KR101714281B1 - 종양 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 면역자극제 및 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 이루어지는 백신 및 심지어 현재 획득가능한 영상화 방법으로 검출될 수 없는 확산된 세포-상태에 있는 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환의 재발을 방지하기 위한 방법, 특히 원-위치 및 생체 내 백신화 방법 및 특히 환자 자신의 면역계가 암세포를 인식하고 그리고 사멸시키고 그리고 암 질환의 재발을 방지하기 위한 기억을 구축하는 것을 가능하게 하고 지지하는 방법에 관한 것이다.

Description

종양 백신{Tumor vaccination}
본 발명은 적어도 하나의 면역자극제(i㎜une stimulant) 및 용량 결합(capacitive coupling)을 이용하는 고주파(radiofrequency wave)로 이루어지는 백신 및 원발성 암(primary cancer) 및 심지어 현재 획득가능한 영상법으로는 검출될 수 없는 산재된 세포-상태들의 그의 전이암(metastases)을 치료하거나 암 질환의 재발을 방지하거나, 특히 환자의 자체 면역계가 상기 암세포들을 인식하고 그리고 사멸시키고 그리고 암 질환의 재발을 방지하도록 기억(memory)을 구축하는 것을 뒷받침(supporting)하기 위한 방법, 특히 원-위치(in-situ) 및 생체 내 백신화 방법에 관한 것이다.
본 발명은 환자의 자체적인, 독특한 종양 특이적 항원들을 사용한다. 그러나, 이들 항원들은 - 이들이 은폐(hidden)되어 있어 - 면역 세포들을 인식할 수 없고 그 결과의 반응들을 및 후속하는 반응들이 이루어지지 않는다. 이는 면역 공격에 대하여 악성 종양(malignancy)을 방지하고, 그리고 신체가 상기 종양을 그 자체의 조직-재생(tissue-reparation)으로 인식한다. 상기 면역계는 종양 세포들에 대하여 침묵한다. 본 발명은 항원표출세포(APCs: antigen presenting cells)로 인식되는 종양 항원들이 없어 상기 악성 종양에 대하여 특이적인 면역반응을 개시하도록 할 수 있는 백신을 제공한다. 이는 본 발명의 백신에 의해, 즉 상기 은폐 항원들을 노출시키고, 항원표출세포들(특히 수지상세포들(dendritic cells))에 의한 인식을 촉진시키고, 그리고 상기 항원표출세포들을 제조하고 그리고 전면역계가 특정의 면역반응을 구축하여 상기 종양을 근절(eradicate)시키도록 하는 특별한 효과이다. 따라서, 본 발명의 상기 백신은 자연적인 과정을 생성한다.
요약하면, 본 발명의 상기 백신에 의해 야기되는 면역원성 세포-사멸이 상기 암세포들에 대해 투쟁하도록 적응면역계(adaptive i㎜une system)의 활성화를 야기한다. 본 발명의 백신의 하나의 구성요소로서의 상기 면역자극제는 이러한 투쟁을 뒷받침하여 상기 효과가 장기 기억(long-term memory)을 갖는 완전히 전신적인 것이다.
정의
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "은폐된 종양 세포" 또는 "비-면역원성 종양"은 그들 표면 상의 종양 특이적 항원(TSA: tumor specific antigens) 발현의 감소 또는 발현하지 않는 것에 의하여 면역계 탐지(i㎜une system detection)를 탈출한 종양 및 종양 세포들을 포함한다. 은폐 종양 세포는 "휴면 종양 세포(dormant tumor cells)", 산재된 세포 및 미세전이암(micrometastases)을 포함한다. 휴면 종양 세포는 검사 동안에 악성 캐릭터(malignant character)를 나타내지 않고 그리고 항암제 내성(chemo-resistant)이기는 하나, 그러나 열 내성(heat resistant)이지는 않다. 산재된 세포는 혈중에서 저 농도로 순환한다. 이들의 혈중의 낮은 항원 표출 및 농도는 이들의 탐지를 불가능하게 만든다. 미세전이암은 대체로 악성 발달의 가장 위험하고 그리고 비가시적인 부분이다. 현재 사용된 영상화 시스템의 해상도는 단지 이들이 수백만의 세포들로 이루어지는 응집물(aggregates)을 형성한 이후에라야 미세전이암의 검출을 허용한다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "생체 내-백신화(in vivo-vaccination)"은 면역화에 필요한 항원들이 환자의 신체 내에서 발생되는 것을 의미한다. 대부분의 종양-백신은 인공적으로 생산된 항원 또는 시험관 내 실험실 조건(in vitro laboratory conditions)을 사용하여 제조되고 그리고 환자에게 재주입된 환자 자신의 항원을 사용하고 있다. 그러나, 본 발명에 있어서는, 면역화에 필요한 적절한 항원이 생체 내, 즉 환자의 신체에 의하여 생산된다. 따라서, 본 발명의 백신화 방법은 또한 생체 내 백신화 방법으로 불리울 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "원-위치 백신화(in-situ vaccination)"는 면역화, 즉 특정 TSA의 인식이 실제로 종양 내에서 진행되는 것을 의미한다. 대부분의 "전통적인" 종양-백신화에 있어서, 항원들은 기대된 활성의 분자 작용의 위치에서 멀리 떨어진 신체 내에 위치된다. 그러나, 본 발명에 따르면, 면역화 과정은 원-위치 즉, 종양의 자리에서 실행된다. 따라서, 본 발명의 백신화 방법은 또한 원-위치 백신화 방법으로 불리울 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "온건 전신 고열요법(moderate whole-body hyperthermia)"은 전신을 38℃ 내지 39℃의 온도까지 가열하는 것을 의미한다. 이는 또한 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 "발열 범위 전신 가열(fever range whole-body heating)"으로 알려져 있고 그리고 면역계를 부양시키기 위하여 일반적으로 사용되고 있다. 3가지 형태들의 전신 고열요법으로 구분될 수 있다:
- 온건 전신 고열요법(Mild whole-body hyperthermia)은 전신을 약 38℃의 온도에서 가열하는 것을 의미하고;
- 중등 전신 고열요법(Moderate whole-body hyperthermia)은 상기 정의된 바와 같고;
- 극한 전신 고열요법(Extreme whole-body hyperthermia)은 전신을 40℃ 내지 41℃의 온도에서 가열하는 것을 의미하고, 이는 때때로 42℃까지 확장될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "암의 증가된 위험을 갖는 사람(people with increased risk of cancer)"은 유전적 돌연변이의 유전의 결과로서 암에 대하여 뚜렷하게 증가된 감수성(susceptibility)을 갖고 태어난 사람을 의미한다. 유전적 돌연변이는 사람에게 하나 또는 그 이상의 암의 형태들의 감수성을 크게 증가시키기에 충분할 수 있고, 그리고 이러한 감수성은 대대로 전달될 수 있다. 이러한 돌연변이의 유전은 다수의 개개인들이 특정의 형태(들)의 암을 발달하는 가족들이라는 결과를 가져온다. 유전성 암과 연관되는 공지의 유전자들에는 유방암 위험을 증가시키는 이상 BRCA1(aberrant BRCA1) 및 이상 BRCA2 유전자들 및 결정암에 연계되는 HNPCC 유전자가 포함된다. 게다가, 용어 "암의 증가된 위험을 갖는 사람"은 또한 발암물질을 갖는 환경에의 노출에 의하여 일부 돌연변이들을 발달시키거나 또는 발달시킬 가능성이 높으며, 그에 따라 암의 증가된 위험을 갖는 사람을 의미한다. 암에 대한 위험 인자들에의 노출에는 방사선에의 연장된 또는 반복된 노출, 담배 사용, 암-유발 화학약품에의 노출 및 인유두종바이러스(HPV: human papillomavirus)와 같은 암 바이러스로의 감염이 포함될 수 있다. 암의 발달을 촉발할 수 있는 화학약품 및 방사선을 "발암물질(carcinogens)"이라고 부른다. 발암물질은 일련의 유전적 변이(genetic alterations ; "돌연변이")를 개시하고 그리고 세포들이 증식하는 것을 자극하는 것에 의하여 작용한다. 발암물질에의 노출과 암의 발병(onset) 사이에는 수십년의 지연이 있을 수 있다. 노출과 질환의 발명 사이의 이 기간이 지체 시간(lag time)이다. 따라서 지체 시간에서 또는 그 부근에서 발암불질에의 노출에 의해 야기된 암의 증가된 위험을 갖는 사람을 치료하는 것이 본 출원의 하나의 양태이다. 따라서, 이러한 범주의 사람에 대하여 본 발명에 따른 백신이 특히 중요하다.
고주파 기반 방법 및 암(Radio Frequency based Methods and Cancer)
현재, 암의 치료를 위하여 고주파 전류를 사용하는 방법은 고주파전극도자절제술(RFA: radiofrequency ablation method)이며, 이는 본 발명과는 상당히 다른 것이다. 고주파전극도자절제술은 병소(lesion)를 소진시키기 위하여 고주파를 사용하는 침습적인 방법이다. 고주파전극도자절제술은 바늘 형태의 "안테나"를 적용하며(도 1 참조), 이는 고형암 내로 종양 내 삽입되고, 그리고 적용된 국소 전류가 상당히 커서 그에 의하여 종양이 소진되고 그에 의하여 격렬한 괴사가 야기된다.
이러한 조건들은 본 발명에 의해서 엄격하게 회피된다. 고주파전극도자절제술은 심장, 종양 또는 다른 기능장애 조직(dysfunctional tissue)의 전기전도계의 일부가 고주파 교류 전류(high frequency alternating current)로부터 발생되는 열을 사용하여 절제되어 질병(medical disorder)을 치료하는 의료방법이다. 고주파 전류(RF current)(이미 사용된 저주파 교류전류(low frequency AC) 또는 직류전류의 펄스 이상)의 이점은 이것이 신경 또는 심근을 직접적으로 자극하지 않고 그에 따라 종종 전신마취를 필요로 하지 않고 사용될 수 있다는 것이다. 고주파전극도자절제술 방법은 마취과 의사(anesthesiologist), 중재적 방사선사(interventional radiologist) 또는 심장전문의(cardiologists)의 하위 전문분야(subspecialty)인 심전도사(cardiac electrophysiologist) 등과 같은 중재적 통증 전문의(interventional pain specialist)에 의한 영상가이드(image guide)(X-선 스크리닝, CT 스캔 또는 초음파) 하에서 수행된다.
암의 치료를 위하여 고주파 전류를 사용하는 다른 의료방법은 펄스화된 고주파로의 혈관 내 자극(intravascular stimulation)이다(국제특허 공개공보 제WO 2011/078676호를 참조하시오). 이 방법은 고체 및 혈액 유래 종양들(solid and blood borne tumors) 둘 다의 치료에 유용하고 그리고 혈관 내로의 1000Ω 이하의 임피던스를 갖는 바늘-형 전극의 삽입 및 0.1 내지 100밀리초(ms)의 지속시간 및 초당 1 내지 초당 20의 폭발 빈도(burst frequency)를 수반하는 펄스 폭발 중의 10 내지 80V의 전압을 갖는 고주파 범위 내의 전류 펄스들의 전기신호의 전달을 포함한다. 혈관 내 펄스화 고주파 자극이 림프구를 자극하고 그리고 유인하는 것에 의하여 면역계를 촉진시키고 이는 종양 세포들을 공격하는 결과를 가져온다고 언급되고 있다. 혈관 내 고주파 자극은 침습적이고 그리고 전신에서 혈액의 가열을 야기한다. 게다가, 혈관 내 고주파 자극에 의해 유도된 면역반응은 비특이적이다. 따라서, 이러한 의료방법에 의해 영향을 받지 않는 "은폐된" 종양 세포들을 표적하는 면역-반응은 없다.
국제특허 공개공보 제WO 2011/078676호는 또한 백신과의 조합으로 펄스화된 고주파로의 혈관 내 자극을 사용하는 가능성을 개시하고 있다. 그러나, 국제특허 공개공보 제WO 2011/078676호에서 이를 위해서는 펄스화된 고주파로의 혈관 내 자극의 역할이 면역계를 촉진시켜서 백신 요법에 의하여 유도된 면역반응이 증폭되어야 한다. 우리의 지식으로는, 현재까지 여러 암 백신들이 회사들에 의해 개발되고 있으나 그러나 단지 하나의 제품이 말기 전립선암을 위한 완전 승인(미국 식품의약국(FDA)에 의해) 되었다. 프로벤지®(Provenge®)(또는 시푸류셀-티(sipuleucel-T))가 "체외(ex vivo)" 배양된 환자 자신의 혈액 세포들과 PAP-GM-CSF 융합 단백질의 혼합물로 이루어지는 전립선암에 대한 면역요법제이다. 지금까지는, "은폐" 종양 세포에 대한 암 백신이 개발되지 않았다. 따라서, 국제특허 공개공보 제WO 2011/078676호에 의해 개시된 방법은 어떻게 비-침습적인 방법으로 적용된 펄스화된 고주파가 암세포에 대한 기억 및 전신적인 면역반응을 제공하고 그리고 백신요법으로서 사용될 수 있는가에 대한 어떠한 정보도 제공하고 있지 못한다.
면역계 및 암
면역계는 복합한 구조이며, 그의 과정은 이상(irregularities) 및 질환에 대하여 유기체를 보호한다. 이는 내재면역계(innate i㎜une system)와 적응면역계(adaptive i㎜une system)의 2개의 기본적인 하위체계를 갖는다. 내재면역계는 거의 모든 살아 있는 대상체에서 발견되고, 면역-기억(i㎜une-memory)을 발달시키지 않고 그리고 그 작용(반응)은 비-특이적이고 그리고 즉각적이다. 내재면역계의 주요 세포구조들은 마크로파지(식균이 가능한), 비만세포(염증 촉진제(infla㎜atory promoters)를 방출); 과립구(염증에 반응하는 3가지 세포-형태들의 군), 수지상세포(적응 면역-세포, 항원을 제공), 자연살해세포(병원체로 감염된 세포를 파괴)들이다. 유악류(gnathostomatas: 턱이 있는 척추동물)에서 발견되는 적응면역계는 면역학적 기억 및 대개는 반응에 지체-시간을 갖는다. 적응면역계에 속하는 세포들의 주요 군들은 침입자를 중화시키는 B-세포 및 감염된 세포를 파괴하거나 또는 면역-반응을 조직화하는 T-세포들이다.
면역계의 역할들 중의 하나는 종양을 동정하고 그리고 파괴하는 것이다. 인식은 건강한 세포 상에서는 발견되지 않는 종양 세포의 표면 상의 종양 특이적 항원 또는 종양 연관 항원으로 인하여 가능하다. 유전적 돌연변이로 인하여 변형된 구조를 갖는 종양 세포에서 발견되는 임의의 단백질이 종양 항원으로서 작용할 수 있다. 달리, 매우 적은 양으로 정상적으로 생성되나 그러나 그 생산이 종양 세포에서 증가되는 단백질들이 때때로 면역반응을 촉발시킬 수 있다. 이러한 단백질의 하나의 예가 효소 티로시나아제이다. 이들 단백질들이 내생 단백질이기 때문에, 면역반응이 거의 없으나 그러나 세포막 상의 항원 밀도가 충분히 높은 경우, 암세포가 인식되고 그리고 특정의 T-세포에 의해 파괴될 수 있다.
종양 항원의 다른 중요한 부류(class)는 단지 면역계가 충분히 발달하기 이전의 배아 발달의 초기 단계에서 정상삭적으로 생산되어 단백질들 또는 항원들에 대한 자체-내성(self-tolerance)이 발달할 수 없는 단백질들이다. 게다가, 온코바이러스(oncoviruses)에 의해 감염된 세포, 예를 들면, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 및 인유두종 바이러스(HPV),는 전사되고 그리고 그 결과의 단백질 또는 그러한 DNA가 면역반응을 야기할 수 있는 바이러스성 DNA를 포함한다.
종양 세포에 대한 특정의 면역반응은 T-세포를 사용한다. 종양 세포는 종종 감소된 수의 인식가능한 구조들을 발현하거나 또는 심지어 인식가능한 구조들을 은폐하며, 이들은 항원표출세포에 의해 인식될 수 있다. 일부 종양은, 예를 들면, 형질전환인자-β(TGF-β)를 분비하는 것에 의하여 면역-반응을 억제한다. 게다가, 면역 내성이 발달될 수 있고 그리고 더 이상 면역-반응이 암세포에로 지행되지 않는다. 종양은 또한 일부 경우들에서 종양 성장을 촉진하는 마크로파지와 같이 패러독스(paradoxes)를 형성할 수 있다.
기본적인 이론적 공식은 발암을 차단하고 그리고 세포 항상성을 강제로 유지시키는 암 면역-감시(cancer i㎜uno-surveillance)를 제안한다. 개체가 그의 자체 면역계에 의하여 암 성장에 대하여 보호되는 과정이 소위 면역-편집(i㎜uno-editing)이라 불리운다. 염증은 나이가 든 대상체들에서의 종양-발달의 주요 촉진제들 중의 하나가 될 수 있다.
현행 암 요법들은 주로 소위 화학요법(제약품), 방사선요법(이온화 빔), 외과적 수술 및 이들의 조합 등과 같은 소위 "골드 스탠다드(gold standard)"에 초점을 맞추고 있다. 암 치료를 위한 새로운 방법들이 출현되고 있고, 그 중에서도 면역-요법(i㎜une-therapy)이 유망한 것이 되고 있다.
화학-열-요법(chemo-thermo-therapies: 화학요법과의 조합으로의 전신 고열요법)에 있어서, 샤프론 단백질(chaperone protein)의 역할이 중요하다. 샤프론(스트레스-단백질 또는 열-충격-단백질(stress- or heat-shock-proteins) 같은)은 거의 모든 살아 있는 세포에 존재하고 그리고 비-공유적 중첩(non-covalent folding)과 중첩 풀림(unfolding) 및 다른 거대분자 구조들을 조립(assembly) 및 분해(disassembly)를 보조하는 고도로 보존된 단백질이다. 샤프론은 진화의 단계와 무관하게 사실상 모든 살아 있는 유기체들에서 발견된다. 샤프론은 정상적인 그리고 병리생리학적인 상태들 하에서 전방위적으로 발현되나 그러나 세포 생활 중의 동적 평형(열, 여러 가지 병원체 과정, 질환 등과 같은 환경적인 스트레스) 중에서의 임의의 종류의 변화가 그들의 합성을 조절, 거의 대부분 활성화시킨다. 샤프론의 분비는 새로운 도전(challenges)에 대한 세포들 자체를 적응시키는 세포의 "스트레스-응답(stress-answer)"이다. 상향 조절된 세포 성장(up regulated cell growth)의 결과 및 그에 따른 악성 세포의 증가된 단백질 발현으로, 분자상 샤프론이 암성 세포(cancerous cells)에서 고도로 발현되고 그리고 이들 세포 형태들의 생존에 필수적이다. 열충격 단백질(HSP: heat shock proteins)은 세포가 상승된 온도 또는 다른 스트레스에 노출되는 경우에 증가된 발현을 갖는 샤프론의 군이다. 게다가, 여러 HSP들(HSP27, HSP70 및 HSP90)의 유도가 여러 전이암들에서 관측되었고 그리고 HSP90 상동체, GRP94가 전이암 생성의 매개체로서 작용할 수 있다. 게다가, 악성종양을 제거하기 위한 모든 종양학적 치료-법(oncological treatment-method)에 의해 스트레스-단백질 및 열-충격-단백질들이 유도된다. 따라서, 통상의 온열요법, 화학요법, 방사선요법 또는 심지어 광에너지-요법(photodynamic-therapy) 이후 집중적인 샤프론 합성이 검출되었다. 스트레스 적응의 과정에서, 스트레스 단백질의 유도 또는 과발현은 대개 세포사멸에 대한 세포의 유효한 보호를 제공한다. 그러나, 스트레스 단백질의 세포외 발현은 반대로 작용하고 그리고 또한 실제 세포의 결함을 면역계에 신호한다. 게다가, 열치료는 또한 다제-약제 내성(multi-drug resistance)을 야기할 수 있다.
비-열 의존적 영향(non-temperature dependent effects: 주로 전자장 스트레스) 또한 샤프론-합성을 생성할 수 있다. 암 조직의 생검에서의 열충격단백질 징후(HSP manifestation)는 치료 반응에 대한 양호한 임상 지표를 제공할 수 있다.
반면, 샤프론 HSP70은 실제 동적 평형("현상(status-quo)")을 동결시키는 것을 보조하고 그리고 그에 따라 세포외 전해질에서의 세포 통신(cellular co㎜unication)의 재구축을 시도한다. 세포-막 상에서의 샤프론 HSP70 발현이 세포사멸 신호를 이득하고 그리고 면역반응을 향상시킨다는 것이 공지되어 있다. HSP70은 p53 종양-억제유전자(p53 tumor-suppressor)의 활성화에 참여하고 그리고 종양-억제유전자 망막 모세포종 단백질(retinoblastoma protein)과 연관된다.
HSP70의 막 재-국소화(membrane re-localization)는 세포사멸을 촉진하고 그리고 그 기능을 유지하도록 막 "유체"(membrane "fluid")에서 (다른 샤프론 이상의) 매우 중요한 역할을 갖는다. 주로 막의 콜레스테롤-풍부 마이크로-도메인(cholesterol-rich micro-domains)에서의 HSP70의 종양-특이적 막 국소화는 면역반응에서의 자연살해(NK)-세포의 효율적인 활성화의 결과를 가져온다. 광대역(0.2 내지 20㎒) 전자기장이 HSP70 발현을 증가시킨다. 온도에 의한 HSP70 발현의 동일한 증가의 생성은 14배 더 큰 교란을 요구하며, 이는 HSP70 발현과 관련하여 온도-의존적인 것 보다 전자기장의 비-온도 의존적 효과가 크게 이롭다는 것을 개괄하여 준다. 세포외 HSP70의 역할은 생물계의 전체 면역반응에서 증가하는 관심사의 주제이다.
