CN101311188A - 人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人乙酰肝素酶小分子多肽抑制剂的氨基酸序列及一组具有人乙酰肝素酶小亚基(8kD)结合活性的小肽，属于生物医学领域。抑制人乙酰肝素酶活性的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末端为序列表SEQIDNO.1。在表达并纯化人乙酰肝素酶小亚基的基础上，以人乙酰肝素酶小亚基为靶标筛选噬菌体展示随机环七肽库，得到一种一致氨基酸序列，此小肽具有抑制高转移性肿瘤细胞体外侵袭活性。另外，还得到了一组具有人乙酰肝素酶小亚基结合活性的小肽。本发明的优点是：这些小肽在肿瘤的导向治疗方面具有潜在的医学价值。

Description

人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制剂

技术领域

本发明涉及一种人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制剂及其在肿瘤治疗中的应用，属于生物医学领域。

背景技术

肿瘤的侵润和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。癌细胞的转移需要突破胞外基质及围绕血管的基底膜等屏障，这些屏障主要是由一类硫酸乙酰肝素碳水化合物的纤维网络中包埋的蛋白质构成。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)正是参与细胞外基质及基底膜降解而帮助癌细胞转移的关键酶。HPA在肿瘤转移中的作用可概括如下：(1)降解胞外基质和基底膜，破坏细胞侵袭的屏障；(2)降解内皮基底膜，促进新生血管生成；(3)释放结合在HS侧链上的生长因子，促进肿瘤细胞生长。

HPA是裂解胞外基质(extracellular matrix，ECM)和细胞基底膜(basementmembrane，BM)中乙酰硫酸肝素盐蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycan，HSPG)上的硫酸乙酰肝素盐(heparin sulphate，HS)侧链的内源葡萄糖醛酸酶的统称。HSPGs由一个蛋白核心通过共价键与HS结合组成的糖氨聚糖，是细胞的自身结构、不溶性的细胞外基质成分以及细胞的粘附、运动所必不可少的重要成分。HS与胞外基质中的大分子，如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白均有作用，且在细胞膜上有不同的结合位点。HPA的作用就是切割HS侧链导致细胞基底膜和胞外基质的降解，解除肿瘤细胞侵袭的屏障；并从胞外基质释放HS结合型活性碱性成纤维生长因子(bEGF)，促进肿瘤新生血管的生成，为肿瘤的生长转移提供非常便利的物质基础和通道；此外还可能促进组织特异性生长因子的释放，参与肿瘤细胞转移和器官组织特异性的选择。

HPA的表达与肿瘤细胞转移潜能密切相关。实验证明，无转移性的乳腺癌细胞MCF-7不具有乙酰肝素酶活性，中度和高转移性的乳腺癌细胞MDA231、MDA435s分别具有中度和高度的HPA活性。高转移性的鼠T淋巴瘤细胞Esb具有很高的HPA活性，而无转移性Esb细胞则不具有HPA活性，Esb细胞转染了HPA基因后表现出很高的HPA活性，将其注射到DAB/2小鼠中，可使其出现肝和肺的广泛转移，生存率明显降低，这提供了HPA促进肿瘤转移的直接证据。另有报道肿瘤病人的血清、尿液中HPA活性增高，这对肿瘤转移的早期诊断、药物效果及预后预测具有重要的意义。

目前已发现多种HPA的抑制剂，Parish报道用磷酸甘露戊糖硫酸酯(PI-88)处理乳腺癌细胞株13762MAT后注入大鼠能使其肺癌形成率降低90％，还能将原发性肿瘤的血管供应降低30％，使其生长降低一半。该药已成功完成I期临床试验，当前正试用于肿瘤患者的治疗。其他抑制剂还有硫酸昆布多糖(sulfated laminarin)、硫酸壳多糖、SdC28、Ca2SP、苏拉明等，但由于分子大小、毒性、不均一性结构以及多重生物学效应等原因导致它们不能应用于临床。因此，特异性已成为设计和寻找HPA抑制剂的关键。

