具体实施方式
对本发明的膦酸二酯衍生物(1)进行说明。
R1和R2的至少任意一个表示离去基团。离去基团使用解离常数pKa为约12以下的离去基团。例如,作为离去基团,可以列举通式(2)至通式(6)等。
作为R3,可以列举:可以具有取代基的芳基、或者可以具有取代基的杂环残基等。芳基可以列举苯基等。R4、R5、R6、R7、R8和R9各自可以列举氢原子、可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的芳基、或者吸电子基团等,它们可以相互相同或者不同。吸电子基团可以列举卤素原子、氨基甲酰基、羰基、氰基、烷硫基、芳硫基、或者羧基等。另外,R4~R8的取代基中相邻的两个取代基可以相互结合形成环。
膦酸二酯衍生物(1)中,优选R1为OR10、R2为OR11的膦酸二酯衍生物(21)。
膦酸二酯衍生物(21)中,R10和R11为氢原子以外的基团,OR10和OR11的至少任意一个为离去基团。离去基团可以列举通式(2)至通式(4)所示的取代基等,其中,优选通式(2)的-O-R3,特别优选R3为可以具有取代基的芳基。此时,优选R10为可以具有取代基的烷基、或者可以具有取代基的芳基,R11为可以具有取代基的芳基。另外,OR10和OR11的至少任意一个优选具有与GGT的底物结构相同或者相近的结构。特别是在人GGT的情况下,优选末端碳原子上结合有羧基或其等价体、并且从磷原子上结合的氧原子至末端的原子数即除氢原子以外的原子数为6-8的结构。
以下,对R10中的可以具有取代基的烷基进行说明。
作为可以具有取代基的烷基的取代基,可以列举可以具有取代基的苯基、具有氮的杂环残基、烷硫基、芳硫基、羟基、氨基甲酰基、氨基、胍基、烷氧基、酰胺基、羧基、或者羧基的等价体等。
作为可以具有取代基的烷基的烷链,可以是直链也可以是支链。其中,优选为
作为R12,可以列举可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的芳基、或者氢原子等。
作为R12的可以具有取代基的烷基的取代基,可以列举可以具有取代基的苯基、具有氮的杂环残基、烷硫基、芳硫基、羟基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、烷氧基、或者酰胺基等。
作为由该可以具有取代基的苯基取代的烷基,优选
等。作为X3,可以列举烷氧基或低级烷基等,作为低级烷基可以列举甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基等碳原子数为1-4的直链或支链烷基等。
作为由具有氮的杂环残基取代的烷基,可以列举
等。
作为由羟基取代的烷基,可以列举-CH2OH、或者-CH(CH3)OH等。作为由羧基取代的烷基,可以列举-CH2COOH、或者-CH2CH2COOH等。作为由氨基甲酰基取代的烷基,可以列举-CH2CONH2、或者-CH2CH2CONH2等。作为由氨基取代的烷基,可以列举-(CH2)4NH2等。作为由胍基取代的烷基,可以列举-(CH2)3NHC(=NH)NH2等。
作为由烷硫基、芳硫基取代的烷基,可以列举-CH2CH2SCH3、-CH2SH、-CH2S)2、或者-CH2SR12’等。作为由烷氧基取代的烷基,可以列举-CH2OR12’等。作为由酰胺基取代的烷基,可以列举-CH2NHCOR12’等。
R12’不包括氢原子,相当于各酶的底物结构。其中,可以列举可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的苄基、可以具有取代基的苯基、或者可以具有取代基的杂环残基等。另外,R12’为R12的下位概念,与R’不同。
作为R12’的可以具有取代基的烷基的取代基,可以列举酰基、烷氧羰基、或者酰胺基等。另外,作为R12’的烷基,优选碳原子数为1-6的烷基。
另外,作为R12的烷基,可以列举-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3、-CH(CH3)CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-C(CH3)3、或者-CH2CH2R12’等。R12’与上述相同。
另外,作为R12的芳基,可以列举苯基等。
作为R13,可以列举氢原子、或者
等。
n1为0-4的整数,n2为0或1,n3为0-4的整数。其中,n3优选为0或1。另外,优选:n2为0时,n1与n3之和为1-3,n2为1时,n1与n3之和为0或1。
作为X1可以列举酰胺基或烯基等,烯基优选-CH=CH-等。作为X2可以列举羧基、或者羧基的等价体等。
作为R14,可以列举氢原子或者低级烷基等。低级烷基可以列举与上述同样的基团,其中,优选甲基和乙基。
另外,在可以具有取代基的烷基中,作为上述所有的羧基和羧基的等价体,可以列举-COOR、-CONR2、-COR、-CN、-NO2、-NHCOR、-OR、-SR、-OCOR、-SO3R、或者-SO2NR2等。该R为氢原子或者烷基,烷基优选与上述同样的低级烷基,特别优选甲基。
以下,对于R10及R11中的可以具有取代基的芳基进行说明。
作为可以具有取代基的芳基的取代基,可以列举可以由羧基或者羧基的等价体取代的烷基、吸电子基团、羧基、或者羧基的等价体等。
作为可以具有取代基的芳基,优选芳基或在其上取代的取代基的碳原子上结合有羧基或其等价体、并且从膦酸二酯衍生物(21)中的磷原子上结合的氧原子到羧基或其等价体的末端的原子数即除氢原子以外的原子数为6-8的结构。
作为芳基,可以列举苯基等。
可以具有取代基的苯基,由
表不。
作为Y1,可以列举-R’、-OR’、或者吸电子基团等,其中优选吸电子基团。R’为氢原子或者可以具有双键的烷基,该烷基优选与上述同样的低级烷基,特别优选甲基或乙基。
作为Y2,可以列举可以由羧基及羧基的等价体的任意一个取代、并且可以具有双键的烷基、氢原子、羧基、或者羧基的等价体等。该烷基优选与上述同样的低级烷基,其中优选甲基或乙基。
另外,Y1和Y2可以是邻位、间位和对位的任意一种,其中优选间位和对位,特别优选对位。
另外,例如,如通式(14)至通式(16)所示,相邻的两个取代基Y1和Y2可以相互结合形成环。作为R16,可以列举氢原子或者与上述同样的低级烷基等,其中优选氢原子、甲基或乙基。
另外,在可以具有取代基的芳基中,作为上述所有的吸电子基团,可以列举卤素原子、-COOR’、-CONR’2、-COR’、-OCOR’、-CF3、-CN、-SR’、-S(O)R’、-SO2R’、-SO2NR’2、-PO(OR’)2、或者-NO2等。作为卤素原子,可以列举氟、氯、溴或碘。R’与前述含义相同。
另外,在可以具有取代基的芳基中,作为上述所有的羧基及羧基的等价体,可以列举-COOR”、-CONR”2、-COR”、-CN、-NO2、-NHCOR”、-OR”、-SR”、-OCOR”、-SO3R”、或者-SO2NR”2等。R”为氢原子或者可以具有双键的烷基,该烷基优选与上述同样的低级烷基。
R11为可以由Y1取代的苯基的情况下,膦酸二酯衍生物优选为:
其中,R12、R14、X2、Y1、n1和n3与前述含义相同。
另外,R11为可以由Y1和/或Y2取代的苯基的情况下,膦酸二酯衍生物优选为:
其中,R15为与上述同样的低级烷基,其中优选甲基或乙基。W为通式(13)至通式(16)等。R16、Y1和Y2与前述含义相同。该通式(13)中,Y2优选为由羧基或羧基的等价体取代的烷基、羧基、或者羧基的等价体。
另外,R10和R11为可以由Y1和/或Y2取代的苯基的情况下,膦酸二酯衍生物优选为:
其中,Y1和Y2与前述含义相同。
以下,对膦酸二酯衍生物的中间体2-取代氨基-4-膦酰丁酸的金属盐(19)进行说明。
M为碱金属。作为碱金属,可以列举锂、钠或钾等,其中优选钠。
R17为包含可以具有取代基的芳烃基的烷氧羰基等。作为包含可以具有取代基的芳烃基的烷氧羰基,可以列举苄氧羰基、4-硝基苄氧羰基、4-氯苄氧羰基、4-溴苄氧羰基、或者2,4-二氯苄氧羰基等,其中优选苄氧羰基、4-硝基苄氧羰基。
以下,对膦酸二酯衍生物的中间体2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)进行说明。
R18为可以具有取代基的芳烃基等,其中优选苄基、4-硝基苄基等。R17与前述含义相同。
以下,对膦酸二酯衍生物(1)的制造方法进行说明。膦酸二酯衍生物(1)可以通过包含以下全部反应式(1)-反应式(6)的一连串反应制造。
另外,其特征在于,在该制造过程中,通过反应式(1)得到碱金属盐(19)的结晶形式的2-取代氨基-4-膦酰丁酸。另外,其特征在于,通过反应式(2),在膦酸基的存在下仅将羧基选择性酯化,而且使用醚类溶剂,得到结晶形式的2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)。
首先,如反应式(1)所示,使2-氨基-4-膦酰丁酸(21)与化合物(22)反应,将得到的产物与碱金属氢氧化物(23)反应,由此得到2-取代氨基-4-膦酰丁酸的碱金属盐(19)。
反应式(1)
2-氨基-4-膦酰丁酸(21)可以根据非专利文献的方法(Kosolapoff,G.M.Isomerization of alkyl phosphites.VII.Some derivatives of2-bromoethanephosphonic acid.J.Am.Chem.Soc.1948,70,1971-1972;Chambers,J.R.,Isbell,A.F.A new synthesis of amino phosphonic acids.J.Org.Chem.1964,29,832-836)合成得到。
2-氨基-4-膦酰丁酸(21)与化合物(22)的反应中,将2-氨基-4-膦酰丁酸(21)溶解于溶剂中,在其中加入化合物(22)和碱后保温。
作为溶剂,可以使用水和不与水混溶的有机溶剂的两相溶剂。作为有机溶剂,可以使用二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、环戊烷、环己烷、醚类溶剂等,其中优选醚类溶剂。作为醚类溶剂,可以列举二乙醚、二异丙醚、叔丁甲醚、二丙醚、甲丙醚、异丙甲醚、丁甲醚、异丁甲醚、甲戊醚、异戊甲醚、环戊甲醚、环己甲醚、丁醚等。
