CN101352180A - 用于抑制植物病原菌的博落回生物碱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于抑制植物病原菌的博落回生物碱及其制备方法。本发明所述的生物碱是从博落回全草中提取出来的总生物碱及其4种主要的单体生物碱：血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和α－别隐品碱。本发明首次明确博落回生物碱对植物病原细菌和真菌具有明显的抑制活性，其中血根碱和白屈菜红碱的抑制活性最强。博落回总生物碱及其单体生物碱可用于防治植物病害。

Description

用于抑制植物病原菌的博落回生物碱及其制备方法

技术领域

本发明涉及博落回生物总碱和主要单体生物碱的制备及其对植物病原真菌和细菌的抑制作用，属于农药技术领域。

背景技术

博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)在分类上属于罂粟科(Papaveraceae)博落回属，为多年生高大草本，主要生长于海拔120-180米的丘陵或低山林的灌丛或草丛中，分布在我国的贵州、广西、广东、福建、江西、湖南、湖北、安徽、浙江、江苏、河南、陕西、甘肃南部等省份，少量分布在日本中部。博落回是重要的药用植物，具有杀虫、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性。博落回中总生物碱含量约占全草干重的1％，为异喹啉类生物碱。生物碱被认为是博落回的主要生物活性成分。

目前尚未见博落回生物碱对根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌等植物病原细菌，以及番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉、水稻纹枯病菌、苹果轮纹病菌等植物病原真菌的抑制作用报道。

本发明着重于博落回总碱及其主要单体生物碱的制备，以及生物碱对上述植物病原细菌和真菌的抑制活性，为新型植物源杀菌剂的研究与开发提供依据。

为了保护环境和人类，以及维持农业的可持续发展，急需不断研制高效、低毒、低残留的环境相容型农药。本发明的目的是提供博落回生物碱作为高效抗菌剂在抑制植物病原真菌和病原细菌上应用的例子。

发明内容

本发明涉及博落回生物总碱和主要单体生物碱的制备及其对植物病原真菌和细菌的抑制作用，提供如下的技术方法。

1、博落回生物总碱的制备

采用酸提碱沉方法得博落回总生物碱，得率为0.7％(g/g干重)。

2、博落回主要生物碱的分离与结构鉴定

采用多种柱层析并结合活性追踪分离的方法，从博落回总碱中分离并鉴定出血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和α-别隐品碱等4个异喹啉类生物碱。

3、博落回生物碱对细菌的抑制作用

采用多孔板生长速率法，测定血根碱和白屈菜红碱对根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌和番茄细菌斑点病菌具有明显的抑制作用(表3)。

4、博落回生物碱对稻瘟菌孢子萌发的抑制作用

博落回主要单体生物碱：血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和α-别隐品碱对稻瘟菌孢子萌发具有明显的抑制作用，半抑制浓度在10μg/mL到40μg/mL之间(表4)。

5、博落回生物碱对真菌生长的抑制作用

采用液体培养基生长速率法，测定血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和α-别隐品碱对番茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦赤霉、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌的生长均具有明显的抑制作用(表5)。

本发明的优点：本发明首次明确了博落回生物碱具有广谱的抗植物病原细菌和真菌的活性，主要的抗菌活性生物碱为：血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和α-别隐品碱。目的是利用植物资源，获得抗菌活性成分，为植物源农药的研究与开发，为探讨植物次生代谢成分的生理生态功能提供依据。

为了更好地理解本发明，下面结合本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

具体实施方式

实施例1：博落回总碱的制备

于秋天采集博落回全株，凉干后粉碎，取3kg粉末，用2倍体积1％硫酸室温下提取3次(每次3天)，滤液用氢氧化钠调pH值至9，得沉淀物。将沉淀物用1L 95％乙醇于80℃下回流提取3次(每次5小时)，提取液用50％硫酸酸化至pH 2，生物碱成盐析出，过滤，即得博落回总生物碱21g，计算总生物碱含量为植物干重的0.7％。