目前，大多数学者认为，在HPA翻译后加工过程中，N端信号肽(Met1-Ala35)被切除，形成HPA酶原前体；在酶原激活过程中，特异性蛋白水解酶将第110-157位氨基酸组成的6kD肽链从前体蛋白中切割下来，余下N-端的8kD小亚基(Gln36-Glu109)与C-端的50kD大亚基(Lys158-Ile543)以非共价键结合形成异源二聚体，成为有活性的成熟蛋白。Zetser等应用HPA C-端大亚基单抗，仅部分抑制HPA的活性，并据此认为N-端8kD小亚基参与构成酶活性中心。McKenzie等构建表达了一系列HPA蛋白缺失体，确定了N-端8kD小亚基的存在对HPA酶活性是必需的。

噬菌体展示随机多肽库技术以噬菌体表面展示(phage display)技术为基础，即将外源蛋白或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒表面，可保持相对独立的空间构象和生物活性。目前这种技术已广泛用于抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物开发等多个方面。这项技术通过“吸附-洗脱-扩增”多轮亲和筛选过程，可以将展示特异性外源肽的噬菌体从噬菌体库中筛选出来，经多轮筛选扩增可以富集10³——10⁸倍，因此很容易对所筛选的克隆进行基因序列测定，最终确定展示外源肽的氨基酸序列。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：利用噬菌体展示随机多肽库技术，以人HPA小亚基为靶标，筛选具有HPA抑制活性的小分子多肽，并用于肿瘤的治疗，或作为先导化合物设计HPA特异性抑制剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种具有抑制人乙酰肝素酶活性的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末端为：K-H-T-H-H-K-H。

一组具有人乙酰肝素酶8kD小亚基结合活性的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末端为：C7-1、K H T H H K H(SEQ ID No.1)

C7-2、 K H I H K H Y(SEQ ID No.2)

C7-3、 N H T H H K H(SEQ ID No.3)

C7-4、 P Q D P R L M(SEQ ID No.4)

C7-5、 Q R M N P D S(SEQ ID No.5)

C7-6、 K H V T A H E(SEQ ID No.6)

C7-7、 S H H H W R K(SEQ ID No.7)

C7-8、 H K H T S T L(SEQ ID No.8)

C7-9、 H F T P Q N P(SEQ ID No.9)

C7-10、P G T P R M A(SEQ ID No.10)。

编码上述小肽(SEQ ID No.1-SEQ ID No.10)的基因序列。这些序列根据本领域的公知常识可以有若干种，无论是普通的序列还是某些表达宿主偏好的序列，只要其编码上述小肽，均属于本发明的保护范围。以下仅举例说明上述小肽的编码基因，并非对本发明的限制：

C7-1. AAG CAT ACT CAT CAT AAG CAT(SEQ ID No.11)

C7-2. AAG CAT ATT CAT AAG CAT TAT(SEQ ID No.12)

C7-3. AAC CAT ACT CAT CAT AAG CAT(SEQ ID No.13)

C7-4. CCG CAG GAT CCT CGG CTG ATG(SEQ ID No.14)

C7-5. CAG CGT ATG AAT CCG GAT AGT(SEQ ID No.15)

C7-6. AAG CAT GTT ACT GCG CAT GAG(SEQ ID No.16)

C7-7. TCG CAT CAT CAT TGG CGG AAG(SEQ ID No.17)

C7-8. CAT AAG CAT ACG TCG ACT TTG(SEQ ID No.18)

C7-9. CAT TTT ACG CCT CAG AAT CCG(SEQ ID No.19)

C7-10.CCT GGG ACT CCT CGT ATG GCG(SEQ ID No.20)

