胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、直肠瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、霍奇金氏病、蕈样真菌病、鼻癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、肾癌、肾细胞癌、非霍奇金氏淋巴瘤、少突神经胶质瘤、食管癌、溶骨癌和成骨癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、浆细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、前列腺癌、咽癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、阴道癌、甲状腺癌、Schneeberger病、食道癌、spinalioms、T细胞淋巴瘤(蕈样真菌病)、胸腺瘤、管癌、眼肿瘤、尿道肿瘤、泌尿系统肿瘤、膀胱上皮癌、外阴癌、疣形(wartappearance)、软组织肿瘤、软组织肉瘤、Wilm瘤、宫颈癌和舌癌。特别适合用于治疗的为例如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、支气管癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、喉癌、恶性黑色素瘤、食道癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌和肾细胞癌。根据本申请的发明尤其适合用于非免疫原性肿瘤或癌症的治疗。

根据本方法的优选实施方案涉及用于无创治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防患者中的已被成功治疗的癌症疾病的复发的方法，所述方法通过给患者施用消癌平和使用电容器布置中的电容耦合的射频波来进行。

本发明的另一方面涉及由至少一种免疫刺激物和使用电容器布置中的电容耦合的射频波组成的疫苗，所述疫苗用于治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防已成功治疗了癌症疾病的人中的癌症疾病的复发或用于预防具有增加的发生癌症的风险的人中的癌症。

因此，本发明涉及免疫刺激物用于制备用于治疗癌症及其转移瘤的药剂的用途，其中所述免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用。此外，本发明涉及免疫刺激物用于制备用于治疗患有癌症的哺乳动物或用于预防已假定成功治疗了癌症疾病的哺乳动物中的癌症疾病的复发的药剂的用途，其中所述免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用。从而免疫刺激物激活多个非特异性免疫反应并将使用电容耦合的射频波的局部效应转化至全身性效应。

在另一方面，本发明涉及免疫刺激物用于制备用于治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防已成功治疗了癌症疾病的患者中的癌症疾病的复发的疫苗的用途，其中所述免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用至患者。该疫苗可特别地用于原位疫苗接种并优选用于上述癌症类型。

疫苗的免疫刺激物优选选自包含下列或由下列所组成的组：细菌制剂、脂多糖、卡介苗提取物、毕西巴尼、Ancer、消癌平、(沙格司亭；重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、被杀死的短小棒状杆菌细菌及其提取物、细胞因子、中度的全身热疗、TLR受体激动剂、作用于TLR途径的任何天然的或合成的试剂、伊匹木单抗、草药化合物(紫锥花属等)和左旋咪唑。

优选地，根据本发明的疫苗是由至少消癌平和使用电容器布置中的电容耦合的射频波组成的疫苗，所述疫苗用于治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防已成功治疗了癌症疾病的人中的癌症疾病的复发或用于预防具有增加的发生癌症的风险的人中的癌症。

本发明的另一方面涉及当与使用电容器布置中的电容耦合的射频波联合使用时用于无创治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发的免疫刺激物。因此，本发明涉及用于无创治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发的免疫刺激物，其中所述免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用。此外，本发明涉及用于治疗患有癌症的哺乳动物或用于预防已假定成功治疗了癌症疾病的哺乳动物中的癌症疾病的复发的免疫刺激物，其中所述免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用。从而免疫刺激物激活多个非特异性免疫反应并将使用电容耦合的射频波的局部效应转化至全身性效应。

本发明的其它方面涉及当与使用电容器布置中的电容耦合的射频波联合使用时用于无创治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发的消癌平。因此，本发明的优选实施方案涉及用于无创治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发的消癌平，其中所述消癌平与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用。此外，本发明涉及用于治疗患有癌症的哺乳动物或用于预防已假定成功治疗了癌症疾病的哺乳动物中的癌症疾病的复发的消癌平，其中免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用。

令人惊讶地发现，当与使用电容器布置中的电容耦合的射频波联合使用时，常用的免疫刺激物对原发性癌及其转移瘤的治疗或对癌症疾病的复发的预防是非常有用的。本发明人可显示单独的使用电容器布置中的电容耦合的射频波对于位于远处的肿瘤或转移瘤不具有任何效应。免疫刺激物(LPS，消癌平)施用也不具有对于肿瘤消退的效应。然而，与使用电容耦合的射频波结合的免疫刺激物施用提供伴随远隔效应并导致位于远处的肿瘤的缩小。因此，使用电容耦合的射频波和免疫刺激物施用联合地导致全身性效应。

本发明不会与辐射耦合一起使用，因为辐射耦合会烧伤细胞。因此，不将类似具有辐射耦合的RF布置中的天线用于将射频波与根据本发明的免疫刺激物联合施用。

根据本发明的射频波通过使用包含至少一个电极和至少一个对电极的电容器布置来施用，其中患者是两者之间的电介质材料。

本发明的优选实施方案涉及与全身性施用的射频波联合使用的免疫刺激物。

根据本发明的使用电容器布置中的电容耦合的射频波不增加患者的体温或治疗区域的温度。

所有常用的免疫刺激物可用于本发明。免疫刺激物或免疫刺激剂是通过诱导免疫系统的任何组分的活化或增加其活性来刺激免疫系统的物质。在本发明中，不论抗原特异性而作用于增强其它抗原的免疫应答或在无抗原特异性的情况下刺激免疫系统的组分的非特异性免疫刺激物是优选的。可在本发明内使用的可能的免疫刺激物的实例是脂多糖、卡介苗提取物、毕西巴尼、Ancer、消癌平、(沙格司亭；重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、杀死的短小棒状杆菌细菌及其提取物、中度的全身热疗、伊匹木单抗(针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的抗体)、左旋咪唑、KLH(钥孔血蓝蛋白)、低剂量顺铂或卡铂(<0.4mg/kg)、Juzentaihoto(JT48)和脱氧胆酸(DCA)。根据本发明的免疫刺激物可选自包含下列或由下列所组成的组：细菌制剂、生物应答调节剂、TLR受体激动剂、作用于TLR途径的天然或合成的试剂、草药(herb)或草药提取物、传统中药(TCM)、汉方(Kampo)(中药的日本改编体)，例如Juzentaihoto(JT48)。特别优选的免疫刺激物是消癌平和

在实施例14中使用了免疫刺激物JT48，结果显示于图48中。在没有使用电容器布置中的电容耦合的射频波的施用的情况下，单独的免疫刺激物(TJ-48)的施用几乎没有效应，而单独的RF治疗(OTM：肿瘤热疗(oncothermia)治疗)具有可观的效应，但两者一起(即免疫刺激物与肿瘤热疗)具有显著的效应。使用任何其它的本文公开的免疫刺激物例如前段的免疫刺激物可获得相同的结果。

细菌制剂优选选自包含下列或由下列所组成的组：脂多糖、卡介苗提取物、毕西巴尼(OK-432)、杀死的短小棒状杆菌细菌及其提取物。

生物应答调节剂(生物制剂；BRM)是人体天然产生的物质，但其也可以是由生物技术方法和其它技术产生的相同的或非常类似的物质。这些物质引起身体对感染的应答。生物制剂优选选自包含下列或由下列所组成的组：单克隆抗体、白细胞介素-2、干扰素、多种类型的集落刺激因子(CSF、GM-CSF、G-CSF)、人TNF受体、由身体的胸腺产生的物质例如胸腺蛋白A或胸腺体液因子(THF)以及伊匹木单抗(针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的抗体)。

草药和草药提取物优选选自包含下列或由下列所组成的组：紫锥花(Echinacea angustifolia)(紫松果菊(Purple coneflower))、人参、消癌平(来自通关藤(Marsdenia tenacissima)的提取物)、Juzentaihoto(JT48)和中国黄芪(Chinese astragalus root)。

身体中性激素水平的变化导致特定的症状。这些在人与人之间不同。症状可以是轻度的但对于某些人可以是严重的并需要治疗。一些癌症(乳腺、前列腺)是激素敏感性的并且需要增加的雌激素或睾酮。因此优选根据本发明的免疫刺激物不是激素并且还优选不是性激素。

本文描述的本发明的免疫刺激物激活患者的免疫系统，并且与施用的使用电容器布置中的电容耦合的射频波联合地通过建立记忆以识别和杀死癌细胞和从而预防癌症疾病的复发，来提供针对癌症疾病的疫苗效应。

如本文中所用，术语“疫苗效应”是指由患者在免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波联合施用之后产生的免疫应答，所述免疫应答使得能够识别癌细胞的抗原和激活用于完全清除癌细胞的防御机制。

本发明的另一方面涉及用于治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防已成功治疗了癌症的患者中的癌症疾病的复发的无创方法，所述方法通过给患者施用免疫刺激物和使用电容器布置中的电容耦合的射频波来进行。

如本文中所用，术语“成功治疗了癌症”是指在最初的癌症治疗后具有改善并且其中不再可检测到癌症的时期中的患者。这些患者具有增加的恢复癌症疾病的风险。因此他们是潜在地成功治疗了癌症的，因为有可能少数原始的癌细胞在最初的治疗中存活下来，例如通过扩散至身体的其它部分且太少以致于不能通过目前的诊断方法检测到。被完全治愈的不具有癌细胞或恶性细胞的哺乳动物不能够产生本发明的疫苗接种效应，因为没有肿瘤特异性或肿瘤相关性抗原可被检测和被免疫系统攻击。然而，复发的风险是如此高以致于目前在常用的抗癌治疗后，甚至在成功的手术后将辐射应用于许多患者以预防复发。本方法的一个优势是治疗仅易感于癌症的人的副作用的减小以及本发明的治疗的全身性效应以便扩散细胞在未知其位于患者身体中的位置时也可被治疗。因此根据本发明的方法适合用于在最初的癌症治疗后具有不完全的癌细胞的清除的风险的患者。

将患有原发性癌和/或转移瘤的患者或经成功的癌症治疗后具有发生复发的风险或已发生了复发的患者利用免疫刺激物局部地或全身性地治疗并且另外地经历利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波的热疗治疗。按需施用利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波的热疗治疗，例如一天一次或两天一次或一周一次或按执业医师所安排地施用。利用使用电容耦合的射频波的热疗治疗在每次治疗期间通常花费一至几个小时。免疫刺激物同样按需施用。用于无创治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发的免疫刺激物可与使用电容器布置中的电容耦合的射频波平行地或连续地应用。因此，平行地意指免疫刺激物和使用电容器布置中的电容耦合的射频波在同一天(12小时内)被应用至患者，但也指其中免疫刺激物的施用和射频波的应用交替进行(12与48小时之间的间隔)的施用方案。连续的应用是指其中免疫刺激物在射频波之前或之后连续地施用但优选在热疗治疗之前施用的应用。

在本发明的优选实施方案中，首先施用使用电容器布置中的电容耦合的射频波，并在仅施用使用电容器布置中的电容耦合的射频波的该第一时期之后另外地施用免疫刺激物。例如在使用电容器布置中的电容耦合的射频波的第一施用之后48h，或更优选施用后72h，第一次施用免疫刺激物。此后，平行地施用免疫刺激物和射频波。因此，本发明涉及当与使用电容器布置中的电容耦合的射频波联合使用时用于无创治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发的免疫刺激物，其中在第一间隔中仅施用射频波并在随后的间隔中将免疫刺激物与射频波同时施用。在治疗期间免疫刺激物以及使用电容器布置中的电容耦合的射频波的施用可以是每天、每两天或每三天地重复的。完全治疗的持续时间取决于不同的参数例如患者的状况(对于预防复发是短的，但对于因相关突变而具有增加的风险的患者可以是较长的或反复的)、癌症的类型或原发性癌的大小。

癌症治疗中热疗的使用在现有技术水平中是公知的。然而，患者的适应性免疫系统以发生高度个性化的原位疫苗接种的方式的活化从未在现有技术水平的文献中被报道过。

因此，本发明的优选实施方案涉及患有癌症或已利用或未利用根据本发明的方法成功治疗了癌症的患者或具有增加的癌症风险的人的原位和体内疫苗接种方法。

此外，本发明还涉及由至少一种免疫刺激物和使用电容器布置中的电容耦合的射频波组成的疫苗，所述疫苗用于治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发。至少一种免疫刺激物和使用电容耦合的射频波的组合对于原发性癌及其转移瘤的治疗或对于癌症疾病的复发的预防是有用的。

