CN101326284A - 富集短链核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及富集长度小于300个核苷酸的核酸的方法，该方法包括以下步骤：i)提供流体相，优选水相P1，其中含有(α1)至少一种长度小于300个核苷酸的核酸，和(α2)至少一种不同于所述核酸(α1)的组分，ii)使所述相P1接触阴离子交换基质以使所述核酸(α1)结合在阴离子交换基质上，iii)任选用洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换基质，其中所述核酸(α1)仍旧结合于阴离子交换基质，和iv)从所述阴离子交换基质上除去，优选洗脱，结合于阴离子交换基质的核酸(α1)以获得含有核酸(α1)的流体相，优选水相P2。本发明还涉及用于富集长度小于300个核苷酸的核酸的试剂盒，涉及所述试剂盒的用途，涉及阴离子交换基质的用途，并涉及治疗疾病的方法。

Description

富集短链核酸的方法
本发明涉及富集长度小于300个核苷酸的核酸的方法，涉及用于富集长度小于300个核苷酸的核酸的试剂盒，涉及所述试剂盒的用途，涉及阴离子交换基质的用途并涉及治疗疾病的方法。
若干年前，由于发现小的核糖核酸(RNA)执行了基因表达的实质调节功能，因此科学研究日益集中于短于300个核苷酸，尤其是短于100个核苷酸的小RNA。更具体地说，许多研究者已经对微小RNA(miRNA)感兴趣。miRNA是一类在进化上保守的长度约22个核苷酸的小的非编码RNA，其在调节基因表达中的复杂作用正变得越来越明显。已在所研究的所有真核生物和几乎所有组织中发现miRNA，其中包括真菌、植物、昆虫和哺乳动物。除了miRNA，还已经发现其它小RNA在细胞功能中也扮演重要角色。这些小RNA包括，例如，小干扰RNA(siRNA)、核小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。
这些短于300个核苷酸的短RNA必须尽可能纯并以高产率从要研究的生物系统中纯化，这样才能够研究它们的细胞作用。因此迫切需要提供能够从复杂生物系统、尤其从细胞裂解物中纯化和分离这种短RNA的方法。
通常，为分离生物样品中的核酸，必须将它们与剩余的细胞组分如蛋白质、糖类、脂质和其它组分分离。现有技术已经披露了多种从非常不同的原料，如从细胞培养物、从植物和动物来源的组织、以及从体液分离核酸的方法。例如，一种方法包括在有机溶剂如酚和氯仿的帮助下提取通常为水性的原始溶液(Chomczynski和Sacchi，1987)，然后在醇类如乙醇或异丙醇的帮助下从水相中沉淀核酸(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.in T.Maniatis，CSH，″Molecular Cloning″，1989)。另一种方法包括将核酸固定于固相，例如通过硅吸附技术。不利的是，所有这些方法不能、或不足以分离或至少纯化相对较小的核酸。
为解决该问题，现有技术已经披露了专门富集小RNA群体的方法，该方法基于硅膜技术。在这些方法中，在将细胞裂解之后在细胞裂解物中加入相对小量的醇，在离液结合条件下至少部分相对较长的核酸可结合于硅膜。然而，现有技术所述纯化方法中所用醇的量过低，因此不能使小核酸也有效结合于硅膜，因此这些小RNA出现在流出液中。然后提高流出液的醇浓度，然后再结合第二硅膜。洗涤步骤之后，小RNA与未结合于第一柱的所有其它核酸一起被洗脱(参见，例如，来自美国奥斯汀安拜恩公司(Ambion，Austin，USA)的mirVana
Figure A20068004630800061
试剂盒或来自德国希尔登恰根公司(QIAGEN，Hilden，Germany)的RNeasy
Figure A20068004630800062
指组织迷你试剂盒，使用方法见″使用手册″)。
恰根与安拜恩法的缺点在于需要使用两种固相，且通过单次结合步骤无法仅获得所需的小RNA。此外，例如，如果不同时分离tRNA和其它较大核酸，则该方法无法分离大小约22个核苷酸的miRNA。尽管在某些条件下通过该方法可以富集小RNA，尤其是miRNA达到一定程度，但所述小RNA仍会被其它核酸尤其被转运RNA(tRNA)污染。
本发明的目的是克服现有技术的缺点。
更具体地说，本发明的目的是提供一种富集(enrich)小核酸，尤其是miRNA的方法，例如，该方法能够采用尽可能少的方法步骤从复杂的生物组合物如细胞裂解物中富集小核酸。
本发明的再一个目的是提供一种纯化小核酸的方法，例如，该方法不仅能够从复杂生物组合物如细胞裂解物中长度大于300个核苷酸的核酸或其它组分中除去长度为25个核苷酸或更小的特定核酸，还能够从长度小于300且大于25个核苷酸的其它核酸如tRNA中特异性除去这些小核酸。
本发明还提供了一种可用于尽可能单独产生所需大小的RNA的方法。
本发明的再一个目的是提供一种无需改变反应容器的方法-通过“单容器反应(one-pot reaction)”-从而将待分析样品的混合风险降至最低。
本发明的再一个目的是提供一种试剂盒，在该试剂盒的帮助下能够如上所述从复杂生物组合物中有利地纯化小核酸，尤其是小RNA。
一种富集长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸的方法为解决一开始提到的问题做出了贡献，所述方法包括以下步骤：
i)提供流体相(fluid phase)，优选水相P1，其中含有