所述小肽均为环七肽，其N末端和C末端均具有一个半胱氨酸，在非还原条件下自动形成二硫键，成环七肽。

所述小肽(SEQID No.1-SEQ ID No.10)作为肿瘤导向治疗的载体。

所述小肽(SEQID No.1-SEQ ID No.10)作为乙酰肝素酶抑制剂治疗肿瘤的方法。

本发明通过表达、纯化、透析复性得到浓度达1.9mg/mL，纯度达98％以上的人HPA小亚基(8kD)蛋白；然后以人HPA小亚基为靶分子筛选噬菌体表面展示环七肽库，通过ELISA鉴定与噬菌体单链DNA测序，得到了10种与人HPA小亚基蛋白结合活性较高的环七肽(现有技术可人工合成这些小肽序列)。通过重组基底膜体外侵袭实验检测环七肽的活性，试验结果表明，C7-1能够抑制人肝癌细胞株HepG-2的体外侵袭活性。此外，所得的与人HPA小亚基蛋白结合活性较高的环七肽在肿瘤导向治疗方面有潜在的应用价值。

肿瘤导向治疗是肿瘤生物学治疗的一种，1975年杂交瘤技术的出现和发展，使人们对以单克隆抗体为载体的“生物导弹”来治疗肿瘤给予很大希望，但到目前为止，尚未有成功的报道。究其原因，主要包括以下几点：①鼠单抗或鼠-人嵌合抗体往往容易在人体内诱发针对抗鼠抗体或康独特型(isiotype)的免疫应答；②抗体或抗体片段是一种生物大分子，体内药物代谢复杂；③抗体分子的穿透性差，不易穿透肿瘤细胞膜将药物有效的富集，而是滞留于血液循环中，破坏正常组织，从而失去了“导向”的意义。

小分子导向载体的寻找和应用可能为解决上述问题提供新的途径。与抗体或抗体片段相比，小分子载体由于分子较小(分子量1000-2000kD)，组织穿透性好，而且不易在体内诱发免疫应答。而噬菌体展示随机肽库为筛选小分子导向工具提供了一种有效的方法，已经在动物实验中取得了较理想的效果。如前所述，HPA是抑制肿瘤转移药物筛选的一个独具优势的靶点，因此，以HPA小亚基为靶分子筛选噬菌体展示随机肽库，可望获得用于肿瘤导向治疗的小分子载体。

本发明的优点：本发明的小肽在肿瘤的导向治疗方面具有潜在的医学价值。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为重组表达载体pET24a(+)-HPA小亚基(8kD)的构建图谱。

图2为IPTG诱导表达HPA小亚基(8kD)蛋白的SDS-PAGE分析图谱：1.诱导前；2.诱导后；3.诱导前；4.诱导后；5.Marker。

图3为HPA小亚基(8kD)蛋白表达形式的SDS-PAGE分析图谱：1.HPA小亚基超声上清；2.HPA小亚基超声沉淀；3.低分子量蛋白marker。

图4为人HPA小亚基纯化的SDS-PAGE分析图谱：1.Marker；2.穿过峰；3.50mM咪唑洗涤液；4-5.300mM咪唑洗脱下的HPA小亚基蛋白。

图5为人HPA小亚基透析复性的SDS-PAGE分析图谱：1.Marker；2.低浓度样品透析前；3.低浓度样品透析后上清；4.低浓度样品透析后沉淀；5.高浓度样品透析前；6.高浓度样品透析后上清；7.高浓度样品透析后沉淀。

图6为人HPA小亚基透析复性的SDS-PAGE薄层扫描分析图谱。

图7为具有与人HPA小亚基结合活性的小肽序列：C7-1～C7-2为环七小肽，氨基酸序列从左到右为N端到C端。

图8为噬菌体单克隆样品与人HPA小亚基结合活性的ELISA检测结果。

图9-1和图9-2为C7-1和C7-2环化前后质谱图，其中S001-1-MS为本发明C7-1；S002-1-MS为本发明C7-5。

图10为C7-1和C7-2纯化图谱。

图11为不同浓度的C7-1对HepG-2细胞侵袭能力的影响。

具体实施方式

实施例1：人乙酰肝素酶8kD小亚基的克隆与表达

一.构建表达载体：

应用PCR方法(引物P1：GGAATTCCATATGCAGGACGTCGTGGACCT(引入Ned I酶切位点)(SEQ ID No.21)和P2：CCGCTCGAGTTCCTTCTTGGGATCG(引入Xho I酶切位点)(SEQ IDNo.22)。