因此，本发明还涉及使用至少一种免疫刺激物以实现针对患者中癌细胞的疫苗接种，其中所述至少一种免疫刺激物与应用电容器布置中的电容耦合的射频波组合施用。本发明还涉及使用至少一种免疫刺激物以实现针对患者中癌细胞的疫苗接种，其中所述至少一种免疫刺激物与应用电容器布置中的电容耦合的射频波组合使用。本发明还涉及用于或可用于实现针对患者中癌细胞的疫苗接种的至少一种免疫刺激物，其中所述至少一种免疫刺激物与应用电容器布置中的电容耦合的射频波组合使用。

因此，本发明涉及免疫刺激物用于制备用于治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防已成功治疗了癌症疾病的患者中的癌症疾病的复发的疫苗的用途，其中所述免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用至患者。该疫苗可特别地用于原位疫苗接种并且优选用于上述癌症类型。根据本发明的疫苗可特别地用于具有增加的发生癌症的风险的人的疫苗接种和/或用于患者的疫苗接种以预防已被成功治疗的癌症疾病的复发。

本发明的另一方面涉及消癌平用于制备用于治疗患有癌症的患者中的原发性癌及其转移瘤或用于预防已成功治疗了癌症疾病的患者中的癌症疾病的复发的疫苗的用途，其中免疫刺激物与使用电容器布置中的电容耦合的射频波结合施用至患者。

重要的是，在本文中公开的任何本发明的用途或方法内，射频波的应用和/或施用不包括有创性步骤。射频波从体外应用而无需将电极或天线布置插入或植入患者体内或血流中或组织中。此外，不使用辐射耦合并且优选不使用或涉及热的直接应用或产生(参见图1)。在本发明内使用的波长为10kHz至50MHz，更优选130kHz至42MHz，最优选为值135,6kHz±5％、339kHz±5％、678kHz±5％、1,356MHz±5％、3,39MHz±5％、6,78MHz±5％、13,56MHz±5％、27,12MHz±5％和40,68MHz±5％。

此外，本发明不应用如通过具有天线布置的辐射耦合进行的相控阵调整。射频波在电容器布置中在电极(即至少一个电极和至少一个对电极)之间形成，其中患者的身体是电介质物(dielectricum)(即电介质材料)。

此外，本发明涉及用于通过施用由至少一种免疫刺激物和使用电容耦合的射频波组成的疫苗进行患者的疫苗接种的方法。这样的疫苗接种使得患者的免疫系统能够识别迄今为止未被识别的癌细胞，并且还能够在患者的免疫系统中产生记忆以同样识别身体其它部位中的癌细胞(特别地在转移瘤形成期间)以及以同样识别在患者的成功的癌症治疗之后复发的新的癌细胞。该多学科方法能够导致原位和体内的个性化肿瘤疫苗接种并且使得免疫系统特别是适应性免疫系统能够在癌症疾病发生之前识别和清除癌细胞特别是单个癌细胞，和能够消除转移瘤以及能够识别和清除在成功的癌症治疗后复发的新的癌细胞。因此，本发明使得免疫系统能够识别先前未被识别的癌细胞和转移瘤并从而能够杀死癌细胞，最终导致成功的原发性癌及其转移瘤的治疗和恶性转移性疾病的复发的预防。

本发明的疫苗的作用模式可大概地如下文所概述的来解释。与单独的免疫刺激物相比而言，本发明的疫苗以特异性方式刺激免疫系统。固有免疫系统不攻击恶性病损，并且适应性免疫系统不能够识别肿瘤，因而也保持未激活的。这是为什么单纯的免疫刺激不能有效破坏发生的恶性疾病的原因。单独的使用电容器布置中的电容耦合的射频波(肿瘤热疗)当全身性应用时刺激免疫系统，因而面临与免疫刺激物相同的非特异性。局部应用的肿瘤热疗导致凋亡或局部效应，但难对付的恶性肿瘤强迫细胞散布并且转移性形成在该治疗的范围之外。本发明的由至少一种免疫刺激物和使用电容耦合的射频波组成的疫苗或组合攻击全身的恶性细胞。

因此，本发明的疫苗对于原发性癌及其转移瘤的治疗和对于具有弱的免疫系统或具有受抑制的免疫系统的患者中的癌症疾病的复发的预防也是非常有用的，因为本发明的疫苗触发免疫应答和激活免疫系统。

下面给出了目前的肿瘤免疫疗法(特别是抗肿瘤疫苗接种方法)发展前景的情况的总结。表1总结了显示现有的抗肿瘤疫苗接种发展前景的一些临床试验(M.Vergati,C.Intrivici,N.-Y.Huen,J.Schlom,K.Y.Tsang,Strategies for Cancer Vaccine Development；J.Biomed.Biotech.2010,Article ID 596432,doi:10.1155/2010/596432)。

表1：使用肿瘤-疫苗接种的临床研究(缩写：OS＝总生存期；RR＝应答率；PFS＝无进展生存期；BSC＝最佳支持医疗；DFS＝无病生存期)。

已开发了多种癌症疫苗接种例如由表1所列出的这些、非常复杂的离位方法或机器人DC培养。然而，上述癌症疫苗仅可在非常有限的条件下应用。现有技术的癌症疫苗的失败和低效力的主要原因是肿瘤细胞在一般情况下的低免疫原性活性。免疫系统不能够识别或鉴定肿瘤细胞，从而不能清除这些细胞。无特定的免疫鉴定过程(例如使用IL-2、IL-8、TNF的细胞因子疗法)的免疫刺激不能达到期望的效力。在这个背景下，根据本发明的癌症疫苗接种优于癌症疫苗接种中已知的现有技术水平。本发明涉及原位和体内疫苗接种并产生下列有益效应：

1.在本发明内应用的RF电场，更具体地经振幅调制(AM)的RR电场诱导免疫原性细胞死亡。

证据：

1.1具有凋亡小体形成的凋亡性细胞死亡(参见图14)

1.2免疫原性DAMP(损伤相关分子模式)/SAMP(应激相关分子模式)形成：

1.2.1HSP过表达和外化(参见图3、18、28和30)

1.2.2DR5(TRAIL)过表达(参见图17)

1.2.3HMGB1(高迁移率族蛋白盒)外化(参见图15)

1.2.4钙网蛋白外化(参见图16)

2.通过使用电容耦合的RF波诱导的免疫原性细胞死亡产生强烈的针对肿瘤的局部免疫反应。未隐藏的肿瘤抗原变得可被APC识别。由于RF波诱导的免疫原性细胞死亡，患者独特的TSA被树突细胞(DC)呈递给T细胞从而产生针对患者恶性疾病的特异性免疫反应。

证据：

2.1被破坏的肿瘤组织周围的白细胞侵入环

2.2在该环中T细胞的存在

3.与局部诱导的使用电容耦合的RF波组合的免疫刺激物例如细菌来源的免疫刺激物(类似例如毕西巴尼、Ancer、短小棒状杆菌、Coley-提取物、Leukine、其它的LPS-提取物等)的效应是全身性的。因此，远端的转移瘤被细胞毒性T细胞破坏，所述细胞毒性T细胞由TSA装载的DC激活。

证据：

3.1LPS研究，人伴随远隔效应，实验的伴随远隔作用(参见图4、5、6、29和40)

本发明的疫苗以及方法导致全身性效应(适应性免疫系统作用于全身)并且这是本发明疫苗的一个最重要的优势，即，使得局部的治疗成为全身性的。本发明的全身性作用疫苗发现隐藏的肿瘤抗原，所述抗原在使用电容耦合的射频波的应用下被呈递，并且所述疫苗在不引起强烈的人工发热的情况下治疗癌症。本发明的疫苗在不诱导人工发热和在没有对虚弱的患者的任何额外负担的情况下产生该免疫支持。

因此，本发明涉及当存在射频波并且使用电容器布置中的电容耦合时或在这样的条件下可用于治疗原发性癌及其转移瘤(甚至处于散布性细胞状态下的其不能通过现有技术水平的成像方法来检测)并且可用于预防癌症疾病的复发的免疫刺激物。在该条件下的免疫刺激物导致激活免疫系统(特别是适应性免疫系统)的全身性疫苗接种而不引起人工发热，其对于不能被现有技术水平的方法检测的转移瘤和原发性癌的治疗是尤其有用的并且对于已被成功治疗的癌症的复发的预防是尤其有用的。

此外，本发明涉及用于治疗原发性癌及其转移瘤(甚至处于散布性细胞状态下的，其不能通过现有技术水平的成像方法来检测)和可用于预防癌症疾病的复发的方法，所述方法通过给患者施用免疫刺激物和在免疫刺激物刺激患者的免疫系统时使患者经历使用电容耦合的射频波来进行。因此，当免疫刺激物在患者体内有活性时，应用使用电容耦合的射频波。

仅通过免疫刺激的方法不能实现这样的效应。按照本发明，可使用免疫刺激的下列施用途径：

1.免疫刺激物的全身性(皮下肌内)施用

2.免疫刺激物的局部(瘤内)施用(通过TLR途径、交叉呈递和二次产生的细胞因子刺激进行的直接局部免疫刺激)

3.瘤内注射

4.通过脂质体(电敏脂质体)进行的至肿瘤的靶向化合物递送

本发明的这些免疫刺激物可被直接注射至肿瘤病损中或全身性地应用(口服，血管内(i.v.)或肌内(i.m.)注射)。当全身性地应用时，可通过专门的肿瘤靶向方法(例如脂质体载体、磁靶向、纳米颗粒载体等)将它们定向至肿瘤病损。当免疫刺激物(例如细菌内毒素例如LPS或LPS样材料)通过TLR受体途径作用时，定向靶向强烈地增强交叉致敏。所述免疫刺激物与TSA一起结合至APC细胞(例如DC)，从而诱导更强和更持久的有效的免疫反应。在脂质体递送的情况下，可添加某些免疫佐剂(例如氧化铝(矾土)、沸石)。

本发明的方法的全身性效应产生强有力的针对肿瘤的免疫记忆，从而预防癌症疾病的复发。因此，本发明的疫苗具有类似预防法的效应。例如，结直肠癌或胰腺癌在>90％的情况下于肝中产生转移瘤。在这些病例中，可局部地治疗可能是转移瘤的位置，甚至在经手术去除了原发性肿瘤时也如此。即使不存在转移瘤的成像证据但转移瘤的形成或复发是可能的，也可应用本发明的疫苗。这在原发性肿瘤治疗的大多数病例中是重要的，甚至在完全的缓解后也如此。临床反应的完全缓解不意味着完全的治愈，仅意指目前的成像系统不能在该特定位置和特定时间看到恶性疾病。

本发明人发现使用电容耦合的射频波可用作物理刺激物，更准确地说可通过诱导针对癌细胞的特异性防御性免疫应答用于治疗原发性癌及其转移瘤以及用于预防癌症疾病的复发。特别地，使用电容耦合的射频波可用作疫苗接种以清除通常不被免疫系统识别的癌细胞。

现有技术方法与本发明内使用的使用电容耦合的RF波之间的最重要的差异总结于下文中：

RFA法(现有技术水平)：

－使用短波长和高频的交流电[130MHz－2400MHz]；

－是有创性方法(针的瘤内插入)；

－仅局部治疗是可能的；

－烧坏病损/烧伤肿瘤；

－只有热引起治疗性效应；

－引起剧烈的坏死；

－使用针形的“天线”；

－使用辐射耦合；

－需要用于调谐目的的相控阵调整；

－在患者体内通过超声或成像方法例如X射线屏检查、CT扫描来引导所述针；

－仅可用于实体瘤。

由WO 2011/078686描述的血管内脉冲射频刺激的特征在于：

－其是有创性方法(血管内引入了针样电极)；

－其是通过刺激和诱集淋巴细胞来导致免疫系统的增强的非特异性血液治疗方法；

－其导致直接的加热；

－其使用1MHz的最高射频；

－其导致宏观区域的加热；

－其不导致凋亡性细胞死亡的诱导。

本发明人发现使用电容耦合和电容器布置的RF波(WO2009/092612,WO 2010/0437372)具有下列的优势，这使得它们适合用于根据本发明的有效的疫苗接种方法：

－使用优选10kHz至50MHz范围内的优选13.56MHz但不超过50MHz的RF波；更优选10kHz至45MHz，和最优选13.56MHz或通过乘以或除以整数优选除以40所获得的任何值。因此，下列频率是最优选的：13.56MHz或该13.56MHz的值的1/100、1/40、1/20、1/10、1/2倍、2倍或3倍(即6.78MHz、27.12MHz或40.68MHz)等。