(α1)至少一种长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸，和
(α2)至少一种不同于所述核酸(α1)的组分，
ii)使所述相P1接触阴离子交换基质以使所述核酸(α1)结合于阴离子交换基质，
iii)任选地用洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换基质，其中所述核酸(α1)仍旧结合于阴离子交换基质，和
iv)从所述阴离子交换基质上除去，优选洗脱，结合于阴离子交换基质的核酸(α1)以获得含有核酸(α1)的流体相，优选水相P2。
令人惊奇地发现通过与阴离子交换基质结合然后再洗涤和洗脱，而不需要上述恰根和安拜恩法所需的首先稀释较长核酸，便可从除所述小核酸外可能含有众多其它组分的复杂生物组合物中富集长度小于300个核苷酸的小核酸。
根据本发明方法的一个优选实施方式，要纯化的核酸(α1)是单链或双链RNA，优选双链RNA。更具体地说，优选的长度小于300个核苷酸的RNA是选自下组的RNA：miRNA，前miRNA，siRNA，snRNA，snoRNA，tRNA，5S-rRNA，5.8S-rRNA或其中至少两种的混合物，尤其是miRNA和tRNA的混合物，更优选的核酸(α1)是miRNA，其长度在15-30个核苷酸之内，再优选为17-24个核苷酸，最优选其长度为20-23个核苷酸。
术语“5S-rRNA”和“5.8S-rRNA”表示可在真核核糖体内发现的非编码核糖核酸。术语“tRNA”表示由约80个核苷酸构成并含有共轭碱基对(腺嘌呤和尿嘧啶；胞嘧啶和鸟嘌呤)的核糖核酸。这些碱基对造成了tRNA苜蓿叶样结构。术语“siRNA”表示长度约为22个核苷酸的核糖核酸，它是通过酶“切割机”切割双链RNA(dsRNA)并掺入“RISC”(RNA-诱导的沉默复合体)酶复合体而产生的。术语“snRNA”表示真核生物细胞核内大小约100-300个碱基对的催化活性RNA。这些snRNA通常与蛋白质结合形成“snRNP”(核小核糖核蛋白)并负责剪切掉前mRMA中的内含子以得到mRNA。术语“snoRNA”表示一类涉及核糖体RNA(rRNA)和其它RNA基因的化学修饰，如甲基化的核糖核酸。它们形成“snoRNP”(核仁小核糖核蛋白)的一部分。术语“miRNA”表示用于调节植物和动物发育过程的小核酸。它们特异性结合mRNA并阻止后者在翻译中的活性，例如防止过量产生生长因子。miRNA是从双链前体产生的单链RNA分子。
不同于长度不超过300个核苷酸的核酸(α1)的组分(α2)是长度至少为300个核苷酸的特定核酸(α2′)和不同于核酸的组分(α2″)。
长度至少为300个核苷酸的核酸(α2′)具体包括单链或双链DNA分子或者单链或双链RNA分子，例如mRNA、18S-rRNA或28S-rRNA。
不同于核酸的组分(α2″)具体是指细胞裂解过程中释放的那些组分。因此，这些组分具体包括蛋白质、脂质、多肽或多糖。
方法步骤i)中提供的流体相，优选水相P1可以是不含细胞的样品材料、血浆、血清、体液(如血液、尿液、精液、唾液、脑脊髓液、痰液)、表面活检样品、废水、淤泥或细胞裂解物(如来自动物或植物组织、来自微生物如细菌、真菌或酵母、来自组织培养物或细胞培养物、或者来自体液如血液的细胞裂解物)。
根据本发明方法的一个具体实施方式，方法步骤i)中提供的流体相，优选水相P1是通过包括以下步骤的方法获得的细胞裂解物：
I)提供细胞，
II)裂解细胞以获得细胞裂解物，和
III)任选地从所述细胞裂解物中至少部分地分离至少一种不同于核酸(α1)的组分(α2)。
方法步骤I)中提供的细胞可以是任选固定的组织切片或任选固定的组织片段、贴壁培养细胞、悬浮培养细胞或者是体液中的细胞。
如果细胞是贴壁细胞或组织装配体内的细胞，则方法步骤I)可任选包括洗涤该贴壁细胞或组织，用合适的酶溶液分开贴壁细胞或或从组织中除去细胞，所述溶液含有诸如EDTA等配位化合物或其混合物，并任选通过例如细胞分选仪、沉淀分开或分离的细胞、洗涤如此获得的细胞团并任选重悬于合适的悬浮缓冲液等方法从如此获得的细胞悬浮液中分离特定细胞群。然而，无需先分开也可以裂解贴壁细胞，这之后宜进行洗涤步骤。
如果所述细胞是悬浮培养细胞或体液内的细胞，则方法步骤I)优选包括沉淀悬浮细胞，这之后宜例如通过细胞分选仪除去特定细胞群，洗涤如此获得的沉淀细胞并任选重悬于合适的悬浮缓冲液。
沉淀细胞可任选地重悬其中的悬浮缓冲液优选含有一种或多种缓冲物质和任选的一种或多种配位化合物。悬浮缓冲液的pH可在较宽范围内变化并能够进行本发明方法，优选范围为pH3-11，再优选范围为5-10，最优选范围为pH7-9。这里可采用熟练技术人员已知的调节pH的缓冲系统。根据本发明，优选采用基于三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)、吗啉代丙磺酸(MOPS)或2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪子基]乙磺酸(HEPES)的缓冲系统，其所含缓冲组分的浓度范围为0.5-100mmol/l，再优选范围为1-50mmol/l，最优选范围为2.5-25mmol/l。也可使用基于碱金属乙酸盐/乙酸的缓冲系统或者碱金属乙酸盐/乙酸缓冲系统与三(羟基甲基)氨基甲烷缓冲系统的混合物。类似地，可采用的配位化合物可以是任何能够与钙离子特异性配位的化合物。优选的配位化合物是乙二胺四乙酸(EDTA)，其在悬浮缓冲液中的含量优选为0.01-20mmol/l，再优选0.1-15mmol/l，最优选0.5-5mmol/l。
