CN101343631A - 一种海蜇基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术，具体的说是一种海蜇基因组DNA的提取方法。具体为将海蜇用手术剪刀剪碎至无明显颗粒状组织，加入CTAB buffer、蛋白酶K，在55～56℃消化24～26小时至溶液澄清；或将海蜇置入95％的酒精中脱水并加入buffer、SDS、蛋白酶K，封口后55～56℃消化0.8～1.0小时；而后混合苯酚、氯仿和异戊醇，离心，吸上清，再加入氯仿和异戊醇混合液混匀，离心，吸上清；再在上清液中加异丙醇，沉淀10～15分钟，沉淀后取出，离心，弃去液体，并用乙醇，离心洗涤，将多余液体倒去室温自然凉干，即得到海蛰基因组DNA。采用本发明可提取高质量的海蜇全基因组DNA，且方法简单、经济、易于操作，适合在普通生物实验室中进行。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术，具体的说是一种海蜇基因组DNA的提取方法。
背景技术
海蛰因其含水量高、易分解和自溶等生物学特点，限制了对它的基因组DNA的提取。海蜇的生活史包括有性世代和无性世代。螅状体营固着生活、属于海蜇无性世代，碟状体营浮游生活、属于海蜇有性世代，两者在外部形态以及生物学功能方面都有很大不同，从而导致两个阶段基因组DNA的提取方法不同。目前，国内外对海蛰的研究并没有将不同的生活世代分开研究基因组DNA的提取。报道的海蜇基因组DNA提取方法多为Kit法和CTAB法。Kit法成本高而且产率低，如要进行大规模的群体分析就不实际；CTAB法样品用液氮研磨、酚仿抽提，方法烦琐且毒性大，同时其并不适于海蜇碟状体基因组的提取，不能保证后期实验的进行。同时现有技术多采用试剂盒提取或酚-氯仿抽提法进行海洋动物基因组的提取，这两种方法用于海蜇基因组DNA的提取均无法保质、保量满足实验的需要，不能达到满意效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济可行并且操作简便的海蛰基因组DNA的提取方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
基因组DNA提取方法：
1)将海蜇无性世代的海蛰螅状体用手术剪刀剪碎至无明显颗粒状组织，加入CTAB buffer 300～400ul，待用；
2)将步骤1)得到的原料内加入3～5ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，在55～56℃消化24～26小时至溶液澄清，待用；
3)在步骤2)澄清溶液中加入与其等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液混匀，离心，吸上清，再加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液混匀，离心，吸上清；而后向上清液中加入上清液的0.7～1倍体积的异丙醇，-20～-18℃沉淀10～15分钟，沉淀后取出，离心，弃去液体，并用体积浓度为70％的乙醇，离心洗1～2次，将多余液体倒去室温自然凉干，即得到海蛰螅状体的基因组DNA；其中苯酚、氯仿和异戊醇按体积份数比为25∶24∶1，氯仿和异戊醇按体积份数比为24∶1。
所述步骤1)中CTAB buffer溶液含有1.4M Nacl，0.02M EDTA，0.1MTris-Hcl和每100ml的CTAB buffer中加入2g质量浓度为2％的CTAB。
基因组DNA提取方法：
1)将海蜇有性世代的海蛰碟状体置入体积浓度为95％的酒精中脱水并保存；
2)将保存的蝶状体样品放入离心管中并直接加入buffer 300～400ul匀浆、30～40ul质量浓度为10％的SDS、3～5ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，封口后55～56℃消化0.8～1.0小时，待用；