添加化合物(22)的温度,为了抑制化合物(22)的分解,只要为室温附近的温度即可,其中优选0℃附近。在该温度条件下,使用约30分钟-约2小时添加化合物(22)后,在搅拌的同时保温直至通过薄层色谱法等方法可以确认反应结束。保温在室温附近的温度、例如25-30℃下进行约10小时-约24小时。
作为碱,可以使用碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐等无机碱等。无机碱可以列举氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾等。碱可以在使2-氨基-4-膦酰丁酸(21)溶解到溶剂中的阶段添加,也可以与化合物(22)同时添加,另外也可以在两个阶段添加。
后处理中,取反应结束后的水层,根据需要用不与水混溶的醚类溶剂洗涤水层后,加酸进行酸化。酸可以列举盐酸、氢溴酸、硫酸等。
然后,根据需要进行浓缩,并在残渣中添加丙酮等有机溶剂,过滤除去不溶于有机溶剂的氯化钠等无机盐后,进行浓缩,由此可以得到包含氨基部分由R17保护的游离膦酸形式的生成物的油状粗产物。
将得到的粗产物溶解于中和量的碱金属氢氧化物(23)的水溶液中。碱金属氢氧化物(23)可以列举氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等。而且,将溶解了粗产物的水溶液浓缩,在残渣中添加丙酮等有机溶剂并进行搅拌,由此可以分离出结晶形式的2-取代氨基-4-膦酰丁酸的碱金属盐(19)。
由此,可以用保护基R17保护化合物(21)的氨基。另外,通过以碱金属盐的形式将该保护的化合物结晶,可以以高收率分离2-取代氨基-4-膦酰丁酸的碱金属盐(19)。
然后,如反应式(2)所示,通过使由反应式(1)得到的2-取代氨基-4-膦酰丁酸的碱金属盐(19)与化合物(24)反应,得到2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)。
反应式(2)
2-取代氨基-4-膦酰丁酸的碱金属盐(19)与化合物(24)的反应在过量酸催化剂的存在下、在室温附近的温度下进行。酸催化剂可以使用氯化氢等。
然后,进行搅拌的同时保温直到通过薄层色谱法等方法可以确认反应结束。保温在室温附近的温度下进行约12小时-约24小时。
反应结束后,根据需要通过浓缩操作等除去过量的化合物(24)和氯化氢等,然后在残渣中添加有机溶剂,并通过过滤操作等除去不溶于有机溶剂的氯化钠等无机盐类。作为有机溶剂,可以使用乙酸乙酯、丙酮、甲乙酮、乙腈、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、或者1,1,1-三氯乙烷等。可以根据需要用水洗涤包含反应生成物的溶液后,使用无水硫酸钠等干燥剂进行干燥。
然后,向包含反应生成物的溶液中添加醚类溶剂,并添加晶种,进行搅拌、保温,由此可以得到结晶形式的2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)。另外,添加醚类溶剂之前,优选通过减压浓缩等除去溶剂。
作为醚类溶剂,可以列举二乙醚、二异丙醚、叔丁甲醚、二丙醚、1,2-二甲氧基乙烷、甲丙醚、异丙甲醚、丁甲醚、异丁甲醚、甲戊醚、异戊甲醚、环戊甲醚、环己甲醚、四氢呋喃、丁醚或者四氢吡喃等。
由此,在2-取代氨基-4-膦酰丁酸的碱金属盐(19)中,通过在膦酸基游离的状态下选择性地仅酯化羧基,可以用保护基R18进行保护。另外,通过用醚类溶剂使2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)结晶,可以以高收率分离2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)。
另外,2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)的晶种,可以通过在粗产物中添加适量与上述同样的醚类溶剂,并加热至其沸点附近,然后进行冷却而得到。
然后,如反应式(3)所示,通过将由反应式(2)得到的2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)卤化,得到化合物(25)。
反应式(3)
2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)的卤化,在催化剂的存在下,使2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯(20)与卤化剂在溶剂中反应来进行。
作为催化剂,可以使用N,N-二甲基甲酰胺等。作为溶剂,可以列举二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、四氯化碳、二乙醚、二异丙醚、叔丁甲醚、或者四氢呋喃等干燥溶剂。作为卤化剂,可以使用草酰氯、二氯亚砜、五氯化磷、或者三氯氧化磷等。反应在室温附近的温度下进行1小时左右。
然后,根据需要除去氯化氢等副产物、以及剩余的卤化剂,则可以得到黄色油状物形式的化合物(25)。另外,副产物等的除去方法可以使用通常使用的方法,但其中优选在室温左右的温度下喷吹氩等惰性气体而使副产物气化的方法。如果使用该除去方法完全除去溶剂和副产物,可以提高化合物(25)的收率。
X可以列举氟、氯、溴、碘等卤素原子,其中优选氯。
然后,如反应式(4)所示,通过使由反应式(3)得到的化合物(25)与化合物(26)反应,得到化合物(27)。
反应式(4)
化合物(25)与化合物(26)的反应中,使化合物(25)溶解于溶剂中,在其中添加化合物(26),并且根据需要在胺碱的存在下进行反应。
化合物(26)的R1-A中的A,可以使用氢原子或者碱金属等。该碱金属可以列举锂、钠、或者钾等,其中优选锂。胺碱可以使用三乙胺、三丁胺、二异丙乙胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二乙基异丙胺、N-甲基咪唑或者吡啶等,其中优选三乙胺。溶剂可以使用干燥二氯甲烷溶液等。在-65℃附近搅拌30分钟左右后,缓慢升温至室温附近的温度,在该温度下搅拌约1小时-约3小时,反应结束。由此,可以得到非对映异构体混合物形式的化合物(27)。
然后,如反应式(5)所示,通过使反应式(4)得到的化合物(27)与化合物(28)反应,得到化合物(29)。
反应式(5)
使化合物(27)溶解于溶剂中,向其中添加化合物(28)以及根据需要添加碱,进行反应。
化合物(28)的R2-B中的B,可以使用氢原子或碱金属等。该碱金属可以列举锂、钠、或者钾等,其中优选锂。作为溶剂,可以列举干燥二氯甲烷溶液等。作为碱,可以使用与反应式(4)中的胺碱同样的碱。
化合物(28)以及根据需要的碱在-65℃附近的温度添加。添加后搅拌30分钟左右,然后缓慢升温至室温,并反应1小时左右直至可以通过薄层色谱法等确认反应结束。
反应结束后,根据需要通过浓缩操作等除去有机溶剂后,向残渣中添加有机溶剂,并通过过滤操作等除去难溶于有机溶剂的盐类。作为有机溶剂,优选醋酸乙酯或丙酮等。然后,使用柱层析等纯化方法,得到无色油状物形式的非对映异构体混合物(29)。
最后,如反应式(6)所示,通过将由反应式(5)得到的化合物(29)去保护,得到膦酸二酯衍生物(1)。
反应式(6)
作为去保护方法,没有限制,可以使用接触氢还原法或者使用氯化铝的去保护法,其中优选使用氯化铝的去保护法。
在通过接触氢还原法的去保护中,在催化剂存在下,在化合物(29)与溶剂的混合溶液中通氢气2小时左右,由此将氨基和羧基去保护。
催化剂可以使用钯类催化剂或者铂类催化剂等,钯类催化剂可以使用钯-碳、或者钯-硫酸钡等。溶剂可以使用水与醋酸的混合溶液、或者醇与水的混合溶剂等,醇可以使用甲醇等。
然后,根据需要除去催化剂和溶剂后,通过柱层析等纯化残渣。然后,根据需要进行浓缩操作,并且进行冷冻干燥,由此可以得到膦酸二酯衍生物(1)。
另外,使用氯化铝的去保护法中,在添加有三氯化铝的溶剂中,使化合物(29)与茴香醚反应,由此将氨基和羧基去保护。
溶剂可以使用干燥硝基甲烷等高极性溶剂。在室温附近的温度下搅拌1小时左右,然后加水,并搅拌10分钟左右,反应结束。
后处理中,通过分液操作从反应结束后的反应液中分离水层,根据需要用容易与水分液的醚类溶剂洗涤水层后,添加甲醇。然后,除去氢氧化铝后,根据需要通过柱层析法等进行纯化,由此可以得到膦酸二酯衍生物(1)。
另外,上述反应式(1)和反应式(2)中反应生成物的纯化方法使用结晶,但是也可以使用萃取、色谱法或者沉淀等代替结晶。
另外,上述反应式(5)和反应式(6)中反应生成物的纯化方法使用柱层析法,但是也可以使用萃取、结晶或者沉淀等代替柱层析法。
实施例
实施例1:2-氨基-4-[甲基(4-甲基苯基)膦酰]丁酸的合成
在200mL水和150mL乙醚的2相混合溶剂中溶解24.0g、600mmol氢氧化钠、和36.6g、200mmol 2-氨基-4-膦酰丁酸,并在0℃剧烈搅拌,同时每次少量地用1小时加入51.2g、300mmol氯甲酸苄酯和25.2g、300mmol碳酸氢钠。将混合物在室温下剧烈搅拌14小时后,利用薄层色谱法(TLC)(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2)的水合茚三酮显色,由2-氨基-4-膦酰丁酸的消失确认反应结束。然后,取水层,并以200mL乙醚洗涤水层三次后,加入计算量的140mL、840mmol 6N盐酸将溶液酸化。将水溶液减压浓缩,向残渣中加入500mL丙酮,过滤除去不溶性的氯化钠。浓缩滤液,得到作为粗产物的油状的2-(N-苄氧羰氨基)-4-膦酰丁酸。将该粗产物添加到中和量的7.2g、180mmol氢氧化钠的水溶液250mL中,达到pH3左右,并将水溶液减压干燥。得到的油状物中添加丙酮并静置,得到2-(N-苄氧羰氨基)-4-膦酰丁酸的单钠盐(51.8g,收率76%),为白色粉末状结晶。
1H-NMR(300MHz,D2O)δH 1.6-1.8(m,2H,PCH2CH2),1.8-2.3(m,2H,PCH2CH2),4.21(m,1H,α-CH),5.13(s,2H,OCH2Ph),7.43(m,5H,Ph);31P NMR(121MHz,D2O)δp 25.10.