所用悬浮缓冲液的量取决于提供的细胞数。通常，悬浮缓冲液的用量为每106个细胞10-2000μl，更优选50-1000μl，最优选100-500μl。
特别适用于本发明的悬浮缓冲液是含有0.5-100mmol/l，更优选1-50mmol/l，最优选约2.5-25mmol/l三(羟基甲基)氨基甲烷和0.01-20mmol/l，更优选0.1-15mmol/l，最优选0.5-5mmol/l EDTA的缓冲液，其pH范围为7-9，更优选约8。
在方法步骤II)中，提供的细胞被裂解，可采用熟练技术人员已知的任何裂解方法裂解细胞，该方法适用于从细胞中释放特定RNA材料。可采用的裂解方法具体是通过加热裂解、通过机械力裂解、通过诸如蛋白激酶K的酶裂解、通过使细胞接触含去污剂或离液化合物的裂解缓冲液裂解、或通过低渗溶液裂解。适当时，也可将上述方法结合，例如在含有去污剂或离液化合物的裂解缓冲液中机械破碎细胞，或者使用含有蛋白激酶K和离液化合物的裂解缓冲液。
根据本发明，特别优选用含有去污剂、酶、离液化合物或这些组分中至少两种的混合物的裂解缓冲液裂解细胞。
现有技术已经披露了大量合适的去污剂。根据本发明特别优选的去污剂选自下组：十二烷基硫酸钠(SDS)，聚乙二醇-苯酚醚如Triton X-100、Tween、NP-40或其混合物，SDS和Triton X-100是特别优选的去污剂。如果所用去污剂为SDS，根据本发明优选每摩尔SDS使用1-30mol，优选2-20mol，最优选3-6molNaOH或KOH，更优选NaOH，以裂解细胞。如果裂解缓冲液含有去污剂，根据本发明在步骤II)中还优选在每106细胞中存在0.01-100μmol，更优选0.1-50μmol，最优选0.25-5μmol去污剂时裂解细胞。当采用去污剂来裂解细胞时，如果所述去污剂是室温室压下为液体的化合物，则通常在存在0.005-5％(v/v)，更优选0.01-1％(v/v)，最优选0.025-0.5％(v/v)去污剂时裂解细胞，如果所述去污剂是室温室压下为固体的化合物，则通常在存在0.01-1重量％，更优选0.25-5重量％，最优选0.05-0.4重量％去污剂时裂解细胞。
优选的离液化合物尤其是离液盐。出于本发明的目的，离液盐优选表示对水有高亲和力(竞争力、吸引力)从而形成较大的紧密水化膜(hydrationenvelope)(外壳状的水分子)的盐。优选的离液盐尤其是异硫氰酸胍或盐酸胍，特别优选异硫氰酸胍。如果采用离液盐来裂解细胞，根据本发明的方法，优选在离液盐浓度为0.5-10mol/l，更优选为1-5mol/l，最优选为2-3.5mol/l时在方法步骤II)中裂解细胞。如果裂解缓冲液中含有离液盐，同样有利的是所述裂解缓冲液可任选含有与水混溶的有机溶剂，如与水混溶的醇如乙醇或异丙醇，其含量为10-60体积％，更优选20-50体积％。
优选的酶尤其是蛋白酶，其中更加优选胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶和内切蛋白酶Lys-C，最优选蛋白酶K。每种情况下基于裂解缓冲液的总重，裂解缓冲液中的酶浓度范围优选为0.01-10重量％，更优选0.1-5重量％，最优选0.2-1重量％。
裂解缓冲液中去污剂、离液盐或酶的浓度也取决于要裂解的细胞量和方法步骤I)中提供所述细胞的方式。如果要裂解的细胞首先被悬浮于悬浮缓冲液，则裂解缓冲液所含去污剂、离液盐或酶的浓度高于细胞裂解期间所需的所述组分的浓度。然后将这种富集的裂解缓冲液加入细胞悬液，加入量足以使所述细胞悬液中离液盐、去污剂或酶的浓度能够满足尽可能完全裂解细胞的需要，并如上文所述。然而，例如，如果裂解缓冲液被直接用于贴壁细胞或接触细胞团，则所述裂解缓冲液所含去污剂、离液盐或酶的浓度优选为细胞裂解期间存在的浓度。
根据本发明方法的一个具体实施方式，在存在0.1-1mol/l，更优选0.2-0.8mol/l，最优选0.3-0.7mol/l碱金属盐时裂解细胞，优选氯化钠、氯化钾和氯化锂，特别优选氯化钠。如果首先将要裂解的细胞悬浮于悬浮缓冲液，则适量的碱金属盐可以已经加入所述悬浮缓冲液，或者可将含有相对较高浓度碱金属盐的裂解缓冲液加入悬浮缓冲液。然而，例如，如果将裂解缓冲液直接用于贴壁细胞或接触细胞团，则所述裂解缓冲液优选含有上述浓度范围内的碱金属盐。
特别适用于本发明并可加入细胞悬液的裂解缓冲液是含有1-200mmol/l，更优选5-150mmol/l，最优选约10-100mmol/l NaOH以及0.01-1％(v/v)，更优选0.025-0.5％(v/v)，最优选0.05-0.4％(v/v)SDS，且pH范围为5-7，更优选约5.5的缓冲液。在细胞悬液中加入该裂解缓冲液的体积比优选为3∶1-1∶3，更优选为2∶1-1∶2，最优选的体积比为约1∶1。
特别适用于本发明并可加入细胞团、加入贴壁细胞或者加入组织切片或组织片段的裂解缓冲液是：
-含有0.1-1mol/l，更优选0.25-0.75mol/l，最优选约0.4-0.6mol/l NaCl以及0.1-10％(v/v)，更优选0.5-5％(v/v)，最优选0.75-1.5％(v/v)Triton X-100且pH范围为6-8，更优选约7的缓冲液，或