－其不是有创性方法；

－其使得全身性治疗成为可能；

－其使用热，所述热与免疫刺激物和患者本身的激活的免疫系统结合而成功地抵抗癌细胞，并因此利用热与患者免疫系统的协同效应；

－其不导致(非期望的)副作用；

－其可与常用的癌症疗法例如化疗和放疗结合使用；

－其诱导肿瘤细胞凋亡；

－其不导致肿瘤细胞坏死；

－其使用电容器布置，其中电极之间的患者的身体是电介质材料并且是传导性电路的部分；

－其使用电容耦合；

－其不需要超声或任何成像方法的支持；

－其可特别地用于破坏单个癌细胞和从而以在刚刚开始的阶段治疗处在其非常初始状态下的癌症和同样地以在刚刚开始的阶段治疗处在其非常初始状态下的癌症疾病的复发；

－其诱导免疫系统中识别癌细胞的能力。更具体地，其触发适应性免疫系统以识别癌细胞，从而在适应性免疫系统中建立长期记忆以识别癌细胞，从而提供针对癌细胞的疫苗接种。这可能是与所有已知的癌症治疗方法最重要的不同。

因此，本发明的疫苗接种方法可特别地用于“隐藏的”肿瘤细胞的清除，其是本领域中具有此出人意料的有益效应的第一个疫苗接种方法。如本领域技术人员所知的，“隐藏的”肿瘤细胞显示最具有攻击性的行为，因为免疫系统将其识别为自身的或根本不识别其。可区分三类隐藏的肿瘤细胞：

－第一类且是最不利的一类包含“休眠肿瘤细胞”，其在被研究的时候不显示恶性特征，其是化疗抗性的，但并不耐热。这些细胞主要在肿瘤块中，因而它们不受远处加热的影响。因此，由于与大体积的循环血液密集的热交换，在热力学意义上具有短距离效应的PRF血管内刺激对于“休眠肿瘤细胞”不具有任何效应。然而，这些细胞被根据本发明的疫苗接种方法靶向。

－隐藏细胞的第二类是散布性细胞，其在血液中循环。由于其低浓度，它们在血液中的存在在目前是不可能被检测到的。

－隐藏细胞的第三类是微转移瘤。微转移瘤是恶性发育的最危险且不可见的部分。目前使用的成像系统(PET、MRI、CT、SPECT、超声等)的分辨率仅允许在微转移瘤形成由几百万的细胞组成的聚集体之后检测其，因为它们的分辨率在毫米(mm)的范围内。据我们所知，没有现有技术方法影响微转移瘤。然而，根据本发明的疫苗接种方法提供针对这些癌细胞的有益效应。

此外，本发明涉及免疫刺激物，其用于治疗转移瘤，甚至在目前的成像方法不能够检测这些转移瘤时的情况下的转移瘤；或用于预防癌症疾病的复发，其中所述免疫刺激物与使用电容耦合的射频波联合应用。可通过使用至少两个电极(其在其全表面上优选是等电位的)的电容器布置中的射频(RF)波的任何常规的RF热疗装置，使用优选13.56MHz的RF电流来产生射频波(参见WO 2009/092612或WO2010/0437372)。至少一个RF电极和至少一个对电极是电磁能量转移工具，其是用于将能量导向至目标的电容器的部分。用于本发明的RF热疗装置使用电容耦合、交流电(AC)和射频(RF)。

RF热疗装置所使用的射频(RF)是低频的并且不超过50MHz。相反，辐射热疗装置必须使用至少100MHz的高频率，否则精确的聚焦是不可能的。通常，必须将天线(辐射的)优化至50Ohm(这是公认的标准)。该功能是由调谐器来进行的。在本发明中，优选6.78MHz、13.56MHz、27.12MHz或40.68MHz或它们之间的任何值的低频率是优选的。相反，常用的辐射热疗使用短波长和70-2400MHz范围内的高频率。

射频(RF)热疗装置本身包含至少射频源、放大器、传感器、任选的反馈放大器和任选地调制信号发生器。适当的RF热疗装置是例如美国申请13/123,838或美国申请12/863,418中公开的那些。如下文中概述的，在本发明内使用的RF热疗装置与现有技术水平的热疗装置是相当不同的。

现有技术水平的热疗装置描述于US 2004/0230263A1中。其与本发明中应用的RF热疗装置在下列特征上不同：

－在US 2004/0230263A1的装置中使用了偶极天线(辐射耦合)。通过使用经吸收的RF辐射来将辐射的RF应用穿过患者或更准确地说穿过靶组织。

－在辐射解决方案中，靶独立于电路，仅通过驻波比(SWR)形成反馈，所述驻波比测量与经转发相比经反射的功率。应用于本发明的RF热疗装置不使用偶极天线；使用了电容器布置，其中电极之间的患者的身体是电介质材料，其是传导性电路的部分。这使得能够直接控制作为电路的部分的靶，并且产生用于控制该过程的更精密和准确的反馈。应用于本发明的RF热疗装置使用电容器电极(电容耦合)用于RF波穿过各自身体横截面的应用。

－常规的热疗装置引发天线之间的相移干涉和其驻波辐射的干涉以将焦点调谐在期望的区域上。本发明中使用的装置利用各自组织的电导率差异(例如恶性肿瘤组织具有比健康组织更高的电导率)，从而导致焦点至恶性肿瘤组织的自动选择。这对于可扩张器官例如肺或心脏具有直接的效果，或者如果患者在可能超过一小时的治疗期间移动的话也如此。

－此外，虽然常规装置中的焦点独立于肿瘤的实际位置而保持在其之前聚焦的点之处，但本发明使用的装置跟随靶的任何移动，因为RF电流自动地在正确方向上流动。

－在常规的热疗装置中，靶被作为吸收辐射能量的电独立对象进行治疗，从而导致烧伤和剧烈的坏死。本发明将靶用作电路的部分，作为谐振电路中的电容器的电介质材料。因此，以不同方式进行和控制加热过程。常规的热疗装置使用SAR(特定吸收率)吸收的能量作为用于实现有益效应的唯一加热机制，从而通过加热肿瘤，肿瘤细胞被烧坏。本发明通过将电流转化为热以及用于电场效应的电位差来使用焦耳热(Q＝I²R)，从而在癌细胞中导致凋亡和因此触发免疫系统产生免疫应答。因此，患者本身的免疫系统开始抵抗经识别的单个癌细胞，其中所述抵抗受到所施用的免疫刺激物的支持，因而成为有效的癌症疗法，所述疗法因治疗是全身性的而非局部(如现有技术水平中的)的事实而可特别用于癌症发育的最开始的初始期(initial stadium)(其不可通过任何已知的诊断方法来检测)和用于治疗转移瘤。

－常规的热疗装置仅将温度作为用于再现和标准化疗法的工具进行控制。相比之下，本发明中应用的装置将吸收能(J/kg)和患者的电导率(S＝1/R)用于治疗条件的严格控制。常规的热疗装置隐含地假定疗法的成功仅取决于相对于所实现的温度的热效应。通过这样的方法，在靶组织中主要产生坏死。然而，本发明中使用的装置不需要实现发生坏死的这样高的温度，因为场效应在较低温度下引起凋亡。因此，本发明中应用的RF热疗装置通过诱导和/或引起凋亡和通过使免疫系统能够识别癌细胞和起始针对其的抵抗而治疗肿瘤性或恶性组织、癌症、肿瘤和特别是转移瘤和单个癌细胞，而常用的使用辐射耦合的装置诱导坏死并且不能够治疗在癌症发育的初始状态或癌症复发的初始状态中的转移瘤和单个癌细胞。本发明中应用的RF热疗装置不使用辐射耦合并且使用电容耦合，其中患者是作为电路的部分的电介质材料或电介质物。

所述差异可如下总结：

1.RFA装置使用RF辐射/吸收；

2.本发明的疫苗接种使用RF电流传导；

3.RFA装置使用针作为用于辐射耦合的天线；

4.本发明的疫苗接种使用电极用于电容耦合；

5.RFA装置需要高频率(高于130MHz)；

6.本发明的疫苗接种需要低于50MHz优选6.78MHz、13.56MHz、27.12MHz或40.68MHz和最优选13.56MHz的频率；

7.RFA装置引起坏死(不可能引起疫苗接种)；

8.本发明的疫苗接种引起癌细胞的凋亡和识别从而导致疫苗接种；

9.RFA装置是有创性地和局部地使用的；

10.本发明的疫苗接种是无创性地和全身性地使用的；

11.RFA装置仅用于治疗实体瘤；

12.本发明的疫苗接种可特别地用于治疗单独的和广泛分布的癌细胞，例如转移瘤和癌症发育的初始期。

在现有技术水平，常用的免疫治疗性疫苗接种方法仅可在非常有限的条件下应用。其形式在当代面临着多种需求。其必须是：

·有效的

·个性化的(特异性的)

·可应用于所有的肿瘤病损

·适合用于阻断复发和转移

·应用简单

·不太昂贵

现有技术水平的肿瘤疫苗接种方法不满足这些标准。所应用的疗法仅在某些特定领域中有效而不是一般性有效的。失败和低效力的主要原因在于肿瘤细胞在一般情况下的低免疫原性活性。免疫系统不识别肿瘤细胞，从而没有活化以清除这些肿瘤细胞。无特定的免疫鉴定过程(例如使用IL-2、IL-8、TNF等的细胞因子疗法)的免疫刺激远不能达到期望的效力。大多数疗法是离位进行的，其从患者获取免疫潜能细胞，离位操作所述细胞并将所述离位操作的细胞或人工制造的疫苗放回至患者。离位疗法非常复杂、非常昂贵且冗长但大多数时候却不够有效：离位操作的细胞的“外来性”和低浓度以及所述细胞的缺失进一步再现性(持续该过程)限制了完全的作用性。

本发明的方法(或也称作疫苗接种方法)应用通过电容耦合而非通过偶极天线产生的射频场，并且该射频场或其射频波使得被治疗的患者的免疫系统能够识别到目前为止未被患者的免疫系统识别的癌细胞。假定通过电容耦合产生的射频场或分别地该射频场的射频波导致癌细胞中的应激，所述应激导致这样的效应：所述癌细胞不能继续隐藏其表面识别序列或结构和/或被通过射频波在癌细胞中产生的热破坏和/或被射频场及其射频波迫使经历凋亡，从而使得患者的免疫系统能够识别不再被隐藏的表面结构或被破坏的或凋亡的癌细胞的降解产物。在射频场/射频波之外施用的免疫刺激物进一步支持免疫系统以有效地攻击和破坏癌细胞。此外，产生了免疫系统的记忆从而使得免疫系统能够识别身体其它部位中的癌细胞和特别是单个癌细胞。因此，本发明涉及方法或疫苗接种方法，其还可直接地杀死癌细胞，但首先使得患者自身的免疫系统能够先识别癌细胞和随后有效地杀死癌细胞。因此，本发明的方法或疫苗接种方法支持免疫系统以抵抗癌细胞和从而癌症疾病，因而其可被视为治疗癌症特别是原发性癌、单个癌细胞和转移瘤以及预防癌症疾病的复发的间接方法。

本发明提供通过支持患者自身的免疫系统以识别隐藏的癌细胞和杀死经识别的癌细胞而用于原发性癌以及用于治疗转移瘤并且还用于预防癌症疾病的复发(特别是在成功治疗了癌症疾病之后)的免疫刺激物、疫苗和疫苗接种方法。本发明的疫苗接种方法是非常敏感的并且使得免疫系统能够在癌细胞可被现有技术水平的任何分析方法检测之前识别所述癌细胞。此外，因为本文中公开的疫苗接种方法的非常低的毒性和非常低的副作用，故所述方法可在癌症疾病的治疗之后使用以预防所述癌症疾病的复发。

在本文的命名法中，“体内”意指适当的抗原形成是在患者体内进行的，以便不牵涉有创性过程。因此，本发明的疫苗接种方法还可被称作体内疫苗接种方法。命名法“原位”意指免疫即特定TSA的识别实际上是在肿瘤中进行的。因此，本发明的疫苗接种方法还可被称作原位疫苗接种方法或原位和体内疫苗接种方法。