实施例2：博落回总碱对植物病原细菌的抑制活性

用实施例1中所述的方法制备到总生物碱，采用打孔药剂扩散法，测定博落回总生物碱对植物病原细菌的抑制活性。

(1)活性测定的植物病原细菌菌株：供试细菌包括：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens ATCC11158)、黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans ATCC 11921)和番茄细菌斑点病菌(Xanthomonasvesicatoria ATCC 11633)。上述供试菌株长期保存在-20℃下，在活性测定前，需要在LB平板上对供试细菌进行活化培养(28℃，暗)48h，然后挑取单菌落，在LB液体培养基中摇培(28℃，暗，150rpm)24h，然后继代培养8-12h，菌液浓度达到10⁹ cfu/mL，即可用于活性测定。

(2)培养基：采用LB琼脂培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，pH7.0)和LB液体培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0)。

(3)抗菌活性测定：采用打孔药剂扩散法测定。具体测定步骤为：90mm直径的培养皿中盛3％的水琼脂10mL，冷却凝固后加入15mL含150μL菌液(10⁹cfu/mL)的LB培养基(45℃)，待上层凝固后，用无菌打孔器打孔(直径5mm)，每孔中加入浓度为5mg/mL(用DMSO配制)的博落回生物总碱溶液40μL、或者0.2mg/mL(用DMSO配制)的硫酸链霉素溶液40μL(阳性对照)、或者DMSO溶液40μL(阴性对照)，在28℃下培养过夜后，采用十字交叉法测定抑菌区域的直径。每个处理重复3次。

(4)实验结果：结果见表1，博落回总生物碱对供试细菌具有较好的抑制活性。

表1博落回总生物碱的抗细菌活性

注：每孔中博落回总碱的量为0.2mg，硫酸链霉素的量为8.0μg。

实施例3：博落回总生物碱对植物病原真菌的抑制活性

用实施例1中所述的方法制备得到总生物碱，采用带毒平板菌丝生长速率法，测定博落回总生物碱对植物病原真菌的抑制活性。

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：配制1L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar，PDA)的步骤为：将洗净去皮的马铃薯200g，切成小块，加去离子水1000mL，煮沸30min，过滤，取滤液，加琼脂20g和葡萄糖20g，加热使琼脂融化后，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。121℃湿热灭菌20min。该培养基用于真菌的活化培养、继代培养和抗菌活性测定。

(2)供试的植物病原真菌：供试真菌包括：番茄早疫病菌(Alternaria solani)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)。上述供试的植物病原真菌菌株长期保存在4℃下，在活性测定前，需要在PDA平板上对供试真菌进行活化培养(25℃，暗)5-10天，然后继代培养1-2次，即可用于活性测定。

(3)实验设计与操作：采用带毒平板菌丝生长速率法，测定生物总碱对真菌菌丝生长的抑制作用。将生物总碱配成系列浓度的母液：200mg/mL、100mg/mL、25mg/mL、10mg/mL、5mg/mL(针对不同的供试真菌，选择不同的溶剂，即番茄枯萎病菌、水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌活性测定采用丙酮作溶剂；黄瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌用DMSO作为溶剂；番茄早疫病菌用乙醇作为溶剂)，然后取一定量(即：0.5mL生物总碱母液于50mL PDA培养基中)于真菌培养基(50-60℃)中，充分混合，此时生物总碱在培养液中的浓度分别为：2000μg/mL、1000μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL。将混合好的培养基倒入90mm直径的无菌培养皿中，待培养基凝固后，挑取新鲜菌丝(直径为5mm的菌饼)于PDA平板的正中(有菌丝的一面向下和培养基贴合)，25℃，暗培养5-10天。实验设阴性对照(即溶剂对照)、空白对照(水)和阳性对照(多菌灵)，每个处理重复3次。

(4)结果观察和数据处理：待空白对照菌落接近培养皿边缘时观察结果，取出培养皿用卡尺测量菌落直径，每个菌落十字交叉测两次直径。用下述公式计算抑制率(计算抑制率时用溶剂作对照)：