-含有0.5-10mol/l，更优选1-5mol/l，最优选约1.5-3mol/l异硫氰酸胍，1-50mmol/l，更优选5-40mmol/l，最优选10-20mmol/l柠檬酸钠以及10-60％(v/v)，更优选20-50％(v/v)，最优选30-40％(v/v)乙醇，且pH范围为6-8，更优选约7的缓冲液，
要加入待裂解细胞的所述裂解缓冲液的量优选为每106细胞50-2000μl，更优选100-1000μl，最优选150-300μl。
如果细胞存在于组织切片或组织片段中，则方法步骤I)中的提供细胞优选包括在从植物或动物中取出后使所述组织切片或所述组织片段立即接触液氮。然后优选使所述组织切片或组织片段立即接触裂解缓冲液，适当的话可通过合适的均化装置将其均化。
细胞在接触裂解缓冲液之后，可在15-40℃的温度范围内，然后尤其优选室温，将细胞裂解1-60分钟，更优选2-15分钟。
在方法步骤ii)中使细胞裂解物以水相P1的方式接触阴离子交换基质之前，根据本发明方法的一个具体实施方式，预先从细胞裂解物中分离出一种或多种不同于核酸(α1)的组分(α2)也是有利的。原则上，所述分离可采用熟练技术人员已知的任何分离方法，如沉淀反应、通过透析或色谱分离或者萃取，特别优选萃取，尤其是用酸性苯酚或苯酚与氯仿的混合物萃取，最优选用酸性苯酚萃取。这涉及使酸性苯酚与细胞裂解物接触并例如用涡漩搅拌器将其彻底混合，其体积比优选为3∶1-1∶3，更优选2∶1-1∶2，最优选约1∶1。然后将组合物离心并将水相与有机相分离。通过这种方法，一种或多种不同于核酸(α1)的组分便被稀释于分开的水相，然后将其作为相P1对其进行方法步骤ii)。
在本发明方法的方法步骤ii)中，然后使水相P1接触阴离子交换基质以使所述核酸(α1)结合于所述阴离子交换基质。
原则上，这里可以采用任何在水相P1接触阴离子交换基质的条件下，尤其在pH条件下具有至少部分阳离子形式官能团的材料作为阴离子交换基质。
阴离子交换基质优选含有电中性基质的固体。根据大小、形式、孔隙率、机械特性以及优选与固体骨架共价结合的正电官能团定义这种基质。三种最常用类型的基质材料是原硅酸、多糖和合成聚烯烃，采用的聚烯烃主要是聚苯乙烯或聚(甲基)丙烯酸树脂。聚(甲基)丙烯酸树脂包括各种取代的(甲基)丙烯酰胺的聚合物(＝聚(甲基)丙烯酰胺)和(甲基)丙烯酸酯的聚合物(＝聚(甲基)丙烯酸酯)，(甲基)丙烯酸单体在C-2或C-3原子上可带有烷基取代基。特别优选的结合于该基质的官能团是选自下组的官能团：伯、仲或叔氨基，膦基，肼基和亚胺基。最优选的阴离子交换基质是共价结合有二乙基氨基乙基(DEAE，[CH3CH2)2N-CH2-CH2-]a)的骨架材料，尤其是DEAE纤维素，以及含有[-CH2-CH2-NH-]基团和/或[-CH2-CH2-N(CH2CH2-NH2)-]基团的直链或支链的聚乙烯亚胺(polyethylenimines)。阴离子交换基质还可被用作填料，例如在单独的分离柱子中。然而，也可将其用作并非由具有阴离子交换特性的材料构成的其它材料-尤其是颗粒、滤器、膜、整料(monolith)或其它有机或无机表面如微滴定板一或具有阴离子交换基质的其它反应容器的涂层。
根据本发明，特别优选的阴离子交换基质的形式为磁性或非磁性颗粒上的涂层，然而尤其优选磁性，最优选超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性颗粒上的涂层。与非磁性颗粒相比，磁性颗粒的优势在于能形成磁性聚集体，使得它们能从水相P1中温和、迅速且有效地除去。
优选的可涂有阴离子交换基质的磁性颗粒购自，例如，丹尼尔公司(Dynal)，先进磁体公司(Advanced megnitics Inc.)，生物技术有限公司(BiotechnologiesLtd.)，爱美沙公司(Amersham)，帕玛咖公司(Promega)，赛金公司(Scigen)，先进遗传技术公司(Advanced Genetic Technologies)和斯莱利奥公司(Seradyn)。合适的磁性颗粒具体是WO-A-83/03920中描述的颗粒以及由挪威奥斯陆的丹尼尔公司(Dynal AS)以DYNA-BEADS出售的颗粒。如果采用的阴离子交换基质是聚乙烯亚胺，则尤其优选环氧化物官能化的磁性颗粒，例如以商品名“M-PVAE0x”购自德国贝斯威勒的切默更公司(Chemagen AG，Baesweiler，Germany)的那些颗粒。还可以使用羧酸酯官能化的颗粒，它们同样可以商品名“M-PVAC11”或“M-PVA C12”购自切默更公司。所述磁性颗粒的平均至今优选为0.1-100μm，更优选0.5-50μm，最优选1-10μm，而其比表面积范围优选为0.5-250m2/g，更优选为1-50m2/g。
根据本发明方法的一个具体实施方式，根据本发明，在方法步骤ii)中优选在pH优选为2-10，更优选为3-7，最优选为4-6时使核酸(α1)附着于阴离子交换基质。
如果用于方法步骤ii)的水相P1的pH不同于这些pH值，尤其当使用含有SDS的碱性裂解缓冲液时会遇到这种情况，在使水相P1接触阴离子交换基质之前或期间可能需要例如加入中和缓冲液来调节水相的pH到所需的值。所述中和缓冲液优选含有乙酸的碱金属盐，更优选乙酸钾，其浓度范围为10-10,000mmol/l，更优选为50-5000mmol/l，最优选为100-1000mmol/l，中和液的pH优选为2-8，更优选为4-6。优选通过加入乙酸将乙酸的碱金属盐溶液的pH调至上述范围。