如本文中所用，术语“个性化”是指利用患者自身的TSA(肿瘤特异性抗原)来进行免疫的事实。如上所述，大多数肿瘤疫苗接种使用人工抗原，其在许多情况下不与患者自身的肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关性抗原(TAA)相同。在大多数情况下，主要的挑战是将一般性(非个性化的)蛋白或蛋白-混合剂用于免疫效应，其对于某些患者和某些类型的癌症可以是有效的，但对于所有的却远非如此。这些情况使得治疗不可控制且不可预测。按照本发明，疫苗接种使用患者恶性细胞自身的独特的而非人工的蛋白分子模式。本发明的疫苗接种产生患者自身的、非常个体化的和无双的TSA“混合剂”以用于实际的和准确的免疫鉴定。在现有技术水平中这样的个性化、简单且廉价的肿瘤疫苗接种是不存在的。现有的方法太精细、高度复杂、非常昂贵且很少有效。例如，TSA可获自经手术取出的样本。在其利用树突细胞(DC)的体外识别过程之后和在特别的免疫活化之后，“疫苗”被直接地注射至肿瘤中或全身施用至患者。本发明的疫苗接种诱导特异性的高度免疫原性的细胞死亡。本发明的疫苗接种方法还可被称作个性化的原位疫苗接种方法或个性化的体内疫苗接种方法或个性化的原位和体内疫苗接种方法。

术语“凋亡诱导”：本发明的疫苗可诱导特殊的具有凋亡小体形成的免疫原性细胞凋亡。凋亡小体(装载有肿瘤细胞组分，包括患者自身的TSA)可被适当的APC(抗原呈递细胞，DC)容易地吞噬。过去的研究结果显示应激诱导的凋亡具有较大的免疫刺激效应。在该过程中产生的凋亡小体包含大量的HSP以及特定的TSA。它们被APC的吞噬诱导强烈的和特异性的免疫反应。

术语“DAMP/SAMP”：本发明的疫苗可在肿瘤细胞中诱导独特的分子变化例如损伤相关分子模式(DAMP)和应激相关分子模式(SAMP)，其在一方面可以是免疫刺激性的并且在另一方面可促进肿瘤细胞的免疫识别。尽管曾认为当被快速吞噬时凋亡细胞经历不触发免疫应答的静息性死亡，但近年来已出现了免疫原性细胞死亡(ICD)的新概念。ICD的免疫原性特征主要通过损伤相关分子模式(DAMP)来介导，所述DAMP包括表面暴露的钙网蛋白(CRT)、分泌的ATP和释放的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。

术语“HSP过表达”：HSP伴侣蛋白在肿瘤免疫学过程中具有重要的和主要的作用。细胞溶质的HSP例如Hsp70和Hsp90以及ER的HSP例如gp96结合在细胞内产生的抗原性肽。这些抗原性肽被HSP转运至存在于细胞表面上的I类MHC分子以呈递至淋巴细胞。此外，受到HSP伴侣的肽被细胞外释放并且这些HSP-肽复合物通过受体介导的胞吞作用被APC即巨噬细胞和树突细胞吸收。因此HSP促进APC的抗原识别。术语“HSP过表达”和“HSP外化”是指：通过免疫刺激物与使用电容耦合的射频波联合的应用，若干HSP蛋白在恶性细胞中以增加的速率(高于未处理细胞的速率)表达并且进一步更多的HSP在细胞表面上出现或被这些细胞分泌。

术语“TRAIL(DR5)过表达”是指编码TRAIL的基因的增加的表达：根据许多出版物，该分子在抗肿瘤免疫反应中具有关键性作用。通过本发明的疫苗产生的肿瘤变形(tumor distortion)引起这样的DAMP和SAMP，其通过释放患者自身的肿瘤特异性抗原(TSA)导致较大的肿瘤特异性免疫反应。以这种方式，疫苗接种是原位的并且其成功不需要人工操作。本发明的疫苗接种满足了所有上文列出的疫苗接种的需求，当与其它免疫刺激性方法一起应用时尤其如此。本发明的疫苗接种全身性地(伴随远隔或旁观者效应)影响并且治疗对于散布性恶性细胞以及对于远端形成的转移瘤也是具有活性的，当与其它免疫刺激性方法一起应用时尤其如此。诱导的免疫反应还形成适当的免疫记忆，其阻断疾病即癌症疾病的复发。

本发明的疫苗的优势总结为如下：

·免疫原性凋亡小体形成

·TSA-HSP交叉致敏

·APC介导的有效的抗原识别

·APC细胞活化和成熟

·APC介导的特异性细胞毒性T细胞活化

·远离经治疗的肿瘤的远端转移瘤的破坏

·预防肿瘤再现和癌症复发的特异性免疫记忆的发生

本发明的疫苗接种实现了常用的癌症治疗策略不可获得的效应。本发明的疫苗的一个作用模式可大概地如下解释：通过本发明的疫苗接种产生的凋亡小体中的TSA变得可被APC获得。由于TSA的鉴定和辅助性HSP的富集(通过使用本发明疫苗的治疗的强应激来实现)，APC诱导显著的免疫反应，包括

1.CTL系统的活化以获得患者特定的TSA信息。该免疫反应允许发现和破坏远端转移瘤中的或散布形式的恶性细胞。

2.导致恶性疾病的随后复发的阻断的有效免疫记忆的产生。

免疫刺激物良好地促进整个过程，其将局部效应转化至全身性效应。伴随远隔(旁观者)效应可被定向和控制。

通过本发明，可实现下列原发性癌症类型的治疗，可治疗下列癌症类型的转移瘤，还可预防下列癌症类型的复发：腺癌、脉络膜黑素瘤、急性白血病、听神经瘤、壶腹癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胰腺瘤、硬纤维瘤、膀胱癌、支气管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳癌、伯基特淋巴瘤、子宫体癌、CUP-综合征(原发灶不明的癌)、结直肠瘤、小肠癌、小肠肿瘤、卵巢瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌症类型、Ewing瘤、胃肠肿瘤、胃癌、胆囊瘤、胆囊癌、子宫癌、宫颈瘤、宫颈、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、耳、鼻和咽喉肿瘤、血液瘤、多毛细胞白血病、尿道癌、皮肤癌、皮肤睾丸癌、脑瘤(神经胶质瘤)、脑转移瘤、睾丸癌、脑下垂体瘤、类癌、卡波西氏肉瘤、喉癌、生殖细胞瘤、骨癌、结直肠癌、头颈部肿瘤(耳、鼻和咽喉区域的肿瘤)、结肠癌、颅咽管瘤、口癌(口腔区域中和唇上的癌)、中枢神经系统的癌症、肝癌、肝转移瘤、白血病、睑瘤、肺癌、淋巴结癌(霍奇金氏/非霍奇金氏)、淋巴瘤、胃肿瘤、恶性黑色素瘤、恶性瘤、胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、直肠瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、霍奇金氏病、蕈样真菌病、鼻癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、肾癌、肾细胞癌、非霍奇金氏淋巴瘤、少突神经胶质瘤、食管癌、溶骨癌和成骨癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、浆细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、前列腺癌、咽癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、阴道癌、甲状腺癌、Schneeberger病、食道癌、spinalioms、T细胞淋巴瘤(蕈样真菌病)、胸腺瘤、管癌、眼肿瘤、尿道肿瘤、泌尿系统肿瘤、膀胱上皮癌、外阴癌、疣形、软组织肿瘤、软组织肉瘤、Wilm瘤、宫颈癌和舌癌。特别适合用于治疗的为例如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、支气管癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、喉癌、恶性黑色素瘤、食道癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌和肾细胞癌。

换句话说，本文中公开的疫苗接种方法使得和支持患者的免疫系统能够抵抗上述癌症类型或杀死上述癌症类型的癌细胞。

此外，本发明的疫苗不具有且不引起任何严重的副作用，以便本发明的疫苗接种适合于与常用的癌症疗法例如使用一种或多种下述化疗剂的化疗进行组合：放线菌素D、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、嘌呤和嘧啶碱基的拮抗剂、蒽环霉素(anthracycline)、芳香酶抑制剂、天冬胺酰酶、抗雌激素药、贝沙罗丁、博来霉素、布舍瑞林(buselerin)、白消安、喜树碱衍生物、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinarabinoside)、烷化细胞抑制剂、达卡巴嗪(dacarbacin)、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星(亚德里亚霉素)、多柔比星脂(doxorubicin lipo)、表柔比星、雌氮芥、依托泊苷、依西美坦、氟达拉滨、氟尿嘧啶、叶酸拮抗剂、福美坦、吉西他滨、糖皮质激素、goselerin、激素拮抗剂、和美新、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、来曲唑、亮丙瑞林、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米替福新、丝裂霉素、有丝分裂抑制剂、米托蒽醌、尼莫司汀、奥沙利铂、紫杉醇、喷司他丁、丙卡巴肼(procarbacin)、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、塞替派、硫鸟嘌呤、拓扑异构酶抑制剂、托泊替康、曲奥舒凡、维甲酸、曲普瑞林、曲磷胺、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、具有细胞毒性活性的抗生素。

缩写：

APC:抗原呈递细胞

CTL:细胞毒性T淋巴细胞

DAMP:损伤相关分子模式

DC:树突细胞

DR5(TRAIL):死亡受体(TNF相关的凋亡诱导配体)

GM-CSF:粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

HMGB1:高迁移率族蛋白盒

HSP:热激蛋白

IHCH:免疫组织化学分析

IL:白细胞介素

LPS:脂多糖

NK:天然杀伤细胞

OTM:肿瘤热疗法(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)

SAMP:应激相关分子模式

TAA:肿瘤相关抗原

TLR:toll样受体

TNF:肿瘤坏死因子

TSA:肿瘤特异性抗原

附图描述

图1显示RFA法如何工作：将天线针插入实体瘤中，通过施加的局部RF电流产生热，其烧坏肿瘤并导致剧烈的坏死。RFA是有创性方法，其通过使用辐射耦合的天线布置利用RF电流来产生热和从而导致消融。

图2显示被切开的肿瘤的载玻片上的HE染色。可看见清晰的侵入环出现(箭头处)在肿瘤周围。因此，按照本发明的治疗后出现了强的免疫反应。

图3显示按照本发明进行治疗的肿瘤中不同的HSP(图3A:HSPA1A,图3B:HSPA6,图3C:HSPA8,图3D:HSPD)的过表达。在mRNA水平上测量HSP产生(B对应于经治疗的肿瘤中的HSP产生[黑色]，A对应于未经治疗的肿瘤中的HSP产生[灰色]，CTRL是未处理的对照)。灰色线对应于未改变的水平。

图4证明本发明的疫苗在小鼠中提供全身性效应。LPS(来自大肠杆菌(E.coli)的脂多糖，100μl Salsol溶液中的100μg LPS)的全身性施用还导致未经治疗的远端肿瘤的大块细胞杀死效应。

图5显示用于实验的小鼠模型：在雌性裸鼠BALB/c(nu/nu)上，通过在大腿区在两侧施用适合于诱导肿瘤生长的0.1mL无血清培养基中的6x 10⁶个细胞来诱导两个对称的远端肿瘤。仅使用对称地发生大致相同大小的肿瘤的小鼠。仅治疗右侧的肿瘤。

图6显示本发明当用于人治疗时的全身性效应。患者被诊断患有非小细胞肺癌并呈现远离原发性癌的位置定位的多种转移瘤：在颈中，在腰区中，在腋窝中等。虽然只对原发性肿瘤采用使用电容耦合的射频(单次发射，30分钟,42℃)进行了治疗，但是GM-GSF()与使用电容耦合的射频的联合施用导致同样对远端转移瘤(其消失了)具有有益效应的全身性效应。

图7显示裸鼠中在经治疗的和远处的肿瘤中半胱天冬酶-3活性的增强。半胱天冬酶-3活性是凋亡信号途径的重要标志物，其在裸鼠中的经治疗的和远处未经治疗的肿瘤中都增强了，显示本发明的疫苗接种的全身性效应。

图8显示裸鼠异种移植物(人结直肠HT29)、单次发射、30分钟、42℃的时间序列。每个点代表3个具有双肿瘤的动物。在治疗后的时间处(在X轴上指出的)进行动物的处死。观察到，凋亡在24小时后开始(插入图显示在开始的8小时中没有效应)且经治疗的与远处未经治疗的肿瘤死亡之间的差异降低，作用远离于局部治疗开始。

图9显示：

A.用于治疗动物(小鼠)的实验设置；

B.具有温度测量传感器探针的治疗施用器系统。一个对电极是磨光的并位于动物下方，第二个电极是动物上方的圆形施用器，其可移动至治疗区。

图10概括了样本评价过程。A.肿瘤切开的方法；B.肿瘤样本的分析方案，包括巨大量的mRNA转录物、35种凋亡相关蛋白、许多形态学因子以及所有的DAMP相关蛋白排列的分析。