菌落扩展直径(mm)＝测量菌落的平均扩展直径(mm)-5(菌饼直径mm)

试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度(μg/mL)取对数(X)，抑制率换算成生物统计机率值(Y)，求得抑制活性回归方程(毒力回归方程)(Y＝aX+b)，从而可以求得半抑制浓度(IC₅₀)。

(5)实验结果：见表2。博落回生物总碱对番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌具有明显的抑制活性。

表2博落回生物总碱的抗真菌活性

注：培养基中多菌灵(阳性对照)浓度为10μg/mL，对供试真菌生长的抑制率为60-100％。

实施例4：博落回主要单体生物碱的分离

博落回总生物碱20g，用乙酸乙酯溶解后过滤，不溶物先用水充分溶解，用50％的氢氧化钠溶液滴定水溶液，不断摇动，见溶液由桔红色变褐色并出现沉淀即可，过滤，除去水分。然后采用硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶丙酮＝100∶3∶3，v/v)，得到黄色组分和红色组分各1个。红色组分经凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(氯仿∶甲醇＝1∶1，v/v)，得到较纯的化合物，经反相硅胶(RP-18)柱层析，梯度洗脱(水∶甲醇＝90∶10；80∶20；70∶30；50∶50；30∶70；10∶90，v/v；各梯度洗脱为2个柱体积)，得到一红色粉末状物质，即化合物1(血根碱)1800mg。上述黄色组分经凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(氯仿∶甲醇＝1∶1，v/v)，得到较纯的化合物，再经制备性薄层层析(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇＝50∶5∶1，v/v)，得到一黄色针晶状物质，即为化合物2(白屈菜红碱)900mg。

上述总碱的乙酸乙酯滤液，浓缩后用水混悬，然后用氯仿萃取，萃取液浓缩后用正相硅胶(300-400目)柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝60∶4∶1.5，v/v)洗脱，得到两个主要成分，分别用氯仿-甲醇反复结晶，得到化合物3(原阿片碱)150mg和化合物4(α-别隐品碱)120mg。

实施例5：化合物1(血根碱)的结构鉴定

用实施例4所述的方法制备到化合物1，为红色结晶(水)。m.p.242-243℃；碘化铋钾显橘红色，提示该化合物可能为生物碱。

EI-MS：m/z 332[M]⁺。

¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)δ(ppm)：7.58(1H，s，H-1)，8.24(1H，s，H-4)，9.95(1H，s，H-6)，8.66(1H，d，J＝9.0Hz，H-9)，7.97(1H，d，J＝8.5Hz，H-10)，8.56(1H，d，J＝9.0Hz，H-11)，8.24(1H，d，J＝9.0Hz，H-12)，4.95(3H，s，H-13)，6.27(2H，s，H-14)，6.52(2H，s，H-15)。

¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)δ(ppm)：105.5(C-1)，148.5(C-2)，148.5(C-3)，131.0(C-4)，119.9(C-4a)，131.0(C-4b)，149.5(C-6)，131.9(C-6a)，146.0(C-7)，147.3(C-8)，118.5(C-9)，119.7(C-10)，126.8(C-10a)，125.3(C-10b)，117.1(C-11)，104.0(C-12)，109.2(C-12a)，52.1(C-13)，102.7(C-14)，104.8(C-15)。

化合物1理化常数和波谱数据与文献(杨秀伟主编。生物碱。北京：化学工业出版社，2005，pp.211-212；Marek R et al.¹H and ¹³C NMR study of quaternary benzo[c]phenathridine alkaloids.Magnetic Resonance inChemistry，1999，37：781-787。)报道的血根碱(Sanguinarine)相比较，基本一致，故确定化合物1为血根碱，分子式为C₂₀H₁₄NO₄，其结构式如下：

实施例6：化合物2(白屈菜红碱)的结构鉴定

用实施例4所述的方法制备到化合物2，为黄色针晶(EtOH)。m.p.207℃(含一分子乙醇)；碘化铋钾显橘红色，提示该化合物可能为生物碱，其盐酸盐为黄色针晶，m.p.202-204℃。