세포 용균 및 세포 괴사에 대하여 특징적인 독소의 방출은 물론 왜곡 과정(distortion process)의 한계들을 야기할 수 있다. 그러나, 세포사멸적 세포-사망 또는 임의의 다른 전신적 면역-반응이 보다 자연적이고 그리고 유독한 합병증들로부터 면역계를 자유롭게 할 수 있을 것이다. 열적으로 유도된 세포사멸 및 자연살해세포의 활성화 둘 다 이러한 임무를 해결하는 데 적절하다.
따라서, 항원표출세포에 의해 인식될 수 있으며, 감소된 수의 인식가능한 구조들을 발현하거나 또는 그 구조들을 은폐하는 종양 세포, 특히 비-면역원성적인 종양 세포를 용이하게 인식하도록 면역계를 지지하는 것이 암치료에서 고도로 유용하다. 이러한 가능성은 또한 전이암 및 정상적으로 치료불가능한 전이암으로 발달한 환자를 성공적으로 치료하는 것을 허용할 수 있다.
본 발명의 목적은 앞서 언급된 가능성을 제공하는 것이다.
이러한 목적은 독립 청구항들의 교시에 의해 해결된다. 게다가 유리한 특징 및 구체예들이 상세한 설명, 실시예들 및 종속 청구항들로부터 명백하게 된다.
본 발명은 암을 앓고 있는 환자의 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료를 위하거나 또는 환자에게 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동(radiofrequency waves)과 함께 면역자극제를 적용하는 것에 의하여 성공적으로 치료된 환자에서의 암 질환의 재발을 방지하기 위한 방법에 관한 것이다.
따라서, 원발암 및/또는 전이암을 앓고 있는 환자 또는 재발의 위험을 갖는 성공적인 암 치료 후의 환자는 국소적으로 또는 전신적으로 면역자극제로 치료되고 그리고 거기에 더해 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 고열요법을 수령한다. 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 고열요법 치료는 1일 또는 매 2일 또는 1주 1회 적용될 수 있거나 또는 필요에 따라 또는 의사(medical practitioner)에 의한 스케쥴에 따라 적용되고 그리고 통상적으로는 매회 1 내지 수시간 소요된다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "용량 결합"은 커패시터 같이 배열을 구축하는 전계 우세(electric field dominance)를 사용하여 전자기 에너지가 부하에 전달된다는 사실을 의미한다. 이 경우에서는 치료되어야 하는 환자인 부하가 커패시터의 일부이고 그리고 커패시터의 좋지 않은 유전물질(lousy dielectric material)로서 작용한다. 전극들이 그들의 임피던스에 의해 매칭된다. 본 발명에서 사용된 방법은 "전도성" 용량 결합, 불완전한 유전물질에서의 유전 기능의 우세 전도부, 대부분의 주울-열 생성을 갖는다. 전극들이 느슨하게 연결되는 경우, 결합이 보다 방사성이 되고 그에 의하여 그의 주울-열 용량을 잃게 된다.
면역자극제와 본 발명에 따른 용량 결합을 사용하는 고주파 파동고열요법 치료의 조합은 환자 자신의 면역계가 원발암 세포 및 전이암 및 전이된 암세포 및 재발 동안에 형성된 단일의 암세포를 인식하고 그리고 이러한 인식 이후 이들 암세포들을 효과적으로 사멸시키는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 암으로 고통받거나 또는 본 발명에 따른 방법으로 또는 본 발명에 따른 방법이 없이 성공적으로 암이 치료된 환자 또는 증가된 암의 위험을 갖는 사람의 원-위치 및 생체 내 백신 방법을 의미한다. 암 및 전이암의 치료 또는 암의 재발을 방지하는 방법에 있어서, 고주파 파동이 적어도 하나의 전극 및 대전극(counter-electrode)을 포함하는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하여 적용되고, 여기에서 환자가 그 사이의 유전물질이 된다.
본 발명의 암의 비-침습적인 치료 및 방지의 방법의 이점들 중의 하나는 고주파 파동의 적용이 방사성 결합(radiative coupling)을 갖는 RF 배열에 있어서와 같은 안테나의 사용을 요구하지 않는다는 것이다. 선행 기술에 대한 본 발명의 방법의 다른 유의미한 이점은 적용된 고주파 파동이 환자의 체온 또는 치료된 영역의 온도를 증가시키지 않는다는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 암의 치료 및 재발을 방지하는 방법은 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 전신적 적용을 포함한다.
상기 방법에서, 면역자극제는 바람직하게는 박테리아 제제(bacterial preparations), 지질다당류(lipopolysaccharides), 바실러스 칼메트-게렝균(Bacillus Calmette-Guerin)의 추출물, 피씨바닐(Picibanil), 앤서(Ancer), 소암평(Xiao-Aiping), 류카인®(Leukine®)(사그라모스팀(sargramostim); 재조합 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자(recombinant granulocyte macrophage colony-stimulating factor)), 사멸된 코리네박테리움 파르붐 박테리아(killed Corynebacterium parvum bacteria) 및 그의 추출물, 사이토카인, 온건 전신 고열요법, 톨-유사 수용기 작용제(TLR receptor agonist agents), TLR 경로에 작용하는 임의의 자연 또는 합성제, 이필리무마브(ipilimumab), 허브 화합물(herbal compounds ; 에케나세아(echinacea) 등) 및 레바미솔(Levamisol)을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법이 면역계가 암세포, 특히 종양 특이적 항원을 은폐하는 것에 의해 면역계를 탈출하기를 시도하는 암세포를 인식하도록 하는 기억을 생성하기 때문에 본 발명의 방법은 특히 암으로 발전할 증가된 위험을 갖는 사람의 백신화에 유용하다.
게다가, 본 발명의 방법은 알려진 바 대로 암의 재발의 높은 가능성이 있는 추정적으로 성공적으로 암이 치료된 환자들의 백신화에 극히 유용하다. 따라서 용어 "재발"은 암이 검출되지 않는 개선의 기간 이후 암 질환 또는 암 질환의 징후 및 증후군의 복귀를 의미한다. 재발이 발생할 가능성은 원래의 암세포의 일부가 초기 치료에서 생존한다는 것이다. 때때로, 이는 암세포가 신체의 다른 부분들에로 확산되고 그리고 치료 이후 즉각적으로 일어나는 추적 동안에 검출되기에는 너무 작았기 때문이다(미세전이암). 본 발명의 방법은 암세포에 대한, 특히 또한 확산 세포에 대한 기억 및 전신적 면역반응을 제공할 수 있고 그리고 백신 요법으로서 사용될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 특히 본 발명에 따른 방법으로 또는 본 발명에 따른 방법이 없이 추정적으로 성공적인 치료 이후의 재발을 방지하는 데 유용하다.
본 발명에 따른 발명은 원발암 및 그의 전이암의 치료를 위하여 그리고 암의 재발의 방지를 위하여 적절하며, 여기에서 암, 원발암, 전이암 또는 암세포는 선암종(adenocarcinoma), 맥락막흑색종(choroidal melanoma), 급성 백혈병(acute leukemia), 청신경초종(acoustic neurinoma), 팽대부암종(ampullary carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 성상세포종(astrocytoma), 기저세포암종(basal cell carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer), 유건종(desmoid tumor), 방광암(bladder cancer), 기관지 내 암종(bronchial carcinoma), 비-소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer), 유방암(breast cancer), 버킷림프종(Burkitt's lymphoma), 코퍼스암(corpus cancer), 원발부위 미상암(CUP: carcinoma of unknown primary)-증후군, 대장암(colorectal cancer), 소장암(small intestine cancer), 소장 종양(small intestinal tumors), 난소암(ovarian cancer), 자궁내막암종(endometrial carcinoma), 뇌실상의종(ependymoma), 상피성 암형(epithelial cancer types), 유잉종양(Ewing's tumors), 위장관간질 종양(gastrointestinal tumors), 위암(gastric cancer), 담관암(gallbladder cancer), 담관암종(gall bladder carcinomas), 자궁암(uterine cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁경부(cervix), 교아세포종(glioblastomas), 부인과 종양(gynecologic tumors), 이비인후 종양(ear, nose and throat tumors), 혈액 신생물 형성(hematologic neoplasias), 모양 세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 요도암(urethral cancer), 피부암(skin cancer), 피부 고환암(skin testis cancer), 뇌종양(brain tumors: 신경교종(gliomas)), 뇌전이암(brain metastases), 고환암(testicle cancer), 뇌하수체 종양(hypophysis tumor), 유암종(carcinoids), 카포시육종(Kaposi's sarcoma), 후두암(laryngeal cancer), 생식세포종(germ cell tumor), 골암(bone cancer), 결직장암종(colorectal carcinoma), 두경부 종양(head and neck tumors: 이비인후 영역의 종양), 결장암종(colon carcinoma), 두개인두종(craniopharyngiomas), 구강암(oral cancer: 구강 영역 및 입술 상의 암), 중추신경계의 암, 간암(liver cancer), 간전이암(liver metastases), 백혈병(leukemia), 안검 종양(eyelid tumor), 폐암(lung cancer), 림프절암(lymph node cancer: 호지킨/비호지킨의(Hodgkin's/Non-Hodgkin's)), 림프종(lymphomas), 위암(stomach cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 악성 신생물 형성(malignant neoplasia), 위장관 악성 종양(malignant tumors gastrointestinal tract), 유방암종(breast carcinoma), 직장암(rectal cancer), 수질아세포종(medulloblastomas), 흑색종(melanoma), 수막종(meningiomas), 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 균상식육종(mycosis fungoides), 비강암(nasal cancer), 신경초종(neurinoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신장암(kidney cancer), 신세포암종(renal cell carcinomas), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas), 핍지교종(oligodendroglioma), 식도암종(esophageal carcinoma), 골용해성암종(osteolytic carcinomas)과 골성형성암종(osteoplastic carcinomas), 골육종(osteosarcomas), 난소암종(ovarial carcinoma), 췌장암종(pancreatic carcinoma), 음경암(penile cancer), 형질세포종(plasmocytoma), 두경부의 편평세포암종(SCCHN: squamous cell carcinoma of the head and neck), 전립선암(prostate cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 직장암종(rectal carcinoma), 망막아세포종(retinoblastoma), 질암(vaginal cancer), 갑상선암종(thyroid carcinoma), 시니버그 질환(Schneeberger disease), 식도암(esophageal cancer), 편평세포암(spinalioms), T-세포 림프종(T-cell lymphoma: 균상식육종), 흉선종(thymoma), 난관암종(tube carcinoma), 안종양(eye tumors), 요도암(urethral cancer), 비뇨기적 종양(urologic tumors), 요로상피암종(urothelial carcinoma), 외음암(vulva cancer), 사마귀 외양(wart appearance), 연조직 종양(soft tissue tumors), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암종(cervical carcinoma) 및 설암(tongue cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 성상세포종(astrocytomas), 교아세포종, 췌장암, 기관지암, 유방암, 대장암, 난소암, 위암, 후두암, 악성 흑색종, 식도암, 자궁경부암, 간암, 방광암 및 신세포암의 치료에 특히 적절하다. 본 출원에 따른 발명은 특히 비-면역원성 종양 또는 암의 치료에 적절하다.
본 발명의 방법에 따른 바람직한 구체예는 암을 앓고 있는 환자의 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료 또는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 소암평을 환자에게 적용하는 것에 의하여 성공적으로 치료된 환자에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 방법을 의미한다.
본 발명의 다른 양태는 암을 앓고 있는 환자에서의 원발암 및 그의 전이암을 치료, 또는 암 질환이 성공적으로 치료된 사람에서의 암 질환의 재발의 방지 또는 암으로 발달할 증가된 위험을 갖는 사람에서의 암의 방지를 위한 적어도 하나의 면역자극제 및 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 이루어지는 백신에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 암 및 그의 전이암의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 면역자극제의 사용을 의미하며, 여기에서 상기 면역자극제는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 적용된다. 게다가, 본 발명은 암을 앓고 있는 포유동물의 치료 또는 추정적으로 성공적으로 암 질환이 치료된 포유동물에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 약물의 제조를 위한 면역자극제의 사용을 의미하며, 여기에서 면역자극제는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 적용된다. 그에 의하여 면역자극제가 여러 비-특이적 면역반응들을 활성화시키고 그리고 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 국소적 효과를 전신적 효과로 전환시킨다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 암을 앓고 있는 환자에서의 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환이 성공적으로 치료된 환자에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 백신의 제조를 위한 면역자극제의 사용과 연관되며, 여기에서 면역자극제는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 환자에게 적용된다. 이 백신은 특히 원-위치 백신화 및 바람직하게는 상기 언급된 암 형태들에 대하여 유용하다.
백신의 면역자극제는 바람직하게는 박테리아 제제, 지질다당류, 바실러스 칼메트-게렝균의 추출물, 피씨바닐, 앤서, 소암평, 류카인®(사그라모스팀; 재조합 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자), 사멸된 코리네박테리움 파르붐 박테리아 및 그의 추출물, 사이토카인, 온건 전신 고열요법, 톨-유사 수용기 작용제, TLR 경로에 작용하는 임의의 자연 또는 합성제, 이필리무마브, 허브 화합물(에케나세아 등) 및 레바미솔을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신은 암을 앓고 있는 환자에서의 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환이 성공적으로 치료된 개인에서의 암 질환의 재발의 방지 또는 암으로 발달할 증가된 위험을 갖는 개인에서의 암의 방지를 위한 적어도 소암평과 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 이루어지는 백신이다.
본 발명의 다른 양태는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 사용되는 경우 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위한 면역자극제와 연관된다. 따라서, 본 발명은 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위한 면역자극제를 의미하며, 여기에서 면역자극제는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 적용된다. 게다가, 본 발명은 암을 앓는 포유동물의 치료 또는 추정적으로 성공적으로 암 질환이 치료된 포유동물에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 면역자극제를 의미하며, 여기에서 면역자극제는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 적용된다. 그에 의하여, 면역자극제가 여러 비-특이적 면역반응들을 활성화시키고 그리고 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 국소적 효과를 전신적 효과로 전환시킨다.
본 발명의 추가의 양태는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 사용되는 경우 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위한 소암평과 연관된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위한 소암평을 의미하며, 여기에서 소암평은 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 사용된다. 게다가, 본 발명은 암을 앓는 포유동물의 치료 또는 추정적으로 성공적으로 암 질환이 치료된 포유동물에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 소암평을 의미하며, 여기에서 면역자극제는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 적용된다.
놀랍게도, 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 사용되는 경우 통상의 면역자극제가 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환의 재발의 방지에 고도로 유용하다는 것이 발견되었다. 본 발명자들은 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동 단독은 원위(far-away)에 위치되는 종양 또는 전이암에 대하여는 어떠한 효과도 갖지 않는다는 것을 볼 수 있었다. 면역자극제(LPS, 소암평) 적용은 또한 종양 퇴행(tumor regression)에 대하여 효과를 갖지 않는다. 그러나, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께의 면역자극제 적용은 앱스코팔 효과(abscopal effect: 조사된 표적으로부터 멀리 떨어진 곳에 미치는 효과)를 제공하고 그리고 원격 위치된 종양들의 수축의 결과를 가져온다. 따라서, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 면역자극제의 조합으로의 적용은 전신적인 효과의 결과를 가져온다.
방사성 결합이 세포를 소각시킬 수 있기 때문에 본 발명은 방사성 결합으로는 작용하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따라 면역자극제와 함께 고주파 파동을 작용하기 위하여 방사성 결합을 갖는 RF 배열에 있어서와 같은 안테나가 사용되지 않는다. 본 발명에 따른 고주파 파동은 적어도 하나의 전극과 적어도 하나의 대전극을 포함하는 콘덴서 배열을 사용하여 적용되며,여기에서 환자는 이들 사이의 유전물질이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 전신적으로 적용되는 고주파 파동과 함께 사용되는 면역자극제를 의미한다.
본 발명에 따라 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동은 환자의 체온 또는 치료된 영역의 온도를 증가시키지 않는다.
모든 통상의 면역자극제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 면역자극제(i㎜unostimulants 또는 i㎜unostimulators)는 임의의 면역계의 구성요소들의 활성화를 유도하거나 또는 활성을 증가시키는 것에 의하여 면역계를 자극하는 물질이다. 본 발명 내에서 다른 항원의 면역반응을 증가시키거나 또는 항원특이성이 없는 면역계의 구성요소를 자극하기 위한 항원특이성(antigenic specificity)과는 무관하게 작용하는 비-특이적 면역자극제가 바람직하다. 본 발명 내에서 유용한 가능한 면역자극제의 예들로는 지질다당류, 바실러스 칼메트-게렝균의 추출물, 피씨바닐, 앤서, 소암평, 류카인®(사그라모스팀; 재조합 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자), 사멸된 코리네박테리움 파르붐 박테리아 및 그의 추출물, 온건 전신 고열요법, 이필리무마브(세포독성 T-림프구-연관 항원 4), 레바미솔, KLH(키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin)), 저-용량 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)(< 0.4㎎/㎏), 십전대보탕(juzentaihoto: JT48) 및 디옥시콜린산(DCA: deoxycholic acid) 들이 있다. 본 발명에 따른 면역자극제는 박테리아 제제, 생물학적 반응 조절물질(biological response modifiers), 톨-유사 수용기 작용제, TLR 경로에 작용하는 임의의 자연 또는 합성제, 허브(herbs) 및 허브 추출물(herbal extracts), 전통 중국약재(T㎝: Traditional Chinese medicine), 십전대보탕(JT48)과 같은 한방약재(Kampo: 중국약재의 일본 적응품)를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 바람직한 면역자극제는 소암평, 류카인®이다.
실시예 14에서 면역자극제 JT48이 사용되었고 그리고 그 결과를 도 48에 나타내었다. 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 적용을 수반함이 없이 면역자극제 단독(TJ-48)의 적용은 거의 효과가 없는 반면, 고주파 치료(RF treatment)(OTM: 온열암요법 치료(oncothermia treatment)) 단독은 상당한 효과를 갖기는 하나 그러나 둘 다 함께, 즉 온열암요법과 함께의 면역자극제는 두드러진 효과를 갖는다. 이전의 절의 면역자극제 등과 같이 여기에서 기술된 임의의 다른 면역자극제를 사용하는 것에 의해서도 동일한 결과들을 얻을 수 있다.
박테리아 제제는 바람직하게는 지질다당류, 바실러스 칼메트-게렝균의 추출물, 피씨바닐(OK-432), 사멸된 코리네박테리움 파르붐 박테리아 및 그의 추출물을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
생물학적 반응 조절물질(BRMs ; 생물학적 제제)은 인체가 자연적으로 생성하는 물질이나, 그러나 역시 생물공학 방법 및 다른 기술들에 의해 동일하거나 또는 매우 유사하게 생산될 수 있다. 이들 물질들은 감염에 대한 신체의 반응을 일으킨다. 생물학적 제제는 바람직하게는 모노클로날 항체, 인터류킨-2, 인터페론, 여러 형태의 집락자극인자(colony-stimulating factors ; CSF, GM-CSF, G-CSF), 인간 종양괴사인자 수용체(human TNF receptor), 흉선 단백질 A(thymic protein A) 또는 흉선 체액 인자(THF: thymic humoral factor)와 같은 신체의 흉선에 의해 생성된 물질 및 이필리무마브(세포독성 T-림프구-연관 항원 4에 대한 항체)를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
허브 및 허브 추출물은 바람직하게는 에케나세아 안구스티폴리아(Echinacea angustifolia)(드린국화(Purple coneflower)), 인삼근, 소암평(마스데니아 테나시씨마(Marsdenia tenacissima)의 추출물, 십전대보탕(JT48) 및 중국황기근(Chinese astragalus root)을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
신체 중의 성호르몬 수준의 변화는 특정의 증후군을 야기한다. 이들은 개인 별로 다르다. 증후군은 온건할 수 있으나 그러나 일부 사람들에 대해서는 중증이고 그리고 치료가 필요할 수 있다. 일부 암(유방암, 전립선암)은 호르몬 감수성이고 그리고 발달하는 데 에스트로겐 또는 테스토스테론을 필요로 한다. 따라서 본 발명에 따른 면역자극제가 호르몬이 없고 그리고 더욱이 성호르몬이 없는 것이 선호된다.