反应体系：

2×GC Buffer I    25μl

TaKaRa LA Taq     0.5μ1

dNTP Mixture      8μl

模板              1μl

上游引物          1.5μl

下游引物          1.5μl

灭菌水补充体积至  50μl

反应条件：94℃预变5min，然后进行30个循环，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min)从含有HPA 8kD的质粒(含pGEX-HPA8kD质粒的BL21(DE3)工程菌株由本室构建保存，其中pGEX-2PK载体为GE Healthcare公司产品，pGEX-HPA 8kD质粒见李燕杰；李吉学；凌焱；汤国营；宋子博；林艳丽；朱厚础；肿瘤转移关键酶：人乙酰肝素酶氨基端亚基的表达纯化及鉴定，军事医学科学院院刊，Bulletin of The Academy of Military(Medical Sciences)，2005年6月29卷03期：PP236-240)中扩增人HPA小亚基目的基因，然后经酶切、连接构建人HPA小亚基表达载体pET24a(+)-HPA(8kD)质粒(pET24a(+)为Novagen公司产品)(图1)。

二.转化诱导表达：

转化本室保存的大肠杆菌RosettaTM感受态(Novagen公司产品)，菌种按1％接种到Kan+-LB中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀在0.8左右，加入终浓度1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶，赛百盛公司产品)诱导，37℃200rpm继续培养4小时，经SDS-PAGE分析，目的蛋白成功表达(图2)。

三.目的蛋白的纯化：

4℃，10000rpm离心15min，收集菌体，-20℃反复冻融后用PBS重悬后冰浴超声破碎10min，离心(条件同上)，SDS-PAGE分析，人HPA小亚基以包涵体形式存在(图3)。沉淀用3M尿素-PBS重悬，离心(条件同上)，弃上清，沉淀用8M尿素-PBS溶解，离心(条件同上)，收集上清液。将上清液上样于Histrap FF金属螯合层析柱(Amersham Biosciences公司产品)，纯化(条件：按照HisTrap FF金属螯合层析柱说明书操作。具体过程如下：

(1)5倍柱床体积的EDTA-2Na

(2)5倍柱床体积的8M脲-PB缓冲液

(3)5倍柱床体积的ddH₂O

(4)3倍柱床体积的NiSO₄溶液

(5)5倍柱床体积的ddH₂O

(6)3倍柱床体积的平衡缓冲液

(7)上样

(8)5倍柱床体积的平衡缓冲液

(9)洗脱缓冲液进行洗脱

(10)收集洗脱液

得到电泳纯的人HPA小亚基蛋白(图4)。将纯化的高浓度与低浓度目的蛋白分别加入终浓度为10mM的DTT(二硫苏糖醇，Amresco公司产品)，分别对6M脲-0.1MNaHCO3-0.75M NaCl(1mM GSSG-0.1mM GSH)(GSH(谷胱甘肽还原型)、GSSG(谷胱甘肽氧化型))均为罗氏公司产品)、4M脲-0.1M NaHCO₃-0.5M NaCl(1mM GSSG-0.1M GSH)、2M脲-0.1M NaHCO3(1mM GSSG-0.1mM GSH)、1M脲-0.1M NaHCO3(1mMGSSG-0.1mM GSH)、0.5M脲-0.1M NaHCO3(1mM GSSG-0.1mM GSH)充分透析复性，透析过程中，均4℃不断搅拌，每种尿素浓度均透析7h以上；最后更换三次0.1M NaHCO3(pH 8.6)，均4℃不断搅拌12h；透析结束，将样品4℃离心(12000rpm，15min)，取上清，沉淀用等体积8M脲-0.1M NaHCO3(pH 8.6)重悬，SDS-PAGE分析复性效果(图5)，复性后的蛋白可溶性良好。