图11显示典型的一组对测量分子进行的时间过程研究。

图12显示作为凋亡的证据的TUNEL测定的结果。蓝色是标准的DAPI染色(细胞核)，绿色是TUNEL FITC。

图13显示时间过程研究如何良好地验证凋亡过程，其与时间尺度作用完全对应。

图14显示在肿瘤热疗治疗后凋亡小体是如何被诱导的。与未经治疗的细胞相比，在经治疗的细胞中可观察到巨大量的凋亡小体。

图15显示在肿瘤热疗治疗后HMGB1呈递和至细胞外基质的释放。

图16显示钙网蛋白表达(治疗后4小时)。钙网蛋白在利用肿瘤热疗(使用电容耦合的射频波)进行治疗的细胞的细胞膜上表达，从而为DAMP创造最适条件。

图17显示通过测量蛋白水平和免疫荧光检测得到的TRAIL-R2的表达：

A.在肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗后8h，在凋亡蛋白阵列中测量的HT29异种移植肿瘤样本中TRAIL-R2的上调。双点印迹代表重复的抗体检测，虚线显示未经治疗的对照中的相对TRAIL-R2表达。

B.相较于对侧的腿的未经治疗的肿瘤(下排)，治疗后8h(上排)肿瘤细胞膜中TRAIL-R2蛋白(Alexa564，红色荧光)的强表达。矩形中的区域以较高倍的放大在插图中突出显示(中间栏)。在左栏中，线围绕其中信号强度超过标准阳性阈值(掩盖面积)(利用HistoQuant软件测量的)的区域(右栏)。相对掩盖面积(rMA)通过将MA的平均值除以全面积的平均值来计算。棒在左栏表示50μm，在中栏表示15μm，在右栏表示10μm。C.图显示相较于未经治疗的肿瘤(灰色柱)，在治疗后8h和14h经治疗的肿瘤(黑色柱)中TRAIL-R2蛋白表达的显著增加的rMA值(**p<0.01)。

图18显示HSP70的免疫荧光检测

A)在利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波进行治疗后14h，HSP70的表达；

B)在利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波进行治疗后72h，HSP70至细胞外基质的释放。

图19显示在DAMP形成期间的HSP70动力学。总结了HSP70的完整的时间关系曲线图，可观察到两个独立的发展过程：

－第一个发展过程在从利用使用电容耦合的射频波的治疗的48h后结束，其与直接的HSP70热诱导相关；

－第二个发展过程随后开始，其促成作为DAMP的部分的免疫原性细胞死亡。

图20在利用使用电容耦合的射频波的治疗后4小时，分析了具有6500个基因及其47000个转录物的人基因组基因芯片。

图21显示Proteome Profiler^TM人凋亡阵列试剂盒分析的方案：A.在阵列芯片上测量的样本；B.在阵列上检查的蛋白；C.用于蛋白表达水平分析的定量方法。

图22显示利用射频波的治疗对参与死亡诱导途径的蛋白的表达的作用。这些结果构成了细胞膜相关凋亡途径的实现的其它证据。

图23概括了在利用使用电容耦合的射频波对HT29细胞进行单次发射治疗(30分钟,42℃)后按经过时间(h)的观察。鉴定了通过治疗诱导的最重要的蛋白。如所显示的，凋亡在治疗后48小时之后结束，在过渡区之后，观察到免疫反应。

图24显示实验的测量设置和温度模式。

图25显示样本评价的实例。

图26显示由本发明提供的典型的伴随远隔效应的证据。

A.研究组中肿瘤的平均相对死亡面积。

B.研究组中肿瘤的经治疗的/未经治疗的相对死亡面积比。

因此，消癌平和使用电容耦合的射频波的组合施用(Xi-OTM)对两个肿瘤都具有有益效应，而仅一个肿瘤利用使用电容耦合的射频波(肿瘤热疗-OTM)进行了治疗。利用使用电容耦合的射频波的治疗(肿瘤热疗-OTM治疗)仅对经治疗的肿瘤有效。利用消癌平(Xi)的治疗相较于对照(CTRL)不具有效果。

图27显示来自仅用OTM治疗的组的HE染色的肿瘤样本。

图28显示来自仅用肿瘤热疗治疗的组的肿瘤样本中的HSP70(红色)的IHCH检测。(细胞核：蓝色)

图29显示来自用OTM+Xi治疗的组的HE染色的肿瘤样本。

图30显示来自用OTM+Xi治疗的组的肿瘤样本中的HSP70(红色)的IHCH检测。(细胞核：蓝色)

图31显示来自仅用肿瘤热疗治疗的组的肿瘤样本中CD3+T细胞(红色)的IHCH检测以及TUNEL反应(绿色)。(细胞核：蓝色)(核与TUNEL反应的共定位意味着程序性细胞死亡)

图32显示通过利用使用电容耦合的射频波的治疗(肿瘤热疗治疗)诱导的核与核酸断裂(TUNEL)的共定位，作为程序性细胞死亡的证据。蓝色是标准的DAPI染色(细胞核)，绿色是TUNEL FITC。

图33显示通过利用使用电容耦合的射频波的治疗(肿瘤热疗治疗)诱导的核与核酸断裂(TUNEL)的共定位，作为程序性细胞死亡的证据。蓝色是标准的DAPI染色(细胞核)，绿色是TUNEL FITC。

图34显示来自仅用OTM+Xi治疗的组的肿瘤样本中CD3+T细胞(红色)的IHCH检测以及TUNEL反应(绿色)。(细胞核：蓝色)(核与TUNEL反应的共定位意味着程序性细胞死亡)

图35显示通过利用使用电容耦合的射频波的治疗(肿瘤热疗治疗)诱导的核与核酸断裂(TUNEL)的共定位，作为程序性细胞死亡的证据。蓝色是标准的DAPI染色(细胞核)，绿色是TUNEL FITC。

图36显示通过利用使用电容耦合的射频波的治疗(肿瘤热疗治疗)诱导的核与核酸断裂(TUNEL)的共定位，作为程序性细胞死亡的证据。蓝色是标准的DAPI染色(细胞核)，绿色是TUNEL FITC。

图37显示通过将根据本发明的疫苗接种应用至非小细胞肺癌患者(男性，72岁)所获得的结果。通过经振幅调制的使用电容耦合的射频波治疗局部肿瘤，并且平行地应用作为免疫刺激剂。原发性肿瘤开始缩小，而转移瘤消失了。

图38显示从福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样本产生组织多块(multiblock)的方法：获取每个样本的选自受损的和完整的肿瘤边界(1和2)和选自受损的肿瘤中心(3)的2mm直径核心(core)。

图39显示使用定量数字显微镜检查分析来计算TDR和TDE的方法的方案：利用软件测量受损的肿瘤面积(标记为D，以红色圈出；内圈)和全肿瘤面积(标记为W，以蓝色圈出；外圈)。在经治疗的(t)和未经治疗的(u)肿瘤中，通过将D除以W值来计算肿瘤破坏比(TDR)。肿瘤破坏效率(TDE)是经治疗的和未经治疗的肿瘤的TDR值之间的相互关系。

图40显示A.在单次发射治疗后24h，肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗诱导的肿瘤破坏的定性组织形态学表现；B.肿瘤破坏比(TDR)的定量分析的结果：图显示经治疗的(黑色框)肿瘤中比未经治疗的(灰色框)肿瘤中显著更高的TDR值(*p<0.05)；C.肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗相关的肿瘤细胞破坏(TDE)的定量分析的结果：图显示在72h，TDE值的治疗相关的增加上升至7倍的差异。

图41是在治疗后48H全肿瘤横截面中TUNEL阳性的定性观察。注意到在肿瘤的中心受损区具有高的TUNEL阳性。

图42是在治疗后24h和48h全肿瘤横截面中TUNEL阳性和凋亡小体形成的定性观察(48h处)和定量测量。

A.在治疗后48h，相较于未经治疗的肿瘤(下排)，肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗的肿瘤(上排)中由TUNEL测定显示的DNA断裂(剪出图的上图中的绿色荧光)、核皱缩和凋亡小体(H&E染色；剪出图的最下图中的箭头)的显著增加。剪出图显示矩形内区域在较高倍放大下的单通道视图。TUNEL和DAPI(蓝色；中间图)双阳性证明标记为1-3的相同细胞中的核DNA染色。未经治疗的肿瘤细胞(例如标记为1-2的细胞)仅显示基本的绿色荧光。棒在左栏中表示50μm，在右栏中表示15μm。

B.显示在治疗后24h和48h(黑色柱)处TUNEL阳性细胞的显著增加的平均数的图；

C.显示相较于未经治疗的对照(灰色柱)，在治疗后48h和72h(黑色柱)凋亡小体的显著增加的平均数的图(*p<0.05,**p<0.01)。

图43显示在治疗后14h和24h，HMGB1的免疫荧光检测。在肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗的肿瘤中可清楚地看见HMGB1被释放至细胞外基质。

图44显示

A.治疗后72h，HE染色的全肿瘤横截面。箭头指示侵入环的形成。

B.治疗后168h，HE染色的全肿瘤横截面。箭头指示界限清楚的侵入环。

图45显示

A.来自TMA多块的髓过氧化物酶(MPO)的IHCH检测。MPO是嗜中性粒细胞(粒细胞)的标志物。受损肿瘤区域周围在72h出现且在168h变得非常特征性的白细胞侵入环包含大量的MPO阳性细胞(嗜中性粒细胞)。

B.来自TMA多块样本的MPO+细胞的半定量分析。肿瘤热疗治疗的肿瘤样本比未经治疗的和对照肿瘤样本包含远远更多的MPO+细胞(嗜中性粒细胞)的数量。

C.来自TMA多块的CD3+阳性细胞的IHCH检测。在治疗后168h侵入环包含巨大量的CD3+T细胞。

D.来自TMA多块样本的CD3+T细胞的半定量分析。肿瘤热疗治疗的肿瘤样本比未经治疗的和对照肿瘤样本包含显著更多的CD3+细胞(T淋巴细胞)。

图46显示组织形态学分析方法。

图47显示根据本发明的疫苗的全身性效应。观察到远离治疗部位定位的转移瘤的消退。

图48显示在常位4T1肿瘤模型中由根据本发明的疫苗提供的对肿瘤体积的减小的有益效应。按实施例14中所描述的施用与TJ-48联合的肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)。

下列实施例包括在本文中以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解下列实施例中公开的技术代表由本发明人发现以在本发明的实践中良好地起作用的技术，并从而可被视为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解可对所公开的具体的实施方案进行许多改变并可仍然获得同样的或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。

基于本说明书，本发明的多个方面的其它修改和可选择的实施方案将对本领域技术人员是显而易见的。因此，本说明书仅应被解释为举例说明性的并且是用于向本领域技术人员教导实施本发明的一般性方式的目的。应理解本文中显示和描述的本发明的形式应当被当作实施方案的实施例。可替换本文中举例说明和描述的成分和材料，可颠倒部件和过程，以及可独立地利用本发明的某些特征，所有这些对于具有本发明的此说明书的利益之后的本领域技术人员来说会是显而易见的。可对本文中描述的成分进行改变而不背离如下述权利要求中描述的本发明的精神和范围。

实施例

材料和方法

肿瘤模型

细胞系

将HT29侵袭性结肠癌细胞系(由Tyrolean Cancer ResearchInstitute,Innsbruck,Austria提供)在Dulbecco改良的Eagle最小必需培养基(DMEM)+GlutaMax(包含10％热灭活胎牛血清(FCS)和1％链霉素-青霉素(5000单位的青霉素和5mg的链霉素)的高葡萄糖(4.5g/l)培养基)中进行传代。通过使用0.25％的胰蛋白酶+乙二胺四乙酸(EDTA，0.22mg/ml)进行5分钟来从亚汇合的单层释放细胞并将其重悬于无血清培养基中以达到所需的10⁷/ml的细胞浓度。所有试剂购自GIBCO(Invitrogen,Carlsbad,USA)。

动物模型

将雌性裸鼠Balb/c(nu/nu)(由Experimental Animal House ofthe National Research Institute for Radiobiology andRadiohygiene,Budapest,Hungary提供)维持在无菌环境中，在12h黑暗/12h光亮的循环下无限制地喂养经灭菌的食物和水。利用10⁷/ml HT29细胞的0.1ml悬浮液对6至8周龄小鼠的两个大腿区进行皮下注射。在HT29细胞注射后18天当肿瘤植入物的直径已达到～1.5cm时治疗动物(异种移植物)。仅将在两条腿中具有对称性肿瘤的小鼠用于治疗。实验动物的饲养和处理符合匈牙利法律(HungarianLaws)No.XXVIII/1998和LXVII/2002关于动物的保护和福利的相关章节和欧盟的动物福利法规的规定。研究在No.22.1/609/001/2010下得到了政府伦理委员会的批准。