EI-MS：m/z 348[M]⁺。

¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)δ(ppm)：4.17(3H，s，H-15)，4.31(3H，s，H-16)，5.03(3H，s，H-13)，6.30(2H，s，H-14)，7.62(1H，s，H-1)，8.27(1H，d，H-4)，8.23(1H，d，J＝4.25Hz，H-9)，8.29(1H，d，J＝8.6Hz，H-12)，8.74(2H，d，J＝9.25Hz，H-10，H-11)，10.00(1H，s，H-6)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：105.7(C-1)，149.6(C-2)，149.4(C-3)，103.7(C-4)，120.5(C-4a)，131.3(C-4b)，150.7(C-6)，118.5(C-6a)，146.2(C-7)，150.4(C-8)，125.8(C-9)，119.6(C-10)，126.1(C-10a)，124.3(C-10b)，118.2(C-11)，128.9(C-12)，133.0(C-12a)，51.5(C-13)，102.9(C-14)，61.4(C-15)，56.2(C-16)。

化合物2理化常数和波谱数据与文献(杨秀伟主编。生物碱。北京：化学工业出版社，2005，p.203：Marek R et al.¹H and ¹³C NMR study of quaternary benzo[c]phenathridine alkaloids.Magnetic Resonance inChemistry，1999，37：781-787)报道的白屈菜红碱(Chelerythrine)相比较，基本一致，故确定化合物2为白屈菜红碱，分子式为C₂₁H₁₈NO₄，其结构式如下：

实施例7：化合物3(原阿片碱)的结构鉴定

用实施例4所述的方法制备到化合物3，黄色单斜棱柱结晶(EtOH-CHCl₃)。m.p.208℃；碘化铋钾显桔红色，提示该化合物可能为生物碱。

EI-MS：m/z 353[M]⁺。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：6.95(1H，s，H-1)，6.67(1H，s，H-4)，6.69(2H，s，H-11，H-12)，6.00和5.96(各1H，s，H-16)，3.32(2H，s，H-13)，3.29(2H，s，H-8)，2.51(4H，br，H-5和H-6)，1.82(3H，s，H-15)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ(ppm)：107.36(C-1)，145.84(C-2)，147.34(C-3)，110.44(C-4)，30.52(C-5)，57.49(C-6)，50.78(C-8)，118.34(C-8a)，145.39(C-9)，145.28(C-10)，106.31(C-11)，125.07(C-12)，129.65(C-12a)，46.12(C-13)，194.75(C-14)，136.10(C-14a)，41.17(C-15)，101.16(C-16)，100.78(C-17)。

化合物3理化常数和波谱数据与文献(杨秀伟主编。生物碱。北京：化学工业出版社，2005，p.201。)报道的原阿片碱(Protopine)相比较，基本一致，故确定化合物3为原阿片碱，分子式为C₂₀H₁₉NO₅，其结构式如下：

实施例8：化合物4(α-别隐品碱)的结构鉴定

用实施例4所述的方法制备到化合物4，无色棱柱状结晶(MeOH-CHCl₃)，m.p.159.6-161.4℃；棱柱状结晶(EtOAc)，m.p.158-160℃。碘化铋钾显桔红色，提示该化合物可能为生物碱。

EI-MS：m/z 369[M]⁺。

¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)δ(ppm)：6.95(1H，s，H-1)，6.91(1H，d，J＝8.5Hz，H-12)，6.79(1H，d，J＝8.5Hz，H-11)，6.63(1H，s，H-4)，5.94(2H，s，H-16)，3.85(3H，s，H-17)，3.78(3H，s，H-18)，1.88(3H，s，H-15)。

¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)δ(ppm)：110.4(C-1)，146.0(C-2)，148.0(C-3)，109.2(C-4)，135.8(C-4a)，32.2(C-5)，57.5(C-6)，50.2(C-8)，128.4(C-8a)，151.5(C-9)，147.3(C-10)，110.6(C-11)，127.6(C-12)，129.4(C-12a)，46.1(C-13)，132.7(C-14a)，41.2(C-15)，101.2(C-16)，60.7(C-17)，55.6(C-18)。