根据本发明方法的一个具体实施方式，在方法步骤ii)中，还优选在存在碱金属盐，优选存在氯化钾、氯化钠或氯化锂，然而更优选存在氯化钠时使核酸(α1)附着于阴离子交换基质，附着期间所述碱金属盐的浓度范围优选为0.01-10mol/l，更优选为0.05-5mol/l，最优选为0.25-0.75mol/l。可通过在最初加入的水相P1(例如细胞裂解物)中加入适当浓缩的盐溶液，或者通过在存在悬浮缓冲液时悬浮细胞或在存在裂解缓冲液时裂解细胞，这两种缓冲液都具有合适的盐浓度，从而调节附着期间这些盐的浓度。
根据本发明方法的另一个具体实施方式，在方法步骤ii)中，还优选在存在离液物质，尤其是离液盐如异硫氰酸胍时使核酸(α1)附着于阴离子交换基质，附着期间所述离液盐的浓度优选为0.1-10mol/l，更优选为0.5-5mol/l，最优选为1-3mol/l。在本发明方法的这个具体实施方式中，在存在与水混溶的有机溶剂，尤其是存在浓度为10-70体积％，更优选20-60体积％的醇类如乙醇或异丙醇时进行附着也是有益的。
在方法步骤ii)中，当使用阴离子交换基质作为柱填料时，优选使水相P1通过柱材料以便使核酸(α1)附着于阴离子交换基质，所述水相P1如细胞裂解物，其具有上述有利pH条件并含有规定浓度的上述盐，通过时的温度优选为1-30℃，更优选2-25℃，例如室温。适当时，可通过过压、真空、离心或通过毛细管力支持使水相P1通过柱材料。
当采用涂有阴离子交换基质的颗粒时，进行附着时优选连续搅拌与颗粒接触的水相P1，例如通过振荡器搅拌，此时，所述附着也优选在温度约为1-30℃，更优选为2-25℃，例如在室温下进行。
在核酸(α1)已附着于阴离子交换基质之后，在方法步骤iii)中可任选地通过洗涤缓冲液洗涤后者。如果阴离子交换基质已被用作柱填料，则优选使洗涤缓冲液通过柱子进行洗涤，这里还可以采用过压、真空、离心或毛细管力。例如，如果采用涂有阴离子交换基质的非磁性颗粒，则首先通过例如过滤或离心将所述颗粒从水相P1中除去，然后用洗涤缓冲液洗涤。当采用涂有阴离子交换基质的磁性颗粒时，优选使含有与水相P1接触的磁性颗粒的反应容器暴露于磁体，使所述磁性颗粒在磁场作用下附着于反应容器内壁，从而进行洗涤。在这些条件下可方便地除去水相P1并用洗涤缓冲液代替。适用于该过程的装置可购自，例如，挪威奥斯陆的丹尼尔公司。
洗涤缓冲液例如可以是不含RNA酶的水，水和水溶性有机溶剂的混合物，如水和1-80体积％的水溶性醇，例如和1-80体积％的乙醇或异丙醇的混合物，或是盐的水溶液，尤其是乙酸盐水溶液，例如乙酸钠水溶液，该溶液的浓度为1-50mmol/l，更优选5-25mmol/l，尤其优选所述洗涤缓冲液的pH为4-9。
洗涤步骤可按需重复一次、两次、三次，适当时甚至更多次，每次都采用新鲜的洗涤缓冲液。
在方法步骤ii)中使核酸(α1)附着于阴离子交换基质并在方法步骤iii)中任选洗涤之后，在方法步骤iv)中可将结合于阴离子交换基质的核酸(α1)从阴离子交换基质上除去，得到含有核酸(α1)的流体相，优选水相P2。
所述除去优选通过洗脱使阴离子交换基质接触能解除阴离子交换基质的官能团与核酸(α1)之间的结合的洗脱缓冲液来进行，得到的洗出液为流体相P2，其含有核酸(α1)。
如果阴离子交换基质被用作柱填料，则优选使洗脱缓冲液流过该柱来进行洗脱，还可以利用过压、真空、离心或毛细管力。例如，如果采用涂有阴离子交换基质的非磁性颗粒，则例如先通过过滤或离心从水相P2或从洗涤缓冲液中除去这些颗粒，然后与洗脱缓冲液接触。当采用涂有阴离子交换基质的磁性颗粒时，优选使含有与水相P1或洗涤缓冲液接触的磁性颗粒的反应容器暴露于磁体，使所述磁性颗粒在磁场作用下附着于反应容器内壁，从而进行洗涤。在这些情况下可方便地除去水相P1或洗涤缓冲液并用洗涤缓冲液代替。
所述洗脱缓冲液优选是盐的水溶液，尤其是含有碱金属卤化物如NaCl、KCl或LiCl，碱土金属卤化物如CaCl2或MgCl2，铵盐如氯化铵或硫酸铵，或者这些盐中至少两种的混合物的水溶液，所述洗脱缓冲液还可以任选含有缓冲系统如碱金属乙酸盐/乙酸或者基于三(羟基甲基)氨基甲烷的缓冲系统。
根据本发明方法的一个具体实施方式，洗脱缓冲液含有水溶性钙盐如CaCl2，水溶性镁盐如MgCl2，水溶性铵盐如硫酸铵或氯化铵，或者这些盐中至少两种的混合物。如果洗脱缓冲液含有CaCl2，则该盐的浓度优选为1-1000mmol/l，更优选为5-500mmol/l，最优选为10-100mmol/l。如果所述洗脱缓冲液含有MgCl2，则该盐的浓度优选为1-1000mmol/l，更优选为5-500mmol/l，最优选为10-100mmol/l。如果所述洗脱缓冲液含有硫酸铵和/或氯化铵，则这些盐的总浓度优选为1-1000mmol/l，更优选为5-500mmol/l，最优选为20-300mmol/l。洗脱缓冲液的pH优选为5-12，优选为6-10，更优选为7-10。
所述洗脱缓冲液优选只含钙盐，尤其是CaCl2，和/或铵盐，优选硫酸铵和/或氯化铵，这是因为相比tRNA这些盐特别适合选择性富集miRNA。从而通过采用由水和CaCl2构成的洗脱缓冲液以及使用由水和硫酸铵或氯化铵构成的洗脱缓冲液可以良好富集miRNA并同时稀释tRNA，CaCl2的浓度优选最高达60mmol/l，硫酸铵或氯化铵的浓度优选最高达170-200mmol/l，且因此，这些洗脱缓冲液特别适合从含有miRNA和tRNA的组合物中选择性富集miRNA。
特别适用于本发明的洗脱缓冲液是：