여기에서 기술된 본 발명의 면역자극제는 환자의 면역계를 활성화시키고 그리고 적용된 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 암세포를 인식하고 그리고 사멸시키는 기억을 구축하고 그리고 그에 따라 암 질환의 재발을 방지하는 것에 의하여 암 질환에 대한 백신-효과를 제공한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "백신-효과(vaccine-effect)"는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께의 면역자극제의 적용에 후속하여 환자에 의해 발달된 면역반응에 관한 것이며, 면역반응은 암세포의 항원의 인식 및 암세포의 완전한 근절을 위한 방어메카니즘의 활성화를 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 양태는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 면역자극제를 환자에 적용시키는 것에 의하여 암을 앓는 환자에서의 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암이 성공적으로 치료된 환자에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 비-침습적인 방법에 관한 것이다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "암이 성공적으로 치료된(successfully treated of cancer)"은 호전을 갖는 초기 암 치료 이후 그리고 그 동안에 더 이상 암이 검출되지 않는 기간 내의 환자를 의미한다. 이들 환자들은 암 질환의 복귀에 대한 증가된 위험을 갖는다. 따라서, 예를 들면, 신체의 다른 부분들에로 확산되고 그리고 현재의 진단 방법들에 의해 검출되기에는 너무 작아서 원래의 암세포의 일부가 초기 치료에서 생존하는 것이 가능하기 때문에 이들은 암이 잠재적으로 성공적으로 치료되었다. 종양 특이적 또는 종양 연관 항원들이 검출되고 그리고 면역계에 의해 공격받을 수 없기 때문에 완전히 치유되어 암세포 또는 악성 세포를 갖지 않는 포유동물은 본 발명의 백신 효과가 발달할 수 없다. 게다가, 재발의 위험이 높아서 현재 통상의 암 치료 이후, 심지어 성공적인 외과적 수술 이후 재발을 방지하기 위하여 방사선 요법이 많은 환자에게 적용된다. 본 발명의 하나의 이점은 단지 암에 대하여 감수적인 사람들을 치료하는 부작용의 감소 및 본 발명의 치료의 전신적인 효과이어서 환자의 신체 중에서 이들이 위치되는 위치가 알려져지 않은 확산 세포가 또한 치료될 수 있다는 것이다. 따라서 본 발명에 따른 방법은 초기 암 치료 이후 암세포의 불완전한 제거(imcomplete clearance)의 위험을 갖는 환자에 적절하다.
원발암 및/또는 전이암으로 고통받는 환자 또는 재발의 발달의 위험을 갖는 성공적인 암 치료 후의 환자가 면역자극제로 국소적으로 또는 전신적으로 치료되고 그리고 거기에 더해 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동을 수반하는 고열요법 치료에 적용된다. 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동을 수반하는 고열요법 치료는 필요에 따라, 예를 들면, 1일 또는 매 2일에 1회 또는 1주 1회 적용될 수 있거나 또는 의사에 의한 스케쥴에 따라 적용된다. 용량 결합을 사용하는 고주파 파동을 수반하는 고열요법 치료는 대개는 매회 1 내지 수시간 소요된다. 면역자극제가 또한 필요에 따라 적용된다. 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위한 면역자극제는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 병행하거나 또는 순차적으로 적용될 수 있다. 그에 의하여 병행하는 것은 면역자극제와 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동이 같은 날(12시간 이내)에 환자에 적용되는 것을 의미하나 그러나 또한 면역자극제의 투약과 고주파 파동의 적용이 교호하여 수행되는(12 내지 48시간 사이의 간격) 투약 개요를 의미한다. 순차 적용은 고주파 파동 이전 또는 순차적으로 이후에 그러나 바람직하게는 고열요법 치료 이전에 면역자극제가 투여되는 적용을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동이 먼저 적용되고 그리고 단지 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동 만이 적용되는 이러한 제1 기간 이후에 면역자극제가 부가적으로 적용된다. 예를 들면, 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 제1 적용의 48시간 후 또는 보다 바람직하게는 적용 72시간 후 면역자극제가 처음으로 적용된다. 그 후, 면역자극제 및 고주파 파동 둘 다 병행 적용된다. 따라서 본 발명은 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 사용되고 여기에서 제1 간격에서 고주파 파동만이 적용되고 그리고 후속하는 간격에서 면역자극제가 고주파 파동과 동시적으로 적용되는 경우에서의 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위한 면역자극제를 의미한다. 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 마찬가지로 면역자극제의 투여는 치료 동안 매일, 매 2일 또는 매 3일 반복될 수 있다. 완전 치료의 기간은 환자의 현황(재발의 방지를 위하여 짧게 그러나 유관한 돌연변이로 인한 증가된 위험을 갖는 환자들에 대하여는 아마도 보다 길거나 또는 반복적으로), 암의 종류 또는 원발암의 크기 등과 같은 서로 다른 매개변수들에 의존적이다.
암 치료에서의 고열요법의 사용은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 그러나, 고도로 개인화된 원-위치 백신화가 일어나는 방법으로의 환자의 적응면역계의 활성화는 당해 기술분야의 문헌에서 보고된 바 없다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 암을 앓고 있거나 또는 본 발명에 따른 방법으로 또는 본 발명에 따른 방법이 없이 성공적으로 암이 치료된 환자 또는 증가된 암의 위험을 갖는 사람의 원-위치 및 생체 내 백신화 방법을 의미한다.
본 발명에 따른 암 및 전이암의 치료 또는 암의 재발의 방지의 방법에 있어서, 고주파 파동이 적어도 하나의 전극과 대전극을 포함하는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하여 적용되며, 여기에서 환자는 이들 사이의 유전물질이다.
본 발명의 암의 비-침습적인 치료 및 방지의 방법의 이점들 중의 하나는 고주파 파동의 적용이 방사성 결합을 갖는 RF 배열에 있어서와 같은 안테나의 사용을 요구하지 않는다는 것이다. 선행 기술분야에 비하여 본 발명의 방법의 다른 유의미한 이점은 적용된 고주파 파동이 환자의 체온 또는 치료된 영역의 온도를 증가시키지 않는다는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 암의 치료 및 재발의 방지의 방법은 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 전신적인 적용을 포함한다.
게다가, 본 발명은 또한 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위한 적어도 하나의 면역자극제 및 콘덴서 배열에서의 용량 결합의 고주파 파동으로 이루어지는 백신에 관한 것이다. 적어도 하나의 면역자극제 및 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 조합은 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환의 재발의 방지를 위하여 유용하다.
따라서 본 발명은 또한 적어도 하나의 면역자극제가 콘덴서 배열에서 용량 결합을 적용하는 고주파 파동과 조합하여 적용되는 경우에 환자에서 암세포에 대한 백신화를 달성하기 위한 적어도 하나의 면역자극제의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 면역자극제가 콘덴서 배열에서 용량 결합을 적용하는 고주파 파동과 조합하여 사용되는 경우에 환자에서 암세포에 대한 백신화를 달성하기 위한 적어도 하나의 면역자극제의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 면역자극제가 콘덴서 배열에서 용량 결합을 적용하는 고주파 파동과 조합하여 사용되는 경우에 환자에서 암세포에 대한 백신화를 달성하기 위하여 사용되거나 또는 유용한 적어도 하나의 면역자극제에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 암을 앓고 있는 환자에서의 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환을 성공적으로 치료한 환자에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 백신의 제조를 위한 면역자극제의 사용을 의미하며, 여기에서 면역자극제가 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 환자에게 적용된다. 이 백신은 원-위치 백신화 및 바람직하게는 앞서 언급된 암의 형태들에 대하여 특히 유용하다. 본 발명에 따른 백신은 암으로 발달할 증가된 위험을 갖는 사람의 백신화 및/또는 성공적으로 치료된 암 질환의 재발을 방지하기 위한 환자의 백신화에 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 양태는 암을 앓고 있는 환자에서의 원발암 및 그의 전이암의 치료 또는 암 질환이 성공적으로 치료된 환자에서의 암 질환의 재발의 방지를 위한 백신의 제조를 위한 소암평의 사용을 의미하며, 여기에서 면역자극제가 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께 환자에게 적용된다.
여기에 기술된 임의의 창의적인 용도 또는 방법 내에서, 고주파 파동의 응용 및/또는 적용은 침습적인 단계를 포함하지 않는다. 고주파 파동은 전극 또는 안테나 배열을 환자의 신체 내로 또는 혈류 내로 또는 조직 내로 삽입 또는 이식할 필요가 없이 신체 외부로부터 적용된다. 게다가, 방사성 결합이 사용되지 않고 그리고 바람직하게는 열의 직접적인 적용 또는 생성이 사용되거나 포함되지 않는다(도 1 참조). 본 발명에서 사용되는 파장은 10㎑ 내지 50㎒, 보다 바람직하게는 130㎑ 내지 42㎒, 그리고 가장 바람직하게는 135,6㎑ ± 5%, 339㎑ ± 5%, 678㎑ ± 5%, 1,356㎒ ± 5%, 3,39㎒ ± 5%, 6,78㎒ ± 5%, 13,56㎒ ± 5%, 27,12㎒ ± 5% 및 40,68㎒ ± 5%의 값들이다.
게다가 본 발명은 안테나 배열을 수반하는 방사성 결합에 의해 수행된 바와 같은 상배열 조정(phase array adjustment)을 적용하지 않는다. 고주파 파동은 전극들, 즉, 적어도 하나의 전극 및 적어도 하나의 대전극 사이의 콘덴서 배열 내에서 형성되고, 여기에서 환자의 신체가 유전체(dielectricum: 즉, 유전물질)이다.
게다가, 본 발명은 적어도 하나의 면역자극제 및 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 이루어지는 백신의 적용에 의한 환자의 백신화 방법에 관한 것이다. 이러한 백신화는 환자의 면역계가 지금까지 인식되지 않은 암세포를 인식하도록 하고, 그리고 추가로 환자의 면역계 내에 특히 전이암 형성 동안 신체의 다른 부분들 내의 암세포를 또한 인식하도록 하고 그리고 환자의 성공적인 암 치료 이후 재발되는 신생 암세포를 인식하도록 하는 기억을 생성하는 것을 가능하게 한다. 이러한 종합적인 방법은 원-위치 및 생체 내 개인화된 종양 백신화를 야기하고 그리고 암 질환이 발생하기 이전에 면역계 특히 적응면역계가 암세포 특히 단일 암세포를 인식하고 그리고 제거하고 그리고 전이암을 근절시키고 그리고 성공적인 암 치료 이후 재발되는 신생의 암세포를 인식하고 그리고 제거하도록 하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 면역계가 이전에는 인식되지 않은 암세포 및 전이암을 인식하도록 하고 그에 따라 암세포를 사멸시키고, 종국적으로 원발암 및 그의 전이암의 성공적인 치료 및 악성의 전이암 질환의 재발을 방지하는 것을 유도하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 백신의 작용의 모드는 아마도 하기에서 개괄된 바와 같이 설명될 수 있을 것이다. 본 발명의 백신은 면역자극제 단독에 비해 특정한 방법으로 면역계를 자극한다. 악성의 병소는 내재면역계에 의해 공격받지 않고, 그리고 적응면역계는 종양을 인식할 수 없으며, 따라서 또한 비활성으로 잔류한다. 이것이 단순한 면역자극제가 발달된 악성종양을 파괴하기에 효과적일 수 없는 지의 이유이다. 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동(온열암요법) 단독은 전신적으로 적용되는 경우에 면역계를 자극하고, 따라서 면역자극제와 동일한 비-특이성에 직면하게 된다. 국소적으로 적용된 온열암요법은 세포자멸사 또는 국소 효과를 야기하나, 그러나 보통의 악성종양은 세포의 산재를 압박하고 그리고 전이암 형성은 이러한 치료의 범위 밖이다. 적어도 하나의 면역자극제와 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 이루어지는 본 발명의 백신 또는 조합은 전신에서 악성의 세포를 공격한다.
따라서, 본 발명의 백신이 면역반응을 촉발시키고 그리고 면역계를 활성화시키기 때문에, 본 발명의 백신은 또한 원발암 및 그의 전이암의 치료 및 약한 면역계를 갖거나 또는 억제된 면역계를 갖는 환자에서 암 질환의 재발을 방지하는 데 고도로 유용하다.
하기에서 현재의 종양 면역요법 가능성, 특히 항종양 백신화 방법의 상태의 요약이 제공된다. 표 1(종양-백신화에 대한 임상연구 ; 약어: OS = 전체 생존 기간(overall survival); RR = 응답율(response rate); PFS = 무진전 생존율(progression free-survival); BSC = 최선의 대증치료(best supportive care); DFS = 무질환 생존율(disease free survival))은 현재의 항종양 백신화 가능성을 보여주는 일부 임상시험을 요약하고 있다(문헌 M. Vergati, C. Intrivici, N.-Y. Huen, J.Schlom, K. Y. Tsang, Strategies for Cancer Vaccine Development; J. Biomed. Biotech. 2010, Article ID 596432, doi:10.1155/2010/596432 참조).
백신 임상 종양 환자의 수 주석
바이러스 벡터를 수반하는 백신
PSA-TRICOM Ⅱ 전립선 122 8.5개월 OS, 위약 대비 개선
Ⅱ 전립선 32 16.4개월 초과 OS, 18개월 초과 군 HPS에서 개선
PANVAC-VF Ⅲ 췌장 255 실패 > 기대수명의 환자 OS < 3개월
펩티드를 수반하는 백신
프로벤지
(Provenge)		 Ⅲ 전립선 512 4.1개월 OS 위약 대비 개선
온코파아제
(Oncophage)		 Ⅲ 흑색종 322 M1a 및 M1b 부분개체군(subpopulation)에서 연장된 OS
Ⅲ 신장 818 DFS 및 OS에서 차이 없음
gp100:209-
217(210M)		 Ⅲ 흑색종 185 RR 및 PES에서 유의미한 개선
스티뮤박스
(Stimuvax)		 ⅡB 폐 171 17.3개월 OS, 국소 ⅡB 단계에서 BSC 대비 개선
종양세포 또는 종양세포 용해물을 수반하는 백신
온코박스
(OncoVAX)		 Ⅲ 결장 254 Ⅱ 단계에서 DFS 및 OS에서 유의미한 개선
레니에일
(Reniale)		 Ⅲ 신장 558 DFS 및 OS에서 유의미한 개선
GVAX Ⅲ 전립선 626 도세탁셀(docetaxel) 대비 OS 개선에 실패
Ⅲ 전립선 408 실패. 도세탁셀 단독 대비 조합 아암(combination arm: 백신 + 도세탁셀)에서 보다 높은 사망율
RNA를 수반하는 백신
Pca 세포주로부터의 mRNA Ⅰ/Ⅱ 전립선 19 면역학적 반응
이들 표 1에 나열된 매우 복잡한 탈-위치(off-situ: 원래 있어야 할 위치에 있지 않은) 방법 또는 자동기계장치로 된 직류전류-배양(robotic DC-culturing) 등과 같은 다중의 암 백신화들이 개발되었다. 그러나, 상기 언급된 압 백신은 단지 매우 제한된 상태들에서만 적용될 수 있다. 선행기술 백신의 실패의 주요 이유 및 낮은 효능은 일반적인 경우들에서의 종양-세포의 낮은 면역원성 활성이다. 면역-계는 종양-세포를 인식하거나 또는 동정할 수 없고, 그리고 그에 따라 이들을 제거할 수 없다. 특정의 면역-동정 과정을 수반하지 않는 면역-자극(예를 들면, 인터류킨-2, 인터류킨-8, TNF 등을 수반하는 사이토카인요법(cytokine therapies))은 소정의 효능에 도달할 수 없을 수 있다. 이러한 맥락에서, 본 발명에 따른 암 백신은 암 백신의 분야에서의 공지된 선행기술의 상태 보다 우월하다. 본 발명은 원-위치 및 생체 내 백신화에 관한 것이고 그리고 하기의 이로운 효과들을 생성한다:
1. 본 발명 내에서 적용된 고주파 전계(RF electric field), 특히 진폭변조(AM: amplitude modulated) RR 전계가 면역원성 세포 사멸을 유도한다.
증거:
1.1. 세포자멸체(apoptotic body) 형성을 수반하는 세포자멸 세포 사멸(도 14를 참조)
1.2. 면역원성 DAMP(손상 연관 분자상 패턴)/SAMP(스트레스 연관 분자상 패턴) 형성:
1.2.1. HSP 과발현 및 외재화(externalization)(도 3, 도 18, 도 28 및 도 30 참조)
1.2.2. DR5(사멸 수용체5(Death Receptor5))(종양괴사인자-연관 세포자멸-유도 리간드(TRAIL: tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)) 과발현(도 17 참조)
1.2.3 H㎎B1(고이동성기 박스(high mobility group box)) 외재화(도 15 참조)
1.2.4 칼레티큘린 외재화(Calreticulin externalization)(도 16 참조)
2. 용량 결합을 사용하는 고주파 파동에 의해 유도된 면역원성 세포 사멸이 종양에 대하여 강한 국소 면역 반응을 생성한다. 은폐되지 않은 종양 항원이 항원표출세포에 의해 인식가능하게 되었다. 고주파 파동이 면역원성 세포 사멸을 유도하기 때문에 환자의 독특한 TSA가 수지상세포(DCs)에 의해 제공되어 T-세포가 환자의 악성종양에 대하여 특정의 면역 반응을 생성하도록 한다.
증거:
2.1. 파괴된 종양 조직 주위의 백혈구 침습 고리(leukocyte invasion ring)
2.2. 이러한 고리 내의 T세포의 존재
3. 국소적으로 유도된 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과의 조합의 박테리아 유도 면역자극제(예를 들면, 피시바닐, 앤서, 코리네박테리움 파르붐, 콜리-추출물(Coley-extract), 류카인, 다른 지질다당류-추출물(LPS-extracts) 등과 같은) 등과 같은 면역자극제의 효과가 전신적이다. 따라서, 멀리 있는 전이암이 TSA-부하 수지상세포(TSA loaded DCs)에 의해 활성화된 세포독성 T-세포에 의해 파괴된다.
증거:
3.1. LPS 조사, 인간 앱스코팔 효과, 실험적 앱스코팔 작용(도 4, 도 5, 도 6, 도 29 및 도 40 참조)
본 발명의 방법과 마찬가지로 백신은 전신적 효과를 야기하고(적응면역계가 전신에서 작용함) 그리고 이는 본 발명의 백신의 가장 중요한 이점의 하나, 즉 국소 치료를 전신적으로 만드는 것이다. 본 발명의 전신적으로 작용하는 백신은 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 적용 하에서 존재하였던 은폐된 종양 항원을 발견하고 그리고 극심한 인위적인 열을 야기함이 없이 암을 치료한다. 본 발명의 백신은 인위적인 열을 유도함이 없이 그리고 허약한 환자에 대하여 어떠한 별도의 부담 없이 이러한 면역 지지를 생성한다.
따라서, 본 발명은 심지어 선행기술의 영상화 방법(imaging methods)의 상태로는 검출될 수 없는 산재된 세포 상태들에 있는 원발암 및 그의 전이암의 치료에 유용한 면역자극제에 관한 것이고, 그리고 고주파 파동이 제공되고 그리고 콘덴서 배열에서 용량 결합이 사용되는 경우 또는 그러한 조건 하에서 암 질환의 재발의 방지에 유용하다. 이러한 상태 하의 면역자극제는 인위적인 열을 야기함이 없이 면역계 특히 적응면역계를 활성화하는 전신적인 백신화를 야기하고, 이는 선행기술 방법의 상태로는 검출될 수 없는 전이암 및 원발암의 치료에 특히 유용한 것과 마찬가지로 성공적으로 치료된 암의 재발을 방지하는 데 특히 유용하다.
게다가, 본 발명은 심지어 선행기술의 영상화 방법의 상태로는 검출될 수 없는 산재된 세포 상태들에 있는 원발암 및 그의 전이암의 치료에 유용하고 그리고 환자에 면역자극제의 투여 및 면역자극제가 환자의 면역계를 자극하는 동안 환자를 용량 결합을 사용하는 고주파 파동에 적용시키는 것에 의하여 암 질환의 재발을 방지하기에 유용한 방법에 관한 것이다. 따라서, 면역자극제가 환자의 신체 내에서 활성인 동안, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동이 적용된다.
이러한 효과는 단지 면역자극을 위한 방법으로는 달성될 수 없다. 본 발명에 따르면, 면역자극을 위한 하기의 투여 경로가 사용될 수 있다:
1. 면역자극제의 전신적(피하 근육 내) 투여
2. 면역자극제의 국소(종양 내) 투여(TLR 경로를 통한 직접적인 국소 면역-자극, 교차-제시(cross-presentation) 및 2차 생성된 사이토카인 자극)
3. 종양 내 주입
4. 리포좀에 의한 종양에 대한 표적화된 화합물 전달(전기-감응성 리포좀(electro-sensitive liposomes))
본 발명의 이들 면역자극제들은 직접적으로 종양 병소 내로 주입되거나 또는 전신적으로(경구적으로, 정맥 내로(i.v.) 또는 근육 내로(i.m.)의 주입) 적용된다. 전신적으로 적용되는 경우, 이들은 특정의 종양 표적화 방법(리포좀 담체(liposome carrier), 자기성 표적화(magnetic targeting), 나노입자 담체 등과 같은)에 의하여 종양 병소에로 지향될 수 있다. 면역자극제(예를 들면, 지질다당류 또는 지질다당류-형 물질 등과 같은 박테리아 내독소)가 TLR 수용체 경로를 통하여 작용하는 경우, 지향된 표적화는 강하게 교차-감작(cross-priming)을 심화시킨다. 상기 면역자극제는 종양 특이적 항원과 함께 항원표출세포(예를 들면, 수지상세포)에 결합되고 그에 따라 보다 강하고 그리고 보다 긴 효과적인 면역 반응을 유도한다. 리포좀 전달의 경우에서, 일부 면역학적 부형제(i㎜unological adjuvants)(알루미늄 산화물(알루미나), 제올라이트 등과 같은)가 첨가될 수 있다.
본 발명의 방법의 전신적인 효과는 종양에 대하여 강한 면역 기억을 생성하여 암 질환의 재발을 방지한다. 따라서, 본 발명의 백신은 예방-형 효과를 갖는다. 예를 들면, 결장암 또는 췌장암은 90% 초과(>90%)로 간에 전이암을 생성한다. 이들 경우들에 있어서, 심지어 원발암이 수술로 제거된 경우에도 전이암이 존재할 것 같은 위치가 국소적으로 치료될 수 있다. 본 발명의 백신은 심지어 전이암의 영상화 증거가 없으나 그러나 전이암의 형성 또는 재발이 있을 것 같은 경우에도 적용될 수 있다. 이는 심지어 완전한 차도 이후에도 많은 경우들의 원발암 치료에서 중요하다. 임상 반응 등과 같은 완전한 차도가 완전한 치유를 의미하는 것은 아니고, 단지 현재 영상화 시스템이 특정의 장소 및 특정의 시간에서 악성종양을 볼 수 없다는 것을 의미한다.