然后,将苄醇226mL冷却至0℃,在其中滴加19.5g、164mmol二氯亚砜。搅拌15分钟后,加入21.2g、62.4mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-膦酰丁酸的单钠盐,撤掉冰浴后,在室温搅拌20小时。通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,254nm)确认反应结束。使用真空泵,在70℃减压蒸馏除去苄醇。将得到的油状残渣用醋酸乙酯300mL进行萃取,并过滤除去不溶性的氯化钠。滤液用水50mL洗涤三次后,用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂后,加入乙醚300mL,并加入晶种,进行剧烈搅拌,由生成物部分溶于乙醚的状态进行结晶,得到2-(N-苄氧羰氨基)-4-膦酰丁酸苄酯(21.2g,收率84%),为白色粉末状结晶。
1H NMR(300MHz,丙酮-d6)δH1.7-1.9(m,2H,PCH2CH2),1.9-2.3(m,2H,PCH2CH2),4.38(m,1H,α-CH),5.08(s,2H,OCH2Ph),5.18(s,2H,OCH2Ph),6.9(d,J=7.8Hz,1H,NH),6.7-7.3[br s,2H,P(OH)2],7.2-7.5(m,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,丙酮-d6)δp29.09.C19H22NO7P计算值:C56.02,H5.44,N3.44;测量值:C56.08,H5.38,N3.35.HRMS(FAB,甘油)C19H23NO7P(MH+)计算值408.1212,测量值408.1192。
另外,2-(N-苄氧羰氨基)-4-膦酰丁酸苄酯的晶种,通过在粗产物中添加适量的二异丙醚,并加热至沸点附近,然后热过滤上清液,并将滤液缓慢冷却至室温而得到。
然后,将2.01g、4.93mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-膦酰丁酸苄酯溶解于10mL干燥的二氯甲烷中,并加入1滴作为催化剂的N,N-二甲基甲酰胺,然后在室温下添加1.41g、11.1mmol的草酰氯,直接在室温下反应1小时。反应后,送入氩气流,使副产物氯化氢与溶剂一起气化而完全除去,由此得到黄色油状物膦酰二氯。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δH 2.1-2.7(m,4H,PCH2CH2),4.53(m,1H,α-CH),5.12(s,2H,PhCH2OCON),5.18(d,J=12Hz)和5.24(d,J=12Hz)[2H,PhCH2O],5.46(br d,1H,J=8.1Hz),7.3-7.4(m,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp49.0.
在膦酰二氯的干燥二氯甲烷溶液20mL中添加0.158g、4.94mmol甲醇,将溶液冷却至-65℃后,加入0.5g、4.94mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,将冷却槽撤掉并缓慢升温至室温,在该状态下搅拌1小时,由此得到2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯,为非对映异构体混合物。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δH1.7-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.84(d,3H,3JHP=13.2Hz,CH3OP),4.52(m,1H,α-CH),5.11(s,2H,PhCH2OCON),5.15-5.2(m,2H,PhCH2O),5.5(br m,1H,J=8.1Hz),7.3-7.4(m,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp44.8.
然后,在4.93mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.53g、4.93mmol的4-甲基苯酚。将溶液冷却至-65℃后,加入0.50g、4.93mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时。通过TLC(丙酮/己烷=1∶1)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于50mL醋酸乙酯中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,并利用中性硅胶60N(关东化学,No.37563-79)由丙酮与己烷以1∶1的比例混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-甲基苯基)膦酰]丁酸苄酯(1.01g,收率40%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.3(m,4H,PCH2CH2),2.3(s,3H,CH3),3.72(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3,),4.46(m,1H,α-CH),5.10(s,2H,OCH2Ph),5.16(s,2H,OCH2Ph),5.6(br d,J=6.9Hz,1H,NH),7.0(d,J=8.4Hz,2H)和7.1(d,J=8.4Hz,2H)(4-甲基苯基),7.3(s,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp 29.34.C27H30NO7P计算值:C63.40,H5.91,N2.74;测量值:C63.15,H5.91,N2.81.HRMS(FAB,甘油)C27H31NO7P(MH+)计算值512.1838,测量值512.1837.
然后,将0.70g、1.37mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-甲基苯基)膦酰]丁酸苄酯溶解于甲醇与水以2∶1的比例混合的溶剂30mL中,并加入5%的钯-碳270mg后通2小时氢气。用硅藻土过滤除去钯-碳,并将滤液减压浓缩。残渣用反相中压柱色谱ODS-S-50B(山善株式会社,大阪)纯化。柱用甲醇30-60%的线性梯度洗脱(流速6mL/分钟),收集以60%甲醇洗脱的化合物级分。通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度后,进行减压浓缩,并进行冷冻干燥,由此得到2-氨基-4-[甲基(4-甲基苯基)膦酰]丁酸(0.20g,收率51%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),1623,1540,1508,1448,1409,1365,1205,1047,941,和833cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH 2.1-2.3(m,4H,PCH2CH2),2.31(s,3H,CH3),3.81(m,1H,α-CH),3.85(d,3JHP=12.3Hz,3H,POCH3),7.11(d,J=8.1Hz,2H)和7.27(d,J=7.8Hz,2H)(4-甲基苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.53.C12H18NO5P·0.3H2O计算值:C49.25,H6.41,N4.79;测量值:C49.28,H6.32,N4.77.HRMS(FAB,甘油)C12H19NO5P(MH+)计算值288.2567,测量值288.1009.
实施例2:2-氨基-4-[(4-甲氧基苯基)(甲基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯5.35mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.66g、5.32mmol的4-甲氧基苯酚。将溶液冷却至-65℃后,添加0.55g、5.39mmol三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在室温反应1小时。通过TLC(丙酮/己烷=1∶1)确认反应结束后,进行减压浓缩,将残渣溶于50mL醋酸乙酯,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由丙酮与己烷1∶1混合的溶剂将粗产物纯化,得到非对映异构体混合物形式的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[(4-甲氧基苯基)(甲基)膦酰]丁酸苄酯(0.90g,收率32%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.72(d,3JHP=10.8Hz,3H,POCH3),3.77(s,3H,OCH3),4.47(m,1H,α-CH),5.10(s,2H,OCH2Ph),5.17(s,2H,OCH2Ph),5.5(br d,J=6.9Hz,1H,NH),6.81(d,J=9.0Hz,2H)和7.1(d,J=7.8Hz,2H)(4-甲氧基苯基),7.3(s,10H,2×Ph),31P NMR(121MHz,CDCl3)δp29.56.C27H30NO8P计算值:C61.48,H5.73,N2.66;测量值:C61.47,H5.82,N2.72.HRMS(FAB,甘油)C27H31NO8P(MH+)计算值528.1787,测量值528.1777.
然后,将0.60g、1.14mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[(4-甲氧基苯基)(甲基)膦酰]丁酸苄酯溶于甲醇与水以2∶1的比例混合的溶剂30mL中,加入5%的钯-碳270mg,并通氢气1小时。然后,硅藻土过滤除去钯-碳,并减压浓缩滤液。将残渣冷冻干燥,得到2-氨基-4-[(4-甲氧基苯基)(甲基)膦酰]丁酸(0.20g,收率58%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),1635,1597,1508,1456,1409,1363,1252,1207,1029,953,和840cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH2.1-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.8-3.9(m,7H,α-CH,POCH3和PhOCH3),7.03(d,J=9.3Hz,2H)和7.20(d,J=8.4Hz,2H)(4-甲氧基苯基);31PNMR(121MHz,D2O)δp 32.88;C12H18NO6P·0.5H2O计算值:C46.16,H6.13,N4.49;测量值:C46.15,H6.20,N4.45;HRMS(FAB,甘油)C12H19NO6P(MH+)计算值304.0950,测量值304.0945.
实施例3:2-氨基-4-[甲基(苯基)膦酰]丁酸的合成
通过与上述实施例1得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯同样的方法,得到2-(N-4-硝基苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯。
在1.86mmol的2-(N-4-硝基苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.175g、1.86mmol的苯酚。将溶液冷却至0℃后,添加0.26g、2.6mmol三乙胺。在0℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时。通过TLC(丙酮/己烷=1∶1)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于50mL醋酸乙酯,并依次用1N盐酸和饱和氯化钠水溶液洗涤后,用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂,并通过中性硅胶60N由丙酮与己烷1∶1混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-4-硝基苄氧羰氨基)-4-[甲基(苯基)膦酰]丁酸苄酯(0.48g,收率48%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH 1.8-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.75和3.76(2×d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.47(m,1H,α-CH),5.20(m,4H,2×OCH2Ph),5.7(2×br d,J=7.8Hz,1H,NH),7.1-7.4(m,10H,2×Ph),7.5(d,J=7.2Hz,2H)和8.2(d,J=7.5Hz,2H)(4-硝基苯基);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp 29.25和29.28.C26H27N2O9P计算值:C57.57,H5.02,N5.16;测量值:C57.50,H4.96,N5.13.
然后,将0.57g、1.05mmol的2-(N-4-硝基苄氧羰氨基)-4-[甲基(苯基)膦酰]丁酸苄酯溶于20mL醋酸,加入10%钯-碳210mg并通氢气1小时。硅藻土过滤除去钯-碳,并将滤液减压浓缩。残渣通过反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱以乙腈4-50%的线性梯度洗脱(流速12mL/分钟),收集以5%乙腈洗脱的化合物级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[甲基(苯基)膦酰]丁酸(0.14g,收率48%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),1634,1593,1491,1455,1403,1345,1208,1045,936,和832cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH 2.1-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.88(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),3.85(m,1H,α-CH)),7.25(d,J=7.8Hz,2H),7.33(t,J=7.2Hz,1H)和7.48(t,J=7.8Hz,2H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.55.C11H16NO5P·0.6H2O计算值:C46.32,H6.10,N4.93;测量值:C46.36,H5.97,N5.06.HRMS(FAB,甘油)C11H17NO5P(MH+)计算值274.0844,测量值274.0840.