-洗脱缓冲液EP1，其含有1-10000mmol/l，更优选10-5000mmol/l，最优选50-1000mmol/l TRIS，1-1000mmol/l，优选5-800mmol/l，最优选10-500mmol/l碱金属盐，优选NaCl或KCl，1-400mmol/l，更优选10-300mmol/l，最优选50-200mmol/l铵盐，优选硫酸铵或氯化铵，以及0.1-200mmol/l，更优选0.5-100mmol/l，最优选1-50mmol/l镁盐，优选氯化镁，都溶于水，且pH优选为7-11，更优选8-10；
-洗脱缓冲液EP2，其含有1-1000mmol/l，更优选5-500mmol/l，最优选10-100mmol/l镁盐，优选氯化镁，溶于水，且pH优选为6-10，更优选7-9；
-洗脱缓冲液EP3，其含有1-1000mmol/l，更优选5-500mmol/l，最优选10-100mmol/l钙盐，优选氯化钙，溶于水，且pH优选为6-10，更优选7-9；
-洗脱缓冲液EP4，其含有1-1000mmol/l，更优选5-500mmol/l，最优选20-300mmol/l铵盐，优选氯化铵或硫酸铵，溶于水，且pH优选为6-10，更优选7-9；
-洗脱缓冲液EP5，其含有1-2000mmol/l，更优选10-1000mmol/l，最优选100-500mmol/l碱金属盐，优选氯化钾、氯化钠或氯化锂，都溶于水，且pH优选为6-10，更优选7-9。
更具体地说，洗脱缓冲液EP1-EP4适合从含有miRNA和tRNA的组合物中纯化miRNA，而洗脱缓冲液EP5特别适合从含有除长度小于300个核苷酸的核酸，尤其是小于100个核苷酸的核酸外还含有长链核酸的组合物中大致纯化所述核酸。此外，还可以通过升高洗脱缓冲液EP2-EP4中Mg2+、Ca2+和NH4 +的浓度来选择性调节从含有miRNA和tRNA的组合物中富集的miRNA对tRNA的富集度。
根据本发明方法的一个具体实施方式，基于所述相P2中RNA总量的所述相P2中长度小于300个核苷酸，优选小于100个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的RNA的相对量比基于所述相P1中RNA总量的所述相P1中长度小于300个核苷酸，优选小于100个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的RNA的相对量优选大至少2倍，更优选至少4倍，再优选至少6倍，再优选至少10倍，最优选至少20倍。
在本发明方法的其它具体实施方式中，尤其是采用洗脱缓冲液EP1-EP4中任何一种的实施方式中，基于水相P2中miRNA和tRNA总量的水相P2中miRNA的相对量比基于水相P1中miRNA和tRNA总量的水相P1中miRNA的相对量优选大至少2倍，更优选至少4倍，再优选至少6倍，再优选至少10倍，最优选至少20倍。
一种用于富集长度小于300个核苷酸，优选小于100个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸的试剂盒也为解决一开始提到的问题做出了贡献，所述试剂盒中装有：
(β1)裂解缓冲液或裂解缓冲液浓缩物，
(β2)阴离子交换基质，
(β3)洗脱缓冲液，
(β4)任选的悬浮缓冲液，
(β5)任选的中和缓冲液，
(β6)任选的洗涤缓冲液，和
(β7)任选的提取剂，例如苯酚、醇如乙醇，或其混合物。
这种试剂盒可用于进行上述方法。
优选的悬浮缓冲液(β4)、裂解缓冲液(β1)、中和缓冲液(β5)、洗涤缓冲液(β6)和洗脱缓冲液(β3)是上文描述的可与本发明方法有关的优选缓冲液的那些缓冲液。裂解缓冲液浓缩物是含有可有效裂解的化合物，尤其是去污剂或离液盐的缓冲液，其浓度高于细胞裂解期间的浓度。如果要将细胞悬液用作分离短链核酸的原料，则这种类型的裂解缓冲液浓缩物尤其有用，可通过加入规定量的所述裂解缓冲液浓缩物来调节裂解所需的裂解条件。
适合作为阴离子交换基质(β2)的是上述作为富集核酸的本发明方法中的优选阴离子交换基质的类似材料，尤其例如涂有阴离子交换基质的磁性或非磁性颗粒。
根据本发明试剂盒的一个具体实施方式，所述试剂盒含有涂有阴离子交换基质的磁性颗粒作为阴离子交换基质(β2)以及选自EP1、EP2、EP3或EP4中的任何缓冲液作为洗脱缓冲液(β3)。
此外，将上述试剂盒用于本发明的方法以纯化长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸也为解决一开始提到的问题做出了贡献。
将阴离子交换基质用于纯化长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸也为解决一开始提到的问题做出了贡献，其中，所述阴离子交换基质和所述核苷酸优选为一开始提到的作为纯化核酸的本发明方法的优选组分的那些化合物。
最后，一种治疗疾病的方法也为解决一开始提到的问题做出了贡献，所述方法包括以下步骤：
(γ1)根据开头描述的纯化方法，通过包括富集长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸的诊断方法诊断疾病，和
(γ2)治疗性处理诊断出的疾病。
要治疗的疾病可以是其病因或进程以任何方式与特定体细胞或体液中存在的核酸的种类和数量相关的任何疾病，所述核酸的长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸，且尤其是与miRNA的种类和数量相关的疾病，与健康人相比，无论是这些核酸种类和数量的改变都是造成疾病的原因，或者与健康人相比，无论是这些核酸种类和数量的改变都是所述疾病的结果。
将根据非限制性的附图和实施例更加详细地阐述本发明。