化合物3理化常数和波谱数据与文献(杨秀伟主编。生物碱。北京：化学工业出版社，2005，p.193-194。)报道的α-别隐品碱(α-allocryptopine)相比较，基本一致，故确定化合物4为α-别隐品碱，分子式为C₂₁H₂₃NO₅，其结构式如下：

实施例9：博落回生物碱的抗细菌活性

用实施例3所述的方法，对从博落回生物总碱中分离到的4个生物碱单体：血根碱(1)、白屈菜红碱(2)、原阿片碱(3)、α-别隐品碱(4)进行抗细菌活性测定。

(1)活性测定的植物病原细菌菌株：见实施例2。

(2)培养基：见实施例2。

(3)抗菌活性测定

最低抑制浓度(MIC)的测定：采用多孔板-MTT法测定化合物对细菌的MIC值，结果见表3。具体步骤如下。每孔加入浓度为10⁶cfu/mL的供试菌液90μL，然后加入不同浓度(20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、1280μg/mL)的化合物药液10μL(40％乙醇溶液，v/v)。而阳性对照为不同浓度(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)的硫酸链霉素母液10μL(40％乙醇溶液，v/v)。实验设阴性对照(即终浓度为4.0％乙醇的溶剂对照)、空白对照(水)和阳性对照(硫酸链霉素)，每个处理重复3次。这样化合物在菌液中的浓度均为母液浓度的十分之一。

将多孔板于28℃振荡(暗)培养24h后，每孔中加入5.0mg/mL的MTT溶液10μL(pH 7.2、0.2mol/LPBS溶液)，继续培养4h后，3000g下离心20min，弃去上清液，加入100％二甲基亚砜(DMSO)100μL，振荡30min，以终止反应并助其溶解。肉眼即可观察判断化合物的MIC值。为了进一步验证MIC值，从多孔板每个孔中吸取10μL培养液涂布到LB平板上，在28℃下培养24h后观察统计平板菌落数即可。

半抑制浓度(IC₅₀)的测定：采用多孔板-MTT法测定化合物对细菌的IC₅₀，结果见表3。具体步骤为：每孔加入浓度为10⁶cfu/mL的供试菌液90μL，然后加入不同浓度(20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、1280μg/mL)的药液10μL(40％乙醇溶液，v/v)，同时设阳性对照、空白对照和溶剂对照，28℃暗培养24h后，每孔中加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续培养4h，3000g下离心20min，弃上清液，再加入100％二甲基亚砜100μL，继续振荡30min，以终止反应并助其溶解。将显色的菌悬液在3000g下离心20min，上清液转到另一多孔板中，用酶标仪测定其在590nm处的吸光值(OD_590nm)，按下式计算药物抑制率(％)：

根据抑制率，查机率值表，可得抑制率机率值(Y)，将药液浓度(μg/mL)换算成浓度对数(X)，即可求出线性方程Y＝aX+b，根据线性方程可求出半抑制浓度(IC₅₀)。本发明中的数据均为3次重复平均值。

(4)实验结果：结果见表3，血根碱和白屈菜红碱具有明显的抗细菌活性。

表3多孔板-MTT比色法测定博落回生物碱的抗细菌活性

注：NA表明在最大浓度为128μg/mL，未检测出抗菌活性；-表明未能求出化合物的抑制活性回归方程。

实施例10：博落回生物碱对稻瘟菌孢子萌发的抑制作用

用实施例3所述的方法，对从博落回生物总碱中分离到的4个生物碱单体：血根碱(1)、白屈菜红碱(2)、原阿片碱(3)、α-别隐品碱(4)，进行稻瘟菌孢子萌发的抑制活性测定。

