CN1230219A - 哺乳动物乙酰肝素酶活性的检测以及哺乳动物乙酰肝素酶的纯化 - Google Patents

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Abstract

检测样品(如哺乳动物组织、细胞或体液)中的哺乳动物乙酰肝素酶活性的方法;以及从含乙酰肝素酶的物质(如人血小板)纯化哺乳动物乙酰肝素酶的方法。

Description

哺乳动物乙酰肝素酶活性的检测 以及哺乳动物乙酰肝素酶的纯化
本发明涉及检测存在于各种哺乳动物组织、细胞和体液(包括血清以及正常细胞和组织与癌细胞和组织)中的哺乳动物乙酰肝素酶活性的分析方法，而且该分析方法可用于测定各种组织和细胞源的哺乳动物乙酰肝素酶活性，作为诊断工具用于测定转移潜能，并用于开发乙酰肝素酶活性和转移的特异性抑制剂。
本发明还涉及纯化哺乳动物乙酰肝素酶、尤其是人血小板乙酰肝素酶的方法，并涉及可通过该方法获得的纯化的哺乳动物乙酰肝素酶。纯化的哺乳动物乙酰肝素酶(如人血小板乙酰肝素酶)的可用性将会促进开发哺乳动物乙酰肝素酶活性的抑制剂，抗该酶的单克隆抗体的生产，以及为了最终克隆和表达该酶的、该酶氨基酸和cDNA序列的鉴定。
血液负载的恶性肿瘤细胞和白细胞侵入组织的重要过程包括：它们在血管内皮的腔表面的粘附，它们穿过血管内皮细胞层，随后下面的基底层和胞外基质(ECM)被一组分泌性和/或细胞表面蛋白酶和糖苷酶活性降解(Nakajima等，1983；Schmitt等，1992；Vlodavsky等，1992)。基底层和下层结缔组织基质主要包括纤连蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原和玻连蛋白的复合网络，它们中每一种都与埋置于基质内的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的硫酸乙酰肝素(HS)侧链相互作用(Yurichenco和Schittny,1990)。HS链一般包括被低度硫酸化或未硫酸化区(主要是1→4连接到β-D-葡糖醛酸的N-乙酰葡糖胺的二糖单元)分隔的硫酸二糖单元(主要是1→4连接到α-L-艾杜糖醛酸残基上的N-硫酸葡糖胺)的聚束(Turnbull和Gallagher,1990,1991)。因此，侵入细胞产生的内切糖苷酶或乙酰肝素酶活性引起的HS链切割可能有助于ECM的分解并促进细胞迁移。已证实乙酰肝素酶活性与鼠的和人的纤维肉瘤细胞系和黑素瘤细胞系的转移潜能有关(Nakajima等，1983,1986a、b,1988；Ricoveri和Cappelletti,1986)。此外，已描述了一些组织和细胞类型中的乙酰肝素酶活性，这些组织和细胞类型包括大鼠肝(Gallagher等，1988；Hook等，1975)，人胎盘(Klein和Von Figura,1979；Lider等，1989)，人血小板(Hoogewerf等，1995；Oldberg等，1980；Oosta等，1982)，培养的人皮肤成纤维细胞(Klein和Von Figura,1976)，人嗜中性粒细胞(Matzner等，1985,1992)，活化但未静息的大鼠T-淋巴细胞(Naparstek等，1984)，正常的和致瘤性鼠B-淋巴细胞(Laskov等，1991)，人单核细胞(Sewell等，1989)以及人脐静脉内皮细胞(Bartlett等，1995；Godder等，1991)。因为HS的切割似乎对转移性肿瘤细胞和白细胞通过基膜很重要，所以乙酰肝素酶抑制剂的研究有可能开发各种新的和高度选择性的抗转移药物和抗炎药物(Coombe等，1987；Irimura等，1986；Parish等，1990；Vlodavsky等，1992；Willenborg和Parish1988)。