通过薄层凝胶扫描分析，复性后的人HPA小亚基蛋白纯度达到98％以上(图6)。Folin-酚法测蛋白浓度，目的蛋白浓度达1.9mg/mL。复性后目的蛋白浓度和纯度均可以用作靶蛋白进行后续的噬菌体库筛选工作。

实施例2：人HPA小亚基抑制剂的筛选

一.在得到纯度和浓度均符合要求的人HPA小亚基的基础上，以人HPA小亚基为靶分子筛选噬菌体展示随机环七肽库(New England Biolabs公司试剂盒产品)，经五轮筛选，回收率约增加了10³倍。从最后一轮筛选的平板上，随机挑取150个噬菌斑于对数生长期的ER2738培养物(New England Biolabs公司试剂盒产品)中，37℃剧烈振荡培养4.5h后4℃离心取上清，保存噬菌体原种，再分别制备150个相应的单克隆样品，ELISA检测挑选阳性克隆，提取噬菌体单链DNA，送出测序。根据DNA测序结果，推断出相应的结合肽氨基酸序列，共得到了10种人HPA小亚基结合肽(图7)。

二.通过ELISA方法得到10种与人HPA小亚基结合力很强的噬菌体

1.包被：用浓度为100μg/mL的HPA小亚基(溶于0.1M的NaHCO₃，pH 8.6)包被酶联板，100μL/孔，同时每个待鉴定克隆均包被一个对应的包被液(0.1MNaHCO₃，pH 8.6)孔作为阴性对照，设包被靶分子不加噬菌体单克隆样品为空白对照，另外设ER2738培养上清为无关阴性对照。4℃密封湿盒中过夜。

2.洗涤：甩出多余靶分子溶液，用TBST洗6次，每次间隔3min，每次均将酶联板倒置在纸巾上拍甩除去残液。

3.封闭：各孔加满封闭液，4℃湿盒内封闭1-2h。

4.洗涤：方法同步骤5。

5.加样：根据单克隆样品滴度测定结果，分别将每个样品用TBST稀释为1×10⁷pfu/μL，向每个样品加样100μL/孔。室温振荡孵育2h。

6.洗涤：方法同步骤5。

7.加二抗：用封闭液按1∶5,000的比例稀释HRP标记的抗-M13单克隆抗体。每孔加入100μL稀释后的抗体，室温振荡孵育1h。

8.洗涤：方法同步骤5。

9.加显色底物：每孔加100μL TMB底物溶液，室温避光作用30min左右。

10.加终止液：每孔加50μL 2mol/L的硫酸溶液终止显色反应。

11.测A₄₅₀：在450nm波长处测A₄₅₀。以A值高于阴性对照2.1倍以上者定为阳性克隆。检测得到10种与人HPA小亚基结合力很强的噬菌体(图8)，其中C7-1是多轮筛选获得的一致氨基酸序列。

委托西安蓝晶生物科技有限公司化学合成C7-1和C7-5两条氨基酸序列，纯度均为95％以上，其环化前后的质谱和纯化图谱分别见图9和图10。

实施例3：采用HepG-2细胞体外重组基底膜侵袭实验检测C7-1和C7-5的活性

一.方法

1.用胰酶(Amresco公司产品)消化对数生长期HepG-2细胞(军事医学科学院生物工程研究所巩新老师惠赠)，加含血清的培养基，离心，弃去培养液，PBS洗1遍，用含0.1％BSA-无血清DMEM培养基(HyClone公司产品)重悬，调整HepG-2细胞终浓度为1×10⁶/mL。向24孔板(下室)中加入10％FBS-DMEM培养基，600μL/孔；用无菌镊子将铺好Matrigel胶的细胞培养池转入24孔板(下室)中。