(1)培养基：采用燕麦西红柿培养基(Oat-tomato agar medium，OTA)。配制1L的燕麦西红柿培养基的步骤为：将成熟的西红柿切碎，用榨汁机榨汁，汁液用四层纱布过滤，取已过滤的汁液150mL待用。同时，称取燕麦片30g，加入1000mL去离子水，煮沸30min，注意边煮边搅拌。煮好的燕麦片用两层纱布过滤。收集滤液，然后往滤液中加入已准备好的番茄汁150mL和20g琼脂，加热融化，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。分装后121℃湿热灭菌20min。该培养基用于稻瘟菌的培养。

(2)供试的植物病原真菌：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)。

(3)稻瘟菌活化培养：用灭菌的接种针从保存菌种的试管中挑取少量菌丝，接种到燕麦番茄汁培养基平板上，用封口膜封好，25℃下培养。

(4)稻瘟菌继代培养：倒燕麦番茄汁培养基平板，每皿倒培养基约40mL。用移液枪在稻瘟菌菌落中央滴加无菌水1mL，然后用灭菌后的接种针轻轻擦洗菌落表面，注意用力要轻，以免擦破培养基表面。

待无菌水变浑浊后，再用移液枪吸取100μL滴加到倒好的燕麦番茄汁培养基平板表面，然后用玻璃涂棒将其涂散均匀。待培养基表面干燥后，盖好倒置25℃下培养。

(5)机械刺激诱导产孢：接种活化的稻瘟菌室温下培养48h后，在其表面滴加无菌水约3mL，然后用灭菌后的棉签轻轻擦洗菌丝，将菌丝机械擦断，连续擦洗两次，待灰色菌落变为黑色后即可，将表面的水倒掉，然后倒扣于灭菌后的吸水纸上，晾干水分，用三层灭菌后的纱布将皿口封住，置于干燥有光的条件下培养48h即可得到稻瘟菌孢子。

(6)配制化合物母液：称取化合物各2mg，加入乙醇溶解，配成2000μg/mL的母液，然后稀释成含20％乙醇的母液浓度梯度：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL和5μg/mL。

阳性对照采用多菌灵(Aldrich)，称取多菌灵1.0mg到Eppendorf管中，向其中加入纯乙醇溶液1.0mL，振荡溶解，得到1000μg/mL的多菌灵母液。然后将多菌灵母液配制成系列浓度为30μg/mL、20μg/mL、16μg/mL、10μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL，溶剂为20％乙醇的溶液。

(7)配制孢子悬浮液：在机械诱导产孢好的平板上滴加无菌水3.0mL，然后用无菌棉签轻轻擦洗菌落表面，洗下孢子，将孢子洗液装到1.0mL的离心管中，离心3次(离心力8000g，每次离心10min)。然后配制孢子悬液，利用血球记数板测定孢子浓度，将孢子浓度配制为2×10⁶个/mL。

(8)进行活性测定：准备洁净培养皿，然后在每个培养皿中放上四层吸水纸，进行灭菌。灭菌后，往每皿中加无菌水5.0mL，在吸水纸上平行放置两根无菌牙签。另准备好凹玻片，用75％的乙醇浸泡24h，然后晾干。在每个凹洞上滴加25μL配制好的稻瘟菌孢子悬浮液(2×10⁶个/mL)和25μL系列浓度梯度的化合物溶液(滴加前应在振荡器上充分震荡，以保证孢子悬浮液和药剂溶液充分混匀)，这样得到生物碱的检测终浓度为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL。而阳性对照的检测终浓度为15μg/mL、10μg/mL、8μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。同时设空白对照和溶剂对照(10％乙醇)，每个处理3个重复。然后将凹玻片放在培养皿中的牙签上，室温下培养7h后进行观察。实验设阴性对照(即溶剂对照)、空白对照(水)和阳性对照(多菌灵)，每个处理重复3次。

(9)观察记录实验结果和孢子萌发率的计算

在显微镜10×10(目镜×物镜)倍下观测每一凹玻片上的孢子萌发情况，选择3个不同的视野，每个视野中100个以上孢子，共数300个孢子，用计数器记下萌发的孢子数，将3个重复合到一块计算孢子萌发率(％)。