利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波对异种移植物的治疗

仅对动物的右侧肿瘤系统地进行治疗，而保留左侧肿瘤用于个体对照(参见图5)。将Balb/c(nu/nu)小鼠的右腿中的肿瘤植入物置于电路的平行设计(plan-parallel)电容器中(参见图9)。取决于包含肿瘤的被治疗的组织的电介质，通过将电路的阻抗保持在50Ohm，该装置允许直接的电控制。电极布置是非对称性的。将动物放下在矩形接地的(下方的)由72.0cm²的磨光铝制成的电极上，将所述电极在治疗期间保持在37℃。将活动的(相对的)上方的由可弯曲的纺织品(铜-银-锡涂覆的纺织物，Lorix Ltd.Bajna,Hungary)制成的2.5cm²圆形电极覆盖在肿瘤区上以提供被治疗腿的完全皮肤接触。从外部通过湿衬垫冷却上方电极的全部表面。在使用1/f振幅调制的13.56MHz射频上产生电磁场(LabEHY,Oncotherm Ltd,Paty,Hungary)。调节参数以将瘤内温度在被治疗侧保持在41-42℃且在对照侧保持在～36℃。在电极下面的皮下温度被保持在～40℃以及直肠温度保持在～37℃。通过光学传感器(Luxtron FOT Lab Kit,LumaSense Technologies,Inc.CA,USA)监测上述位置处的温度。

在此动物模型中，通过电容耦合即置于电容器电极之间而将癌植入物作为电路的部分。由于在～25MHz之下可实现有效的组织穿透，故使用了经调制的13.56MHz的射频。预期根据本发明应用的所施加的射频波与离子和双极性分子基团相互作用(非热效应)从而导致其旋转并且还可产生≤42℃的热(热效应)。在所施加的控制下，13.56MHz的频率没有损坏正常组织、诱导神经中的动作电位或干扰任何电信或电力设备的风险。

研究设计

治疗组包括33个动物(图11)，在100mg/kg氯胺酮和10mg/kg塞拉嗪的麻醉下将单次发射的使用电容器布置中的电容耦合的射频波以4W的平均功率施加给所述动物，进行30分钟。进行时间过程研究。在单次发射治疗后，在治疗后0、1、4、8、14、24、48、72、120、168、216h制备样本，在每组中使用3只小鼠。将另外的5个未经治疗的肿瘤植入动物与治疗后24h和72h的小鼠一起处死。

肿瘤样本处理

在取样的时候，将单治疗的动物处死，取出对照和经治疗的肿瘤并将其成对地研究(参见图10A)。将离体肿瘤的一半固定在10％福尔马林中，脱水并常规地包埋至石蜡(FFPE)中。将另一半新鲜冷冻在液氮中，并在进一步的检测之前在低温冰箱中保持在-80℃。使用不同类型的方法分析肿瘤样本(图10B)。

组织微阵列(TMA)方法

由于肿瘤样本非常大的数量，故使用组织微阵列(TMA)技术以对许多样本在一块进行精确的免疫组织化学反应(图10B)。多块物包含许多小的(2mm)代表性肿瘤组织样本，因此在所有的样本中可进行相同的且高度标准化的免疫组织化学反应。这是该技术真正的优势。TMA包含使用计算机驱动的TMA Master(3DHISTECH Ltd.,Budapest,Hungary)从每个供体块中的标准区域取样的3个2mm直径的核心，其中两个来自受损的和完整的肿瘤边界的边缘，1个来自受损的中心(图38)。

免疫组织化学和免疫荧光方法

对于免疫组织化学，将4μm厚的切片脱蜡、再水化，随后通过使用甲醇中3％的过氧化氢将内源过氧化物酶封闭20分钟(免疫荧光除外)。在电压力锅(Avair Ida YDB50-90D,Biatlon kft,Pecs,Hungary)中于～105℃在由0.01M柠檬酸钠(柠檬酸盐，pH 6.0；用于被切割的半胱天冬酶-3)或0.1M Tris碱和0.01M EDTA(T-E，pH 9.0，用于所有其它的抗体)制成的缓冲液中进行抗原修复，随后进行20分钟的牛血清白蛋白(BSA)-叠氮化物(1％，Sigma-Aldrich,St Luis,MO)蛋白封闭。使用下列一级抗体将切片在湿度箱中于室温温育16h：

1.多克隆兔抗-人的被切割的半胱天冬酶-3(1:100，CellSignaling Danvers,MA)，

2.髓过氧化物酶(1:200,Sigma-Aldrich)，

1.AIF(1:50,Cell Signaling)，

2.TRAIL-R2(1:50,Cell Signaling)，

3.钙网蛋白(1:200,Cell Signaling)，

4.HMGB1(1:200Cell Signaling)，

5.CD3(1:2,Dako,Glostrup,Denmark)。

随后，使用EnVision聚合物过氧化物酶检测系统(Dako)进行30分钟。对于酶显影，使用3,3’-二氨基联苯按(DAB,棕色)试剂盒(RE7105,Leica-NovoCastra,Newcastle,UK)或氨基乙基咔唑(AEC,红色)试剂盒(K3461,Dako)。在温育之间，在Tris缓冲的盐缓冲液(TBS)中洗涤载玻片，进行3x2分钟，最后使用苏木精复染色。

对于免疫荧光(IF)，使用Alexa Fluor 546(橙红色)偶联的抗-兔IgG(1:200)或Alexa Fluor 488(绿色)偶联的抗-小鼠IgG(1:200)进行90分钟来检测一级抗体，使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将细胞核显示为蓝色(所有的均来自Invitrogen/Molecular Probes)。扫描明视野图像，而IF图像通过SlideScanner系统扫描或使用Nicon Eclipse e-600。

凋亡相关蛋白分析

在冰上使用提取缓冲液(20mM Tris,2mM EDTA,150mM NaCl,1％Triton-X100,10μl/ml磷酸酶抑制剂和5μl/ml蛋白酶抑制剂)进行30分钟来从冷冻的样本分离蛋白，随后在4℃以15,000rpm离心15分钟。使用Bradford测定来测量蛋白浓度。

凋亡测定

使用硝酸纤维素膜Proteome Profiler^TM人凋亡阵列试剂盒(R&D,Minneapolis,MN)同时检测经治疗的和未经治疗的样本中35种凋亡相关蛋白的表达(图21A和B)。将阵列在摇床上与250μl的1,200μg/ml蛋白裂解物于4℃温育过夜，随后与生物素化抗-人IgG温育60分钟以及与抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物温育30分钟，并使用化学发光ECL试剂盒(West Pico化学发光试剂盒；Thermo Scientific,Rockford,IL)在Kodak ImageStation 4000mm(Rochester,NY)中显影10分钟。使用ImageJ 1.45s(http://rsbweb.nih.gov/ij/)进行半定量分析。

westerm免疫印迹

对于western免疫印迹，将蛋白提取物与包含5％2-巯基乙醇的5x Laemmli样本缓冲液混合并加热至95℃进行5分钟。将30μg蛋白上样至12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的每个孔中，在150V进行电泳1h。随后在75mA于4℃过夜将蛋白免疫印迹至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。对于免疫检测，将膜相继地用5％半脱脂牛奶作为蛋白封闭物温育60分钟，随后用兔抗-人AIF(1:1000；Cell Signaling,Danvers,MA)、RIP(受体相互作用蛋白激酶；1:1000,Sigma-Aldrich)抗体在4℃温育16h。对于上样对照，使用兔抗-β-肌动蛋白(1:200,Thermo)抗体进行60分钟。随后通过使用KodakImage Station及其4.1软件利用辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗-兔IgG(1:1000；Cell Signaling)进行60分钟和利用SuperSignal增强化学发光(ECL)试剂盒(Thermo)进行10分钟来检测信号。Precision Plus Protein Standard Ladder产生250kDa、150-、100-、75-、50-和37kDa上的条带。除非另有指明，否则所有的试剂均来自Bio-Rad(Hercules,CA)。

TUNEL测定

在TMA切片中的预筛选的基础上，还对在治疗后24h和48h收集的利用使用电容器布置中的电容耦合的射频波进行治疗的肿瘤及其匹配对照的全横截面进行TUNEL测定。TUNEL测定使用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)利用荧光染料标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)连接DNA缺口末端。因此，细胞核中的荧光信号与断裂的DNA的量成比例以指示程序性细胞死亡。按照制造商的说明书使用“Click it TUNELAlexa Fluor 488Imaging Assay”(Invitrogen)。简要地，使用电压力锅(如上所述)将经脱蜡和再水化的载玻片在基于柠檬酸盐的pH6.0抗原暴露溶液(H-3300,Vector Lab,Burlingame,CA)中加热。随后将载玻片与炔烃取代的dUTP和TdT的混合剂在37℃下温育60分钟，然后与偶联至dUTP的荧光染料在室温温育30分钟。最后，用DAPI将核DNA进行染色。

数字显微镜检查法：

载玻片扫描程序：

使用利用20x物镜的Pannoramic Scan载玻片扫描仪系统(3DHISTECH,Budapest,Hungary)将针对苏木精和伊红(H&E)、免疫组织化学或TUNEL测定进行染色的全横截面和TMA样本进行数字化。

数字显微镜检查成像和分析：

使用Panoramic Viewer软件进行肿瘤组织成像。数位调节图像的放大倍数，所有成像的肿瘤样本均包含指示比例尺棒。基于图像颜色和强度分割，人工地或使用Panoramic Viewer软件的HistoQuant模块(所有均来自3DHISTECH,Budapest,Hungary)进行样本的定量分析。通过将被破坏的肿瘤组织面积(D)除以全横截面中测量的全肿瘤面积(W)来计算肿瘤热疗治疗相关的肿瘤破坏比(TDR)。通过将经治疗的肿瘤的TDR除以相同动物的未经治疗的肿瘤的TDR来评价治疗相关的肿瘤破坏效率(TDE)(图39)。对于统计分析，使用SPSSStatistics v.20软件(IBM Corp.New York,NY)的Kruskal-Wallis检验。

在每个检测时间点，在x100物镜放大倍数下计算3个经治疗的和3个未经治疗的样本的10个不同的显微镜视野(FOV)中的标志物阳性细胞、细胞核或凋亡小体的数量。由于核定位对于AIF和TUNEL染色样本都是至关重要的，故将DAPI共染色用于验证。对于细胞色素c染色，仅在形态学上完整的肿瘤区域中计数具有弥散的细胞质信号的细胞。在H&E载玻片上计数凋亡小体。使用HistoQuant软件评价TRAIL-R2和被切割的半胱天冬酶-3染色的载玻片。通过将标志物阳性的掩盖面积除以总体注释面积(overall annotated area)来定义相对掩盖面积(rMA)。对于统计学，在独立t检验之后使用SPSSStatistics v.20进行Kolmogorov-Smirnov正态性检验。对于髓过氧化物酶和CD3染色的载玻片，建立10-比例尺系统(10－scale system)来给阳性细胞的频率打分并使用Kruskal-Wallis检验分析结果。

实施例1：肿瘤破坏

在HT29异种移植物的H&E染色的横截面中，将肿瘤的受损中心带区别为浅色区域(图40A中的箭头)。数字载玻片观察器软件允许以μm²的精确的面积测量。相较于未经治疗的肿瘤，在经治疗的肿瘤中肿瘤破坏比(TDR)(每全肿瘤面积(W)的受损肿瘤面积(D)的比例)显著更高(*p<0.05)(参见图40B)。肿瘤热疗治疗相关的肿瘤细胞破坏(TDE)也从24h起显示动态增加，在治疗后72h观察到7倍峰值(图40C)。

实施例2：DNA断裂

TUNEL测定证明相较于未经治疗的肿瘤，在治疗后24h(*p<0.05)和48h(**p<0.01)，经治疗的肿瘤的全横截面(图41)中的程序性细胞死亡相关的DNA断裂显著更高(图42A-B)。与此一致的是，相较于未经治疗的肿瘤，在治疗后48h(*p<0.05)和72h(**p<0.01)，经治疗的肿瘤中存在显著更高程度的核皱缩(核固缩)和稠密染色质片段(凋亡小体)的积累(图42A和C)。