图1描述了用于分离实施例1所得洗出液的硝酸银染色的、浓度为15％的聚丙烯酰胺凝胶(一式两份用于凝胶；a＝第一次洗涤后的洗涤缓冲液，b＝第二次洗涤后的洗涤缓冲液，c＝洗出液)。
图2描述了用于分离实施例2所得洗出液的硝酸银染色的、浓度为15％的聚丙烯酰胺凝胶(一式两份用于凝胶)。
图3描述了用于分离实施例3所得洗出液的硝酸银染色的、浓度为15％的聚丙烯酰胺凝胶(一式两份用于凝胶)。
图4描述了用于分离实施例4所得洗出液的硝酸银染色的、浓度为15％的聚丙烯酰胺凝胶(一式两份用于凝胶)。
图5描述了用于分离实施例5所得洗出液的硝酸银染色的、浓度为15％的聚丙烯酰胺凝胶(一式两份用于凝胶)。
实施例
在以下实施例中，miRNA在细胞背景中形成尖峰。
实施例1
将106个Jurkat细胞与1μg miR177反义miRNA混合并在550μl含0.5MNaCl，1％(v/v)Triton X-100的裂解缓冲液的帮助下裂解细胞。冰上培育10分钟之后加入550μl酸性苯酚。涡漩搅拌，然后20800×g离心5分钟，将水相除去并与652μg涂有聚乙烯亚胺的磁性颗粒混合。
将4g环氧化物官能化磁性颗粒(购自德国贝斯威勒的切默更公司的M-PVA E0x颗粒)悬浮于50ml 10％高分子量聚乙烯亚胺(西格玛奥尔德利希公司(Sigma-Aldrich)，Aldrich编号40，872-7)的水溶液，pH10，转移至圆底烧瓶并在60℃边搅拌边加热10小时，从而获得颗粒。然后解除磁性，用脱盐水将该混合物洗涤6次。
在平板振荡器上振荡5分钟之后，弃去上清液，之后用500μl水洗涤2次，将pH调至4.7、5.5、7.0或8.5(图1凝胶的a和b道)。用20μl含1mol/l Tris/Cl，pH9.5，400mmol/l KCl，100mmol/l硫酸铵和30mmol/l MgCl2的缓冲液进行洗脱。在15％聚丙烯酰胺凝胶上加入等分洗出液并用硝酸银染色(图1的c道)。
采用0.5mol/l NaCl作为裂解缓冲液，它可以有效纯化miRNA，使洗脱后的洗出液中仅保留miRNA和tRNA，而所有其它核酸类型都已通过纯化过程被稀释。
实施例2
如实施例1所述，将106个Jurkat细胞与1μl let7a反义RNA混合，裂解并结合于磁性颗粒。用水洗涤两次之后，用20μl含100mmol/l NaCl，250mmol/lNaCl，400mmol/l NaCl，100mmol/l KCl，250mmol/l KCl和400mmol/l KCl的缓冲液作为洗脱缓冲液进行洗脱。在15％聚丙烯酰胺凝胶上加入等分洗出液并用硝酸银染色(图2)。
该实验揭示，洗脱时可采用不同摩尔浓度的盐。当采用NaCl、KCl和LiCl(数据未显示)作为洗脱缓冲液时，可以高产量地同时纯化tRNA和miRNA。
实施例3
其过程如实施例2所述，用含10-100mmol/l MgCl2的缓冲液作为洗脱缓冲液。在15％聚丙烯酰胺凝胶上加入等分洗出液并用硝酸银染色(图3)。
该实验证实，用MgCl2作为洗脱缓冲液也可纯化miRNA。如果采用低摩尔浓度的MgCl2作为洗脱缓冲液，则可相当地稀释tRNA和较长核酸，同时可以非常好的产率回收miRNA。
实施例4
其过程如实施例2所述，用含10-85mmol/l CaCl2的缓冲液作为洗脱缓冲液。在15％聚丙烯酰胺凝胶上加入等分洗出液并用硝酸银染色(图4)。
当CaCl2的摩尔浓度最高达约50mmol/l时，可以非常好的回收率洗脱miRNA，同时洗出液中仅含有痕量tRNA。如果进一步升高摩尔浓度，还有可能以良好的回收率洗脱tRNA。
实施例5
其过程如实施例2所述，用含25-400mmol/l硫酸铵或25-400mmol/l氯化铵的缓冲液作为洗脱缓冲液。在15％聚丙烯酰胺凝胶上加入等分洗出液并用硝酸银染色(图5)。
尤其是铵盐，与氯化钙一起，在洗脱时显示出最佳特性，可实现高的miRNA产率同时获得非常低的tRNA产率。当洗脱液中的铵盐浓度最高达约170-200mmol/l时，tRNA的产率仍旧相对较低，而这些摩尔浓度下miRNA的产率非常好。当浓度升高到约400mmol/l时，在洗出液中也可发现非常大量的tRNA。

Claims (29)

1.一种富集长度小于300个核苷酸的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供流体相，优选水相，P1，其中含有
(α1)至少一种长度小于300个核苷酸的核酸，和
(α2)至少一种不同于所述核酸(α1)的组分，
ii)使所述相P1接触阴离子交换基质以使所述核酸(α1)结合于阴离子交换基质上，
iii)任选地用洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换基质，其中所述核酸(α1)仍旧结合于阴离子交换基质，和
iv)从所述阴离子交换基质上除去，优选洗脱，结合于阴离子交换基质的核酸(α1)以获得含有核酸(α1)的流体相，优选水相，P2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸(α1)是RNA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述RNA选自下组：miRNA，前miRNA，siRNA，snRNA，snoRNA，tRNA，5S-rRNA，5.8S-rRNA，或其中至少两种的混合物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述RNA是miRNA、前miRNA、tRNA或者miRNA和tRNA的混合物。