实施例4:2-氨基-4-[(4-氯苯基)(甲基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.59mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.59g、4.59mmol的4-氯苯酚。将溶液冷却至-65℃后,添加0.46g、4.59mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时。通过TLC(丙酮/己烷=1∶2)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于丙酮20mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由丙酮与己烷1∶2混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[(4-氯苯基)(甲基)膦酰]丁酸苄酯(1.45g,收率59%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.7-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.73(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.47(m,1H,α-CH,),5.10(2×s,2H,OCH2Ph),5.17(s,2H,OCH2Ph),5.5(br d,J=8.4Hz,1H,NH),7.09(d,J=8.1Hz,2H)和7.26(d,J=8.1Hz,2H)(4-氯苯基),7.28-7.40(m,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp29.69.C26H27ClNO7P计算值:C58.71,H5.12,N2.63;测量值:C58.68,H5.10,N2.61.HRMS(FAB,甘油)C26H28NO7ClP(MH+)计算值532.1292,测量值532.1300.
然后,将0.73g、1.37mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[(4-氯苯基)(甲基)膦酰]丁酸苄酯和0.89g、8.22mmol的茴香醚溶于干燥的硝基甲烷10mL中,在室温下添加0.55g、4.11mmol的三氯化铝。在室温下搅拌1小时后,加水20mL,并搅拌10分钟。将混合物用50mL的乙醚洗涤三次,取水层,向水层中加入甲醇使得终浓度为30%。使溶液通过中性硅胶60N,除去氢氧化铝。洗脱液不浓缩,直接通过反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱用40%甲醇以6ml/分钟的流速洗脱,收集化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[(4-氯苯基)(甲基)膦酰]丁酸(0.24g,收率57%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),1623,1595,1488,1405,1358,1213,1093,1045,928,和835cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH 2.1-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.83(m,1H,α-CH),3.86(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),7.21(d,J=7.8Hz,2H)和7.46(d,J=8.7Hz,2H)(4-氯苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp 32.69.C11H15ClNO5P·0.4H2O计算值:C41.96,H5.06,N4.45;测量值:C42.17,H5.03,N4.53.HRMS(FAB,甘油)C11H16ClNO5P(MH+)计算值308.0455,测量值308.0466.
实施例5:2-氨基-4-[甲基(4-三氟甲基苯基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.93mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.80g、4.93mmol的4-三氟甲基苯酚。将溶液冷却至-65℃后,添加0.50g、4.93mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时。通过TLC(丙酮/己烷=1∶2)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于醋酸乙酯50mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由丙酮与己烷1∶2混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-三氟甲基苯基)膦酰]丁酸苄酯(1.50g,收率54%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.75(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.49(m,1H,α-CH),5.10(2×s,2H,OCH2Ph),5.18(s,2H,OCH2Ph),5.5(br d,J=6.9Hz,1H,NH),7.26(d,J=8.4Hz,2H)和7.58(d,J=8.4Hz,2H)(4-三氟甲基苯基),7.3(s,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp29.83.C27H27F3NO7P计算值:C57.35,H4.81,N2.48;测量值:C57.25,H4.77,N2.50.HRMS(FAB,甘油)C27H28F3NO7P(MH+)计算值566.1556,测量值566.1546.
然后,将1.40g、2.48mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-三氟甲基苯基)膦酰]丁酸苄酯和1.61g、14.9mmol的茴香醚溶于干燥的硝基甲烷10mL中,在室温下添加0.99g、7.44mmol的三氯化铝。在室温下搅拌1小时后,加水20mL,并搅拌10分钟。将混合物用50mL的乙醚洗涤三次,取水层,向水层中加入甲醇使得终浓度为30%。使溶液通过中性硅胶60N,除去氢氧化铝。洗脱液不浓缩,直接通过反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱用甲醇30%-60%的线性梯度洗脱(流速6ml/分钟),收集60%甲醇洗脱的化合物的级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[甲基(4-三氟甲基苯基)膦酰]丁酸(0.53g,收率63%),为无色固体。
IR(KBr)vmax 3600-2300(br),1646,1616,1516,1403,1338,1225,1174,1121,1070,1047,933,和850cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH2.1-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.85(m,1H,α-CH),3.89(2×d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),7.41(d,J=8.4Hz,2H)和7.80(d,J=8.7Hz,2H)(4-三氟甲基苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.58.C12H15F3NO5P·0.8H2O计算值:C40.53,H4.70,N3.94;测量值:C40.63,H4.41,N4.20.HRMS(FAB,甘油)C12H16F3NO5P(MH+)计算值342.0178,测量值342.0709.
实施例6:2-氨基-4-[(4-氰基苯基)(甲基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯5.01mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.60g、5.01mmol的4-氰基苯酚。将溶液冷却至-20℃后,添加0.51g、5.01mmol的三乙胺。在-20℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应过夜。通过TLC(丙酮/己烷=2∶3)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于丙酮20mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由丙酮与己烷2∶3混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[(4-氰基苯基)(甲基)膦酰]丁酸苄酯(1.0g,收率38%),为淡黄色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.76(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),4.49(m,1H,α-CH),5.10(2×s,2H,OCH2Ph),5.18(s,2H,OCH2Ph),5.46(br d,J=6.6Hz,1H,NH),7.3(d,J=7.5Hz,2H)和7.60(2×d,J=8.4Hz)(4-氰基苯基),7.4(s,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp 30.05.C27H27N2O7P计算值:C62.07,H5.21,N5.36;测量值:C 61.93,H 5.15,N 5.47.
然后,将0.95g、1.82mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[(4-氰基苯基)(甲基)膦酰]丁酸苄酯和1.18g、10.9mmol的茴香醚溶于干燥的硝基甲烷10mL中,在室温下添加0.73g、5.46mmol的三氯化铝。在室温下搅拌1小时后,加水20mL,并搅拌10分钟。将混合物用50mL的乙醚洗涤三次,取水层,向水层中加入甲醇使得终浓度为30%。使溶液通过中性硅胶60N,除去氢氧化铝。洗脱液不浓缩,直接通过反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱用甲醇30%-60%的线性梯度以流速6ml/分钟洗脱,收集45%甲醇洗脱的化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[(4-氰基苯基)(甲基)膦酰]丁酸(0.38g,收率70%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),2231,1647,1604,1500,1412,1360,1225,1176,1105,1045,926,和837cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH2.1-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.82(m,1H,α-CH),3.88(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),7.39(d,J=8.7Hz,2H)和7.83(d,J=8.1Hz,2H)(4-氰基苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp 32.61.C12H15N2O5P·0.3H2O计算值:C47.47,H5.18,N9.23;测量值:C47.56,H5.09,N9.24.HRMS(FAB,甘油)C12H16N2O5P(MH+)计算值299.0797,测量值299.0789.
实施例7:2-氨基-4-[甲基(4-硝基苯基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.91mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.68g、4.91mmol的4-硝基苯酚。将溶液冷却至-20℃后,添加0.50g、4.91mmol的三乙胺。在-20℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应过夜。通过TLC(丙酮/己烷=1∶2)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于丙酮20mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由丙酮与己烷1∶2混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-硝基苯基)膦酰]丁酸苄酯(1.2g,收率45%),为淡黄色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.77(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.5(m,1H,α-CH),5.10(m,2H)和5.18(m,2H)(2×OCH2Ph),5.5(d,J=6.9Hz,1H,NH),7.31(d,J=9.3Hz,2H)和8.20(d,J=9.0Hz,2H)(4-硝基苯基),7.3(s,10H,2×Ph);31PNMR(121MHz,CDCl3)δp30.20.C26H27N2O9P计算值:C57.57,H5.02,N5.16;测量值:C57.35,H5.11,N5.17;HRMS(FAB,甘油)C26H28N2O9P(MH+)计算值543.1532,测量值543.1537.
然后,将0.85g、1.57mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-硝基苯基)膦酰]丁酸苄酯和1.02g、9.42mmol的茴香醚溶于干燥的硝基甲烷10mL中,在室温下添加0.63g、4.71mmol的三氯化铝。在室温下搅拌1小时后,加水20mL,并搅拌10分钟。将混合物用50mL的乙醚洗涤三次,取水层,向水层中加入甲醇使得终浓度为30%。使溶液通过中性硅胶60N,除去氢氧化铝。将约30mL洗脱液不浓缩,直接通过反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱用甲醇30%-60%的线性梯度以流速6ml/分钟洗脱,收集48%甲醇洗脱的化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[甲基(4-硝基苯基)膦酰]丁酸(0.35g,收率70%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),2231,1629,1590,1490,1411,1342,1292,1223,1164,1108,1045,931,和860cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH2.1-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.88(m,1H,α-CH),3.91(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),7.44(d,J=8.7Hz,2H)和8.33(d,J=9.0Hz,2H)(4-硝基苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.63.C11H15N2O7P·1.5H2O计算值:C38.27,H5.26,N8.11;测量值:C38.25,H5.05,N8.20.HRMS(FAB,甘油)C11H16N2O7P(MH+)计算值319.0695,测量值319.0703.
实施例1-7的化合物的结构如表1所示。
[表1]
实施例 |
取代基:X |
1 |
CH3 |
2 |
OCH3 |
3 |
H |
4 |
Cl |
5 |
CF3 |
6 |
CN |
7 |
NO2 |
实施例8:2-氨基-4-[甲基(4-甲基伞形酮基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.93mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.87g、4.93mmol的4-甲基伞形酮。将溶液冷却至-65℃后,添加0.49g、4.83mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时。通过TLC(EtOAc/己烷=3∶1)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于醋酸乙酯50mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由醋酸乙酯与己烷3∶1混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-甲基伞形基)膦酰]丁酸苄酯(1.30g,收率46%),为淡黄色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.3(m,4H,PCH2CH2),2.42(s,3H,CH3),3.77(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.49(m,1H,α-CH),5.11(s,2H,OCH2Ph),5.19(s,2H,OCH2Ph),5.5(br d,J=6.9Hz,1H,NH),6.25(s,1H,3’-H),7.14(s,1H,8’-H),7.16(d,1H,J=9Hz,5’-H),7.3-7.4(s,10H,2×Ph),7.53(d,1H,J=8.4Hz);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp30.07.C30H30NO9P计算值:C62.18,H5.22,N2.42;测量值C62.09,H5.25,N2.54.HRMS(FAB,甘油)C30H31NO9P(MH+)计算值580.1737,测量值580.1727.