본 발명자들은 용량 결합을 사용하는 고주파 파동이 물리적인 자극제로서 유용하고 그리고 보다 정확하게는 원발암 및 그의 전이암의 치료와 마찬가지로 암세포에 대해 특이적인 방어적 면역-반응을 유도하는 것에 의한 암 질환의 재발의 방지에 유용하다. 특히, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동은 정상적으로는 면역계에 의해 인식되지 않는 암세포를 근절하기 위한 백신화로서 유용하다.
선행기술 방법과 본 발명에서 사용된 바와 같은 용량 결합을 사용하는 고주파 파동 간의 가장 중요한 차이점들을 하기에 요약하였다:
고주파전극도자절제술(RFA method: 선행기술의 상태):
- 짧은 파장과 고주파 교류(130㎒ 내지 2400㎒);
- 침습적인 방법(바늘의 종양 내 삽입);
- 단지 국소적 치료만 가능;
- 병소가 소각(burned out)됨 / 종양이 소각됨;
- 단지 열만이 치료적인 효과를 야기함;
- 격렬한 괴사를 야기함;
- 바늘 형태의 "안테나"를 사용;
- 방사성 결합을 사용;
- 튜닝(tuning) 목적으로 상배열 조정을 필요로 함;
- 바늘이 환자의 신체 내에서 초음파 또는 X-선 스크리닝, CT 스캔 등과 같은 영상화 방법으로 안내됨;
- 단지 고형암에 대해서만 유용함.
국제특허 공개공보 제WO 2011/078686호에 의해 기술된 혈관 내 펄스화 고주파 자극은 하기와 같이 특정됨:
- 이는 침습적인 방법임(바늘-형 전극이 혈관 내로 도입됨);
- 이는 림프구를 자극하고 그리고 유인하는 것에 의하여 면역계의 촉진을 야기하는 비특이적인 혈액-치료법임;
- 이는 직접적인 가열의 결과를 가져옴;
- 이는 1㎒의 최대 고주파수를 사용함;
- 이는 광역(macro region)의 가열이라는 결과를 가져옴;
- 이는 세포자멸적 세포-사멸의 유도를 야기하지 못함.
본 발명자들은 본 발명의 효율적인 백신화를 적절하게 만드는 용량 결합 및 콘덴서 배열을 사용하는 고주파 파동(국제특허 공개공보 제WO 2009/092612호, 동 제WO 2010/0437372호)가 하기의 이점들을 갖는 다는 것을 발견하였다:
- 바람직하게는 10㎑ 내지 50㎒의 범위 이내, 바람직하게는 13.56㎒이나 50㎒를 초과하지 않는 고주파 파동이 사용됨; 보다 바람직하게는 10㎑ 내지 45㎒의 범위 이내 그리고 가장 바람직하게는 13.56㎒ 또는 정수로 곱하거나 나누어서, 바람직하게는 40으로 나누어서 얻어진 임의의 값. 따라서, 하기의 주파수들이 가장 바람직함: 13.56㎒, 또는 이 값 13.56㎒의 1/100, 1/40, 1/20, 1/10, 1/2배, 2배 또는 3배 등(즉, 6.78㎒, 27.12㎒ 또는 40.68㎒).
- 침습적인 방법이 아님;
- 전신적인 치료를 가능하게 함;
- 이는 열을 사용하며, 이는 면역자극제 및 활성화된 환자 자신의 면역계와 조합하여 암세포에 대한 투쟁에서 성공하고, 그리고 그에 따라 열과 환자의 면역계와의 상승작용적인 효과를 사용함;
- 이는 (원치않는) 부작용을 야기하지 않음;
- 이는 화학요법 및 방사선요법 등과 같은 통상의 암요법과 조합하여 사용될 수 있음;
- 이는 종양-세포 세포자멸사를 유도함;
- 이는 종양 세포 괴사를 야기하지 않음;
- 이는 콘덴서 배열을 사용하며, 여기에서 전극들 사이의 환자의 신체가 유전물질이고 그리고 전도성 회로로의 일부임;
- 이는 용량 결합을 사용함;
- 이는 초음파 또는 임의의 영상화 방법에 의한 지지를 요구하지 않음;
- 이는 특히 단일 암세포를 파괴하고 그리고 그에 따라 극히 초기의 상태에서 극히 초기의 단계에서의 암을 치료하고 그리고 또한 극히 초기의 상태에서 극히 초기의 단계에서의 암 질환의 재발을 치료하는 데 유용함;
- 이는 면역계에서 암세포를 인식하도록 하는 능력을 유도함. 보다 특별히는, 이는 적응면역계가 암세포를 인식하도록 하고, 그에 따라 적응면역계가 암세포를 인식하도록 하는 장기간 기억을 구축하고 그에 따라 암세포에 대한 백신화를 제공하는 것을 촉발한다. 이것이 모든 공지된 암치료법에 대한 가장 중요한 차이가 될 것이다.
따라서, 본 발명의 백신화 방법은 이러한 예기치 않은 이로운 효과를 갖는 분야에서의 제1 백신화 방법인 "은폐된" 종양-세포의 근절에 특별히 유용하다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 알려진 바와 같이, "은폐" 종양-세포는 면역계가 그 자체로서 이들을 인식하거나 또는 이들을 전혀 인식하지 못함에 따라 가장 공격적인 거동을 제공한다. 3가지 범주들의 은폐된 종양-세포들이 구분될 수 있다:
- 제1 그리고 가장 나쁜 범주는 "휴면 종양 세포"를 포함하며, 이는 조사 동안에는 악성 캐릭터를 보이지 않고, 화학약품 내성이나 그러나 열 내성은 아니다. 이들 세포들은 주로 종양-덩어리 내에 존재하고, 따라서 이들은 원격의 가열에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 대량의 순환하는 혈액과의 집중적인 열교환으로 인하여, 열역학적인 의미에서 단거리(short-range) 효과를 갖는 PRF 혈관 내 자극은 "휴면 종양 세포"에 대하여 어떠한 효과도 가지지 못한다. 그러나, 이들 세포들은 본 발명에 따른 백신화 방법에 의하여 표적화된다.
- 은폐 세포의 제2 범주는 혈액 중에서 순환하는 산재된 세포이다. 이들의 낮은 농도로 인하여, 혈액 중에서의 이들의 존재는 현재 검출되는 것이 불가능하다.
- 은폐 세포의 제3 범주는 미세전이암이다. 미세전이암은 악성 종양 발달의 가장 위험하고 비가시적인 부분들이다. 현재 사용된 영상화 시스템들(양전자단층촬영(PET), 자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영(CT), 단일광자 단층촬영(SPECT), 초음파 등)의 해상도가 수 ㎜의 범위 이내이기 때문에 이들의 해상도는 미세전이암이 수백만개의 세포들로 이루어지는 응집물을 형성한 이후에라야만이 이들 미세전이암들의 검출이 가능하다. 우리의 지식으로는 선행기술 방법들 중의 어느 것도 미세전이암에 영향을 주지 못한다. 그러나, 본 발명에 따른 백신화 방법은 이들 암세포들에 대해 이로운 효과를 제공한다.
게다가, 본 발명은 현재의 영상화 방법들이 전이암을 검출하지 못하는 경우에서조차도 전이암을 치료하거나; 또는 암 질환의 재발을 방지하기 위한 면역자극제를 겨냥하고 있으며, 여기에서 면역자극제는 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 조합하여 적용된다. 고주파 파동은 바람직하게는 바람직하게는 13.56㎒의 RF-전류를 사용하는, 그들 전체 표면에 걸쳐 등전위인 적어도 2개의 전극들의 콘덴서 배열에서 고주파(RF) 파동을 사용하는 임의의 통상적인 고주파 고열요법 장치에 의해 생성될 수 있다(국제특허 공개공보 제WO 2009/092612호 또는 동 제WO 2010/0437372호를 참조하시오). 적어도 하나의 RF-전극 및 적어도 하나의 대전극은 에너지를 표적에로 지향시키기 위한 콘덴서의 부분인 전자기 에너지 전달 수단들이다. 본 발명에서 적용되는 RF 고열요법 장치는 용량 결합, 교류(AC) 및 고주파(RF)를 사용한다.
RF 고열요법 장치에 의해 사용되는 고주파(RF)는 낮고 그리고 50㎒를 초과하지 않는다. 대조적으로, 방사 고열요법 장치는 적어도 100㎒의 고주파를 사용하여야만 하고, 달리는 정밀한 집중(focusing)이 불가능하다. 대체로, 안테나(방사성)는 50Ω(Ohm)으로 최적화되어만 한다(이것이 수용된 표준이다). 이 기능은 튜너에 의해 이루어진다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 6.78㎒, 13.56㎒, 27.12㎒ 또는 40.68㎒ 또는 그 사이의 임의의 값의 저주파가 바람직하다. 대조적으로 통상의 방사성 고열요법은 단파장 및 70 내지 2400㎒의 범위 이내의 고주파를 사용한다.
고주파(RF) 고열요법 장치 자체는 적어도 하나의 고주파 공급원, 증폭기, 센서, 선택적인 패드백 증폭기(feedback amplifier) 및 선택적으로 변조신호발생기(modulation signal generator)를 포함한다. 적절한 RF 고열요법 장치들은 예를 들면 미합중국 특허출원 제13/123,838호 또는 동 제12/863,418호에 개시되어 있다. 본 발명 내에서 사용되는 RF 고열요법 장치는 하기에서 개괄되는 바와 같은 당해 기술분야의 고열요법 장치들과는 상당히 다르다.
당해 기술분야의 고열요법 장치가 미합중국 공개특허 공보 제US 2004/0230263 A1호에 개시되어 있다. 이는 하기의 특징들에 있어서 본 발명에서 적용되는 RF 고열요법 장치와는 다르다:
- 미합중국 공개특허 공보 제US 2004/0230263 A1호의 장치에 있어서, 이극 안테나(dipole antennas)(방사성 결합)가 사용된다. 방사성 RF는 환자를 통하거나 또는 보다 정밀하게는 흡수된 RF 방사를 사용하는 것에 의하여 표적 조직을 통하여 적용된다.
- 방사성 용액 중에서 표적은 회로와는 독립적이고, 피드백은 정재파-비(SWR: standing-wave-ratio) 만에 의해서 이루어지고, 이는 전송된 것과 비교하여 반사된 파워를 측정한다. 본 발명의 RF 고열요법 장치는 이극 안테나를 사용하지 않고; 콘덴서 배열이 사용되고, 여기에서 전극들 사이의 환자의 신체가 용량 회로의 일부인 유전물질이 된다. 이는 회로의 일부로서 표적의 직접적인 제어를 가능하게 하고 그리고 공정을 제어하기 위한 보다 정밀하고 그리고 정확한 피드백을 생성한다. 본 발명에서 적용된 RF 고열요법 장치는 개별 신체 단면을 통한 RF 파동의 적용을 위한 콘덴서 전극(용량 결합)을 사용한다.
- 통상의 고열요법 장치는 소정의 영역 상에의 초점을 조정하기 위하여 안테나들 사이에서의 상-전이된 간섭 및 이들의 정재파 방사의 간섭을 유도한다. 본 발명에서 사용된 장치는 개별 조직들의 전도도 차이를 사용하고(예를 들면, 악성 종양 조직은 건강한 조직 보다 더 높은 전도도를 가짐), 따라서 악성 종양 조직에 대한 초점의 자동적인 선택을 야기한다. 이는 폐 또는 심장과 같은 팽창가능한 기관들 또는 한 시간을 초과할 수 있는 치료 시간 동안에 움직이는 경우에 대해 즉각적인 결과를 가져온다.
- 게다가, 통상적인 장치에서의 초점은 종양의 실제 위치와는 별개로 이전에 초점이 맞추어진 지점에 잔류하는 한편, 본 발명에서 사용된 장치는 RF 전류가 자동적으로 정확한 방향으로 흐르기 때문에 표적의 임의의 움직임도 추적한다.
- 통상적인 장치에 있어서 표적은 방사된 에너지를 흡수하는 전기적으로 독립적인 대상과 같이 처리되고 그에 의하여 소각 및 격렬한 괴사를 야기한다. 본 발명은 표적을 공명 회로 중의 콘덴서의 유전 물질로서 전기 회로의 일부로서 사용한다. 따라서, 다른 방법으로 가열과정이 실행되고 그리고 제어된다. 통상적인 고열요법 장치는 이로운 효과를 달성하기 위하여 오로지 가열 메카니즘 만을 사용하기 때문에 SAR(전자파흡수율(specific absorption rate)) 흡수 에너지를 사용하고 따라서 종양을 가열시키는 것에 의해서 종양 세포가 소각된다. 본 발명은 전계효과에 대한 전위차와 마찬가지로 전류 흐름을 열로 전환시키는 것에 의한 주울열(Q=I2R)을 사용하고, 그에 의하여 암세포에서의 세포자멸을 야기하고 그에 따라 면역계가 면역반응을 촉발하도록 한다. 따라서, 환자 자신의 면역계가 인식된 단일의 암세포에 대해 투쟁하고, 여기에서 투쟁은 투여된 면역자극제로 지지되고, 따라서 특히 어떠한 공지의 진단방법에 의해서도 검출될 수 없는 매우 초기의 초기 단계에 대하여 그리고 치료가 전신적이고 선행기술에서와 같이 국소적이지 않기 때문에 전이암의 치료에 대하여 효과적인 암치료법이 된다.
- 통사적인 고열요법 장치는 치료를 재현하고 그리고 표준화하기 위한 도구로서 단지 온도 만을 제어한다. 대조적으로, 본 발명에서 적용된 장치는 치료조건의 엄격한 제어를 위하여 흡수된 에너지(J/㎏) 및 환자의 전도도(S=1/R)를 사용한다. 통상적인 고열요법 장치는 맹목적으로 치료법의 성공이 전적으로 도달된 온도에 대한 열효과에 의존적이라고 가정한다. 이러한 방법으로는 주로 표적 조직 내에서 괴사가 야기된다. 그러나, 본 발명에서 사용된 장치는 전계효과가 저온에서 세포자멸을 야기하기 때문에 괴사가 일어나는 그러한 높은 온도를 달성하는 것을 요구하지 않는다. 따라서 본 발명에서 적용된 RF 고열요법 장치는 세포자멸을 유도 및/또는 야기하고 그리고 면역계가 암세포를 인식하도록 하고 그리고 이들에 대하여 투쟁하도록 하는 것을 가능하게 하는 것에 의하여 종양의 또는 악성의 조직, 암, 종양 및 특히 전이암 및 단일 암세포들을 치료하는 반면에, 방사성 결합을 사용하는 통상의 장치는 괴사를 유발하고 그리고 심지어 암 발달의 초기 단계 또는 암 재발의 초기 단계에서 전이암 및 단일 암세포를 치료하는 것이 불가능하다. 본 발명에서 적용되는 RF 고열요법 장치는 방사성 결합을 사용하지 않고 그리고 용량 결합을 사용하며, 여기에서 환자가 전기 회로의 일부로서 유전 물질 또는 유전체가 된다.
차이점들은 하기와 같이 요약될 수 있다:
1. RFA 장치는 RF-방사/흡수를 사용함;
2. 본 발명의 백신화는 RF 전류 전도를 사용함;
3. RFA 장치는 방사성 결합을 위한 안테나로서 바늘을 사용함;
4. 본 발명의 백신화는 용량 결합을 위한 전극을 사용함;
5. RFA 장치는 고주파(130㎒ 이상)를 요구함;
6. 본 발명의 백신화는 50㎒ 이하 그리고 바람직하게는 6.78㎒, 13.56㎒, 27.12㎒ 또는 40.68㎒, 그리고 가장 바람직하게는 13.56㎒;의 주파수를 요구함;
7. RFA 장치는 괴사를 야기함(백신화가 불가능함);
8. 본 발명의 백신화는 세포자멸 및 암세포의 인식을 야기하고 따라서 백신화를 유도함;
9. RFA 장치는 침습적으로 그리고 국소적으로 사용됨;
10. 본 발명의 백신화는 침습적이 아니고 그리고 전신적으로 사용됨;
11. RFA 장치는 단지 고형암을 치료하는 데 유용함
12. 본 발명의 백신화는 특히 전이암 및 암 발달의 초기 단계 등과 같이 단리되고 그리고 확산된 암세포를 치료하는 데 유용함.
통상적인 면역치료 백신화 방법은 현재의 기술 상태로는 단지 매우 제한된 조건들에서만 적용가능하다. 양상은 근대기의 여러 요청들에 직면하고 있다. 이는
ㆍ 효과적이고
ㆍ 개별화되어야 하고(특이적)
ㆍ 모든 종양-병소들에 대하여 적용가능하여야 하고
ㆍ 재발 및 전이를 차단하기에 적절하여야 하고
ㆍ 간단하게 적용가능하여야 하고
ㆍ 너무 고가가 아니어야 한다.
이들 기준들은 종래 기술의 종양 백신화 방법으로는 충족되지 않는다. 적용된 치료법들은 대체로 효과적이지 않으며, 단지 일부 특정한 분야에서만 효과적이다. 실패 및 낮은 효능의 주요 이유는 일반적인 경우들에서 종양 세포의 낮은 면역원성 활성에 존재한다. 면역계가 종양 세포를 인식하지 못하고 그리고 그에 따라 이들을 제거하기 위하여 활성적이지 않다. 특이적인 면역 동정 과정(예를 들면, IL-2, IL-8, TNF 등으로의 사이토카인 요법)은 소정의 효능에 도달하기에는 너무 멀 수 있다. 대부분의 치료법들은 탈-위치에서 작용하고, 환자로부터 면역-잠재력을 취하고, 상기 세포를 탈-위치 조종하고 그리고 환자에게 상기 탈-위치 조종된 세포 또는 공을 들여 만든(labor-made) 백신을 되돌려준다. 탈-위치 요법은 매우 복잡하고, 매우 고가이고 그리고 지루하나, 그러나 대부분의 시간이 충분히 효과적이지 않다: 상기 세포의 추가의 재생(과정의 지속)의 상실과 마찬가지로 탈-위치 조종된 세포의 "이질성(foreigness)" 및 낮은 농도는 완전한 작용을 제한한다.
본 발명의 방법(또는 또는 백신화 방법이라 불리움)은 이극 안테나에 의한 것이 아닌 용량 결합에 의해 생성된 고주파 필드(radiofrequency field)를 적용하고 그리고 이 고주파 필드 또는 그의 고주파 파동은 치료된 환자의 면역계가 지금까지는 환자의 면역계에 의해 인식되지 못하였던 암세포를 인식하는 것을 가능하게 한다.
용량 결합에 의해 생성된 고주파 필드 또는 개별적으로 이러한 고주파 필드의 고주파 파동은 암세포에서 스트레스를 야기하고, 이는 암세포들이 그들의 표면 인식 시퀀스를 은폐하는 것을 유지하지 못하게 하거나 및/또는 암세포 내에서 고주파 파동에 의해 생성된 열에 의해 파괴되거나 및/또는 고주파 필드 및 그의 고주파 파동에 의해 세포자멸을 수행하도록 압박하고, 따라서, 환자의 면역계가 더 이상 은폐되지 않은 표면 구조들 또는 파괴되거나 또는 세포자멸사한 암세포의 분해 산물들을 인식하도록 하는 것을 가능하게 한다. 고주파 필드 / 고주파 파동에 더해 투여된 면역자극제가 추가로 면역계가 암세포를 효과적으로 공격하고 그리고 파괴하는 것을 지지한다. 게다가, 면역계의 기억이 생성되고, 그에 따라 면역계가 암세포, 특히 신체의 다른 부위 내의 단일 암세포를 인식하도록 하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 또한 암세포를 직접적으로 사멸시킬 수 있으나, 그러나 무엇보다도 환자의 면역계가 먼저 암세포를 인식하고 그리고 계속해서 암세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 가능하게 하는 방법 또는 백신화 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법 또는 백신화 방법은 면역계가 암세포 및 그에 따라 암 질환에 대해 투쟁하도록 하는 것을 지지하고, 그리고 그에 따라 암, 특히 원발암, 단일의 암세포 및 전이암을 치료하고 그리고 암 질환의 재발을 방지하도록 하는 간접적인 방법으로 고려될 수 있다.
본 발명은 환자 자신의 면역계가 은폐된 암세포를 인식하고 그리고 인식된 암세포를 사멸시키는 것에 의하여 전이암의 치료 및 또한 암 질환 특히 성공적으로 치료된 이후의 암 질환의 재발을 방지하기 위한 것과 마찬가지로 원발암에 대한 면역자극제, 백신 및 백신화 방법을 제공한다. 본 발명의 백신화 방법은 매우 민감하고 그리고 면역계가 암세포들이 당해 기술분야의 어떠한 분석적인 방법에 의해서 검출될 수 있기 이전에 암세포를 인식하도록 하는 것을 가능하게 한다. 게다가, 여기에서 기술된 백신화 방법의 매우 낮은 독성 및 매우 낮은 부작용으로 인하여, 이 방법은 암 질환의 재발을 방지하기 위하여 암 질환의 치료 이후에도 사용될 수 있다.