乙酰肝素酶活性被血小板、免疫系统中的转移瘤细胞和循环细胞表达与它们的血细胞和外渗物中包括它们相关。研究表明，虽然转移瘤细胞初始被毛细管内皮截留与血小板无关，但不久后出现的血小板聚集可导致血小板活化和脱粒，致使间隙形成和内皮细胞收缩，露出下层基膜与肿瘤细胞粘连(Tanaka等，1986；Crissman等，1985；Yahalom等，1985)。已证实人血小板包含高水平量的乙酰肝素酶活性，能降解内皮细胞表面、肿瘤衍生的和ECM衍生的HSPG(Bartlett等，1995a,1995b；Castellot等，1982；Hoogewerf等，1995；Wasteson等，1976,1977；Yahalom等，1984；)以及游离的HS和肝素链(Graham等，1995a和b；Oldberg等，1980；Oosta等，1982；Wasteson等，1976,1977)。迄今，已报道了3种不同的哺乳动物细胞乙酰肝素酶活性：只切割HS的小鼠黑素瘤B16乙酰肝素酶，既切割肝素也切割HS的人血小板乙酰肝素酶以及据报道可切割新合成的肝素前体但不切割肝素或HS的小鼠肥大细胞瘤内切葡糖苷酸酶(Hoogewerf等1995；Nakajima等，1988；Thunberg等，1982)。更近期研究表明，鼠黑素瘤和巨噬细胞提取物实际上既能降解HS也能降解肝素，但肝素被降解的程度小于被人血小板提取物降解的程度(Graham和Underwood,1996)。虽然Hennes等(1988)报道了肿瘤衍生的乙酰肝素酶能降解基质HS但不能降解内皮细胞表面HS，不过已证实人血小板可降解内皮细胞表面HS(Wasteson等，1977)，该内皮细胞表面HS由Gamse等(1978)证实在结构上与肝素更相似。因此，有可能血小板乙酰肝素酶(它既能降解肝素也能降解HS)在降解病灶粘着斑的细胞表面HS中起关键作用，并帮助血液负载的细胞外渗。
Oldberg等(1980)在部分纯化人血小板乙酰肝素酶后，确定了该酶是一种内切葡糖苷酸酶，它作用于N-硫酸化含艾杜糖醛酸的肝素生物合成中间体；通过6-柱法将该酶以6％收率纯化240,000倍至表观同质性(Oosta等，1982)。该酶是134kDa单亚单位蛋白质，它对125I-肝素有活性并被确定为内切葡糖苷酸酶。在后续的研究中，证实了血小板乙酰肝素酶可切割抑制平滑肌细胞增殖的内皮细胞表面肝素样物质(Gastellot等，1982)，并可切割GlcA-GlcNS3S之间的抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)-结合八糖(Thunberg等，1982)，可能导致在其降解后肝素抗凝血活性的损失(Oldberg等，1980)。不过，已证实该纯化的酶可作用于八糖底物，也证实了血小板提取物可降解ECM衍生的HS链至10kDa(Yahalom等，1984)片段和5kDa片段(Freeman和Bartlett，未公开的观察结果)，表明存在确定该切割位点的专一结构基元。尚未确定血小板乙酰肝素酶作用后的肝素切割产物的尺寸(Graham和Underwood,1996；Oldberg等，1980；Oosta等，1982)。然而，最近Hoogewerf等(1995)报道了人血小板乙酰肝素酶活性的4100倍纯化(8％收率)，在放射标记消化产物后证实该酶是内切氨基葡糖苷酶(endoglucosaminidase)，它将肝素和HS二者切割主要成二糖。该活性存在于8～10kDa亚单位CXC趋化因子结缔组织激活肽-Ⅲ(CTAP-Ⅲ)和嗜中性粒细胞激活肽-2(NAP-2)中，这些肽属于血小板碱性蛋白族。反之，Graham和Underwood(1996)曾指出人血小板提取物中的乙酰肝素酶活性具有Mr为40～60kDa，并且切割HS和肝素，不过未确定降解产物的尺寸。
如下问题的解决，即报道的分子尺寸差异(8～134kDa)，底物专一性(该酶是内切葡糖苷酸酶活性还是内切氨基葡糖苷酶活性)差异，底物切割产物的尺寸(二糖或5～10kDa)差异，要求以高收率纯化该酶至同质性。虽然报道了一些有关该血小板酶的底物专一性的研究(Oldberg等，1980；Oosta等，1882；Thunberg等，1982)，但意外地，除了研究某些修饰的肝素和肝素本身在抑制ECM相关性HSPG的血小板降解方面的应用(Eldor等，1987)之外，关于硫酸化多糖对该酶的抑制(类似于Nakajima等(1986a和b))对肿瘤细胞乙酰肝素酶活性抑制的研究)方面报道得很少。考虑到在肿瘤细胞外渗的初始阶段中血小板的潜在重要作用，这就特别令人感到意外。