然后,将0.70g、1.21mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(4-甲基伞形基)膦酰]丁酸苄酯和0.79g、7.26mmol的茴香醚溶于干燥的硝基甲烷10mL中,在室温下添加0.48g、3.63mmol的三氯化铝。在室温下搅拌1小时后,加水20mL,并搅拌10分钟。将混合物用50mL的乙醚洗涤三次,取水层,向水层中加入甲醇使得终浓度为30%。使溶液通过中性硅胶60N,除去氢氧化铝。将约30mL洗脱液通过反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱用甲醇30%-60%的线性梯度以流速6ml/分钟洗脱,收集60%甲醇洗脱的化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[甲基(4-甲基伞形酮基)膦酰]丁酸(0.21g,收率49%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),1733,1716,1612,1506,1446,1390,1270,1230,1137,1070,1043,989,920,和833cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH 2.1-2.4(m,4H,PCH2CH2),2.49(s,3H,CH3),3.86(m,1H,α-CH),3.91(2×d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),6.4(s,1H,3’-H),7.27(d,J=8.1Hz,1H,5’-H),7.28(s,1H,8’-H),7.84(d,J=8.1Hz,1H,6’-H);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.69.C15H18NO7P·0.3H2O计算值:C49.95,H5.20,N3.88;测量值:C49.86,H5.14,N3.84.HRMS(FAB,甘油)C15H19NO7P(MH+)计算值356.0899,测量值356.0904.
实施例9:2-氨基-4-[丁基(苯基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的膦酰二氯4.91mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.35g、4.72mmol的1-丁醇。将溶液冷却至-65℃后,添加0.47g、4.66mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时,得到单氯膦酸单丁酯的粗产物,为非对映异构体的混合物。
1HNMR(300MHz,CDCl3)δH0.86-0.96(m,3H,OCH2CH2CH2CH3)δH1.3-2.6(m,8H,PCH2CH2和OCH2CH2CH2CH3),3.9-4.3(m,2H,OCH2CH2CH2CH3),4.5(m,1H,α-CH),5.0-5.2(m,4H,2×PhCH2O),5.4(br m,1H,NH),7.2-7.4(m,10H,2×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp43.1.
然后,在4.91mmol单氯膦酸单丁酯的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.46g、4.91mmol的苯酚,将溶液冷却至-65℃后,添加0.50g、4.91mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时。通过TLC(EtOAc/己烷=2∶3)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于丙酮30mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由醋酸乙酯与己烷2∶3混合的溶剂纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[丁基(苯基)膦酰]丁酸苄酯(0.76g,收率29%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH0.88(t,J=7.2Hz,3H,OCH2CH2CH2CH3),1.2-1.4(m,2H,OCH2CH2CH2CH3),1.5-1.6(m,2H,OCH2CH2CH2CH3),1.8-2.3(m,4H,PCH2CH2),4.1(m,2H,OCH2CH2CH2CH3),4.5(m,1H,α-CH),5.1(m,2H,PhCH2OCON),5.2(m,2H,PhCH2O),5.5(br d,J=7.8Hz,1H),7.1-7.3(m,15H,3×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp28.0.C29H34NO7P计算值:C64.55,H6.35,N2.60;测量值:C64.55,H6.36,N 2.64.
然后,将0.64g、1.19mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[丁基(苯基)膦酰]丁酸苄酯溶于甲醇与水以3∶1的比例混合的溶剂20mL中,添加5%的钯-碳200mg并通氢气75分钟。用硅藻土过滤除去钯-碳,并将滤液减压浓缩。残渣用反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱用甲醇30%-60%的线性梯度以流速6ml/分钟洗脱,收集60%甲醇洗脱的化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[丁基(苯基)膦酰]丁酸(0.28g,收率75%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),1623,1597,1541,1491,1408,1363,1290,1207,1059,1024,939,和765cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH 0.87(t,3H,OCH2CH2CH2CH3),1.3-1.4(m,2H,OCH2CH2CH2CH3),1.6-1.7(m,2H,OCH2CH2CH2CH3),2.1-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.8(m,1H,α-CH),4.2(m,2H,OCH2CH2CH2CH3),7.23(d,J=8.1Hz,2H),7.31(t,J=7.2Hz,1H)和7.46(t,J=7.8Hz,2H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp31.1.C14H22NO5P·0.4H2O计算值:C52.14,H7.13,N4.34;测量值:C52.25,H7.15,N4.60.
实施例10:2-氨基-4-[1-[N-(羧甲基)氨基甲酰基]丙基(苯基)膦酰]丁酸的合成
将1.50g、13.6mmol的2-羟基丁酸锂、4.60g、13.6mmol的甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐、1.84g、13.6mmol的1-羟基苯并三唑一水合物(HOBt)加到80mL乙腈中,在室温下搅拌20分钟。在该混合物中添加2.61g、13.6mmol的1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC),在室温下搅拌过夜。过滤反应混合物后,将滤液减压浓缩,将残渣溶解于200mL醋酸乙酯中。依次用1N的盐酸和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,然后用无水硫酸钠干燥。蒸馏除去溶剂后,利用硅胶快速柱层析(Merck,No.9385)由己烷与醋酸乙酯以1∶2的比例混合的溶剂纯化残渣,得到N-(2-羟基丁酰)甘氨酸苄酯(1.67g,收率49%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH0.99(t,J=7.5Hz,3H,CH3CH2),1.70(ddq,J=7.2,7.2和15Hz,1H)和1.89(ddt,J=4.2,7.2和15Hz,1H)(CH3CH2),4.08(dd,J=5.6和18Hz,1H,NHCH2CO),4.14(dd,J=3.9和7.5Hz,1H,CH),4.16(dd,J=5.7和18Hz,1H,NHCH2CO),7.10(brt,1H,NH),7.3-7.4(s,5H,Ph).HRMS(FAB,甘油)C13H18NO4(MH+)计算值252.1236,测量值:252.1232.
然后,在通过与实施例1同样的方法得到的4.82mmol膦酰二氯的干燥二氯甲烷溶液20mL中,在室温下添加0.44g、4.72mmol的苯酚。将溶液冷却至-65℃后,添加0.49g、4.82mmol的三乙胺。在-65℃搅拌30分钟后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在该状态下反应1小时,得到单氯膦酸单苯酯(非对映异构体混合物,δp=39.37)的溶液。在该溶液中添加1.21g、4.82mmol的N-(2-羟基丁酰)甘氨酸苄酯,并冷却至-65℃。添加0.49g、4.82mmol的三乙胺,在-65℃反应30分钟,并且进一步在室温下反应1小时。通过TLC(丙酮/己烷=1∶2)确认反应结束后,减压浓缩,将残渣溶于醋酸乙酯40mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由丙酮与己烷1∶3混合的溶剂纯化粗产物,得到包括4种非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[1-[N-(苄氧羰甲基)氨基甲酰基]丙基(苯基)膦酰]丁酸苄酯(0.52g,收率15%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH0.81和0.92(2×t,J=7.5Hz,3H,CH2CH3),1.7-2.4(m,6H,PCH2CH2和CH2CH3),3.7-4.1(m,2H,NHCH2CO),4.5(m,1H,α-CH),4.9(m,H,POCHCO),5.1-5.2(m,6H,3×PhCH2O),5.5(br m,1H,NH),5.6和5.8(2×br m,1H,NH),7.1-7.4(m,20H,4×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp 28.05(24%),28.31(17%),28.47(25%),28.66(34%).C38H41N2O10P计算值:C 63.68,H 5.77,N3.91;测量值C63.66,H 5.85,N 3.86.HRMS(FAB,甘油)C38H42N2O10P(MH+)计算值717.2577,测量值717.2578.
然后,将0.25g、0.35mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[1-[N-(苄氧羰甲基)氨基甲酰基]丙基(苯基)膦酰]丁酸苄酯溶于甲醇与水以20∶1的比例混合的溶剂30mL中,添加5%的钯-碳200mg并通氢气45分钟。用硅藻土过滤除去钯-碳,并将滤液减压浓缩。残渣用反相中压柱色谱ODS-S-50B纯化。柱用甲醇30%-60%的线性梯度以流速6ml/分钟洗脱,收集60%甲醇洗脱的化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[1-[N-(羧甲基)氨基甲酰基]丙基(苯基)膦酰]丁酸(250mg,收率18%),为无色固体。
IR(KBr)vmax3600-2300(br),1668,1652,1593,1541,1489,1455,1398,1348,1205,1051,1007,941,和769cm-1;1H NMR(300MHz,D2O)δH 0.84(t,3H,J=7.5Hz,CH2CH3),1.6-1.9(m,3H)和2.2-2.4(m,3H)(PCH2CH2和CH2CH3),3.8-4.0(m,3H,α-CH和NHCH2COOH),4.9(m,H,POCHCO),7.26(d,J=8.1Hz,2H),7.33(t,J=7.3Hz,1H)和7.46(t,J=7.8Hz,2H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp30.91.HRMS(FAB,甘油)C16H24N2O8P(MH+)计算值403.1270,测量值403.1275.
实施例11:2-氨基-4-{[3-(羧甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯3.60mmol的干燥二氯甲烷溶液30mL中,添加0.88g、3.60mmol的3-羟苯基醋酸苄酯。将溶液冷却至0℃后,添加0.51mL、3.60mmol的三乙胺,并在0℃搅拌15分钟。然后,升温并在34℃反应45分钟,通过TLC(EtOAc/己烷=1∶1)确认反应结束后,减压浓缩反应溶液,将残渣溶于醋酸乙酯30mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,由醋酸乙酯与己烷4∶3混合的溶剂通过中性硅胶60N纯化粗产物,得到2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[3-(苄氧羰甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯(0.72g,收率31%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.64(s,2H,CH2COOBn),3.71(d,3JHP=10.8Hz,3H,POCH3),4.5(m,1H,α-CH),5.10和5.12(2×s,4H,2×OCH2Ph),5.17(s,2H,CHCOOCH2Ph),5.6(br m,1H,NH),7.06-7.11(m)和7.22(m)(4H,POC6H4),7.3-7.5(m,15H,3×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp 29.31.C35H36NO9P计算值:C65.11,H5.62,N2.17;测量值:C65.36,H5.38,N2.11.HRMS(FAB,甘油)C35H37NO9P(MH+)计算值646.2206,测量值646.2233.