우리의 명명법에 있어서 "생체-내"는 적절한 항원 형성이 환자의 신체 내에서 이루어지고, 따라서 침습적인 과정이 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 백신화 방법은 또한 생체 내 백신화 방법이라고 불리울 수 있다. 원-위치라는 명명은 면역화 즉, 특정의 TSA의 인식이 실제로 종양 내에서 진행되는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 백신화 방법은 또한 원-위치 백신화 방법 또는 원-위치 및 생체-내 백신화 방법이라고 불리울 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "개인화(personalized)"는 면역화가 환자 자신의 TSA(종양 특이적 항원)로 수행된다는 사실을 의미한다. 상기 언급된 바와 같이, 대부분의 종양 백신화는 인공의 항원들을 사용하며, 이들은 많은 경우들에 있어서 환자 자신의 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 연관 항원(TAA)과 동일하지 않다. 대부분의 경우들에 있어서, 주요 도전과제는 면역 효과를 위한 일반적인(개인화되지 않은) 단백질 또는 단백질-칵테일(protein-cocktails)의 사용이며, 이들은 일부 환자들 및 일부 종류의 암들에 대하여 효과적일 수 있으나, 그러나 전체에 대해서는 효과적이지 않고 거리가 멀다. 이들 조건들은 치료를 제어불가능하게 그리고 예측불가능하게 만든다. 본 발명에 따르면, 백신화가 인공적인 것이 아닌 환자의 악성종양의 세포의 자체의 독특한 단백질 분자 패턴을 사용한다. 본 발명의 백신화는 실제의 그리고 정밀한 면역 동정을 위하여 환자 자신의 매우 개인적인 그리고 비할 데가 없는 TSA "칵테일"을 생성한다. 당해 기술분야에서 이러한 개인화된, 간단하고 그리고 저렴한 종양 백신화는 존재하지 않는다. 현존하는 과정들은 너무 정교하고, 고도로 복잡하고, 매우 고가이고 그리고 좀처럼 효과적이지 않다. 예를 들면, TSA는 수술로 제거된 시료(out-operated specimen)로부터 수득될 수 있다. 수지상세포(DC)로의 그의 시험관-내 인식 과정 이후, 그리고 특정의 면역 활성화 이후, "백신"이 직접적으로 종양 내로 주입되거나 또는 전신적으로 환저에게 투여된다. 본 발명의 백신화는 고도로 특이적인 면역원성 세포 사멸을 유도한다. 본 발명의 백신화 방법은 또한 개인화된 원-위치 백신화 방법 또는 개인화된 생체 내 백신화 방법 또는 개인화된 원-위치 및 생체 내 백신화 방법이라고 불리울 수 있다.
용어 "세포자멸 유도(apoptosis induction)": 본 발명의 백신은 세포자멸체 형성(apoptotic body formation)을 수반하는 특정의 면역원성 세포자멸을 유도할 수 있다. 세포자멸체(환자의 바로 자신의 TSA들을 포함하여 종양 세포 성분으로 담지된)는 적절한 APC(항원표출세포, 수지상세포들)에 의해 쉽게 식균될 수 있다. 과거의 연구결과들은 스트레스-유발 세포자멸사의 주요 면역-자극 효과를 보여주고 있다. 이 과정에서 생성된 세포자멸체는 특정의 TSA와 함께 대량의 HSP들을 포함한다. APC에 의한 이들 식균작용은 강한 그리고 특이적인 면역반응을 유발한다.
용어 "DAMP/SAMP": 본 발명의 백신은 종양 세포 내에서 일측면 상에서 면역 자극적이 될 수 있고 그리고 타측면 상에서 종양 세포의 면역 인식을 촉진할 수 있는 손상-연관 분자상 패턴 분자(DAMP: Damage-associated molecular pattern molecules) 및 스트레스-연관 분자상 패턴 분자(SAMP: stress-associated molecular pattern molecules) 등과 같은 독특한 분자 변화를 유도할 수 있다. 비록 신속하게 식균작용되는 경우, 세포자멸 세포가 면역반응을 촉발하지 않는 침묵 사멸(silent death)을 수행하는 것으로 여겨졌으나, 최근 새로운 개념의 면역원성 세포 사멸(ICD: i㎜unogenic cell death)이 출현되었다. ICD의 면역원성 특성들은 표면-노출된 칼레티큘린(CRT: calreticulin), 분비된 ATP 및 방출된 쾌속군단백질 B1(H㎎B1: high mobility group protein B1)을 포함하는 손상-연관 분자상 패턴(DAMPs)에 의해 주로 매개된다.
용어 "HSP 과발현": HSP 샤프론 단백질은 종양 면역학적 과정에서 중요하고 그리고 1차적인 역할을 갖는다. Hsp70 및 Hsp90 등과 같은 세포기질(cytosol) 및 gp96 등과 같은 소포체(ER: endoplasmic reticulum)의 HSP는 세포 내에서 발생된 항원성 펩티드를 결합한다. 이들 항원성 펩티드들은 HSP들에 의하여 림프구에로의 제공을 위한 세포 표면 상에 존재하는 주조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자들에로 수송된다. 게다가, HSP들에 의해 보호된 펩티드들이 세포 밖으로 방출되고 그리고 이들 HSP-펩티드 복합체들이 APC들, 즉, 마크로파지 및 수지상세포들에 의해 수용체-매개 내포작용을 통하여 취하여진다. 따라서 HSP들이 항원표출세포들에 의하여 항원 인식을 촉진한다. 용어 "HSP 과발현" 및 "HSP 외재화(HSP externalization)"은 하기를 의미한다: 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과 함께의 면역자극제의 적용에 의하여 여러 HSP 단백질들이 악성종양의 세포들 내에서 증가된 비율로(미치료된 세포들의 비율 이상으로) 발현되고 그리고 추가로 보다 많은 HSP들이 세포 표면 상에 제공되거나 또는 이들 세포들에 의해 분비된다.
용어 "TRAIL (DR5) 과발현"은 TRAIL을 인코딩하는 유전자의 증가된 발현을 의미한다: 많은 간행물들에 따르면 이 분자는 항종양 면역 반응에서 중요한 역할을 갖는다. 본 발명의 백신에 의해 생성된 종양 왜곡(tumor distortion)은 그러한 DAMP 및 SAMP를 야기하고, 이는 환자 자신의 종양 특이적 항원(TSA)의 방출에 의한 주요 종양 특이적 면역 반응의 결과를 가져온다. 이러한 방식으로, 백신화가 원-위치에서 이루어지고 그리고 그의 성공을 위하여 노력이 드는 조작이 필요치 않다. 본 발명의 백신화는 특히 다른 면역 자극 과정과 함께 적용되는 경우에 상기 나열된 백신화의 요건들 전부를 만족시킨다. 본 발명의 백신화는 전신적으로 영향을 미치고(앱스코팔 또는 방관자 효과(bystander effect)) 그리고 특히 다른 면역 자극 과정과 함께 적용되는 경우에 치료가 산재된 악성종양 세포에 대하여 그리고 또한 원거리 형성 전이암에 대하여 활성이다. 유도된 면역 반응은 또한 적절한 면역 기억을 형성하고 이는 질환, 즉 암 질환의 재발을 차단한다.
본 발명의 백신의 이점을 다음과 같이 요약하였다:
ㆍ 면역원성 세포자멸체 형성
ㆍ TSA-HSP 교차-감작
ㆍ APC에 의한 효과적인 항원 인식
ㆍ APC 세포 활성화 및 성숙(maturation)
ㆍ APC에 의한 특정의 세포독성 T세포 활성화
ㆍ 치료된 암으로부터 멀리 떨어진 원거리 전이암의 파괴
ㆍ 종양 회귀 및 암 재발을 방지하는 특정의 면역 기억의 발달.
본 발명의 백신화는 통상의 암 치료 전략들에 의해서는 도달될 수 없는 효과들을 달성한다. 본 발명의 백신의 작용의 하나의 모드는 아마도 다음과 같이 설명될 수 있을 것이다: 본 발명의 백신화에 의해 생성된 세포자멸체 중의 TSA들이 APC들에 의해 도달가능하게 된다. 본 발명의 백신으로의 치료의 강한 스트레스에 의한 TSA의 동정 및 보조의 HSP 풍부화(enrichment)로 인하여, APC들이 하기를 포함하는 뚜렷한 면역 반응들을 유도한다:
1. 환자의 특이적인 TSA 정보를 수득하기 위한 세포독성림프구(CTL) 시스템의 활성화. 이 면역 반응은 원거리 전이암 내의 또는 산재된 형태 내의 악성종양의 세포을 발견하고 그리고 파괴하는 것을 허용한다.
2. 후기의 악성종양의 재발의 차단의 결과를 가져오는 유효한 면역 기억의 생성.
완전한 과정이 면역자극제들에 의해 잘 촉진되며, 이는 국소적 효과를 전신적 효과로 전환시킨다. 앱스코팔(방관자) 효과가 지향되고 그리고 제어될 수 있다.
본 발명에 의하여 하기의 원발암 형태들의 치료가 달성될 수 있고 그리고 하기의 암 형태들의 전이암들이 치료될 수 있고 그리고 또한 하기의 암 형태들의 재발이 방지될 수 있다: 선암종, 맥락막흑색종, 급성 백혈병, 청신경초종, 팽대부암종, 항문암종, 성상세포종, 기저세포암종, 췌장암, 유건종, 방광암, 기관지 내 암종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 유방암, 버킷림프종, 코퍼스암, 원발부위 미상암-증후군, 대장암, 소장암, 소장 종양, 난소암, 자궁내막암종, 뇌실상의종, 상피성 암형, 유잉종양, 위장관간질 종양, 위암, 담관암, 담관암종, 자궁암, 자궁경부암, 자궁경부, 교아세포종, 부인과 종양, 이비인후 종양, 혈액 신생물 형성, 모양 세포성 백혈병, 요도암, 피부암, 피부 고환암, 뇌종양(신경교종), 뇌전이암, 고환암, 뇌하수체 종양, 유암종, 카포시육종, 후두암, 생식세포종, 골암, 결직장암종, 두경부 종양(이비인후 영역의 종양), 결장암종, 두개인두종, 구강암(구강 영역 및 입술 상의 암), 중추신경계의 암, 간암, 간전이암, 백혈병, 안검 종양, 폐암, 림프절암(호지킨/비호지킨의), 림프종, 위암, 악성 흑색종, 악성 신생물 형성, 위장관 악성 종양, 유방암종, 직장암, 수질아세포종, 흑색종, 수막종, 호지킨 질환, 균상식육종, 비강암, 신경초종, 신경아세포종, 신장암, 신세포암종, 비-호지킨 림프종, 핍지교종, 식도암종, 골용해성암종과 골성형성암종, 골육종, 난소암종, 췌장암종, 음경암, 형질세포종, 두경부의 편평세포암종(SCCHN), 전립선암, 인두암, 직장암종, 망막아세포종, 질암, 갑상선암종, 시니버그 질환, 식도암, 편평세포암, T-세포 림프종(균상식육종), 흉선종, 난관암종, 안종양, 요도암, 비뇨기적 종양, 요로상피암종, 외음암, 사마귀 외양, 연조직 종양, 연조직 육종, 빌름스 종양, 자궁경부암종 및 설암. 예를 들면, 성상세포종(astrocytomas), 교아세포종, 췌장암, 기관지암, 유방암, 대장암, 난소암, 위암, 후두암, 악성 흑색종, 식도암, 자궁경부암, 간암, 방광암 및 신세포암의 치료에 특히 적절하다.
환언하면, 여기에 기술된 백신화 방법은 환자의 면역계가 상기 언급된 암 형태들과 투쟁하도록 하거나 또는 상기 언급된 암 형태들의 암세포를 사멸시키는 것을 가능하게 하고 그리고 지지한다.
게다가, 본 발명의 백신은 어떠한 심각한 부작용도 갖지 않거나 또는 야기하지 않으며, 따라서 본 발명의 백신화는 하기의 화학요법제들 중의 하나 또는 그 이상을 수반하는 화학요법 등과 같은 통상의 암치료법과 결합되기에 적절하다: 악티노마이신 D(actinomycin D), 아미노글루테치미드(aminoglutethimide), 암사크린(amsacrin), 아나스트로졸(anastrozol), 퓨린 및 피리미딘 염기의 길항제, 안트라사이클린(anthracycline), 방향화 효소 억제제(aromatase inhibitors), 아스파라기나아제(asparaginase), 항에스트로겐(antiestrogenes), 벡사로텐(bexaroten), 블레오마이신(bleomycin), 부세렐린(buselerin), 부설판(busulfan), 캄토테신 유도체(camptothecin derivates), 카페시타빈(capecitabin), 카보플라틴(carboplatin), 카무스틴(carmustine), 클로람부칠(chlorambucil), 클라드리빈(cladribin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabin), 사이토신아라비노사이드(cytosinarabinoside), 알킬화 정균제(alkylating cytostatics), 다카바신(dacarbacin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin: 아드리아마이신(adriamycin)), 독소루비신 리포(doxorubicin lipo: 리포독스), 에피루비신(epirubicin), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드(etoposid), 엑세메스탄(exemestan), 플루다라빈(fludarabin), 플루오로우라실(fluorouracil), 엽산 길항제(folic acid antagonists), 포메스탄(formestan), 젬시타빈(gemcitabin), 글루코코르티코이드(glucocorticoides), 고세렐린(goselerin), 호르몬 길항제(hormone antagonists), 하이캄틴(hycamtin), 하이드록시우레아(hydroxy urea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamid), 이마티니브(imatinib), 이리노테칸(irinotecan), 레트로졸(letrozol), 류프로렐린(leuprorelin), 로무스틴(lomustin), 멜팔란(melphalan), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 밀테포신(miltefosin), 미토마이신(mitomycine), 유사분열 억제제(mitosis inhibitors), 미토크잔트론(mitoxantron), 니무스틴(nimustine), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 펜토스타틴(pentostatin), 프로카바신(procarbacin), 타목시펜(tamoxifen), 테모졸로미드(temozolomid), 테니포시드(teniposid), 테스토락톤(testolacton), 티오테파(thiotepa), 티오구아닌(thioguanine), 국소이성화효소 억제제(topoisomerase inhibitors), 토포테칸(topotecan), 트레오설판(treosulfan), 트레티노인(tretinoin), 트립토렐린(triptorelin), 트로포스파미드(trofosfamide), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 세포독성 활성을 갖는 항생제.
약어:
APC: 항원표출세포
CTL: 세포독성림프구
DAMP: 손상 연관 분자상 패턴
DC: 수지상세포
DR5(TRAIL): 사멸 수용체(종양괴사인자-연관 세포자멸-유도 리간드)
GM-CSF: 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자
H㎎B1: 고이동성기 박스
HSP: 열충격 단백질
IHCH: 면역이력화학적 분석
IL: 인터류킨
LPS: 지질다당류
NK: 자연살해 세포
OTM: 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동)
SAMP: 스트레스 연관 분자상 패턴
TAA: 종양-연관 항원
TLR: 톨 유사 수용기
TNF: 종양 괴사 인자
TSA: 종양 특이적 항원
도 1은 RFA 방법이 어떻게 작용하는 지를 나타내는 도면이다: 안테나 바늘이 고형암 내로 삽입되고 그리고 적용된 국소 고주파 전류에 의해 열이 발생되고 이는 종양을 소각시키고 그리고 격렬한 괴사를 야기한다. RFA는 고주파 전류를 사용하여 열을 생성하고 그리고 그에 따라 방사성 결합을 사용하는 안테나 배열에 의한 삭마(ablation)를 야기하는 침습적인 방법이다.
도 2는 해부된 종양의 슬라이드 상의 HE-염색을 나타내는 도면이다. 종양 주위에 명백한 침습 고리(화살표)가 나타남을 볼 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치료 이후 강한 면역 반응이 발생한다.
도 3은 본 발명에 따라 치료된 종양에서 다른 HSP(도 3a: HSPA1A, 도 3b: HSPA6, 도 3c: HSPA8, 도 3d: HSPD)의 과발현을 나타내는 도면이다. HSP 생산은 mRNA 수준으로 측정되었다(B는 치료된 종양에서의 HSP 생산에 대응하고(흑색), A는 미치료된 종양에서의 HSP 생산에 대응하고(회색), CTRL은 미치료된 대조군이다). 회색선은 미변화된 수준에 대응한다.
도 4는 본 발명의 백신이 생쥐에서 전신적인 효과를 제공한다는 것을 입증하는 도면이다. LPS(대장균으로부터의 지질다당류, 100㎕ 살솔 용액(Salsol solution) 중의 100㎍ LPS)의 전신적인 적용은 미치료된 원거리 종양 역시 매우 큰 세포 사멸 효과를 가져온다.
도 5는 실험을 위하여 사용된 생쥐-모델을 나타내는 도면이며: 자성(female) 누드 생쥐 BALB/c (nu/nu)에 대하여, 2개의 대칭적, 원거리 종양들이 양측의 대퇴 영역에의 종양 성장을 유발하기에 적절한 0.1㎖의 무혈청 배지 중의 6 X 106세포의 적용에 의해 유발되었다. 대칭적으로 그리고 거의 동일한 크기의 종양들이 발달한 생쥐들만이 사용되었다. 우측 종양만 치료되었다.
도 6은 인간 치료에 사용된 경우에서 본 발명의 전신적인 효과를 나타내는 도면이다. 환자는 비-소세포 폐암으로 진단되었고 그리고 원발암의 위치로부터 멀리 떨어져서 위치된 목 안, 요추 내, 겨드랑이 내 등에 여러 전이암들이 존재한다. 단지 용량 결합을 사용하는 고주파로 원발암 만이 치료되었으나(싱글 슛(single shoot), 30분, 42℃), 용량 결합을 사용하는 고주파와의 조합의 GM-GSF(류카인®)의 적용이 또한 원거리 전이암에 대하여 이로운 효과를 갖는 전신적인 효과의 결과를 가져왔으며, 이들은 사라졌다.
도 7은 누드 생쥐들에서의 치료된 그리고 원거리 종양들 둘 다에서의 카스파아제-3 활성의 증가를 나타내는 도면이다. 세포자멸 신호-경로의 중요한 표지(marker)인 카스파아제-3가 누드 생쥐들에서의 치료된 그리고 원거리의 미치료된 종양들 둘 다에서 증가되었으며, 따라서 본 발명의 백신화의 전신적인 효과를 나타내고 있다.
도 8은 싱글 슛, 30분, 42℃, 누드 생쥐 이종이식(HT29 인간 결장)의 시-계열을 나타내는 도면이다. 매 지점은 3개 이중(3 double)의 종양-함유 동물들을 나타낸다. 치료 이후 시간(X-축 상에 표시됨)에서 동물들을 희생시켰다. 24시간 이후(삽입은 처음 8시간에서는 효과가 나타나지 않음) 세포자멸이 개시되고 그리고 치료된 그리고 원거리 미치료된 종양-사멸 간의 차이가 낮아지고, 국소 치료에서 멀리 떨어져서 작용이 개시된 것으로 관측되었다.
도 9a는 동물(생쥐)의 치료를 위하여 사용된 실험 구성(experimental setup)을 나타내고; 도 9b는 온도 측정 센서 탐침을 수반하는 치료 적용기 시스템을 나타내고 있다. 하나의 대전극은 반짝이고 그리고 동물 아래에 위치하고 그리고 제2 전극인 동물 위의 둥근 적용기이고 이는 치료 영역으로 이동될 수 있다.
도 10은 샘플 평가 과정의 요약을 나타내는 도면이다. 도 10a는 종양 해부의 방법을 나타내고; 도 10b는 모든 DAMP 연관 단백질 배열과 함께 막대한 수의 mRNA 전사체들, 35개의 세포자멸 연관 단백질들, 많은 형태론적 인자들을 포함하는 종양 샘플 분석 개요를 나타낸다.
도 11은 측정된 분자들과 함께 전형적인 시간 경과 시험 세트를 나타내는 도면이다.
도 12는 세포자멸의 증거로서의 TUNEL 분석의 결과를 나타내는 도면이다. 청색은 표준 DAPI 염색(세포 핵들)이고 녹색은 TUNEL FITC이다.
도 13은 어떻게 시간 경과 조사가 시간 척도 작용들에 완전하게 대응하는 세포자멸의 과정을 충분히 입증하는 지를 보여주는 도면이다.
도 14는 어떻게 세포자멸체들이 온열암요법 치료에 따라 유도되는 지를 나타내는 도면이다. 막대한 수의 세포자멸체들이 미치료된 세포들에 비하여 치료된 세포들에서 관측될 수 있다.
도 15는 온열암요법 치료에 따라 H㎎B1 제공 및 세포외 기질에로의 방출을 나타내는 도면이다.
도 16은 칼레티큘린 발현(치료 후 4시간)을 나타내는 도면이다. 칼레티큘린은 온열암요법으로 치료된 세포들의 세포막 상에 발현되어(용량 결합을 사용하는 고주파 파동) DAMP에 대한 최적의 상태를 생성한다.
도 17은 단백질 수준 측정 및 면역형광 검출에 의한 TRAIL-R2의 발현을 나타내는 도면이며:
A는 세포자멸 단백질 분석에서 측정된 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료 8시간 후의 HT29 이종이식 종양 샘플에서의 TRAIL-R2의 상향조절(upregulation)을 나타낸다. 이중의 돗트 블럿(double dot blots)들은 복제된 항체 프로브들을 나타내고 그리고 파선은 미치료된 대조군들에서의 상대적인 TRAIL-R2 발현을 나타낸다.
B는 반대의 다리들의 미치료된 종양들(하부 열)에 비하여 치료 8시간 후에서의 종양 세포 막들(상부 열) 내에서의 TRAIL-R2 단백질의 강한 발현을 나타낸다. 사각형들 내의 영역들은 보다 높은 배율로 절단면들을 강조하였다(중간 행). 좌측 행에서, 신호 세기가 표준 양성 문턱값을 초과하는 영역(마스킹된 영역)을 둘러싸는 선들은 히스토퀀트 소프프웨어(HistoQuant software)로 측정되었다(우측 행). 상대 마스킹 영역(rMA: relative mask areas)들은 마스킹 영역(MA)들의 평균들을 전체 면적의 평균들로 나누는 것에 의하여 산출되었다. 막대는 좌측 행에서 50㎛, 중간 행에서 15㎛ 그리고 우측 행에서 10㎛를 표시한다.