(10)数据处理和半抑制浓度的计算

试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度(μg/mL)取对数(X)，抑制率换算成生物统计机率值(Y)，求得抑制活性回归方程(Y＝aX+b)，从而可以求得半抑制浓度(IC₅₀)。实验设空白对照和溶剂对照(10％乙醇，v/v)，每个处理两个重复。

(11)实验结果

化合物对稻瘟菌孢子萌发抑制活性结果见表4，从博落回总碱中分离到4个单体生物碱中，血根碱的抑制活性最强，其次是白屈菜红碱。

表4化合物对稻瘟菌孢子萌发抑制活性

实施例11：博落回生物碱对真菌菌丝生长的抑制活性

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：配制1L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar，PDA)的步骤为：将洗净去皮的马铃薯200g，切成小块，加去离子水1000mL，煮沸30min，过滤，取滤液，加琼脂20g和葡萄糖20g，加热使琼脂融化后，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。121℃湿热灭菌20min。该培养基用于真菌的活化培养和继代培养。

PDB培养基的配制步骤除不加琼脂外，同于PDA培养基。该培养基用于博落回生物碱对真菌菌丝生长的抑制活性测定。

(2)供试的植物病原真菌：番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeriaberengeriana)、小麦赤霉(Fusarium graminearum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)。

上述供试的植物病原真菌菌株长期保存在4℃下，在活性测定前，需要在PDA平板上对供试真菌进行活化培养(25℃，暗)5-10天，然后继代培养1-2次，即可用于活性测定。

(3)实验设计与操作：采用液体培养基中菌丝生长速率法，测定化合物对真菌菌丝生长的抑制作用。将化合物(包括阳性对照多菌灵)配成系列浓度的母液(溶剂为甲醇)：2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL和0.0625mg/mL，然后取一定量(即：300μL化合物母液于30mL真菌培养液中)于真菌培养液中，此时化合物在培养液中的浓度分别为：20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25g/mL、0.625μg/mL。同时，挑取新鲜菌丝(直径为5mm的菌饼)于PDB培养液中(1个菌饼/30mL培养基/100mL容积的三角瓶)，摇床培养(25℃，暗，150rpm)5-6天，采用过滤法收集菌丝，于60℃下烘干至恒重。实验设阴性对照(即溶剂对照)、空白对照(水)和阳性对照(多菌灵)，每个处理重复3次。抑制率的计算如下：

(4)数据处理：试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度(μg/mL)取对数(X)，抑制率换算成生物统计机率值(Y)，求得抑制活性回归方程(Y＝aX+b)，从而可以求得半抑制浓度(IC₅₀)。

(5)实验结果

采用液体培养基中菌丝生长速率抑制法测定博落回中4种主要生物碱对6种植物病原真菌的抑制作用(结果见表5)，血根碱和白屈菜红碱对供试真菌的抑制活性强于原阿片碱和α-别隐品碱的抑制活性。

表5博落回生物碱对植物病原真菌的抑制活性

Claims (7)

1、博落回生物碱在制备抑制植物病原菌药物中的应用。

2、一种按权利要求1所述的博落回生物碱，其特征是博落回全草经干燥后粉碎，采用酸提碱沉方法获得总生物碱。

3、一种按权利要求1所述的博落回生物碱，其特征是总生物碱的含量为植物干重的0.7％。

4、一种从按权利要求1所述的博落回总生物碱中分离到血根碱的方法，该化合物对植物病原细菌和病原真菌具有抑制活性。

5、一种从按权利要求1所述的博落回总生物碱中分离到白屈菜红碱的方法，该化合物对植物病原细菌和病原真菌具有抑制活性。

6、一种从按权利要求1所述的博落回总生物碱中分离到原阿片碱的方法，该化合物对植物病原细菌和病原真菌具有抑制活性。

7、一种从按权利要求1所述的博落回总生物碱中分离到α-别隐品碱的方法，该化合物对植物病原细菌和病原真菌具有抑制活性。