然后,将0.72g、1.12mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[3-(苄氧羰甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯溶于甲醇与水以5∶1混合的溶剂24mL中,在其中添加5%的钯-碳200mg,并在室温下通氢气2.5小时。而且,从溶液中利用硅藻土过滤除去钯-碳,将滤液减压浓缩,并用水将该残渣冷冻干燥,得到2-氨基-4-{[3-(羧甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸(0.19g,收率51%),为无色固体。
1H NMR(300MHz,D2O)δH 2.2-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.68(s,2H,PhCH2COOH),3.8-3.9(m,1H,α-CH),3.86(d,3JHP=11.1Hz)和3.87(d,3JHP=11.1Hz)(3H,POCH3),7.15(s,2H),7.20(d,J=7.8Hz,1H)和7.41(m,1H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp 32.52.C13H18NO7P·0.6H2O计算值:C45.65,H5.66,N4.09;测量值:C45.56,H5.43,N4.04.HRMS(FAB,甘油)C13H19NO7P(MH+)计算值332.0899,测量值332.0894.
实施例12:2-氨基-4-{[4-(羧甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.82mmol的干燥二氯甲烷溶液30mL中,添加1.28g、5.28mmol的4-羟苯基醋酸苄酯。将该溶液冷却至0℃后,添加1.34mL、9.45mmol的三乙胺,并在0℃搅拌15分钟。然后,升温并在30℃反应50分钟,通过TLC(EtOAc/己烷=8∶5)确认反应结束后,减压浓缩反应溶液,将残渣溶于醋酸乙酯20mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,由醋酸乙酯与己烷8∶5混合的溶剂通过中性硅胶60N纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[4-(苄氧羰甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯(1.25g,收率40%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.62(s,2H,CH2COOBn),3.73(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.5(m,1H,α-CH),5.10和5.12(2×s,4H,2×OCH2Ph),5.17(s,2H,CHCOOCH2Ph),5.5(br m,1H,NH),7.10(d,J=7.8Hz)和7.22(d,J=8.4Hz)(4H,POC6H4),7.3-7.4(m,15H,3×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp29.36.C35H36NO9P计算值:C65.11,H5.62,N2.17;测量值:C65.01,H5.71,N 2.25.HRMS(FAB,甘油)C35H37NO9P(MH+)计算值646.2206,测量值646.2605.
然后,将1.25g、1.94mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[4-(苄氧羰甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯溶于醋酸20mL中,在其中添加5%的钯-碳200mg,并在室温下通氢气3.5小时。而且,利用硅藻土过滤除去钯-碳,将滤液减压浓缩,并将残渣用反相中压柱色谱法(ODS-S-50B)纯化。该柱用甲醇30%-60%的线性梯度以流速6ml/分钟洗脱,收集60%甲醇洗脱的化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,利用水进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-{[4-(羧甲基)苯基](甲基)膦酰}丁酸(0.41g,收率64%),为无色固体。
1H NMR(300MHz,D2O)δH2.2-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.67(s,2H,PhCH2COOH),3.8-4.0(m,1H,α-CH),3.88(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),7.21(d,J=8.1Hz,2H)和7.35(d,J=8.4Hz,2H)(苯基);31PNMR(121MHz,D2O)δp32.56.C13H18NO7P·1.0H2O计算值:C44.70,H5.77,N4.01;测量值:C44.42,H5.43,N3.83.HRMS(FAB,甘油)C13H19NO7P(MH+)计算值332.0899,测量值332.0900.
实施例13:2-氨基-4-[4-羧基苯基(甲基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的4.82mmol膦酰二氯的干燥二氯甲烷溶液30mL中,添加1.10g、4.82mmol的市售4-羟基苯甲酸苄酯,冷却至-65℃后,添加0.74mL、5.31mmol的三乙胺,并在-65℃搅拌10分钟。然后,撤掉冷却槽并缓慢升温至室温,在30℃再反应30分钟,得到对应的膦酰一氯。0℃下在该反应溶液中添加0.17g、5.31mmol的甲醇和1.34mL、9.64mmol的三乙胺,并在该状态下反应10分钟,然后升温至30℃进一步反应1小时。通过TLC(EtOAc/己烷=4∶3)确认反应结束后,将反应溶液减压浓缩,将残渣溶于醋酸乙酯20mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,通过中性硅胶60N由醋酸乙酯与己烷4∶3混合的溶液纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[4-(苄氧羰基)苯基(甲基)膦酰]丁酸苄酯(1.46g,收率48%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.7-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.74(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.5(m,1H,α-CH),5.10和5.17(2×s,4H,CHCOOCH2Ph和NHCOOCH2Ph),5.35(s,2H,COOCH2Ph),5.47(br d,J=7.2Hz,1H,NH),7.2(d,J=8.4Hz,2H)和8.0(d,J=9.0Hz,2H)(POC6H4),7.3-7.5(m,15H,3×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp29.55.C34H34NO9P计算值:C64.65,H5.43,N2.22;测量值:C64.72,H5.54,N2.22.HRMS(FAB,甘油)C35H35NO9P(MH+)计算值632.2050,测量值632.2026.
然后,将1.40g、2.22mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[4-(苄氧羰基)苯基(甲基)膦酰]丁酸苄酯溶于醋酸与水以2∶1的比例混合的溶剂28mL中,在其中添加5%的钯-碳200mg并在室温下通氢气2.2小时。然后,用硅藻土过滤除去钯-碳,并将滤液减压浓缩。残渣用水进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[4-羧基苯基(甲基)膦酰]丁酸(0.62g,收率89%),为无色固体。
1H NMR(300MHz,D2O)δH2.2-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.8-3.9(m,1H,α-CH),3.89(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),7.32(d,J=7.8Hz,2H)和8.05(d,J=8.4Hz,2H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.40.C12H16NO7P·0.6H2O计算值:C43.94,H5.28,N4.27;测量值:C44.19,H5.14,N3.94.HRMS(FAB,甘油)C12H17NO7P(MH+)计算值318.0743,测量值318.0747.
实施例14:2-氨基-4-[甲基(3-硝基苯基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.91mmol的干燥二氯甲烷溶液20mL中,添加0.68g、4.91mmol的3-硝基苯酚,并将溶液冷却至-20℃。然后,添加0.50g、4.91mmol的三乙胺,并搅拌15分钟。然后,升温至室温反应过夜。通过TLC(EtOAc/己烷=1∶1)确认反应结束后,将反应溶液减压浓缩,将残渣溶于醋酸乙酯20mL中,并过滤除去不溶性的盐。将滤液减压浓缩,由醋酸乙酯与己烷1∶1混合的溶液通过中性硅胶60N纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(3-硝基苯基)膦酰]丁酸苄酯(1.18g,收率44%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.3(m,4H,PCH2CH2),3.77(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),4.5(m,1H,α-CH),5.11(s,2H,NHCOOCH2Ph),5.19(s,2H,CHCOOCH2Ph),5.5(d,J=7.8Hz,1H,NH),7.3-7.4(m,10H,2×Ph),7.5-7.6(m,2H)和8.0-8.1(m,2H)(3-硝基苯基);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp30.44.C26H27N2O9P计算值:C57.57,H5.02,N5.16;测量值:C57.48,H5.05,N5.03;HRMS(FAB,甘油)C26H28N2O9P(MH+)计算值543.1532,测量值543.1523
然后,将1.09g、2.01mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[甲基(3-硝基苯基)膦酰]丁酸苄酯和1.30g、12.0mmol的茴香醚溶于干燥的硝基甲烷10mL中,在其中添加0.80g、6.00mmol的三氯化铝,并在室温下反应3小时,然后进一步加水20mL,并搅拌10分钟。将该混合物用50mL的乙醚洗涤三次,取水层,添加甲醇使得终浓度为30%。使溶液通过中性硅胶60N,除去氢氧化铝。而且,约30mL的洗脱液不浓缩,直接用反相中压柱色谱法ODS-S-50B纯化。该柱用甲醇30%-60%的线性梯度以流速6ml/分钟洗脱,收集60%甲醇洗脱的化合物的洗脱级分,通过TLC(BuOH/AcOH/H2O=5∶2∶2,水合茚三酮显色)确认化合物的洗脱和纯度。减压浓缩后,利用水进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[甲基(3-硝基苯基)膦酰]丁酸(0.40g,收率63%),为无色固体。
1H NMR(300MHz,D2O)δH2.1-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.8-3.9(m,1H,α-CH),3.88(d,3JHP=12.0Hz,3H,POCH3),7.62(m,2H),8.04(s,1H)和8.13(m,1H)(3-硝基苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.93.C11H15N2O7P·0.5H2O计算值:C40.37,H4.93,N8.56;测量值:C40.56,H4.95,N8.68.HRMS(FAB,甘油)C11H16N2O7P(MH+)计算值319.0695,测量值319.0694.
实施例15:2-氨基-4-[3-羧基苯基(甲基)膦酰]丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.82mmol的干燥二氯甲烷溶液40mL中,添加1.21g、5.30mmol的3-羟基苯甲酸苄酯,并冷却至0℃。然后,添加0.81mL、5.78mmol的三乙胺,在0℃下搅拌15分钟。然后,升温并在30℃反应1.5小时。通过TLC(EtOAc/己烷=8∶5)确认反应结束后,将反应溶液减压浓缩,将残渣溶于丙酮30mL中,并过滤除去不溶性的盐。将该滤液减压浓缩,使用醋酸乙酯与己烷8∶5混合的溶液通过中性硅胶60N纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[3-(苄氧羰基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯(1.49g,收率49%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.4(m,4H,PCH2CH2),4.5(m,1H,α-CH),5.10(s,2H,NHCOOCH2Ph),5.17(s,2H,CHCOOCH2Ph),5.36(s,2H,COOCH2Ph),5.5(d,J=6.9Hz,1H,NH),7.3-7.9(m,19H,4×Ph);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp29.75.C34H34NO9P计算值:C64.65,H5.43,N2.22;测量值:C64.26,H5.50,N2.28.HRMS(FAB,甘油)C34H35NO9P(MH+)计算值632.2050,测量值632.2056.