C. 그래프는 치료 8시간 후 및 14시간 후 둘 다에서 미치료된 종양들(회색 기둥들)에 비하여 치료된 종양들(흑색 기둥들)에서 TRAIL-R2 단백질 발현의 유의미하게 증가된 rMA 값들(**p<0.01)을 나타내고 있다.
도 18은 HSP70의 면역형광 검출을 나타내는 도면이다.
도 18a는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료 14시간 후 HSP70의 발현을 나타내고;
도 18b는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료 72시간 후 세포외 기질에로의 HSP70의 방출을 나타낸다.
도 19는 DAMP 형성 동안의 HSP70 동력학을 나타내는 도면이다. HSP의 완전한 시간 이력이 요약되었고 그리고 2개의 독립적인 발달들이 관측될 수 있었다:
- 제1 발달은 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료 48시간 후 종료되었고 그리고 직접적인 HSP70 열-유도에 연관된다;
- 제2 발달은 그 후 개시되어 DAMP의 일부로서 면역원성 세포-사멸에 기여한다.
도 20에서 인간 유전자의 유전자-칩(gene-chip)은 6500개의 유전자들을 갖고 그리고 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료 4시간 후에 이들의 47000개의 전사체들이 분석되었다.
도 21은 프로테옴 프로파일러™ 인간 세포자멸 분석 키트(Proteome Profiler™ Human Apoptosis array kit) 분석의 개요를 나타내는 도면이다:
A는 어레이 칩(array chip) 상에서 측정된 샘플들을 나타내고;
B는 어레이 상의 검사된 단백질들을 나타내고;
C는 단백질 발현 수준 분석을 위한 정량적인 방법을 나타낸다.
도 22는 사멸 유도 경로들에 관여된 단백질들의 발현에 대한 고주파 파동으로의 치료의 효과를 나타내는 도면이다. 이들 결과들은 세포-막 연관 세포자멸 경로의 실현을 위한 추가의 증거들을 구성한다.
도 23은 HT29 세포에 대한 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 단일의 샷(single shot) 치료(30분, 42℃) 후 경과된 시간(h)에 따른 관측들을 요약한 도면이다. 치료에 의해 유도된 가장 중요한 단백질이 동정되었다. 표시된 바와 같이, 세포자멸은 치료 48시간 후에 종결되었고, 그리고 전이 영역(transition zone) 이후 면역 반응들이 관측되었다.
도 24는 실험의 측정 구성(measurement set-up) 및 온도 패턴을 나타내는 도면이다.
도 25는 샘플의 평가의 실시예를 나타내는 도면이다.
도 26은 본 발명에 의해 제공되는 전형적인 앱스코팔 효과에 대한 증거를 나타내는 도면이다.
도 26a는 시험군들에서의 종양들의 평균 상대적 사멸 영역(average relative dead area)을 나타낸다.
도 26b는 시험군들에서의 종양들의 치료/미치료된 상대적 사멸 영역비를 나타낸다. 따라서, 소암평과 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 조합된 적용(Xi-OTM)은 종양들 둘 다에 대하여 이로운 효과를 갖는 반면에, 단지 하나의 종양만이 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 치료되었다(온열암요법 - OTM). 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료(온열암요법- OTM 치료)는 단지 치료된 종양에 대해서만 효과적이었다. 소암평으로의 치료(Xi)는 대조군(CTRL)에 비하여 아무런 결과도 나타내지 않았다.
도 27은 OTM 단독 치료군으로부터의 HE 염색된 종양 샘플들을 나타내는 도면이다.
도 28은 온열암요법 단독으로 치료된 군으로부터의 종양 샘플들 내의 HSP70(적색)의 IHCH 검출을 나타내는 도면이다(세포 핵들: 청색).
도 29는 OTM + Xi(온열암요법 + 소암평) 치료된 군으로부터의 HE 염색된 종양 샘플들을 나타내는 도면이다.
도 30은 OTM + Xi 치료된 군으로부터의 종양 샘플들 중의 HSP70의 IHCH 검출(적색)을 나타내는 도면이다(세포 핵들: 청색).
도 31은 온열암요법 단독으로 치료된 군으로부터의 종양 샘플들 중의 CD3 + T세포(적색) 및 TUNEL 반응(녹색)의 IHCH 검출을 나타내는 도면이다(세포 핵들: 청색)(핵 및 TUNEL 반응의 공국소화(colocalization)는 예정세포사를 의미함).
도 32는 예정세포사의 증거로서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료(온열암요법 치료)에 의해 유도된 핵 및 핵산 단편화(TUNEL)의 공국소화를 나타내는 도면이다. 청색은 표준 DAPI 염색(세포 핵)이고 그리고 녹색은 TUNEL FITC이다.
도 33은 예정세포사의 증거로서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료(온열암요법 치료)에 의해 유도된 핵 및 핵산 단편화(tunnel)의 공국소화를 나타내는 도면이다. 청색은 표준 DAPI 염색(세포 핵)이고 그리고 녹색은 TUNEL FITC이다.
도 34는 OTM + Xi만으로 치료된 군으로부터의 종양 샘플들 중의 CD3 + T세포(적색) 및 TUNEL 반응(녹색)의 IHCH 검출을 나타내는 도면이다(세포 핵들: 청색)(핵 및 TUNEL 반응의 공국소화(colocalization)는 예정세포사를 의미함).
도 35는 예정세포사의 증거로서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료(온열암요법 치료)에 의해 유도된 핵 및 핵산 단편화(tunnel)의 공국소화를 나타내는 도면이다. 청색은 표준 DAPI 염색(세포 핵)이고 그리고 녹색은 TUNEL FITC이다.
도 36은 예정세포사의 증거로서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료(온열암요법 치료)에 의해 유도된 핵 및 핵산 단편화(tunnel)의 공국소화를 나타내는 도면이다. 청색은 표준 DAPI 염색(세포 핵)이고 그리고 녹색은 TUNEL FITC이다.
도 37은 비-소세포 폐암 환자(남성, 72세)에 본 발명에 따른 백신화를 적용시키는 것에 의해 수득된 결과들을 나타내는 도면이다. 용량 결합을 사용하는 진폭 변조 고주파 파동에 의해 국소암이 치료되었고 그리고 면역자극제로서 류카인®이 병행하여 적용되었다. 원발종양(primary tumor)이 수축되기 시작한 한편으로 전이암이 사라졌다.
도 38은 포르말린-고정, 파라핀 포매된 종양 샘플(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded tumor sample)로부터 조직 다중블록(multiblock)을 생성하는 방법을 나타내는 도면이다: 손상된 그리고 완전한 종양 경계로부터(1 및 2) 그리고 손상된 종양 중심으로부터(3) 선택된 2㎜ 직경의 코어들을 각 샘플로 취하였다.
도 39는 정량적 디지털 현미경 분석(quantitative digital microscopy analysis)을 사용하여 TDR 및 TDE를 산출하는 방법의 개요를 나타내는 도면이다: 손상된 종양 영역들(D로 표지되고 그리고 적색으로 둘러싸여짐; 내측 원들) 및 전체 종양 영역(W로 표지되고 그리고 청색으로 둘러싸여짐; 외측 원들)이 소프트웨어로 측정되었다. 종양파괴비(TDR: tumor destruction ratio)는 치료된 종양(t) 및 미치료된 종양(u)들 둘 다에서 D값을 W값으로 나누는 것에 의하여 산출되었다. 종양파괴효율(TDE: tumor destruction efficiency)은 치료된 종양과 미치료된 종양들의 TDR값들 사이의 상관관계이다.
도 40a는 단일의 샷 치료 24시간 이후 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료 유발 종양 파괴의 정성적인 이력형태학적 외양(histomorphological appearance)을 나타내고;
도 40b는 종양파괴비(TDR)의 정량적인 분석의 결과를 나타내고: 그래프는 미치료된(회색 상자) 종양들에 비해 치료된(흑색 상자) 종양들에서 유의미하게 높은 TDR 값들(*p<0.05)을 나타내고;
도 40c는 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료 연관 종양 세포 파괴(TDE)의 정량적인 분석의 결과를 나타내고: 그래프는 치료 연관 TDE값들의 증가가 72시간에서 7배 차이로 올라가는 것을 나타낸다.
도 41은 치료 48시간 후 전체 종양 단면에서 TUNEL 양성의 정성적인 관측을 나타내는 도면이다. 종양의 중앙의 파괴된 영역에서 높은 TUNEL 양성을 나타냄을 주목하라.
도 42는 치료 24시간 및 48시간 후 전체 종양 단면적들에서의 TUNEL 양성의 정성적인 관측(48시간에서) 및 정량적인 측정 그리고 세포자멸체 형성을 나타내는 도면이고:
A는 치료 48시간 후에서 미치료된 종양들(하부 열)에 비하여 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료된(상부 열) 종양들에서 TUNEL 분석(절취한 상부 사진 중의 녹색 형광)에 의해 나타난 DNA 단편화, 핵 수축 및 세포자멸체(H&E 염색; 절취한 하부 사진 중의 화살표들)의 유의미한 상승을 나타낸다. 절취한 사진들은 보다 높은 배율의 사각형들 내의 영역들의 단일채널 시야들(single channel views)을 나타내고 있다. TUNEL 및 DAPI(청색; 중간 사진) 이중의 양성은 1 내지 3으로 표지된 동일한 세포들에서의 핵 DNA 염색을 증거하고 있다. 미치료된 종양 세포들(예를 들면, 1 내지 2로 표지된 것들)은 단지 기본적인 녹색 형광만을 나타내고 있다. 막대는 좌측 열에서는 50㎛ 그리고 우측 열에서는 15㎛를 표시한다.
B는 치료 24시간 및 48시간 후 둘 다에서의 유의미하게 증가된 TUNEL 양성 세포들(흑색 기둥들)의 평균수를 나타내는 그래프이다;
C는 미치료된 대조군들(회색 기둥들)에 비하여 치료 48시간 및 72시간 후에서의 유의미하게 증가된 세포자멸체들의 평균수(흑색 기둥들)를 나타내는 그래프이다(*p<0.05, **p<0.01).
도 43은 치료 14시간 및 24시간 후의 H㎎B1의 면역형광 검출을 나타내는 도면이다. 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료된 종양들에서 H㎎B1이 세포외 기질에로 방출된 것이 분명하게 보여진다.
도 44a는 치료 72시간 후 HE 염색된 전체 종양 단면적을 나타낸다. 화살표들은 침습 고리의 형성을 표시하고 있다.
도 44b는 치료 168시간 후 HE 염색된 전체 종양 단면적을 나타낸다. 화살표들은 잘-한정된 침습 고리를 표시하고 있다.
도 45a는 TMA 다중블록으로부터의 미엘로퍼옥시다아제(MPO: myeloperoxidase)의 IHCH 검출을 나타내는 도면이다. MPO는 호중구(과립구)의 표지이다. 파괴된 종양 영역 주위에서 72시간에서 나타나고 그리고 168시간에서 매우 특징적이 되는 백혈구 침습 고리가 많은 수의 MPO 양성 세포(호중구)를 포함한다.
도 45b는 TMA 다중블록 샘플들로부터의 MPO+ 세포들의 반-정량적인 분석을 나타내는 도면이다. 온열암요법 치료된 종양 세포들은 미치료 및 대조군 종양 샘플들에 비해 훨씬 많은 수의 MPO+ 세포(호중구)를 포함한다.
도 45c는 TMA 다중블록으로부터의 CD3+ 양성 세포의 IHCH 검출을 나타내는 도면이다. 치료 168시간 후 침습고리가 막대한 양의 CD3+ T세포를 포함한다.
도 45d는 TMA 다중블록 샘플들로부터의 CD3+ T세포의 반-정량적인 분석을 나타내는 도면이다. 온열암요법 치료된 종양 샘플들이 미치료된 그리고 대조군 종양 샘플들에 비하여 유의미하게 많은 CD3+ 세포(T 림프구)를 포함한다.
도 46은 이력형태학적인 분석 방법을 나타내는 도면이다.
도 47은 본 발명에 따른 백신의 전신적인 효과를 나타내는 도면이다. 치료의 자리로부터 원거리에 위치된 전이암의 퇴행이 관측되었다.
도 48은 본 발명에 따른 백신에 의해 제공된 정위 4T1 종양 모델(orthotopic 4T1 tumor model)에서의 종양 용적의 감소에 대한 이로운 효과를 나타내는 도면이다. TJ-48과의 조합의 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동)이 실시예 14에서 기술된 바 대로 적용되었다.
하기의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 입증하기 위하여 포함되었다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 본 발명자들에 의하여 발견된 대표적인 기술들을 따르는 실시예들에서 기술된 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하고 따라서 그의 실행을 위한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것은 이해되어야 한다. 그러나, 당해 기술분야에서 숙련된 자들로서는 본 상세한 설명을 고려하여 본 발명의 정신 및 관점으로부터 벗어남이 없이 개시되고 그리고 여전히 같거나 또는 유사한 결과를 얻는 특정의 구체예들에서 많은 변경들에서 이루어질 수 있음은 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 여러 양태들의 추가의 변경들 및 변경된 구체예들은 본 상세한 설명의 관점에서 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백할 수 있을 것이다. 따라서, 본 상세한 설명은 단지 설명적인 것으로 이해되어야 하고 그리고 본 발명을 실시하는 일반적인 방법으로 당해 기술분야에서 숙련된 자를 교시하는 것을 목적으로 한다. 여기에 나타나고 그리고 기술된 본 발명의 형태들이 구체예들의 실시예들로서 고려되어야 함은 이해되어야 한다. 본 발명의 이러한 기술의 덕분으로 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 모두 명백하게 될 수 있는 바와 같이, 구성성분들 및 재료들은 여기에 묘사되고 그리고 기술된 것들로 대체될 수 있고, 부품들 및 공정들은 역전될 수 있고, 그리고 발명의 특정의 특징들은 독립적으로 활용될 수 있다. 하기의 특허청구범위들에서 기술된 바와 같은 본 발명의 정신 및 관점으로부터 벗어남이 없이 여기에 기술된 구성요소들에서 변화들이 이루어질 수 있다.
실시예
재료 및 방법
종양 모델
세포주
HT29 침습적 결장암 세포주(오스트리아 인스부르크 소재 타이롤린 암 연구소(Tyrolean Cancer Research Institute)에 의해 제공됨)가 둘베코 변성 이글 최소 필수 배지(EMEM) + 글루타맥스(GlutaMax), 10% 열 비활성화 우태혈청(FCS: fetal calf serum) 및 1% 스트렙토마이신-페니실린(페니실린 5000단위 및 5㎎ 스트렙토마이신/㎖)을 포함하는 고-글루코스(4.5g/ℓ) 배지에서 번식시켰다. 0.25% 트립신 + 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 0.22㎎/㎖)을 사용하여 5분 동안 세포들을 아-융합 단층(sub-confluent monolayer)으로부터 방출시키고 그리고 요구되는 107/㎖ 세포 농도에 도달되도록 무혈청 배지에 현탁시켰다. 모든 시약들은 기브코(GIBCO)(미합중국 칼스배드 소재 인비트로겐사(Invitrogen))로부터 구입하였다.
동물 모델
자성 누드 Balb/c (nu/nu) 생쥐(헝가리 부다페스트 소재 국립 방사선생물학 및 방사선위생 연구소의 실험동물실(Experimental Animal House of the National Research Institute for Radiobiology and Radiohygiene)에 의해 제공됨)는 멸균 환경에서 유지되고, 12시간 암/12시간 명의 주기 하에서 멸균된 음식 및 물은 임의로 공급되었다. 6 내지 8주령의 생쥐의 양쪽 대퇴부들에 피하로 107/㎖ HT29의 0.1㎖ 현탁액을 주입하였다. HT29 세포 주입 18일 후 종양 이식물의 직경이 약 1.5㎝에 도달하는 경우에 동물들(이종이식된)이 치료되었다. 양쪽 다리들에 대칭적인 종양들을 갖는 생쥐들 만이 치료에 사용되었다. 실험 동물들은 동물의 보호 및 복지에 대한 헝가리 법률 제XXVIII/1998호 및 동 제LXVII/2002호의 관련 부분들 및 유럽연합의 동물 복지 규정들에 따라 유지되고 그리고 치료되었다. 정부윤리위원회는 본 연구를 제22.1/609/001/2010호로 승인하였다.
콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 이종이식물의 치료( Treatment of xenografts with radiofrequency waves using capacitive coupling in a condenser arrangement)
치료들은 단지 동물의 우측 종양에 대해서만 체계적으로 이루어진 반면에 좌측은 개별적인 대조로 유지시켰다(도 5 참조). Balb/c (nu/nu) 생쥐들의 우측 다리들 내의 종양 이식물들을 계획-평행의 회로의 전기 콘덴서들 내로 위치시켰다(도 9 참조). 종양을 포함하여 치료되는 조직의 유전체에 따라 회로의 임피던스를 50오옴(Ohm)으로 유지시키는 것에 의하여 구성이 즉각적인 전기회로를 이루도록 하였다. 전극 배열은 비대칭적이었다. 치료 동안 37℃로 유지되는, 72.0㎠의 연마된 알루미늄으로 이루어진 직사각형의 접지된(하부의) 전극 상에 동물을 눕혔다. 가요성의 섬유(구리-은-주석 코팅된 직물, 헝가리 바즈나 소재 로릭스사(Lorix Ltd.))로 이루어진 활성의(대향되는) 상부의 2.5㎠ 둥근 형태의 전극을 종양 영역 상에 덮어씌워 치료된 다리에 대해 완전한 피부 접촉을 제공하도록 하였다. 상부 전극의 전체 표면을 습윤 패드(wet pad)에 의해 외측으로부터 냉각시켰다. 1/f 진폭 변조(헝가리 파티 소재 온코테름사(Oncotherm Ltd) LabEHY)를 사용하여 13.56㎒ 고주파에서 전자장을 발생시켰다. 치료측 상의 종양 내 온도가 41 내지 42℃로 그리고 대조측 상에서는 약 36℃로 유지되도록 매개변수들을 조정하였다. 전극 아래의 피하 온도는 약 40℃로 그리고 직장 온도는 약 37℃로 유지되었다. 앞서 언급된 국소들에서의 온도를 광학센서(미합중국 캘리포니아주 소재 루마센스테크놀로지사(LumaSense Technologies, Inc.) Luxtron FOT Lab Kit)로 모니터링하였다.
이 동물 모델에 있어서, 암 이식물들을 용량 결합을 통하여 즉, 콘데서 전극들 사이에 위치시키는 것을 통하여 전기 회로의 일부로 만들었다. 약 25㎒ 이하에서 효율적인 조직 투과가 달성될 수 있기 때문에, 13.56㎒의 조절된 고주파가 사용되었다. 본 발명에 따라 적용된 고주파 파동은 이온 및 이극 분자기(bipolar molecular groups)들에 대하여 작용하여 이들의 회전의 결과를 야기하고(비-열효과) 그리고 또한 42℃ 이하(≤42℃)의 열을 생성(열효과)할 것으로 기대된다. 적용된 제어 하에서, 13.56㎒ 주파수는 신경에서의 작용 잠재성을 유도하거나 또는 임의의 원격통신 또는 전기 기구들과 간섭하여 정상 조직을 손상시키는 위험을 갖지 않는다.
시험 설계
치료군들은 33개체의 동물들(도 11)을 포함하고, 이들에는 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 단일의 샷의 고주파 파동이 100㎎/㎏ 케타민(Ketamine) 및 10㎎/㎏ 자일라진(Xylazine) 마취 하에서 4W의 평균 전력으로 30분간 적용되었다. 시간 경과 시험이 수행되었다. 단일의 샷 이후, 치료 후 각 군에서 개체의 생쥐들을 사용하여 0, 1, 4, 8, 14, 24, 48, 72, 120, 168, 216시간에서 샘플링(샘플을 취하는 것) 하였다. 치료 후 24시간 및 72시간에서의 생쥐들과 함께 추가의 5개체의 미치료된 종양 이식된 동물들을 희생시켰다.
종양 샘플 처리과정( Tumor sample processing)
샘플링 시에서, 단일-치료된 동물들을 희생시키고 그리고 대조 및 치료된 종양들 둘 다를 제거하고 그리고 쌍으로 시험하였다(도 10a 참조). 절개된 종양들의 절반을 10% 포르말린으로 고정시키고, 탈수시키고 그리고 파라핀 왁스 내로 통상적으로 포매시켰다(FFPE: formalin-fixed and paraffin-embedded). 다른 절반을 액체 질소 중에서 신선-동결시키고 그리고 추가의 시험 때까지 초저온 냉동고(deep freezer) 중에서 -80℃에서 보존시켰다. 서로 다른 종류의 방법들로 종양 샘플들을 분석하였다(도 10b).
조직 마이크로어레이법(tissue Microarray(TMA ) method)
극히 많은 수의 종양 샘플들로 인하여, 조직 마이크로어레이(TMA) 기술을 사용하여 하나의 블록 내의 많은 샘플들에 대한 정확한 면역이력화학 반응(i㎜onohistochemical reactions)을 수행하였다(도 10b). 하나의 다중블록은 많은 작은(2㎜) 대표적인 종양 조직 샘플들을 포함하고, 따라서 모든 샘플들에서 동일한 그리고 고도로 표준화된 면역이력화학 반응을 수행할 수 있다. 이는 본 기술의 실질적인 이점이다. TMA들에는 컴퓨터 구동 TMA 마스터(헝가리 부다페스트 소재 3디히스테크사(3DHISTECH Ltd.))를 사용하여 각 공여자 블록(도 38) 중에서 표준 영역들로부터 샘플채취된 2㎜ 직경의 3개의 코어들, 분해되고 그리고 완전한 종양 경계의 모서리들로부터 2개 그리고 분해된 중심으로부터 1개가 포함되었다.