5.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换基质具有选自下组的官能团：氨基、膦基，肼基和亚胺基。
6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换基质以颗粒、过滤器、膜、整料、微滴定板或其它反应容器上涂层的形式存在。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述颗粒是磁性颗粒，优选超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性颗粒。
8.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸(α1)在存在0.01-10 mol/l NaCl时在方法步骤ii)中结合于所述阴离子交换基质。
9.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液是不含RNA酶的水。
10.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，方法步骤iv)中的分离通过洗脱缓冲液进行。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含有水溶性钙盐、水溶性镁盐、水溶性铵盐或其混合物。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含有浓度为1-1000mmol/l的氯化钙。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含有浓度为1-1000mmol/l的氯化镁。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含有浓度为1-1000mmol/l的硫酸铵或氯化铵。
15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，方法步骤i)中提供的水相P1是细胞裂解物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解物可通过包括以下步骤的方法获得：
I)提供细胞，
II)裂解细胞以获得细胞裂解物，和
III)任选地从所述细胞裂解物中至少部分地分离至少一种不同于核酸(α1)的组分(α2)。
17.如权利要求2-16中任一项所述的方法，其特征在于，基于所述相P2中RNA总量的所述相P2中长度小于300个核苷酸的RNA的相对量比基于所述相P1中RNA总量的所述相P1中长度小于300个核苷酸的RNA的相对量大至少2倍。
18.如权利要求4-17中任一项所述的方法，其特征在于，基于水相P2中miRNA和tRNA总量的水相P2中miRNA的相对量比基于水相P1中miRNA和tRNA总量的水相P1中miRNA的相对量大至少2倍。
19.一种用于富集长度小于300个核苷酸的核酸的试剂盒，其中装有：
(β1)裂解缓冲液或裂解缓冲液浓缩物，
(β2)阴离子交换基质，
(β3)洗脱缓冲液，
(β4)任选的悬浮缓冲液，
(β5)任选的中和缓冲液，
(β6)任选的洗涤缓冲液，和
(β7)任选的提取剂。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述阴离子交换基质(β2)具有选自下组的官能团：氨基，膦基，肼基和亚胺基。
21.如权利要求19或20所述的试剂盒，其特征在于，所述阴离子交换基质(β2)以颗粒、过滤器、膜、整料或微滴定板上涂层的形式存在。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述阴离子交换基质(β2)以磁性颗粒，优选超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性颗粒上涂层的形式存在。
23.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱缓冲液(β3)含有浓度为1-1000mmol/l的氯化钙。
24.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱缓冲液(β3)含有浓度为1-1000mmol/l的氯化镁。
25.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱缓冲液(β3)含有浓度为1-1000mmol/l的硫酸铵或氯化铵。
26.权利要求19-25中任一项所述的试剂盒在富集长度小于300个核苷酸的核酸中的用途。
27.权利要求19-25中任一项所述的试剂盒在权利要求1-18中任一项所述方法中的用途。
28.阴离子交换基质在富集长度小于300个核苷酸的核酸中的用途。
29.一种治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(γ1)按照如权利要求1-18中任一项所述的方法，用包括富集长度小于300个核苷酸的核酸的诊断方法诊断疾病，和
(γ2)治疗性处理诊断出的疾病。
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