实施例3：凋亡小体形成

利用TUNEL测定、核皱缩和凋亡小体(参见图14)测量的DNA断裂的显著增加证明程序性细胞死亡是肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)诱导的肿瘤破坏的主要机制。

实施例4：钙网蛋白表达

钙网蛋白(CRT)是ICD过程中最重要的分子中的一个。当CRT出现在肿瘤细胞膜上时，其可产生用于吞噬作用细胞(包括树突细胞(DC))的强烈信号以攻击濒死的肿瘤细胞。这是对于免疫细胞的最重要的“吃掉我”信号。肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗可在治疗后不久就显著增加CRT的膜表达(图16)。

实施例5：HMGB1表达

HMGB1是ICD的另一重要的标志。在正常状态下HMGB1位于细胞核中，在其中HMGB1稳定核并调节许多基因的转录。越来越多的证据显示HMGB1可从凋亡细胞中释放。细胞外HMGB1用作细胞因子并且可激活DC(通过TLR4)从而可触发抗肿瘤T细胞应答和介导ICD。肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗诱导的程序性细胞死亡加速HMGB1至细胞外基质的释放(图15和图43)，从而帮助激活DC和介导抗肿瘤免疫反应过程。

实施例6：TRAIL表达

使用包含用于35种程序性细胞死亡相关蛋白的抗体的蛋白质组分析硝酸纤维素阵列以检测肿瘤热疗诱导的细胞死亡的分子背景。该蛋白质阵列显示治疗后8h死亡受体TRAIL-R2相较于未经治疗的对照显著上调(图17A)。当利用自动成像分析来检测免疫荧光染色时，也证实8h和14h处TRAIL-R2蛋白在经治疗的肿瘤中显著增加的细胞膜表达(图17B-C)。

实施例7：HSP70表达

HSP70伴侣分子具有复杂的功能。在细胞中HSP设法保持细胞的完整性，但如果其可表达至细胞膜(图18A)或释放至ECM(图18B)，则其对于免疫细胞是强烈的信号。HSP通过交叉致敏和共呈递的过程而在肿瘤特异性或肿瘤相关性抗原识别中起着重要的作用。

实施例8：局部免疫反应的组织形态学标志

治疗后72h，白细胞侵入环出现在经肿瘤热疗治疗的肿瘤的被破坏的区域周围(图44A)，其在单次发射肿瘤热疗治疗后120h和168h变得更加突出(图44B)。

实施例9：侵入环中白细胞的免疫组织化学(IHCH)鉴定

侵入环中不同的免疫细胞在形态学上是不可被区分的。复杂的免疫组织化学检测对于显示免疫细胞群的组成是必需的。髓过氧化物酶(MPO)是嗜中性粒细胞的关键标志物(图45A和B)，CD3是幼稚T细胞(T cell)的标志物(图45C和D)。

根据实施例1-9中显示的结果，可得出如下结论：

1.肿瘤热疗治疗可在肿瘤中诱导产生许多凋亡小体的程序性细胞死亡。凋亡小体在被破坏的肿瘤组织中的存在对于诱导免疫原性反应是必要的。

2.肿瘤热疗治疗诱导的细胞死亡是高度免疫原性的，显示所有的关键分子模式动态变化是免疫原性肿瘤细胞死亡的特征。

3.肿瘤热疗治疗可在治疗的部位、在肿瘤热疗治疗之后的长时间内诱导强烈的且非常不寻常的局部免疫反应。

4.如果宿主具有完整的免疫系统并且施用适当的免疫刺激物，那么肿瘤热疗治疗的局部抗肿瘤免疫反应可以是全身性的。该过程可通过旁观者效应控制远端转移瘤，从而使得利用局部治疗来全身性控制恶性疾病成为可能。

实施例10：使用电容耦合的射频波与消癌平的组合施用

消癌平注射剂(Xi)由传统中药(TCM)使用。该注射剂是通关藤的煎剂，其包含类黄酮、绿原酸和虎杖甙。使用分为4组(4只动物/组)的常规雌性BALB-C小鼠来进行实验：

C：假处理对照

Xi：利用Xi注射剂的治疗，剂量：7.5ml/kg体重/天，腹膜内进行4天

OTM：右侧大腿肿瘤进行一次肿瘤热疗治疗，持续30分钟

OTM+Xi：利用Xi注射剂的治疗，剂量为7.5ml/kg体重/天，腹膜内进行4天，在第4天对右侧大腿肿瘤进行一次OTM治疗，持续30分钟

通过将10⁶个培养的C26结肠腺癌细胞皮下注射至动物的两个大腿区来产生同种异体移植物。14天之后，该对称性双肿瘤模型使得能够使用内参(经治疗的和未经治疗的肿瘤)以用于肿瘤热疗治疗和用于研究Xi和组合治疗的全身性效应。

OTM治疗，实验设置(图24)

·RF参数：

－13.56MHz

－使用1/f噪声进行振幅调制

－电容耦合的-阻抗调谐的

·系统：

－LAB-EHY 100(Oncotherm,Páty)

·持续时间：30分钟

输出功率：1-3W

在最后一次治疗后24小时处死动物，切取瘤形成组织并进行福尔马林固定。

进行样本的组织病理学和免疫组织化学检查：

－组织病理学：H&E载玻片

－免疫组织化学

·TUNEL测定(核酸断裂)(FITC)

·CD3(淋巴细胞)(罗丹明)

·HSP70(罗丹明)

·评价：在每组中成对比较相对死亡面积比(HistoQuant,3DHistech)(图39)

虽然根据结果，单独的Xi疗法是无效的，但与肿瘤热疗治疗的组合在肿瘤热疗治疗的以及未经治疗的一侧均产生肿瘤的大块破坏。肿瘤热疗单一疗法仅导致经治疗的肿瘤的破坏，而在未经治疗的肿瘤与假处理治疗的同种异体移植物之间没有可观的差异(图26A和B)。

根据结果，OTM+Xi组合治疗在检测的动物中具有针对多定位肿瘤的全身性效应。针对未经治疗一侧上的肿瘤的破坏效应的水平是与同一组中或OTM单一疗法组中在经治疗一侧所经历的效应在统计上等同的。组织形态学和免疫组织化学的发现可见于图27-36中。

实施例11：与低剂量卡铂联合的使用电容器布置中的电容耦合的射频波

此报告支持与免疫刺激物联合的肿瘤热疗治疗提供全身性效应并消除远离治疗部位的转移瘤的能力。

Case No.:11461，克卡犬(Cocker spaniel)，8岁，被阉割的雄性，

诊断：具有肺转移瘤的黑素瘤。原发性肿瘤位于右后腿并被手术去除。5个月后肺中的转移瘤出现，此时开始治疗。

治疗：

肿瘤热疗(在2周时期内进行10次)

2次低剂量卡铂(100mg/m²)

(给狗开的卡铂剂量是300mg/m²)

具有远低于最初开的剂量的剂量的卡铂具有免疫刺激性质。该效应的解释是，在较低的剂量下，该药物的细胞毒性效应对于癌细胞是不显著的，但可有效地阻断调节性T细胞(T_reg；以前被知晓为抑制性T细胞)功能的功能。T_reg细胞可控制免疫反应的强度，因此如果T_reg细胞的数目减少，那么免疫系统的一般活性会以某种方式上调(具有减弱的T_reg细胞功能原因的患者发生严重的自身免疫性疾病)。

OTM治疗的部位在胸部上，恰在心脏线上。如可在CT图像系列中所见的，不仅在治疗的部位而且在OTM直接治疗的区域之外都观察到显著的肿瘤消退(参见图47)。

实施例12

如下进行典型的时间过程测量实验：

－使用雌性裸鼠BALB/c(nu/nu)；

－细胞系，HT29，人结直肠癌；

－两个大腿区中的异种移植模型，仅治疗一个；

－时间过程研究0→216h，39个动物，(78个肿瘤)；

－使用的治疗是使用电容耦合的射频波(肿瘤热疗)，单次发射，30分钟，42℃；

－使用的频率，13.56MHz，经粉红噪声调制的；

－根据专利WO 2009/092619电极的性质是可弯曲的；

－如前所述分析数据-免疫刺激物：在使用电容耦合的射频波的施用(肿瘤热疗治疗)前24h，将大肠杆菌LPS免疫刺激物(100μL Salsol溶液中的100μg LPS)皮下(sc.)施用至动物的背部区。

典型的时间过程测量的总结显示于图11中。此研究使用完全的横截面来鉴定形态学。治疗的典型结果是肿瘤细胞的凋亡(参见图12)，其通过多重研究和不同的检测方法来证明，如下文所公开的。

凋亡的主导性存在通过显示DNA断裂(如图12所显示的)的TUNEL测定(如前所述地进行)来实验地证明。如图13所显示的，凋亡时间尺度得到时间过程实验的良好证实。

首先，包含抗原的凋亡小体可被良好地观察为免疫原性凋亡细胞死亡的总体标志物(参见图14)，所述免疫原性凋亡细胞死亡是根据本发明的疫苗接种方法的基础。利用使用电容耦合的射频波(肿瘤热疗)的治疗的该特性(主导性的凋亡细胞死亡)是疫苗接种效应的关键因素。损伤相关分子模式的形成和完全免疫反应的刺激是免疫原性细胞死亡的两个必需的条件。

肿瘤热疗诱导的对必需的DAMP成员的效应得到实验证明。因此，使用电容耦合的射频波的治疗导致HMGB1呈递和至细胞外基质的释放(参见图15)。此外，治疗后4h，观察到细胞膜上的钙网蛋白表达(参见图16)。

此外，癌细胞的利用使用电容耦合的射频波的治疗诱导TRAIL-R2(DR5)的表达(参见图17)和HSP70在细胞外空间和在细胞的膜表面上的表达(参见图18)。

HSP70在肿瘤体积中的平均相对百分比的评估显示两个独立的发展过程(参见图19)：

在利用使用电容耦合的射频波的治疗后4h的mRNA表达的评价概述了根据本发明的治疗诱导下列蛋白的合成的能力：HSP4,HSPA8,BAG3,HSPB1,DNAJB1,HSPA1A,HSP90AA1,DNAJB4,HSPA6,HSPD1,HSP1L(参见图20和图3)。

为了进一步研究细胞死亡的凋亡机制，进行了人凋亡蛋白质组分析测定。结果概括于图21中。利用射频波的治疗对参与死亡诱导途径的蛋白例如TRAIL-R2(DR5)、FAS和FADD的效应(如图22中所显示的)提供了对细胞膜凋亡途径的实现机制的进一步的洞悉。

因此，鉴定了参与利用使用电容耦合的射频波的治疗对肿瘤细胞凋亡的诱导的最重要的蛋白。此外，区分了对利用使用电容耦合的射频波的治疗的免疫应答：因此，如图23中显示的，经治疗的癌细胞的凋亡事件在治疗后48h之前消逝，并在过渡期后，发生免疫系统的强烈活化，其导致免疫原性癌细胞死亡。

如图4所显示的，根据本发明的抗肿瘤疫苗提供全身性效应：位于另一肢上的未经治疗的肿瘤响应施加至位于另一肢上的肿瘤的治疗而缩小。当实验室辅助对于远端(免疫辅助)效应是必需的时，现有技术水平文献仅显示离体免疫支持。在按照本发明的治疗中，主要的一点是原位应用。单独的肿瘤热疗(使用电容耦合的射频波)对远处定位的肿瘤不具有任何效应。LPS施用对于肿瘤消退也不具有效应。然而，LPS辅助的使用电容耦合的射频波的施用提供伴随远隔效应并导致远处定位肿瘤的缩小。因此，肿瘤热疗(使用电容耦合的射频波)和LPS施用导致局部肿瘤热疗的远距离(全身性)效应。

实施例13：与联合的使用电容器布置中的电容耦合的射频波

72岁的男性患者被诊断患有不可分类的非小细胞肺癌。首次诊断的肿瘤分类是cT2N2M0，IIIB期。尽管有先前的病例，但患者拒绝任何治疗。5个月后，该患者在补充和替换医疗的门诊部就诊，患有在4周前渐渐加重的咳血和运动型呼吸困难的疾病。该患者被转至医学肿瘤学部门并接受再评估。

包括胸部CT和PET扫描的分期检查显示右中叶处9.5cm大小的腔肿块并具有多区域的和转移的淋巴结。该患者没有并存疾病且没有医疗史。然而，该患者仍然拒绝化疗并与其家庭成员一起要求其它可能的治疗选择。