3)将步骤2)中消化后的溶液取出加入6M NaCl，振荡浑匀20～30S，10000～12000rpm离心20-30分钟，吸上清，而后加入上清液的0.7～1倍体积的异丙醇，-20～-18℃沉淀10～15分钟，沉淀后取出，以10000～12000rpm离心15-20分钟，弃去液体，并用体积浓度为70％的乙醇，离心洗1～2次，自然室温凉干，即得到海蛰碟状体的DNA。
所述步骤1)buffer溶液含有0.01M Tris-Hcl和0.1M EDTA。
所述得到海蛰DNA溶于灭菌纯水中-20～-18℃保存；所述异丙醇和体积浓度为70％的乙醇可在4℃预冷；所述海蜇为新鲜或酒精保存的样品。
本发明所具有的优点：
本发明海蛰基因组DNA的提取方法区别于现有技术中的Kit法和一般的酚氯仿抽提法，在于对材料的处理即蝶状体用无水乙醇保存，可去除多余水分造成的对后期基因组DNA提取的干扰。而且蝶状体的提取采用改进的高盐法，毒性小，操作简单，技术要求低。螅状体基因组DNA的提取我们采用改良的CTAB法，其特征在于样品不用液氮研磨而采用手术剪刀尽量剪碎，长时间消化(24小时)，这样即简化了操作步骤又节约了成本。所得的高质量的基因组DNA可广泛应用于群体遗传学、分子标记辅助育种以及系统进化分析等方面。
附图说明
图1为本发明与现有技术CTAB法提取的海蛰螅状体基因组电泳图谱，其中：1、6泳道为MarkerλDNA/HindIII；2、3泳道为本发明方法提取的海蜇螅状体基因组DNA；4、5泳道为现有CTAB法提取的海蜇螅状体基因组DNA。
图2为本发明与现有技术高盐法、现有技术CTAB法提取的海蜇蝶状体基因组电泳图谱，其中1、8泳道为MarkerλDNA/HindIII；2、3泳道为本发明方法提取的海蜇蝶状体基因组DNA；4、5泳道为现有高盐法提取的海蜇蝶状体基因组DNA；6、7泳道为使用本发明中螅状体基因组DNA提取法所提的海蜇蝶状体基因组DNA。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明进行详细说明。
实施例1
将海蛰螅状体用牙签从波纹板(或其附着物)上挑起，收集到1.5ml的离心管中。用手术剪刀仔细的剪碎至无明显颗粒状组织加入400ul的CTABbuffer，待用。加入5ul蛋白酶K，55℃消化24小时至溶液澄清，待用。
而后再加入与澄清溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混合均匀12000rpm离心30min吸上清，再加入与所得上清等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，上下颠倒混匀12000rpm离心30mi n吸上清。所得上清液中加入其0.7倍体积的异丙醇-20℃沉淀10分钟，12000rpm离心20min弃去液体。并用500ul体积浓度为70％的乙醇，12000rpm，5min洗2次。将多余液体倒去室温自然凉干，即得到海蛰螅状体的DNA；海蛰螅状体的DNA灭菌纯水中-20℃保存。
将得到海蛰螅状体的DNA溶于40ul灭菌纯水中，30min后可用于琼脂糖凝胶电泳检测(参见图1)。
其中苯酚、氯仿和异戊醇按体积份数比为25∶24∶1；氯仿和异戊醇按体积份数比为24∶1；CTAB buffer溶液含1.4M Nacl，0.02M EDTA，0.1MTris-Hcl，2％CTAB(2g/100ml))；所述异丙醇和体积浓度为70％的乙醇在4℃预冷。
实施例2
将95％酒精保存的海蛰蝶状体收集到一个1.5ml的离心管中。加入400ul匀浆buffer、40ul 10％SDS、3ul蛋白酶K，封口后在55℃消化1小时。消化好后取出加入400ul 6M NaCl，振荡浑匀30S后12000rpm离心30min。吸上清800ul加入560ul异丙醇，-20℃沉淀10分钟，然后12000rpm离心20min，去上清。在用70％乙醇离心洗两遍，离心条件为12000rpm离心5min，自然室温凉干。即得到海蛰碟状体的DNA；海蛰碟状体的DNA灭菌纯水中-20℃保存。
将得到海蛰螅状体的DNA溶于40ul灭菌纯水中，30min后可用于琼脂糖凝胶电泳检测(参见图2)。