然后,将1.31g、2.07mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[3-(苄氧羰基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯溶于醋酸与水以3∶1混合的溶剂28mL中,添加5%的钯-碳200mg,并在室温下通氢气3小时。然后,硅藻土过滤除去钯-碳,并将滤液减压浓缩,然后将残渣用水进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-[3-羧基苯基(甲基)膦酰]丁酸(0.59g,收率90%),为无色固体。
1H NMR(300MHz,D2O)δH2.0-2.4(m,4H,PCH2CH2),3.8-3.9(m,1H,α-CH),3.88(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),7.46(d,J=8.1Hz,1H),7.55(t,J=8.1Hz,1H),7.77(s,1H)和7.89(d,J=7.8Hz,1H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp 32.63.C12H16NO7P·0.6H2O计算值:C43.94,H5.28,N4.27;测量值:C43.74,H5.11,N4.25.HRMS(FAB,甘油)C12H17NO7P(MH+)计算值318.0743,测量值318.0755.
实施例16:2-氨基-4-{[3-(2-羧基乙基)苯基](甲基)膦酰}丁酸的合成
在通过与实施例1同样的方法得到的2-(N-苄氧羰氨基)-4-[氯(甲基)膦酰]丁酸苄酯4.82mmol的干燥二氯甲烷溶液30mL中,在室温下添加1.75g、6.83mmol的3-(3-羟基苯基)丙酸苄酯,并冷却至0℃。然后,添加1.34mL、9.64mmol的三乙胺,在0℃下搅拌溶液15分钟。然后,在室温下反应过夜。通过TLC(EtOAc/己烷=4∶3)确认反应结束后,将反应溶液减压浓缩,将残渣溶于丙酮30mL中,并过滤除去不溶性的盐。将该滤液减压浓缩,使用醋酸乙酯与己烷7∶5混合的溶液通过中性硅胶60N纯化粗产物,得到非对映异构体混合物的2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[3-(2-苄氧羰基乙基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯(0.82g,收率26%),为无色油状物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH1.8-2.4(m,4H,PCH2CH2),2.66(t,J=7.8Hz,2H,CH2CH2COO),2.94(t,J=7.8Hz,2H,CH2CH2COO),3.72(d,3JHP=11.1Hz,3H,POCH3),4.5(m,1H,α-CH),5.10(s,4H,COOCH2Ph和NHCOOCH2Ph),5.17(s,2H,CHCOOCH2Ph),5.5(br d,J=7.5Hz,1H,NH),7.0-7.4(m,19H,3×Ph和C6H4);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp 29.21.C36H38NO9P计算值:C65.55,H5.81,N2.12;测量值:C65.36,H5.88,N2.28.HRMS(FAB,甘油)C36H39NO9P(MH+)计算值660.2363,测量值660.2359.
然后,将0.68g、1.03mmol的2-(N-苄氧羰氨基)-4-{[3-(2-苄氧羰基乙基)苯基](甲基)膦酰}丁酸苄酯溶于甲醇与水以4∶1混合的溶剂50mL中,在其中添加5%的钯-碳240mg,并在室温下通氢气5小时。然后,硅藻土过滤除去钯-碳,并将该滤液减压浓缩,然后将残渣用水进行冷冻干燥,得到2-氨基-4-{[3-(2-羧基乙基)苯基](甲基)膦酰}丁酸(0.31g,收率86%),为无色固体。
1H NMR(300MHz,D2O)δH2.0-2.2(m,4H,PCH2CH2),2.68(t,J=7.2Hz,2H,PhCH2CH2COO),2.93(t,J=7.2Hz,2H,PhCH2CH2COO),3.8-3.9(m,1H,α-CH),3.84(d,3JHP=11.4Hz,3H,POCH3),7.07(d,J=9.3Hz,2H),7.17(d,J=7.2Hz,1H)和7.36(t,J=7.8Hz,1H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp32.48.C14H20NO7P·0.6H2O计算值:C47.22,H6.00,N3.93;测量值:C47.32,H5.88,N3.99.HRMS(FAB,甘油)C14H21NO7P(MH+)计算值346.1056,测量值346.1059.
实施例17:2-氨基-4-(二苯基膦酰)丁酸的合成
在合成实施例3中的2-(N-4-硝基苄氧羰氨基)-4-[甲基(苯基)膦酰]丁酸苄酯时,得到0.64g作为副产物的2-(N-4-硝基苄氧羰氨基)-4-(二苯基膦酰)丁酸苄酯。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δH2.0-2.4(m,4H,PCH2CH2),4.51(m,1H,α-CH),5.21(m,4H,2×OCH2Ph),5.7(br d,J=7.5Hz,1H,NH),7.1-7.4(m,15H,3×Ph),7.5(d,J=8.7Hz,2H)和8.2(d,J=8.7Hz,2H)(4-硝基苯基);31P NMR(121MHz,CDCl3)δp 24.40.C31H29N2O9P计算值:C61.59,H4.84,N4.63;测量值:C61.94,H4.97,N4.49.
然后,将0.64g、1.06mmol的2-(N-4-硝基苄氧羰氨基)-4-(二苯基膦酰)丁酸苄酯溶于醋酸20mL中,在其中添加10%的钯-碳86mg,并在室温下通氢气2小时。然后,硅藻土过滤除去钯-碳,并将滤液减压浓缩,然后使用乙腈与水的混合溶剂使残渣结晶,得到2-氨基-4-(二苯基膦酰)丁酸(0.13g,收率37%),为无色固体。
1H-NMR(300MHz,D2O)δH2.3-2.5(m,4H,PCH2CH2),3.87(t,J=4.8Hz,1H,α-CH),7.19(d,J=7.8Hz,4H),7.31(t,J=7.8Hz,2H)和7.44(t,J=8.4Hz,4H)(苯基);31P NMR(121MHz,D2O)δp28.20.C16H18NO5P·H2O计算值:C54.39,H5.71,N3.96;测量值:C54.40,H5.51,N4.25.HRMS(FAB,甘油)C16H19NO5P(MH+)计算值336.1001,测量值336.1001.
[对GGT的抑制活性试验]
实验的GGT试样使用大肠杆菌的GGT的纯化酶、以及人GGT的粗酶。另外,大肠杆菌GGT的纯化酶,使用其物理化学性质记载于文献(Hideyuki Suzuki,Hidehiko Kumagai,Tatsurokukro Tochikura″gamma-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12:Purificationand Properties″Journal of Bacteriology,Dec.1986,Vol.168,No.3,p.1325-1331)的酶。另外,人GGT的粗酶使用旭化成株式会社制造的酶(HC-GTP(制品编号)、603AA(批号))。该人GGT粗酶中添加了大量的牛血清白蛋白(BSA),酶浓度为1%以下,酶稳定。
实验中,首先,在大肠杆菌GGT和人GGT的水解活性试验中,使用荧光法[Smith,G.D.;Ding,J.L.;Peters,T.J.Anal.Biochem.100,136-139(1979)],求出对于作为底物的7-(γ-L-谷氨酰氨基)-4-甲基香豆素的米氏常数(Km)。
在大肠杆菌GGT的水解活性试验中,将0.42nM的酶溶液10μL添加到含有2μM的底物水溶液100μL的100mM琥珀酸-氢氧化钠缓冲液(pH5.5)中,并定容为1mL。使用日立制荧光分光光度计F-2000在25℃下连续跟踪(激发波长:350nm,测定波长:440nm)伴随酶反应释放的生成物7-氨基-4-甲基氨基香豆素(AMC)。AMC浓度另外使用标准溶液由表示荧光强度(F)与浓度(C)的关系的校准曲线求出,使用荧光强度变化(ΔF)与浓度变化(ΔC)的关系式(1)计算。
ΔF/ΔC=0.11nM-1(1)
荧光强度对AMC浓度在直到2.0μM的范围内保持直线关系。结果,对于7-(γ-L-谷氨酰氨基)-4-甲基香豆素的Km在该条件下为0.2μM。
人GGT的水解活性试验中,除了将底物浓度设定为4.0μM以外,与大肠杆菌GGT的水解活性试验同样进行测定,因此对于共同的部分省略说明。测定结果是:对于7-(γ-L-谷氨酰氨基)-4-甲基香豆素的Km为12.6μM。
另外,蛋白质浓度使用バィォラッド公司制造的蛋白质定量用色素以BSA为标准蛋白质进行测定。
然后,通过连续检定法和非连续检定法求出酶失活的二次反应速度常数kon。另外,对GGT的抑制活性与连续检定法和非连续检定法一起在伪一次反应速度条件下进行。
连续检定法中,在保持温度25℃的状态下,预先使包含各种浓度的抑制剂的100mM琥珀酸-氢氧化钠缓冲液(pH5.5)和底物达到平衡。在此,对于大肠杆菌GGT使用底物0.2μM,对于人GGT使用底物0.4μM。并且,在其中添加大肠杆菌GGT的酶溶液使得终浓度为0.04nM,添加GGT粗酶溶液使得终浓度为5μg/mL。由此开始反应,在10分钟内连续跟踪AMC的释放(荧光强度的增加)。将得到的荧光强度数据对时间作图,如图1和图2所示。
图1中显示了作为抑制剂一例的实施例8的化合物与大肠杆菌GGT反应时的AMC荧光强度,图2中显示了作为抑制剂一例的实施例8的化合物与人GGT反应时的AMC荧光强度。图1和图2的纵轴为荧光强度,横轴为时间。
如图1和图2所示,抑制曲线随时间斜率变小,各抑制曲线的曲率随抑制剂浓度而不同。将由各曲线得到的荧光强度数据代入伪一次反应速度式(2)[Stein,R.L.et al.Biochemistry 26,2682-2689(1987)],通过非线性回归求出酶失活的伪一次反应速度常数(kobs)。