在这些情况下，我们进行了与肿瘤热疗和GM-CSF组合的放疗，期望诱导伴随远隔效应。以28个每日部分的1.7cGy的剂量给予至肺肿块的局部区域辐射疗法，一周中进行5-6次治疗。随后在辐射后进行一周3次的肿瘤热疗。在肿瘤热疗治疗的2周后，皮下施用GM-CSF(250微克，,USA)，每天一次进行10天。在放疗的1周后，皮下给予125μg/m²剂量的GM-CSF，进行14天。结果表明使用GM-CSF是可行的并且其效应增强了免疫疗法。

提供了无任何并发症的治疗。患者没有显示严重的不良反应，除了在治疗期结束时的1级疲劳以外。通过随访过程，在完成辐射治疗系列后立即的PET扫描显示多重转移淋巴结几乎完全的缓解，所述淋巴结是远离放疗区域的。原发性(经治疗的)肿瘤缩小，远端的转移瘤消失(参见图37)。

患者很满意并在有成效的反应下离开。患者的随访持续进行。此病例描述了与肿瘤热疗和GM-CSF免疫刺激组合的局部放疗的成功的伴随远隔效应。该尝试看起来在免疫应答上比单独的放疗更为有效。

实施例14：与Juzentaihoto(TJ-48)联合的使用电容器布置中的电容耦合的射频波

在4T1(luc2)常位肿瘤模型上评价了与使用电容器布置中的电容耦合的射频波组合的Juzentaihoto(TJ-48)的疫苗效应。

Juzentaihoto(TJ-48)(Tsumura Co.,Tokyo,Japan)是已被用于缓解贫血的日本草药。其包含10种传统药草的提取物并且对免疫系统具有有力的生物应答调节剂效应。

肿瘤细胞系：4T1(luc2)。细胞系的该克隆包含光素酶。肿瘤及其转移瘤在腹膜内施用所述酶的底物时可发出弱的光辐射，并可使用敏感的摄影系统(体内生物发光成像系统IVIS2000)来进行成像(和定量)。

实验设计：

肿瘤诱导：-14天。

TJ-48施用：从第-3天至第18天(50mg/天，每天，po.)

肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗：第0天和第6天(1-2W，达到41-42℃的肿瘤核心温度，25分钟的总治疗时间)

在第20天处死小鼠，并离体地对肺进行成像以检测转移瘤。如前所述地进行肺中原发性肿瘤和转移瘤的组织形态学检查。

实验动物组：

1.未经治疗的对照(4只小鼠)

2.TJ-48组：仅用TJ-48治疗小鼠(4只小鼠)；使用胃探针经口施用TJ-48。

3.肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)组：在第0天和第6天仅用使用电容器布置中的电容耦合的射频波治疗小鼠(4只小鼠)

4.肿瘤热疗+TJ-48组：在第0天和第6天用TJ-48和肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)治疗小鼠(4只小鼠)

从第0天至第13天评价被诱导的原发性肿瘤的肿瘤体积。如图48中所显示的，肿瘤热疗(使用电容器布置中的电容耦合的射频波)与TJ-48的联合施用导致肿瘤体积的显著减小。

实施例15：本发明方法的疫苗接种效应的实验证明

实验设计、肿瘤模型(4T1)和实验动物组与实施例14中所描述的相同。

本文件中使用的缩写：

评价方法：

I.实验组中动物的存活时间的研究。

利用肿瘤热疗和免疫刺激物治疗的组的存活时间的显著增加间接证明方法的疫苗接种效应。

II.使用ELISPOT测定评价疫苗接种效率

酶联免疫斑点(ELISPOT)测定是用于监测人和动物中的免疫应答的常用方法。ELISPOT测定基于改良版的ELISA免疫测定并由此开发而来。ELISPOT测定最初被开发来确定分泌抗原特异性抗体的B细胞的数目，并随后被改编用于多种任务，特别是细胞因子产生细胞在单个细胞水平上的鉴定和计数。简单地说，在适当的条件下ELISPOT测定允许个体活化或应答细胞的分泌产物的显影。在测定中显影的每个斑点代表单个活性细胞。因此，ELISPOT测定提供定性(免疫蛋白的类型)和定量(应答细胞的数目)的信息。对于抗肿瘤疫苗接种评价，IFN-γELISPOT测定是广泛使用和接受的方法。

ELISPOT研究设计的简要描述(用于小鼠的ELISPOT测定试剂盒，商购获自BDBiosciences)：

1.从实验组的动物收集目的细胞(外周血单核细胞(PBMC)或脾来源的细胞)。将来自个体动物的样本根据实验组进行混合。实验组：未经治疗的对照动物；肿瘤热疗治疗的动物，用免疫刺激物治疗的动物；组合的肿瘤热疗治疗和免疫刺激治疗

2.用4T1肿瘤细胞温育来自目的细胞的样本

3.根据制造商的说明书进行ELISPOT测定

4.研究的评价：在成功疫苗接种效应的情况下，OTM+CIS样本在测定中显示最高数量的斑点。

III.使用流式细胞检测分析(FACS)评价疫苗接种效率

可使用流式细胞检测分析和适当的抗体来研究来自PBMC的CD4+和CD8+T细胞群。在此实验中还可混合血液样本。在成功的疫苗接种的情况下，OTM+CIS组中的CD4+和CD8+阳性细胞的比率将相较于其它组显著更高。

VI.在肿瘤和转移瘤样本中使用IHCH分析评价疫苗接种效率(T细胞应答)

原发性肿瘤及其转移瘤的浸润是有力的抗肿瘤免疫应答的标志。(即成功的抗肿瘤疫苗接种)。

浸润的T细胞群的IHCH研究可提供关于疫苗接种过程的结果的重要的支持性信息。在原发性肿瘤或特别地转移瘤中的高的CD8阳性的情况下，意味着更强的抗肿瘤免疫反应和更好的疫苗接种效率。

Claims

1.一种免疫刺激物，其在与使用电容器布置中的电容耦合的射频波联合使用时，用于无创治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发。

2.权利要求1的免疫刺激物，其中所述电容器布置包含至少一个电极和至少一个对电极，其中患者是两者之间的电介质材料。

3.权利要求1或2的免疫刺激物，其中不将如具有辐射耦合的RF布置中的天线用于施用所述射频波。

4.前述权利要求任一项的免疫刺激物，其中全身性地施用所述射频波。

5.前述权利要求任一项的免疫刺激物，其中施用的射频波不增加患者的体温或患者的治疗区域的温度。

6.前述权利要求任一项的免疫刺激物，其中所述免疫刺激物激活患者的免疫系统，并且与使用电容器布置中的电容耦合的施用的射频波联合时，通过产生识别和杀死癌细胞的记忆细胞来提供针对癌症疾病的疫苗效应。

7.前述权利要求任一项的免疫刺激物，其中所述免疫刺激物选自包含下列的组：脂多糖、卡介苗提取物、毕西巴尼、Ancer、消癌平、(沙格司亭；重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、被杀死的短小棒状杆菌细菌及其提取物、伊匹木单抗(针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的抗体)、左旋咪唑、KLH(钥孔血蓝蛋白)、低剂量顺铂或卡铂(<0.4mg/kg)、Juzentaihoto(JT48)和脱氧胆酸(DCA)。

8.前述权利要求任一项的免疫刺激物，其中所述转移瘤或原发性癌选自：腺癌、脉络膜黑素瘤、急性白血病、听神经瘤、壶腹癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胰腺瘤、硬纤维瘤、膀胱癌、支气管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳癌、伯基特淋巴瘤、子宫体癌、CUP-综合征(原发灶不明的癌)、结直肠瘤、小肠癌、小肠肿瘤、卵巢瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌症类型、Ewing瘤、胃肠肿瘤、胃癌、胆囊瘤、胆囊癌、子宫癌、宫颈瘤、宫颈、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、耳、鼻和咽喉肿瘤、血液瘤、多毛细胞白血病、尿道癌、皮肤癌、皮肤睾丸癌、脑瘤(神经胶质瘤)、脑转移瘤、睾丸癌、脑下垂体瘤、类癌、卡波西氏肉瘤、喉癌、生殖细胞瘤、骨癌、结直肠癌、头颈部肿瘤(耳、鼻和咽喉区域的肿瘤)、结肠癌、颅咽管瘤、口癌(口腔区域中和唇上的癌)、中枢神经系统的癌症、肝癌、肝转移瘤、白血病、睑瘤、肺癌、淋巴结癌(霍奇金氏/非霍奇金氏)、淋巴瘤、胃肿瘤、恶性黑色素瘤、恶性瘤、胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、直肠瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、霍奇金氏病、蕈样真菌病、鼻癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、肾癌、肾细胞癌、非霍奇金氏淋巴瘤、少突神经胶质瘤、食管癌、溶骨癌和成骨癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、浆细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、前列腺癌、咽癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、阴道癌、甲状腺癌、Schneeberger病、食道癌、spinalioms、T细胞淋巴瘤(蕈样真菌病)、胸腺瘤、管癌、眼肿瘤、尿道肿瘤、泌尿系统肿瘤、膀胱上皮癌、外阴癌、疣形、软组织肿瘤、软组织肉瘤、Wilm瘤、宫颈癌和舌癌；特别适合用于治疗的为例如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、支气管癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、喉癌、恶性黑色素瘤、食道癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌和肾细胞癌。

9.由至少一种免疫刺激物和使用电容器布置中的电容耦合的射频波组成的疫苗，其用于治疗原发性癌及其转移瘤或用于预防癌症疾病的复发。

10.权利要求9的疫苗，其中所述免疫刺激物选自包含下列的组：脂多糖、卡介苗提取物、毕西巴尼、Ancer、消癌平、(沙格司亭；重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、杀死的短小棒状杆菌细菌及其提取物、伊匹木单抗(针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的抗体)、左旋咪唑、KLH(钥孔血蓝蛋白)、低剂量顺铂或卡铂(<0.4mg/kg)、Juzentaihoto(JT48)和脱氧胆酸(DCA)。

11.权利要求9或10的疫苗，其中所述疫苗用于原位疫苗接种。

12.权利要求9-11任一项的疫苗，其用于具有增加的发生癌症的风险的人的疫苗接种和/或用于患者的疫苗接种以预防被成功治疗的癌症疾病的复发。

13.权利要求9-12任一项的疫苗，其中所述电容器布置包含至少一个电极和至少一个对电极，其中患者是两者之间的电介质材料。

14.权利要求9-13任一项的疫苗，其中施用的射频波不增加患者的体温或患者的治疗区域的温度。

15.权利要求9-14任一项的疫苗，其中转移瘤或癌症选自：腺癌、脉络膜黑素瘤、急性白血病、听神经瘤、壶腹癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胰腺瘤、硬纤维瘤、膀胱癌、支气管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳癌、伯基特淋巴瘤、子宫体癌、CUP-综合征(原发灶不明的癌)、结直肠瘤、小肠癌、小肠肿瘤、卵巢瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌症类型、Ewing瘤、胃肠肿瘤、胃癌、胆囊瘤、胆囊癌、子宫癌、宫颈瘤、宫颈、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、耳、鼻和咽喉肿瘤、血液瘤、多毛细胞白血病、尿道癌、皮肤癌、皮肤睾丸癌、脑瘤(神经胶质瘤)、脑转移瘤、睾丸癌、脑下垂体瘤、类癌、卡波西氏肉瘤、喉癌、生殖细胞瘤、骨癌、结直肠癌、头颈部肿瘤(耳、鼻和咽喉区域的肿瘤)、结肠癌、颅咽管瘤、口癌(口腔区域中和唇上的癌)、中枢神经系统的癌症、肝癌、肝转移瘤、白血病、睑瘤、肺癌、淋巴结癌(霍奇金氏/非霍奇金氏)、淋巴瘤、胃肿瘤、恶性黑色素瘤、恶性瘤、胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、直肠瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、霍奇金氏病、蕈样真菌病、鼻癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、肾癌、肾细胞癌、非霍奇金氏淋巴瘤、少突神经胶质瘤、食管癌、溶骨癌和成骨癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、浆细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、前列腺癌、咽癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、阴道癌、甲状腺癌、Schneeberger病、食道癌、spinalioms、T细胞淋巴瘤(蕈样真菌病)、胸腺瘤、管癌、眼肿瘤、尿道肿瘤、泌尿系统肿瘤、膀胱上皮癌、外阴癌、疣形、软组织肿瘤、软组织肉瘤、Wilm瘤、宫颈癌和舌癌；特别适合用于治疗的为例如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、支气管癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、喉癌、恶性黑色素瘤、食道癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌和肾细胞癌。