CN101328217A - 一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法 - Google Patents
一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101328217A CN101328217A CNA2008100214113A CN200810021411A CN101328217A CN 101328217 A CN101328217 A CN 101328217A CN A2008100214113 A CNA2008100214113 A CN A2008100214113A CN 200810021411 A CN200810021411 A CN 200810021411A CN 101328217 A CN101328217 A CN 101328217A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- artificial antigen
- liquid
- preparation
- bovine serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明以4－硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与正己醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4－硝基邻苯二甲酸二己酯苯环上的硝基还原为胺基，制备半抗原；利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备邻苯二甲酸二己酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二己酯－牛血清蛋白。本发明合成了邻苯二甲酸二己酯的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析，为以后的研究提供了方便，可满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
邻苯二甲酸二己酯(di-n-Hexyl phthalate，DHP)是酞酸酯的一种。酞酸酯作为增塑剂在塑料的加工生产中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生产中被广泛的使用。由于酞酸酯增塑剂与塑料基质之间没有形成共价键，而是以氢键和范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质，因而在接触到包装食品中所含的水、油脂时，便会溶出。经过研究发现酞酸酯是一种环境激素物质，它干扰生物为保持体内平衡并调节生长过程的正常激素的产生、释放、转移、代谢、反应和消除，或在未受损的生物后代中引起不良的健康影响和内分泌功能的改变。美国环保局将六种酞酸酯列入重点控制的污染物名单中，我国优先污染物黑名单中包括邻苯二甲酸二己酯。目前，国内外有关邻苯二甲酸二己酯的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，国内外已经开展了对酞酸酯类免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制备邻苯二甲酸二己酯人工抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法，所制备的产品可用于邻苯二甲酸二己酯免疫分析方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。
本发明的技术方案：一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测，以4-硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与正己醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4-硝基邻苯二甲酸二己酯苯环上的硝基还原为胺基，制备人工半抗原；第二步为人工抗原的制备及检测，利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白(BSA)结合，制备邻苯二甲酸二己酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白。其反应方程式为：
工艺步骤为：
(1)人工半抗原的制备：
①4-硝基邻苯二甲酸二己酯的合成
称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL的三颈烧瓶中，加入0.1mol的正己醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入1.6mL的浓硫酸，加热升温至110-130℃，反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油状残留加入到冷水中用质量浓度10％的Na2CO3溶液洗至下层水层无色，取上层得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到0.041mol的4-硝基邻苯二甲酸二己酯。
硅胶薄层板的制作：称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用。
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.69处观察到显色点作为反应终点。
②4-氨基邻苯二甲酸二己酯的合成
称取9mmol还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入10mL水、3mmol氯化铵，水浴中加热15min。另称取4-硝基邻苯二甲酸二己酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h。趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，4℃析出0.91g橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二己酯作为半抗原备用。
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.53处观察到显色点作为反应终点。
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取5mg半抗原于25mL烧杯中，加入1mL二甲基甲酰胺、0.1mL水和0.1mL的1N盐酸，形成深红色溶液，冷却至4℃。然后逐步滴加1M亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝停止滴加，4℃搅拌1h，此液为A液。
硼酸盐缓冲液：0.2mol/L硼酸∶硼酸12.37g加水至1000mL；0.05mol/L硼砂∶硼砂19.07g加水至1000mL，将上述两溶液以体积比2∶8的比例混合即为pH9.0的硼酸盐缓冲液。
制备B液：称取10mg的牛血清蛋白溶于1.5mL的pH9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存。此液为B液。
在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在9；4℃条件下搅拌保存过夜，即得到人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白。
(3)邻苯二甲酸二己酯人工抗原的鉴定：邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，在吸收波长312nm处测吸光值，并计算其偶联比。
偶联比测定：即估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制4-氨基邻苯二甲酸二己酯浓度为0，10，20，30μg·mL-1的20％乙醇溶液，通过紫外扫描可知4-氨基邻苯二甲酸二己酯的最大吸收波长为312nm，在312nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε＝18042.32L·mol-1
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将偶联物溶液按一定比例稀释，在595nm处测定偶联物溶液的吸光值，从曲线上得到偶联物溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得偶联物溶液的蛋白浓度为2.59mg·mL-1。
偶联比测定：配制150μg·mL-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL-1，在312nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r为：γ＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/66200)，本实验计算得r≈14。
其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL-1)。
本发明的有益效果：本发明合成了邻苯二甲酸二己酯的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1邻苯二甲酸二己酯人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
(1)人工半抗原的制备：
①4-硝基邻苯二甲酸二己酯的合成
称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸与100mL的三颈烧瓶中，加入0.1mol的正己醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入1.6mL的浓硫酸，加热升温至110-130℃，反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油状残留加入到冷水中用质量浓度10％的Na2CO3溶液洗至下层水层无色，得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到0.041mol的4-硝基邻苯二甲酸二己酯。
硅胶薄层板的制作：称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用。
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.69处观察到显色点作为反应终点。
②4-氨基邻苯二甲酸二己酯的合成
称取9mmol还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入10mL水、3mmol氯化铵，水浴中加热15min。另称取4-硝基邻苯二甲酸二己酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h。趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，4℃析出0.91g橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二己酯作为半抗原备用。
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.53处观察到显色点作为反应终点。
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取5mg半抗原于25ml烧杯中，加入1mL二甲基甲酰胺、0.1mL水和0.1mL的1N盐酸，形成深红色溶液，冷却至4℃。然后逐步滴加1M亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停止滴加，4℃下搅拌1h，此液为A液。