2.取HepG-2细胞悬液160μL加入细胞培养池；分别加入不同浓度的C7-1和0.25mg/mL C7-5，加入等体积的0.1％BSA-无血清DMEM培养基为空白对照，置于37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱内培养23h，培养结束后，先用无菌干棉签擦去基质胶和微孔滤膜上室面细胞，再用无菌PBS湿润的棉签小心擦两次。向24孔板中加入5mg/mL MTT磷酸盐储存液(Amresco公司产品)100μL，将小池置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养5h后，向24孔板中加入400μL20％SDS-0.01N HCl，37℃，5％ CO₂饱和湿度培养箱中放置过夜后取出，在微量振荡器上振荡混匀后，从每个孔中取出结晶物溶解液200μL于96孔板中。在570nm处读数，设与试验孔平行不加细胞只加培养液的孔调0。计算侵袭抑制率。

3.侵袭抑制率[％]＝[(对照孔OD₅₇₀-给药孔OD₅₇₀)/对照孔OD570]×100％

二.结果

C7-1通过抑制HepG-2细胞降解重组基底膜，抑制了HepG-2细胞的体外侵袭(图11)。侵袭抑制率为57.1％。

C7-5的实验结果与不加药的空白对照孔没有明显差异，说明C7-5不能抑制HepG-2细胞的体外侵袭。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制剂

<130>

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Lys His Thr His His Lys His

1              5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Lys His Ile His Lys His Tyr

1              5

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>3

Asn His Thr His His Lys His

1              5

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>4

Pro Gln Asp Pro Arg Leu Met

1              5

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>5

Gln Arg Met Asn Pro Asp Ser

1              5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>6

Lys His Val Thr Ala His Glu

1              5

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>7

Ser His His His Trp Arg Lys

1              5

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>8

His Lys His Thr Ser Thr Leu

1              5

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>9

His Phe Thr Pro Gln Asn Pro

1              5

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>10

Pro Gly Thr Pro Arg Met Ala

1              5

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>11

aagcatactc atcataagca t    21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>12

aagcatattc ataagcatta t    21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>13

aaccatactc atcataagca t    21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>14

ccgcaggatc ctcggctgat g    21

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>15

cagcgtatga atccggatag t    21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>16

aagcatgtta ctgcgcatga g    21

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>17

tcgcatcatc attggcggaa g    21

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>18

cataagcata cgtcgacttt g    21

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>19

cattttacgc ctcagaatcc g             21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>20

cctgggactc ctcgtatggc g             21

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

ggaattccat atgcaggacg tcgtggacct    30

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>22

ccgctcgagt tccttcttgg gatcg         25

Claims (7)

1.抑制人乙酰肝素酶活性的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末端为：K-H-T-H-H-K-H。

2.根据权利要求1所述的抑制人乙酰肝素酶活性的小肽，其特征在于：所述小肽为环七肽，其N末端和C末端均具有一个半胱氨酸，在非还原条件下自动形成二硫键，成环七肽。

3.一组具有人乙酰肝素酶8kD小亚基结合活性的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末端为：C7-1、K H T H H K H

C7-2、K H I H K H Y

C7-3、N H T H H K H

C7-4、P Q D P R L M

C7-5、Q R M N P D S

C7-6、K H V T A H E

C7-7、S H H H W R K

C7-8、H K H T S T L

C7-9、H F T P Q N P

C7-10、P G T P R M A。

4.根据权利要求3所述的一组具有人乙酰肝素酶8kD小亚基结合活性的小肽，其特征在于：所述小肽为环七肽，其N末端和C末端均具有一个半胱氨酸，在非还原条件下自动形成二硫键，成环七肽。

5.编码权利要求1或3所述的小肽的基因序列。

6.权利要求1或3所述的小肽作为肿瘤导向治疗的载体。

7.权利要求1所述小肽作为乙酰肝素酶抑制剂治疗肿瘤的方法。

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