면역이력화학 및 면역형광법(i㎜ unohistochemistry and i㎜ unofluorescent methods)
면역이력화학을 위하여 면역형광에 대해서는 예외로 4㎛ 두께의 절편들을 탈왁스시키고, 재수화시키고 그리고 계속해서 내생적 퍼옥시다아제 효소(endogen peroxidase enzymes)들을 20분간의 메탄올 중의 3% 과산화수소를 사용하여 차단시켰다. 전기압력솥(electric pressure cooker: 헝가리 펙스 소재 비아틀론사(Biatlon kft) Avair Ida YDB50-90D) 내에서 약 105℃에서 0.01M 시트르산나트륨-시트르산(시트르산염, pH 6.0; 개열된-카스파아제-3(cleaved-caspase-3)를 위한) 또는 0.1M 트리스염기 및 0.01M EDTA(T-E, pH 9.0, 모든 다른 항체들을 위한) 중의 어느 하나로 이루어진 완충제 중에서 그리고 후속하여 20분간 소혈청알부민(BSA)-아지드(1%, 미합중국 미주리주 세인트루이스 소재 시그마-알드리치사) 단백질 차단에 의하여 항원 회수를 수행하였다. 하기의 주요 항체들에 대하여 절편들을 16시간 동안 가습 챔버(humid chamber) 내에서 실온에서 배양시켰다:
1. 폴리클로날 토끼 항-인간의 개열된-카스파아제-3(1 : 100, 미합중국 메사츄세츠 댄버 소재 셀시그널링사(Cell Signaling)),
2. 미엘로퍼옥시다아제(1 : 200, 시그마-알드리치사),
1. AIF(1 : 50, 셀시그널링사),
2. TRAIL-R2(1 : 50, 셀시그널링사),
3. 칼레티큘린(1 : 200, 셀시그널링사)
4. H㎎B1(1 : 200 셀시그널링사)
5. CD3(1 : 2, 덴마크 글로스트룹 소재 다코사(Dako)
계속해서, 30분간 엔비전 폴리머 퍼옥시다아제 검출 시스템(EnVision polymer peroxidase detection system; 다코사)를 사용하였다. 효소 발달을 위하여, 3,3'-디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine: DAB, 갈색) 킷트(영국 뉴캐슬 소재 라이카-노보카스트라사(Leica-NovoCastra) RE7105) 또는 아미노에틸카바졸(aminoethylcarbazole: AEC, 적색) 킷트(다코사 K3461) 중의 하나가 사용되었다. 배양들 간에서, 슬라이드들을 트리스-완충 염수 완충제(TBS: Tris-buffered saline buffer) 중에서 2분간 3회 세척하고 그리고 마지막으로 헤마톡실린(hematoxylin)을 사용하여 대비염색시켰다.
면역형광(IF)을 위하여, 90분간 알렉사 플루오르 546(Alexa Fluor 546: 오렌지색 내지 적색) 결합 항-토끼 면역글로블린 G(anti-rabbit IgG)(1 : 200) 또는 알렉사 플루오르 488(녹색) 결합 항-생쥐 면역글로블린 G(1 : 200)을 사용하여 주요 항체를 검출하고 그리고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole)을 사용하여 세포 핵을 청색으로 노출시켰다(모두 인비트로겐/몰레큘라프로브사로부터 구입). 밝은 영역 영상들이 주사(scanned)된 한편으로 IF 영상들은 슬라이드스캐너 시스템(SlideScanner system) 또는 니콘 이클립스 e-600(Nicon Eclipse e-600)을 사용하여 스캔되었다.
세포자멸 -연관 단백질 분석( apoptosis - related protein analysis )
얼음 상에서 30분간 추출완충제(20mM 트리스, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 1% 트리톤-X100, 10㎕/㎖ 포스파타아제 억제제 및 5㎕/㎖ 프로테나아제 억제제)를 사용하고 그리고 후속하여 4℃에서 15분간 15,000rpm에서 원심분리시켜 동결된 샘플들로부터 단백질들을 단리시켰다. 브래드포드 분석법(Bradford assay)으로 단백질 농도를 측정하였다.
세포자멸 분석( apoptosis array )
니트로셀룰로오스 멤브레인 프로테옴 프로파일러™ 인간 세포자멸 어레이 킷트(nitrocellulose membrane Proteome Profiler™ Human Apoptosis Array Kit ; 미합중국 미네소타주 미니에폴리스 소재 알앤디사(R&D))를 사용하여 치료되고 그리고 미치료된 샘플들 중에서의 35개의 세포자멸-연관 단백질들의 발현을 동시에 시험하였다(도 21a 및 도 21b). 진탕기(shaker) 상에서 어레이들을 1,200㎍/㎖ 단백질 용해물 250㎕와 함께 4℃에서 밤새도록 계속해서 비오티닐화된 항-인간 면역글로블린 G와 함께 60분간 그리고 스트렙타비딘-호스래디시 퍼옥시다아제(HRP: horseradish peroxidase) 공액화물과 함께 30분간 배양시키고 그리고 코닥 이미지 스테이션 400㎜(Kodak Image Station 4000㎜: 미합중국 뉴욕주 로체스터 소재)에서 10분간 화학형광 ECL 킷트(SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Kit; 미합중국 일리노이주 록포드 소재 써모사이언티픽사(Thermo Scientific))를 사용하여 가시화시켰다. 이미지제이 1.45s(ImageJ 1.45s ; http://rsbweb.nih.gov/ij/)를 사용하여 반-정량적 분석을 수행하였다.
웨스턴 면역블럿( western i㎜ unoblots )
웨스턴 면역블럿을 위하여, 단백질 추출물을 5% 2-머캡토에탄올(5-mercaptoethanol)을 포함하는 램리 샘플 완충제(Laemmli sample buffer) 5배량과 혼합시키고 그리고 95℃에서 5분간 가열시켰다. 30㎛의 단백질을 12% 소듐도데실설페이트-폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE)의 각 웰 내로 담지시키고 그리고 150V에서 1시간 동안 전기영동을 수행하였다. 계속해서 단백질을 75㎃ 및 4℃에서 밤새도록 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 막 내로 면역블럿시켰다. 면역검출을 위하여는, 막들을 순차적으로 단백질 차단제로서 5% 반탈지우유(semi-skimmed milk)와 60분간 배양시키고 그리고 후속하여 토끼 항-인간 AIF(1 : 1000; 미합중국 메사츄세츠주 덴버 소재 셀시그널링사), RIP(수용체-간섭 단백질 키나아제(receptor-interacting protein kinase; 1 : 1000, 시그마-알드리치사) 항체와 4℃에서 16시간 동안 배양시켰다. 대조군을 담지하기 위하여, 항-베타-액틴(anti-β-actin)(1 : 200, 써모사(Thermo)) 항체를 60분간 사용하였다. 계속해서 신호들을 코닥 이미지 스테이션 및 그의 4.1 소프트웨어를 사용하는 것에 의하여 호스래디시 퍼옥시다아제(HRP)-공액화 염소 항-토끼 면역글로블린 G(1 : 1000; 셀시그널링사)로 60분간 그리고 슈퍼시그널(SuperSignal) 강화 케미루미네센스(ECL: enhanced chemiluminescence) 킷트(써모사)로 10분간 검출하였다. 프레시션 플러스 프로테인 스텐다드 래더(Precision Plus Protein Standard ladder)가 250kDa(킬로달톤), 150-, 100-, 75-, 50- 및 37kDa에서 밴드들을 생성하였다. 달리 표시하지 않는 한 모든 시약들은 바이오-래드사(Bio-Rad)(미합중국 캘리포니아주 허큘레스 소재)로부터 구입하였다.
TUNEL ( 터넬 ) 분석
TMA 섹션(sections)들에서의 예비-스크리닝(pre-screening)에 기초하여 치료 24시간 후 및 48시간 후 수집된 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 치료된 종양들 및 이들의 짝지워진(matched) 대조군들의 전체 단면적들에 대하여 TUNEL 분석이 또한 수행되었다. TUNEL 분석은 DNA 닉 말단(nick ends)을 말단 디옥시뉴클레오티딜 트란스퍼라아제(TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 플루오로크롬 표지 디옥시우리딘트리포스페이트(dUTP: deoxyuridine triphosphate)와 연결한다. 따라서, 세포 핵 중의 형광 신호는 예정세포사를 나타내는 단편화된 DNA의 양에 비례한다. 제조업자의 지시에 따라 "클릭 잇 터넬 알렉사 플루오르 488 영상화 분석(Click it TUNEL Alexa Fluor 488 Imaging Assay)(인비트로겐사)"를 사용하였다. 요약하면, 탈왁스되고 재수화된 슬라이드를 전기압력솥(상기한 바와 같음)을 사용하여 시트르산 기반 pH 6.0 항원 탈마스크화(unmasking) 용액(H-3300, 미합중국 캘리포니아주 버링감 소재, 벡터랩사(Vector Lab)) 내에서 가열시켰다. 계속해서 슬라이드를 37℃에서 60분간 알킨 치환 dUTP 및 TdT와 함께 그리고 후속하여 dUTP에 결합된 플루오로크롬과 함께 30분간 실온에서 배양시켰다. 마지막으로, 핵 DNA를 DAPI로 염색시켰다.
디지털 현미경법 :
슬라이드 주사 방법:
전체 단면적 및 TMA 샘플들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)로 염색시키고, 면역이력화학 또는 TUNEL 분석을 20배 대물렌즈를 사용하는 파노라믹 스캔 슬라이드 스캐너 시스템(Pannoramic Scan slide scanner system using a 20x objective ; 헝가리 부다페스트 소재, 3디히스테크사)를 사용하여 디지털화하였다.
디지털 현미경 영상화 및 분석:
종양 조직 영상화를 파노라믹 뷰어 소프트웨어(Panoramic Viewer software)를 사용하여 수행하였다. 영상의 확대는 디지털적으로 조정하였으며, 모든 영상화된 종양 샘플은 눈금자 표시 막대를 포함한다. 샘플의 정량적 분석을 수작업으로 또는 영상 색상 및 세기 분할(intensity segmentation)에 기초하는 파노라믹 뷰어 소프트웨어의 히스토퀀트 모듈(모두 헝가리 부다페스트 소재, 3디히스테크사에서 구입)을 사용하여 수행하였다. 종양파괴비(TDR) 연관 온열암요법 치료는 전체 단면적에서 측정된 파괴된 종양 조직의 영역(D)을 전체 종양 영역(W)으로 나누는 것에 의하여 산출되었다. 종양파괴효율(TDE)와 연관된 치료는 치료된 TDR을 동일한 동물의 미치료된 종양의 TDR로 나누는 것에 의하여 평가되었다(도 39). 통계학적인 분석을 위하여, SPSS 스태티스틱스 v.20 소프트웨어(미합중국 뉴욕주 뉴욕 소재, 아이비엠사(IBM Corp.))의 크루스칼-왈리스 검정이 사용되었다.
표지 양성 세포의 수, 세포 핵들 또는 세포자멸체들의 수는 각 시험된 시간점에서 3개의 치료된 그리고 3개의 미치료된 샘플들의 10개의 서로 다른 현미경 필드(관측시야(FOV))에서 100배 대물렌즈 확대에서 계수되었다. 핵 국소화가 AIF 및 TUNEL 염색 샘플들 둘 다에 대하여 절대적이기 때문에, 증명(verification)을 위하여 DAPI 공-염색이 사용되었다. 확산을 수반하는 사이토크롬 씨(cytochrome c) 염색 세포들에 대하여는 형태학적으로 완전한 종양 영역들 내에서만 세포질 신호(cytoplasmic signal)가 계수되었다. 세포자멸체는 H&E 슬라이드 상에서 계수되었다. TRAIL-R2 및 개열된 카스파아제-3 염색 슬라이드들을 히스토퀀트 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 상대 마스킹 영역(rMA)는 표지 양성 마스크 영역을 전체 주석된 영역(overall annotated area)로 나누는 것으로 정의되었다. 통계를 위하여, 콜모고로프-스미르노프 정규성 검정(Kolmogorov-Smirnov normality test)을 수행하고 그리고 후속하여 SPSS 스태티스틱스 v.20을 사용하여 독립표본 t-검정(independent t-test)을 수행하였다. 미엘로퍼옥시다아제 및 CD3 염색 슬라이드들에 대해서는, 10-척도 시스템(10-scale system)을 구축하여 양성 세포들의 빈도를 점수화하였고 그리고 그 결과들을 크루스칼-왈리스 검정을 사용하여 분석하였다.
실시예 1: 종양 파괴
HT29 이종이식물의 H&E 염색 단면적 내에서, 종양들의 손상된 중앙 영역들을 흐릿한 영역(pale areas)로 경계를 표시하였다(도 40a의 화살표). 디지털 슬라이드 뷰어 소프트웨어로 ㎛2으로의 정밀한 면적 측정이 허용되었다. 전체(W) 종양 면적에 대한 손상된(D) 종양 면적의 비율인 종양파괴비(TDR)는 미치료된 종양들에 비하여 치료된 종양들에서 유의미하게 더 높았다(*p<0.05)(도 40b 참조). 종양 세포 파괴(TDE)에 연관된 온열암요법 치료는 또한 치료-후 24시간으로부터 동적 증가를 나타내어 72시간에서 7-배 피크가 관측되었다(도 40c).
실시예 2: DNA 단편화
TUNEL 분석은 치료-후 24시간에서(*p<0.05) 그리고 48시간에서(**p<0.01) 미치료된 종양들에 비하여 치료된 종양들의 전체 단면적(도 41)에서 유의미하게 높은 예정세포사 연관 DNA 단편화를 입증하였다(도 42a 내지 도 42b). 이와 일치하여, 치료-후 48시간(*p<0.05) 및 72시간(**p<0.01) 둘 다에서 미치료된 종양들에 비하여 치료된 종양들에서 유의미하게 높은 핵수축의 정도(핵농축(pyknosis)) 및 밀집한 크로마틴 단편들(세포자멸체들)이 있었다(도 42a 및 도 42c).
실시예 3: 세포자멸체 형성
TUNEL 분석으로 측정된 DNA 단편화, 핵수축 및 세포자멸체에서의 유의미한 상승(도 14를 참조하시오)은 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 유발 종양 파괴 뒤의 주요 메카니즘으로서의 예정세포사를 입증하였다.
실시예 4: 칼레티큘린 발현
칼레티큘린(CRT)은 ICD의 과정에서 가장 중요한 분자의 하나이다. CRT가 종양 세포 막에 출현하는 경우, 이는 수지상세포(DC)를 포함하여 포식세포(phagocytotic cells)에 대하여 강한 신호를 생성하여 사멸 중인 종양 세포를 공격하도록 할 수 있다. 이는 면역 세포에 대한 가장 유의미한 "잇미(eat me)" 신호이다. 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료는 치료 직후 CRT의 막-발현을 유의미하게 증가시킬 수 있다(도 16).
실시예 5: HMGB1 발현
HMGB1은 ICD의 다른 중요한 특징이다. 정상 상태에서 HMGB1은 세포 핵 내에 위치되며, 여기에서 이는 핵을 안정화시키고 그리고 많은 유전자들의 전사를 조절한다. 점점 더 많은 증거가 이것이 세포자멸 세포로부터 방출될 수 있다는 것을 암시하고 있다. 세포외 HMGB1이 사이토카인으로서 작용하고 그리고 수지상세포들(TLR4를 통하여)을 활성화시킬 수 있고 그에 따라 항-종양 T세포 반응을 촉발시키고 그리고 ICD를 매개할 수 있다. 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료 유발 예정세포사가 그의 방출 세포외 기질에로의 방출을 촉진시켜(도 15 및 도 43) 수지상세포를 활성화시키고 그리고 항종양 면역 반응 과정을 매개하는 데 기여한다.
실시예 6: TRAIL 발현
35개의 예정세포사 연관 단백질들에 대한 항체들을 포함하는 프로테옴 프로파일러 니트로셀룰로오스 배열(proteome profiler nitrocellulose array)을 사용하여 온열암요법 유발 세포 사멸의 분자상 배경을 시험하였다. 이 단백질 배열은 미치료된 대조에 비하여 사멸 수용기(death receptor) TRAIL-R2 8시간 치료 후의 유의미한 상향조절을 밝혀내었다(도 17의 A). 치료된 종양에서의 TRAIL-R2 단백질의 유의미하게 상승된 세포 막 발현은 또한 자동화된 영상 분석에 대하여 면역형광 염색을 시험한 경우에서 8시간 및 14시간 둘 다에서도 확인되었다(도 17의 B 내지 C).
실시예 7: HSP70 발현
HSP70 샤프론은 복잡한 기능을 갖는다. 세포 내에서 HSP들은 세포의 보전(integrity)을 유지하도록 노력하나, 그러나 이것이 세포 막에 대하여 발현되거나(도 18a) 또는 ECM에로 방출되는 경우(도 18b), 이는 면역 세포들에 대한 강한 신호이다. HSP들은 교차-감작 및 공-표출(co-presentation)의 과정에 의한 종양 특이적 또는 종양 연관 항원 인식에서 중요한 역할을 한다.
실시예 8: 국소 면역 반응의 이력형태학적 징후
치료 72시간 후 온열암요법 치료 종양의 파괴된 영역 주위에 백혈구 침습 고리가 나타났으며(도 44a), 이는 단일의 샷 온열암요법 치료 이후 120시간 및 168시간에서 점점 더 강조되었다(도 44b).
실시예 9: 침습 고리 중에서의 백혈구의 면역이력화학(IHCH: immunohistochemical) 동정
침습 고리 중에서 형태학적으로 다른 면역 세포들이 구별될 수는 없다. 면역 세포 개체군들의 조성을 밝히기 위해서는 복잡한 면역이력화학 검출이 필요하였다. 미엘로퍼옥시다아제(MPO)는 호중구의 핵심 표지(key markder)이고(도 45a 및 도 45b), CD3는 무손상(naive)의 T세포의 표지이다(도 45c 및 도 45d).
실시예 1 내지 9에서 제공된 결과들의 관점에서 하기와 같이 결론지을 수 있다:
1. 온열암요법 치료는 많은 세포자멸체를 생성하는 종양의 예정세포사를 유도할 수 있다. 파괴된 종양 조직 중의 세포자멸체의 존재는 면역원성 반응을 유도하는 데 필수적이다.
2. 온열암요법 치료 유도 세포 사멸은 면역원성 종양 세포 사멸의 특징인 모든 핵심 분자상 패턴 동적 변화를 나타내는 고도로 면역원성이다.
3. 온열암요법 치료는 치료의 그 자리에서 온열암요법 치료 이후 장기간 강하고 그리고 매우 독특한 국소 면역 반응을 유도할 수 있다.
4. 숙주가 완전한 면역계를 갖고 그리고 적절한 면역자극제가 투여되는 경우, 온열암요법 치료의 국소 항종양 면역반응이 전신적일 수 있다. 이 과정은 방관자 효과에 의한 원거리 전이암들을 제어하여 국소 치료로 악성 질환의 전신적인 제어를 가능하게 할 수 있다.
실시예 10: 소암평과의 조합의 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 적용
소암평 주사(Xi)는 전통적인 한의학(TCM)에서 사용되었다. 이 주사는 플라보노이드, 클로로겐산 및 폴리다틴(polydatin)을 포함하는 나도은조롱과(Marsdenia tenacissima)의 달인 약(decoctum)이다. 4군의, 군당 4개체의 동물들통상의 자성 BALB-C 생쥐를 사용하여 실험을 수행하였다:
C: 위약 대조군
Xi: 소암평 주사로의 치료, 용량: 7.5㎖/㎏ 체중/일, 4일 동안 복강내로
OTM: 우측 대퇴부 종양의 30분간의 1회의 온열암요법 치료
OTM+Xi: 소암평 주사로의 치료, 용량: 7.5㎖/㎏ 체중/일, 4일 동안 복강내로, 4일차에의 우측 대퇴부 종양의 30분간의 1회의 온열암요법 치료
동물의 양측 대퇴부 영역들에 106의 배양된 C26 결장-선암종 세포를 피하로 주사하는 것에 의하여 동종이식물이 생성되었다. 4일 후, 이 대칭의 이중-종양 모델을 온열암요법 치료 및 또한 Xi 및 조합 치료의 전신적인 효과의 조사를 위한 내부 대조(치료된 그리고 미치료된 종양들)로 사용하였다.
OTM 치료, 실험 구성(도 24)
ㆍ RF 매개변수들:
- 13.56㎒
- 1/f 소음으로의 진폭 변조
- 용량 결합-임피던스 조정
ㆍ 시스템:
- LAB-EHY 100(온열암, 파티(Paty)
ㆍ 지속시간: 30분
출력: 1 내지 3W
최종 치료 24시간 후 동물들을 희생시키고, 종양 조직을 절개하고 그리고 포르말린 고정시켰다.