硼酸盐缓冲液：0.2mol/L硼酸∶硼酸12.37g加水至1000mL，0.05mol/L硼砂∶硼砂19.07g加水至1000mL，将上述两溶液以体积比2∶8的比例混合即为pH9.0的硼酸盐缓冲液。
制备B液：称取10mg的牛血清蛋白溶于1.5mL的pH9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存。此液为B液。
在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氢氧化钠溶液调节ph，使pH保持在9，4℃条件下，搅拌保存过夜，即得到人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白。
(3)邻苯二甲酸二己酯人工抗原的鉴定：
邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，在吸收波长312nm处测吸光值，并计算其偶联比。
偶联比测定：配制150μg·mL-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL-1，在312nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r为：γ＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/66200)，本实验计算得r≈14。
其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL-1)。
Claims (1)
1.一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法，其特征是以4-硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与正己醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4-硝基邻苯二甲酸二己酯苯环上的硝基还原为胺基，制备人工半抗原；利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备邻苯二甲酸二己酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白；步骤为：
(1)人工半抗原的制备：
①4-硝基邻苯二甲酸二己酯的合成
称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL的三颈烧瓶中，加入0.1mol的正己醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入1.6mL的浓硫酸，加热升温至110-130℃，反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油状残留加入到冷水中用质量浓度10％的Na2CO3溶液洗至下层水层无色，取上层得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到0.041mol的4-硝基邻苯二甲酸二己酯；
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.69处观察到显色点作为反应终点；
②4-氨基邻苯二甲酸二己酯的合成
称取9mmol还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入10mL水、3mmol氯化铵，水浴中加热15min；另称取4-硝基邻苯二甲酸二己酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h；趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，4℃析出0.91g橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二己酯作为半抗原备用；
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.53处观察到显色点作为反应终点；
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取5mg半抗原于25mL烧杯中，加入1mL二甲基甲酰胺、0.1mL水和0.1mL的1N盐酸，形成深红色溶液，冷却至4℃；然后逐滴滴加1M亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝停止滴加，4℃搅拌1h，此液为A液；
制备B液：称取10mg牛血清蛋白溶于1.5mL的pH9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存，此液为B液；
在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氢氧化钠溶液调节pH，使pH始终保持在9；在4℃条件下搅拌保存过夜，得人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白；
(3)人工抗原的鉴定：邻苯二甲酸二己酯-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，在吸收波长312nm处测吸光值，并计算其偶联比。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100214113A CN101328217A (zh) | 2008-07-29 | 2008-07-29 | 一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100214113A CN101328217A (zh) | 2008-07-29 | 2008-07-29 | 一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101328217A true CN101328217A (zh) | 2008-12-24 |
Family
ID=40204248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008100214113A Pending CN101328217A (zh) | 2008-07-29 | 2008-07-29 | 一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101328217A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206269A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-05 | 聊城大学 | 邻苯二甲酸二庚酯完全抗原、制备方法及用途 |
| CN102225898A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-26 | 聊城大学 | 4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法 |
| CN102225901A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-26 | 聊城大学 | 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法 |
-
2008
- 2008-07-29 CN CNA2008100214113A patent/CN101328217A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206269A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-05 | 聊城大学 | 邻苯二甲酸二庚酯完全抗原、制备方法及用途 |
| CN102225898A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-26 | 聊城大学 | 4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法 |
| CN102225901A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-26 | 聊城大学 | 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101328204B (zh) | 一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法 | |
| CN102277023A (zh) | 一种玻璃透明隔热涂料及其制备方法 | |
| CN101328217A (zh) | 一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法 | |
| CN101158685A (zh) | 一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备与使用方法 | |
| CN102680417A (zh) | 酒糟中直、支链淀粉含量的检测方法 | |
| CN104597258A (zh) | 基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法 | |
| CN101328218A (zh) | 一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法 | |
| CN101358230B (zh) | 一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法 | |
| CN101071133B (zh) | 一种硝西泮人工抗原的制备方法 | |
| CN105403612B (zh) | 一种基于植物酯酶快速检测农残的方法 | |
| CN102706819A (zh) | 一种食品中甲醛测定的乙酰丙酮萃取分光光度法 | |
| CN101585876B (zh) | 一种苏丹红ⅱ完全抗原的合成方法 | |
| CN1332203C (zh) | 检测动物性食品中盐酸克伦特罗的快速测试方法 | |
| CN100401065C (zh) | 快速检测呋喃唑酮的免疫纳米金试纸条的制备方法 | |
| CN104407093B (zh) | 一种快速检测发酵液中l-谷氨酰胺含量的方法 | |
| CN110530806B (zh) | 一种快速测定阔叶材原料中聚戊糖和纤维素含量的方法 | |
| CN100513423C (zh) | 一种地西泮人工抗原的制备方法 | |
| CN101899109B (zh) | 一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法 | |
| CN108037090B (zh) | 一种利用壳聚糖-金纳米粒子检测汞离子的方法 | |
| CN101830981A (zh) | 一种4-氨基二苯甲酮人工抗原的制备方法 | |
| CN115372610A (zh) | 一种用于胶体金法检测试纸条的质控线包被溶液、质控线、试纸条及其应用 | |
| CN107764816A (zh) | 纳米金固定化小球的制备方法及其在福美锌检测中的应用 | |
| CN109535094B (zh) | 一种反应性弱碱可变色的偶氮-蒽醌类pH探针及其制备和应用 | |
| CN101585875B (zh) | 一种柠檬黄完全抗原的合成方法 | |
| CN102520178A (zh) | 同时定量检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素b1的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20081224 |