[P]=[P]∞[1-exp(-kobst)](2)
在此,[P]和[P]∞表示时间t及无限时间后(t=∞)的生成物浓度。
并且,将kobs对抑制剂浓度([I])作图,在直到实验可能的最大抑制剂浓度范围得到直线关系。因此,使用以下所示的由动力学机理导出的式(3),计算酶失活的二次反应速度常数kon。
kobs=kon[I]/(1+[S]/Km)(3)
在此,S表示7-(γ-L-谷氨酰氨基)-4-甲基香豆素。对于大肠杆菌GGT,底物浓度[S]为0.2μM,Km值为0.2μM。对于人GGT,底物浓度[S]为4.0μM,Km值为12.6μM。动力学数据使用Synergy Software公司制造的程序カレィダグラフ进行非线性回归分析。
另外,在非连续检定法中,将各种各样浓度的抑制剂溶于100mM琥珀酸-氢氧化钠缓冲液(pH5.5)中,在该缓冲液中加入酶溶液。在此,对于大肠杆菌GGT添加酶溶液使得终浓度为0.4nM,对于人GGT粗酶添加酶溶液使得终浓度为0.5mg/mL。而且,在25℃下使抑制剂和各GGT反应,每隔一定时间取反应溶液10μL作为试样,通过上述酶活性法求出残留活性。通过使用酶失活的伪一次反应速度式(4)对每隔一定时间的残留活性进行非线性回归,求出kobs的值。
at/a0=exp(-kobst)(4)
在此,at表示时间t的残留活性,a0表示抑制前(t=0)的酶活性。并且,非线性回归分析使用カレィダグラフ进行。
将kobs对抑制剂浓度([I])作图,在直到实验可能的最大抑制剂浓度范围得到直线关系,由得到的kobs值通过式(5)求出kon。
kobs=kon[I](5)
[对GGT的抑制活性试验的试验结果]
通过上述试验得到的、实施例1-17的化合物和比较例1的GGT酶失活的二次反应速度常数kon如表2所示。另外,比较例1中,使用阿西维辛((αS,5S)-acivicin)。
[表2]
从表2所示的试验结果可以看出,实施例1-17的所有化合物具有对大肠杆菌和人GGT的抑制效果。特别是实施例6-8和14的化合物的大肠杆菌GGT酶失活的二次反应速度常数kon大于比较例1的阿西维辛的kon,因此,这些化合物的大肠杆菌GGT失活速度比阿西维辛的失活速度大。因此,实施例6-8和14的化合物对大肠杆菌GGT的抑制效果比阿西维辛的抑制效果好。
另外,实施例4-8、10、11和13-16的化合物的人GGT酶失活的二次反应速度常数kon大于比较例1的阿西维辛的kon,因此,这些化合物的人GGT失活速度比利用阿西维辛的失活速度快。因此,实施例4-8、10、11和13-16的化合物对人GGT的抑制效果比阿西维辛对人GGT的抑制效果好。
[化合物的稳定性与对GGT的抑制活性的关系]
实施例1-8和10-17的化合物中、各化合物的芳基的解离常数Ka与大肠杆菌GGT酶失活的二次反应速度常数kon的关系如图3所示。图3中,纵轴为化合物的logkon,横轴为化合物的芳基的pKa。
从图3所示的试验结果可以看出,实施例1-8和10-17的化合物的图形为直线状,它们的logkon与芳基的pKa成比例。一般而言,如果化合物的芳基的pKa变小,则芳基容易解离,化合物自身的化学反应性增大。因此,从图3的结果可以看出,实施例1-8和10-17的化合物根据其化学反应性对大肠杆菌GGT起作用。
另外,实施例1-8和10-17的化合物中、各化合物的芳基的解离常数Ka与人GGT酶失活的二次反应速度常数kon的关系如图4所示。图4中,纵轴为化合物的logkon,横轴为化合物的芳基的pKa。
从图4所示的结果可以看出,实施例1-7、12-15和17的化合物的图形为直线状,这些化合物的logkon与芳基的pKa成比例。与此相对,实施例8、10、11和16的化合物的图形偏离到上述直线的上方,实施例8、10、11和16的化合物的logkon显示比该直线上的logkon更大的值。因此,实施例8、10、11和16的化合物对人GGT的抑制效果比从根据芳基的pKa预计的脱离能即化合物自身的化学反应性预料的更高,与实施例1-7、12-15和17的化合物相比相对高。
另外,实施例8、10、11和16的化合物,像这样对人GGT显示比由化合物自身的化学反应性预料的更高的抑制效果,另一方面,如图3所示,对于大肠杆菌GGT显示与从化合物自身的化学反应性预料的基本同等的抑制效果。因此,实施例8、10、11和16的化合物具有与对大肠杆菌GGT相比对人GGT显示特别高抑制效果的特殊性质。
特别是对于实施例11和实施例12的化合物,实施例11中羧甲基取代苯基的间位,与此相对,实施例12中羧甲基取代苯基的对位,仅仅是羧甲基的结合位置不同,它们的分子结构类似。另外,实施例11和12的化合物的芳基的pKa和大肠杆菌GGT酶失活的二次反应速度常数kon基本相等,实施例11和12的化合物显示基本同等的化学反应性和对大肠杆菌GGT的抑制活性。但是,实施例11的化合物的人GGT酶失活的kon:51(M-1s-1)比实施例12化合物的人GGT酶失活的二次反应速度常数kon:0.33(M-1s-1)高约155倍,实施例11的化合物显示比实施例12更高的对人GGT抑制活性。
这可能是因为实施例8、10、11和16的化合物具有与人GGT的底物结构相近的结构,从而该部分适合与人GGT活性中心即底物识别部位相互作用,从而引起人GGT的快速失活。
这样,化合物对大肠杆菌GGT的抑制活性依赖于其化学反应性,化合物对人GGT的抑制活性不仅依赖于其化学反应性,而且依赖于对酶的底物识别部位的适合性,因此,如果进行分子设计以引入尽力抑制化学反应性并且适合人GGT的底物识别部位的结构,可以得到选择性地作用于人GGT的稳定抑制剂。相反,如果进行分子设计以引入提高化学反应性并且适合人GGT的底物识别部位的结构,则可以得到对大肠杆菌GGT的抑制活性高的抑制剂。
[实施例8的化合物对GGT的抑制活性]
由上述图1(作为抑制剂一例的实施例8的化合物与大肠杆菌GGT反应时的AMC荧光强度)和图2(作为抑制剂一例的实施例8的化合物与人GGT反应时的AMC荧光强度)所示的酶的活性曲线可以看出,实施例8的化合物可以引起大肠杆菌和人GGT随时间缓慢失活的特殊抑制。
即,一般抑制剂的情况下,抑制剂的量越多,则活性曲线的斜率越小,但是其活性曲线不弯曲而呈直线状。此时,如果从GGT与抑制剂混合的体系中通过任何方法除去抑制剂,则GGT立即复活,恢复原来的活性。
与此相对,实施例8的化合物的酶活性曲线,随时间的经过斜率变小。这是由于:通过实施例8的化合物而使GGT随时间的经过而失活时,活性最终变为0。此时,一旦GGT失活,则例如即使除去抑制剂,GGT的活性也不恢复。因此,实施例8的化合物是使GGT不可逆失活的抑制剂。与使GGT可逆失活的一般抑制剂相比,具有高的GGT抑制效果。
[化学稳定性]
实施例1-11的化合物的水解率如表3所示。在此,测定了实施例1-11的各化合物在室温下保存于水中后的各化合物的水解率。实施例10以外的化合物在水中保存12小时,实施例10的化合物在水中保存112小时。
[表3]
从表3所示的试验结果可以看出,实施例1-5、9和11的化合物的水解率为0,这些化合物不水解,化学上稳定。特别是实施例11的化合物,如表2所示,具有与实施例6和10同等的对人GGT的高抑制活性,同时如表3所示,显示比实施例6和10低的水解率。因此,实施例11的化合物稳定地发挥对人GGT的高抑制效果。
另外,在碱性、中性或酸性条件下,实施例7的化合物的水解率如表4所示。在此,在表4所示的溶剂中添加实施例7的化合物,在23.5℃的条件下保存,测定12小时后实施例7化合物的水解率。
[表4]
溶剂 |
pH |
水解率(%) |
0.1N Na2CO3 |
11.6 |
100 |
0.1N NaHCO3 |
8.3 |
100 |
D2O |
7 |
49 |
0.1N CH3COOD |
2.9 |
40 |
0.1N CF3COOD |
<1 |
0 |
0.1N DCl |
<1 |
0 |
0.1N DCl+MeOH |
<1 |
0 |
从表4所示的试验结果可以看出,碱性和中性条件下,实施例7的化合物水解,特别是碱性条件下实施例7的化合物的水解率高。但是,在酸性条件下实施例7的化合物水解率低,实施例7的化合物几乎不水解而稳定。因此,在酸性条件下实施例7的化合物可以稳定保存,对GGT可以稳定地发挥抑制效果。
该实施例7的化合物,如表3所示,是实施例1-11的化合物中水解率最高、最容易水解的不稳定化合物。实施例7的化合物在酸性条件下稳定,因此它以外的实施例1-6和8-11的化合物至少在酸性条件下是稳定的。
另外,根据发明人的实验,确认了:即使在典型的谷氨酰胺转移酶谷氨酸依赖型天冬酰胺合成酶中加入实施例11的化合物10mM并保存2小时,实施例11的化合物也完全不抑制谷氨酰胺依赖型天冬酰胺合成酶的作用。因此,膦酸二酯衍生物(1)特异地作用于GGT。
本发明进行了详细说明和图示,但是这些仅仅是图解和例子,不应解释为限定,本发明的精神和范围由权利要求书限定。
5.如权利要求4所述的膦酸二酯衍生物,其中,所述可以具有取代基的烷基的取代基为选自由可以具有取代基的苯基、具有氮的杂环残基、烷硫基、芳硫基、羟基、氨基甲酰基、氨基、胍基、烷氧基、酰胺基、羧基和羧基的等价体组成的组中的至少一个基团。
9.如权利要求4所述的膦酸二酯衍生物,其中,所述可以具有取代基的芳基的取代基为选自由可以由羧基和羧基的等价体的任意一个取代的烷基、吸电子基团、羧基和羧基的等价体组成的组中的至少一个基团。
21.一种膦酸二酯衍生物制造方法,其特征在于,在由2-氨基-4-膦酰丁酸制造权利要求1所述的通式(1)表示的膦酸二酯衍生物的过程中,分离出结晶形式的权利要求19所述的通式(19)表示的2-取代氨基-4-膦酰丁酸的金属盐。
22.一种膦酸二酯衍生物制造方法,其特征在于,在由2-氨基-4-膦酰丁酸制造权利要求1所述的通式(1)表示的膦酸二酯衍生物的过程中,分离出结晶形式的权利要求20所述的通式(20)表示的2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯。
23.如权利要求22所述的膦酸二酯衍生物制造方法,其特征在于,在分离出结晶形式的权利要求20所述的通式(20)表示的2-取代氨基-4-膦酰丁酸酯的过程中,使用醚类溶剂。