其中buffer溶液含0.01M Tris-Hcl和0.1M EDTA；所述异丙醇和体积浓度为70％的乙醇在4℃预冷。
实施例3
与实施例1不同之处在于：
将海蛰螅状体用手术剪刀剪碎至无明显颗粒状组织，加入CTABbuffer 300ul，待用；
而后加入3ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，在56℃消化26小时至溶液澄清，待用；
向用氯仿和异戊醇混合离心后的上清液中加入上清液的1倍体积的异丙醇，-18℃沉淀15分钟，沉淀后取出，离心，弃去液体，并用体积浓度为70％的乙醇，离心洗1次，将多余液体倒去室温自然凉干，即得到海蛰螅状体的基因组DNA。
实施例4
与实施例2不同之处在于
将海蛰碟状体置入体积浓度为95％的酒精中脱水并保存；
将保存的蝶状体样品放入离心管中并直接加入buffer 300ul、30ul质量浓度为10％的SDS、5ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，封口后56℃消化0.8小时，待用；
消化后的溶液取出加入6M NaCl，振荡浑匀20S，10000rpm离心30分钟，吸上清，而后加入上清液的1倍体积的异丙醇，-18℃沉淀15分钟，沉淀后取出，以10000rpm离心20分钟，弃去液体，并用体积浓度为70％的乙醇，离心洗1次，自然室温凉干，即得到海蛰碟状体的DNA。
Claims (5)
1.一种海蛰基因组DNA提取方法，其特征在于：
1)将海蜇无性世代的海蛰螅状体用手术剪刀剪碎至无明显颗粒状组织，加入CTAB buffer300～400ul，待用；
2)将步骤1)得到的原料内加入3～5ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，在55～56℃消化24～26小时至溶液澄清，待用；
3)在步骤2)澄清溶液中加入与其等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液混匀，离心，吸上清，再加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液混匀，离心，吸上清；而后向上清液中加入上清液的0.7～1倍体积的异丙醇，-20～-18℃沉淀10～15分钟，沉淀后取出，离心，弃去液体，并用体积浓度为70％的乙醇，离心洗1～2次，将多余液体倒去室温自然凉干，即得到海蛰螅状体的基因组DNA；其中苯酚、氯仿和异戊醇按体积份数比为25∶24∶1，氯仿和异戊醇按体积份数比为24∶1。
2.按权利要求1所述的海蛰基因组DNA提取方法，其特征在于：所述步骤1)中CTAB buffer溶液含有1.4M Nacl，0.02M EDTA，0.1M Tris-Hcl和每100ml的CTAB buffer中加入2g质量浓度为2％的CTAB。
3.一种海蛰基因组DNA提取方法，其特征在于：
1)将海蜇有性世代的海蛰碟状体置入体积浓度为95％的酒精中脱水并保存；
2)将保存的蝶状体样品放入离心管中并直接加入buffer 300～400ul匀浆、30～40ul质量浓度为10％的SDS、3～5ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，封口后55～56℃消化0.8～1.0小时，待用；
3)将步骤2)中消化后的溶液取出加入6M NaCl，振荡浑匀20～30S，10000～12000rpm离心20-30分钟，吸上清，而后加入上清液的0.7～1倍体积的异丙醇，-20～-18℃沉淀10～15分钟，沉淀后取出，以10000～12000rpm离心15-20分钟，弃去液体，并用体积浓度为70％的乙醇，离心洗1～2次，自然室温凉干，即得到海蛰碟状体的DNA。
4.按权利要求3所述的海蛰基因组DNA提取方法，其特征在于：所述步骤1)buffer溶液含有0.01M Tris-Hcl和0.1M EDTA。
5.按权利要求1或3所述的海蛰基因组DNA提取方法，其特征在于：所述海蜇为新鲜或酒精保存的样品。
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