샘플의 조직병리학적 및 면역이력화학적 검사를 수행하였다:
- 조직병리학: H&E 슬라이드
- 면역이력화학
ㆍ TUNEL 분석(핵-산 단편화)(FITC)
ㆍ CD3(림프구)(로다민)
ㆍ HSP70(로다민)
ㆍ 평가: 각 군에서의 쌍들에 비하여 상대적인 사멸 영역 비율(히스토퀀트, 3디히스테크)(도 39)
비록 결과에 따르면 소암평 요법 단독이 비효과적이기는 하였으나, 온열암요법 치료와의 조합은 온열암요법-치료 및 마찬가지로 미치료된 측 양쪽 모두에서 종양의 대량의 파괴를 생성하였다. 온열암요법 단독치료는 치료된 종양에서만의 파괴의 결과를 가져온 반면, 미치료된 종양과 위약 치료 동종이식물들 간에 고려할 만한 차이가 없었다(도 26a 및 도 26b).
결과에 따르면, OTM + Xi 조합 치료는 치료된 동물에서 다-국소화(multi-localized) 종양에 대하여 전신적인 효과를 갖는다. 미치료된 측 상의 종양에 대한 파괴 효과의 수준은 통계학적으로 동일한 군 또는 마찬가지로 OTM 단일요법 군에서 치료된 측에서 경험된 효과와 동등하였다. 이력형태학적 및 면역이력화학적 발견들은 도 27 내지 도 36에서 볼 수 있다.
실시예 11: 저용량 카보플라틴과 함께 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동
이 보고는 면역자극제와 함께의 온열암요법 치료가 전신적인 효과를 제공하고 그리고 치료의 위치에서 멀리 떨어진 전이암들을 근절하는 능력을 지지한다.
사례 번호: 11461, 코커 스패니엘(Cocker spaniel), 8연령(8 years), 거세된 웅성(male),
진단: 폐 전이암을 수반하는 흑색종.
원발암은 우측 뒷다리 상에 위치되었고 그리고 외과적으로 제거되었다. 5개월 후, 폐에서 전이암이 발생되었고, 이때 치료가 개시되었다.
치료:
온열암요법(2주간 내에 10회)
저용량 카보플라틴 2회(100㎎/㎡)
(개에 대하여 처방된 카보플라틴의 용량은 300㎎/㎡임)
원래 처방된 용량에 비해 훨씬 더 적은 용량의 카보플라틴은 면역자극 속성을 갖는다. 이러한 효과의 설명은 저용량에서 이 약물의 세포독성 효과가 암세포에 대하여 유의미하지 않으나, 그러나 조절 T세포의 기능을 효과적으로 차단할 수 있다(Treg; 억제 T세포로서 이미 알려짐). Treg세포는 면역 반응의 세기를 조절하여 만일 Treg세포의 수가 감소되는 경우, 면역계의 종합적인 활성은 어느 정도 상향조절될 수 있다(손상된 Treg세포 기능을 갖는 환자는 심각한 자가면역 질환으로의 발달을 야기한다).
OTM 치료의 자리는 흉부 상, 정확하게는 심장선(line of the heart)이었다. CT 영상 시리즈에서 볼 수 있는 바와 같이 치료의 자리에서 뿐만이 아니라 직접적으로 OTM 치료된 영역의 외측에서도 유의미한 종양 퇴행이 관측되었다(도 47).
실시예 12
전형적인 종양-경로 측정 실험을 다음과 같이 수행하였다:
- 자성 누드 BALB/c (nu/nu) 생쥐가 사용됨;
- 세포주, HT29, 인간 대장암;
- 2개의 대퇴부 영역 내의 이종이식 모델, 단지 하나만 치료됨;
- 시간 경과 시험 0 → 216시간, 39개체의 동물(78개의 종양);
- 사용된 치료는 용량 결합을 사용하는 고주파 파동(온열암요법), 단일의 샷, 30분, 42℃;
- 사용된 주파수, 13.56㎒, 핑크-노이즈(pink-noise) 변조;
- 전극의 속성은 국제특허 공개공보 제WO 2009/092619호에 따라 가요성임;
- 앞서 기술된 바와 같이 데이터가 분석됨 - 면역자극제: 대장균(E. coli) LPS 면역자극제(100㎕ 살솔 용액 중의 100㎍ LPS)가 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 적용(온열암요법) 24시간 이전에 동물의 배측 영역(dorsal region)에 피하 투여됨.
전형적인 시간-경과 측정의 요약을 도 11에 나타내었다. 이 시험은 전체 단면적을 사용하여 형태학(morphology)을 동정하였다. 치료의 전형적인 결과는 종양 세포의 세포자멸이었으며(도 12를 참조하시오), 이는 이하에서 기술되는 바와 같이 중복 연구 및 다른 검출 방법에 의해 입증되었다.
세포자멸의 지배적인 존재는 도 12로 나타난 바와 같은 DNA 단편화를 보이는 TUNEL 분석(앞서 기술된 바와 같이 수행된)에 의해 실험적으로 입증되었다. 도 13으로 나타난 바와 같이, 세포자멸 기간(apoptosis timescale)은 시간-경과 실험으로 충분히 지속되었다.
먼저, 면역원성 세포자멸 세포-사멸에 대한 전체 표지와 마찬가지로 항원 함유 세포자멸체가 충분히 관찰가능하였으며(도 14를 참조하시오), 이는 본 발명에 따른 백신화 방법의 기초이다. 용량 결합을 사용하는 고주파 파동(온열암요법)으로의 치료의 이러한 특이성(지배적인 세포자멸 세포-사멸)이 백신화 효과의 핵심 인자이다. 손상 연관 분자상 패턴의 형성 및 완전 면역 반응의 자극은 면역원성 세포-사멸의 2가지 필수적인 조건들이다.
필수적인 DAMP 구성원들에 대한 온열암요법 유발 효과들이 실험적으로 증명되었다. 따라서, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료는 HMGB1 제공의 결과를 가져오고 그리고 세포외 기질로 방출한다(도 15를 참조하시오). 게다가, 치료 4시간 후, 세포 막 상에서의 칼레티큘린 발현이 관측되었다(도 16을 참조하시오).
게다가, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 암세포의 치료는 세포외 공간 및 세포의 막 표면 상에서의 TRAIL-R2(DR5)의 발현(도 17을 참조하시오) 및 HSP70 발현(도 18을 참조하시오)을 유도한다.
종양 용적에서의 HSP70의 평균 상대 백분율의 평가는 2개의 독립적인 발달을 나타내고 있다(도 19를 참조하시오):
- 첫 번째의 발달은 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료 48시간 후에 종료되고, 그리고 직접적인 HSP70 열유도에 연결된다;
- 두 번째의 발달은 직후에 개시하고 그리고 DAMP의 일부로서 면역원성 세포-사멸에 기여한다.
용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료 4시간 후 mRNA 발현의 평가는 하기의 단백질들 즉: HSP4, HSPA8, BAG3, HSPB1, DNAJB1, HSPA1A, HSP90AA1, DNAJB4, HSPA6, HSPD1, HSP1L의 합성을 유도하기 위한 본 발명에 따른 치료의 능력을 개괄한다(도 20 및 도 3을 참조하시오).
세포 사멸의 세포자멸 메카니즘을 추가로 조사하기 위하여, 인간 세포자멸 프로테옴 프로파일러 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 21에 요약하였다. 도 22에 표시한 바와 같은 TRAIL-R2(DR5), FAS 및 FADD와 같은 사멸 유도 경로들에 포함되는 단백질들의 발현에 대한 고주파 파동으로의 치료의 효과는 세포-막 세포자멸 경료의 실현의 메카니즘에서의 추가의 이해를 제공한다.
따라서, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료에 의한 종양 세포 세포자멸의 유발에 포함되는 가장 중요한 단백질이 동정되었다. 게다가, 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로의 치료에 대한 면역 반응이 분류되었으며: 따라서, 도 23에 나타난 바와 같이, 치료된 암세포의 세포자멸 사건은 치료 후 48시간이 경과하고 그리고 면역계의 강한 활성화에 의한 천이기(transition period)에 후속하며, 이는 면역원성 암세포 사멸을 야기한다.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 항-종양 백신은 전신적인 효과를 제공하고: 타측 다리 상에 위치된 미치료된 종양이 타측 다리 상에 위치된 종양에 적용된 치료에 반응하여 수축된다. 선행기술 문헌의 현상은 원-거리(면역-보조) 효과에 대한 실험실 원조(laboratory assistance)가 필요한 경우에 단지 탈-위치 면역 지지 만을 나타낸다. 본 발명에 따른 치료에 있어서 요점은 원-위치 적용이다. 온열암요법 단독(용량 결합을 사용하는 고주파 파동)은 원거리에 위치된 종양에 대하여 어떠한 효과도 갖지 않는다. LPS 투여는 종양 퇴행에 대하여 어떠한 효과도 갖지 않는다. 그러나, LPS가 보조된 용량 결합을 사용하는 고주파 파동의 적용은 앱스코팔 효과를 제공하고 그리고 원거리에 위치된 종양의 수축의 결과를 가져온다. 따라서, 온열암요법(용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 및 LPS 투여는 국소 온열암요법의 장거리(전신적) 효과의 결과를 가져온다.
실시예 13: 류카인®(Leukine®)과의 조합의 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동
72세의 남성 환자가 분류불가능한 비소세포폐암으로 진단되었다. 최초 진단에서의 종양의 분류는 cT2N2M0 IIIB기(cT2N2M0, stage IIIB)이었다. 진행된 사례에도 불구하고, 환자는 어떠한 치료도 거부하였다. 5개월 후, 환자는 4주 전 과로로 점진적으로 악화된 객혈(hemoptysis) 및 호흡곤란(dyspnea)을 호소하면서 보완 및 대체의학과(department of complementary and alternative medicine) 외래환자로 방문하였다. 환자는 암학과(medical oncology department)에 조회되었고 그리고 재평가가 승인되었다.
흉부 CT 및 PET 스캔을 포함한 병기 설정과정(staging work-up)에서 우중엽(right middle lobe)에 다중 지역(multiple regional) 및 림프절 전이암을 수반하는 9.5㎝ 크기의 공동 덩어리가 나타났다. 환자는 동반-질환 및 의료이력이 없었다. 그러나, 환자는 여전히 화학요법을 거절하였고 그리고 그의 가족 구성원들과 함께 다른 가능한 치료 옵션을 요청하였다.
이러한 상황에서, 본 발명자들은 앱스코팔 효과를 유도하기 위하여 온열암요법 및 GM-CSF와의 조합으로 방사선요법을 시행하였다. 폐종괴(lung mass)에의 국소 영역 방사요법(local field radiation therapy)을 1주에 5 내지 6회의 치료로 1일 선량(daily fractions) 1.7cGy(센티그레이)의 용량으로 조사하였다. 1주 당 3회 방사 후 온열암요법이 후속되었다. 온열암요법 치료 2주 후, GM-CSF(250㎍, 류카인®, 미합중국)를 10일간 매일 1회 피하로 투여하였다. 방사선요법 1주 후 용량 125㎍/㎡으로 GM-CSF가 피하로 14일간 피하로 제공되었다. 그 결과는 GM-CSF의 사용이 실현가능하였고 그리고 그의 효과가 면역요법을 강화시켰다는 것이 지지되었다.
어떠한 합병증도 없이 치료들이 제공되었다. 환자는 치료 기간 종기에서 등급 1의 피로도(grade 1 fatigue)를 제외하고는 심각한 부작용을 나타내지 않았다. 추수과정(follow-up process)으로, 방사선치료 시리즈 종결 직후 PET 스캔은 방사선요법 영역으로부터 멀리 떨어진 다중 림프절 전이암에서 거의 완전한 차도를 나타내었다. 원발의(치료된) 종양이 수축되었고, 멀리 떨어진 전이암이 사라졌다(도 37을 참조하시오). 환자는 만족하였고 그리고 성공적인 반응으로 퇴원하였다. 환자의 추적 조사(follow-up)가 진행중이다. 이 사례는 온열암요법 및 GM-CSF 면역자극과의 조합의 국소 방사선요법에 대한 성공적인 앱스코팔 효과를 기술하고 있다. 이 시도는 면역 반응에 있어서 방사선요법 단독에 비해 보다 효과적인 것으로 여겨진다.
실시예 14: 십전대보탕(TJ-48)과의 조합으로의 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동
콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과의 조합으로의 십전대보탕(TJ-48)의 백신 효과가 4T1(luc2) 정위 종양 모델(orthotopic tumor model)에 대하여 평가되었다. 십전대보탕(TJ-48)(일본국 도쿄 소재, 츠무라사(Tsumura Co.))은 빈혈증을 완화시키는 데 사용되어 온 일본 한방(Japanese herbal)이다. 이는 10가지의 전통적인 약초의 추출물을 포함하고 그리고 면역계에 대하여 강력한 생체반응조절(biological response modifier) 효과를 갖는다.
종양 세포주: 4T1(luc2) 이는 루시퍼라아제 효소(luciferase enzyme)를 포함하는 세포주의 복제물이다. 종양 및 그의 전이암은 효소의 기질이 복강 내 투여되는 경우 약한 광 방사를 방출할 수 있고, 그리고 민감한 카메라 시스템(IVIS2000 생체 내 생물발광 영상화 시스템)을 사용하여 영상화(및 정량화)될 수 있다.
실험 설계:
종양 유도: -14일
TJ-48 투여: -3일 내지 18일(50㎎/일, 매일, 경구(po))
온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 치료: 0일 및 6일(1 내지 2W 종양 중심에 도달 온도 41 내지 42℃, 25분의 총 치료 시간)
20일차에 생쥐들을 희생시키고 그리고 폐를 체외 영상화시켜 전이암을 검출하였다. 폐 내의 원발종양 및 전이암의 이력형태학적 검사를 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다.
실험 동물 군:
1. 미치료 대조(4개체의 생쥐들)
2. TJ-48 군: 생쥐들을 단지 TJ48로만 치료하였음(4개체의 생쥐들); TJ-48을 위장 탐침(gastric probe)를 사용하여 경구적으로 투여하였다.
3. 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동) 군: 생쥐들을 단지 0일차 및 6일차에 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동으로 치료하였다(4개체의 생쥐들)
4. 온열암요법 + TJ-48 군: 생쥐들을 0일차 및 6일차에 TJ-48 및 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동)으로 치료하였다(4개체의 생쥐들)
유도된 원발종양의 종양 용적을 0일차 내지 13일차에서 평가하였다. 도 48에 나타난 바와 같이, TJ-48과의 조합으로의 온열암요법(콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동)의 적용은 종양 용적의 유의미한 감소의 결과를 가져왔다.
실시예 15: 본 발명의 방법의 백신화 효과의 실험적인 입증
실험 설계, 종양 모델(4T1) 및 실험 동물군들은 실시예 14에서 기술된 바와 동일하였다. 이 기록에서는 약어들이 사용되었다:
평가 방법:
I. 실험군들 중의 동물의 생존시간의 조사
온열암요법 및 면역자극제로 치료된 군의 생존시간에서의 유의미한 증가가 본 방법의 백신화 효과를 간접적으로 입증하고 있다.
II. ELISPOT 분석을 사용한 백신화 효능의 평가
효소-결합 면역흡수 스팟(ELISPOT: enzyme-linked i㎜unosorbent spot) 분석은 인간 및 동물에서의 면역 반응을 모니터링하기 위한 통상적인 방법이다. ELISPOT 분석은 ELISA 면역분석의 변형된 버전에 기초하고 있고 그리고 그로부터 발달되었다. ELISPOT 분석은 원래 B세포 분비 항원-특이적 항체를 열거하기 위하여 개발되었고 그리고 그 후 단일 세포 수준에서 여러 임무들, 특히 사이토카인-생산 세포의 열거를 위하여 적용되었다. 간단히 말해서, 적절한 조건들에서 ELISPOT 분석은 개개 활성화되거나 또는 대응하는 세포의 분비 생성물의 가시화(visualization)를 허용한다. 분석에서 발달된 각 스팟(spot)은 단일의 반응성 세포를 나타낸다. 따라서, ELISPOT 분석은 정성적인(면역 단백질의 타입) 그리고 정량적인(대응하는 세포의 수) 정보 둘 다를 제공한다. 항종양 백신화 평가를 위하여는 감마-인터페론(IFN-ga㎜a) ELISPOT 분석이 폭 넓게 사용되고 그리고 수용된 방법이다.
ELISPOT 시험의 설계의 짧은 설명(생쥐용 ELISPOT 분석 킷트는 비디바이오사이언스사(BDBiosciences)로부터 상용적으로 획득가능함);
1. 실험군의 동물로부터의 대상 세포의 수집(말초혈액 단핵세포(PBMC: peripherial blood mononuclear cell) 또는 비장 유래 세포). 샘플들을 실험군들에 따라 개개 동물로부터 수집하였다. 실험군들: 미치료 대조 동물; 온열암요법 치료 동물, 면역-자극제로 치료된 동물; 온열암요법 치료와 면역자극 치료가 조합됨.
2. 대상 세포로부터의 샘플을 4T1 종양 세포와 함께 배양
3. 제조업자의 프로토콜에 따른 ELISPOT 분석의 수행
4. 시험의 평가: 성공적인 백신화 효과의 사례에서 OTM = CIS 샘플이 분석에서 가장 높은 수의 스팟들을 보이고 있다.
III. 유세포 분석(FACS: flow-cytometric analysis)을 사용한 백신화 효능의 평가
PBMC로부터의 CD4+ 및 CD8+ T세포 개체군이 유세포 분석 및 적절한 항체를 사용하여 조사될 수 있다. 혈액샘플들이 또한 이 실험에서 수집될 수 있다. 성공적인 백신화의 사례에서, 다른 군들에 비해 OTM+CIS 군에서 CD4+ 및 CD8+ 양성 세포의 비율이 유의미하게 더 높을 것이다.
VI . 종양 및 전이암 샘플 중에서의 IHCH 분석을 사용한 백신화 효능(T세포 반응)의 평가:
원발종양 및 그의 전이암의 침습은 잠재적인 항종양 면역-반응의 특징이다. (즉, 성공적인 항종양 백신화). 침습된 T세포 개체군의 IHCH 조사는 백신화 과정의 결과에 대한 중요한 지지정보(supportive information)를 제공할 수 있다. 원발종양에서 또는 특히 전이암에서의 높은 CD8 양성의 경우 보다 강한 항종양 면역 반응 및 보다 나은 백신화 효능을 의미한다.

Claims (16)

  1. 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 비-침습적으로 적용되는 고주파 파동과의 조합으로 사용되며, 소암평, 저-용량 카보플라틴(< 0.4㎎/㎏) 및 십전대보탕(JT48)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비-특이적 면역 자극제를 포함하는, 원발암 및 그의 전이암의 비-침습적인 치료, 암 질환의 재발의 비-침습적인 방지 및 암 발달에 대한 증가된 위험을 갖는 사람의 비침습적 백신화를 위한 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    콘덴서 배열이 적어도 하나의 전극 및 적어도 하나의 대-전극(counter-electrode)을 포함하고, 환자가 그 사이의 유전물질인, 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    고주파 파동의 적용을 위하여 방사성 결합을 수반하는 고주파 배열에서와 같은 안테나가 사용되지 않는, 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    고주파 파동이 전신적으로 적용되는, 약제학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    적용된 고주파 파동이 환자의 체온 또는 환자의 치료된 영역의 온도를 증가시키지 않는, 약제학적 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-특이적 면역자극제가 환자의 면역계를 활성화시키고 그리고 적용된 콘덴서 배열에서 용량 결합을 사용하는 고주파 파동과의 조합으로 기억을 발달시키는 것에 의하여 세포가 암세포를 인식하고 그리고 사멸시키도록 암 질환에 대하여 백신-효과를 제공하는, 약제학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    전이암 또는 원발암이 선암종, 맥락막흑색종, 급성 백혈병, 청신경초종, 팽대부암종, 항문암종, 성상세포종, 기저세포암종, 췌장암, 유건종, 방광암, 기관지 내 암종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 유방암, 버킷림프종, 코퍼스암, 원발부위 미상암-증후군, 대장암, 소장암, 소장 종양, 난소암, 자궁내막암종, 뇌실상의종, 상피성 암형, 유잉종양, 위장관간질 종양, 위암, 담관암, 담관암종, 자궁암, 자궁경부암, 자궁경부, 교아세포종, 부인과 종양, 이비인후 종양, 혈액 신생물 형성, 모양 세포성 백혈병, 요도암, 피부암, 피부 고환암, 뇌종양, 뇌전이암, 고환암, 뇌하수체 종양, 유암종, 카포시육종, 후두암, 생식세포종, 골암, 결직장암종, 두경부 종양(이비인후 영역의 종양), 결장암종, 두개인두종, 구강암, 중추신경계의 암, 간암, 간전이암, 백혈병, 안검 종양, 폐암, 림프절암, 림프종, 위암, 악성 흑색종, 악성 신생물 형성, 위장관 악성 종양, 유방암종, 직장암, 수질아세포종, 흑색종, 수막종, 호지킨 질환, 균상식육종, 비강암, 신경초종, 신경아세포종, 신장암, 신세포암종, 비-호지킨 림프종, 핍지교종, 식도암종, 골용해성암종과 골성형성암종, 골육종, 난소암종, 췌장암종, 음경암, 형질세포종, 두경부의 편평세포암종(SCCHN), 전립선암, 인두암, 직장암종, 망막아세포종, 질암, 갑상선암종, 시니버그 질환, 식도암, 편평세포암, T-세포 림프종, 흉선종, 난관암종, 안종양, 요도암, 비뇨기적 종양, 요로상피암종, 외음암, 사마귀 외양, 연조직 종양, 연조직 육종, 빌름스 종양, 자궁경부암종 및 설암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
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  15. 삭제
  16. 제 1 항에 있어서,
    전이암 또는 원발암이 성상세포종, 교아세포종, 췌장암, 기관지암, 유방암, 대장암, 난소암, 위암, 후두암, 악성 흑색종, 식도암, 자궁경부암, 간암, 방광암 및 신세포암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
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