为了纯化和鉴定哺乳动物乙酰肝素酶活性并筛选和开发有效的乙酰肝素酶抑制剂，要求对乙酰肝素酶活性进行简单而迅速的分析。然而，以前的乙酰肝素酶分析法在放射性底物的制备和降解产物与未切割底物的分离两方面既麻烦又费时。通常乙酰肝素酶分析包括ECM相关性HSPG的生物合成放射性标记以及通过从ECM释放的放射性标记物质的凝胶过滤分析检测HS链降解(Bartlett等，1995；Vlodavsky等，1992及其中的参考文献)。这种方法的主要缺点是ECM中HS链的降解包括了蛋白酶的协同作用，需要这些蛋白酶使HS链面临后续的乙酰肝素酶攻击(Bar-Ner等，1985,1986；Benezra等，1992；Vlodavsky等，1988)。此外，多数乙酰肝素酶分析要求放射性标记的HS(或ECM衍生的HSPG)底物的彻底降解以便通过凝胶过滤将降解产物与底物分离(Bartlett等，1995；Klein和Von Figura,1979；Nakajima等，1986a；Vlodavsky等，1992)，不过单一位点上HS链的切割可能正是让白细胞和肿瘤细胞通过基膜所需要的全部条件。也已开发了固相乙酰肝素酶分析，其中化学法和生物合成法放射性标记的肝素和HS链被连接到固相支持体上，以放射性标记物从固相支持体的释放为酶活性的量度(Nakajima等，1986a；Oosta等，1982；Sewell等，1989)。然而，这类分析方法的缺点在于，固定化底物可能较不易与哺乳动物乙酰肝素酶接触，而且放射性标记的底物通过该底物的还原端与固相支持体的偶合是复杂而低效的方法。以前的研究也已对肝素和HS两者通过天然存在的葡糖胺残基上的碘化(Oosta等，1982)或通过部分脱-N-硫酸化底物的N-乙酰化(Nakajima等，1986a)而进行放射性标记。但是这类方法可能导致掩蔽或产生新的乙酰肝素酶切割位点。
本发明一方面提供了检测样品如哺乳动物组织、细胞或体液中的哺乳动物乙酰肝素酶活性的方法。
按该方面，本发明提供了检测样品中哺乳动物乙酰肝素酶活性的方法，它包括如下步骤：
(ⅰ)将待测样品与乙酰肝素酶底物在样品中的乙酰肝素酶足以降解该乙酰肝素酶底物的条件下接触一段时间；
(ⅱ)通过把未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物与硫酸乙酰肝素结合蛋白结合将降解产物与未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物分离；以及
(ⅲ)检测分离的降解产物以指示样品中的乙酰肝素酶活性。
在该方面，本发明还提供了用于检测样品中哺乳动物乙酰肝素酶活性的试剂盒，它包括呈区室化形式的：
(ⅰ)乙酰肝素酶底物；
(ⅱ)硫酸乙酰肝素结合蛋白；以及
(ⅲ)任选地，进行如前面广泛描述的本发明方法的说明。
本发明的另一方面提供了迅速纯化哺乳动物乙酰肝素酶活性、更确切地说人血小板乙酰肝素酶活性的新方法，以及通过该方法制备的纯化了的哺乳动物乙酰肝素酶。
按该方面，本发明提供了从含乙酰肝素酶的物质纯化哺乳动物乙酰肝素酶的方法，它包括下列步骤：
(ⅰ)在去污剂存在下将含乙酰肝素酶的物质与固定化凝集素亲和层析基质接触，使乙酰肝素酶活性结合到所述基质上；
(ⅱ)从所述基质洗脱第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分；
(ⅲ)任选将所述第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分与固定化金属离子亲和层析基质接触；
(ⅳ)将所述第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分与染料-树脂基质接触，使乙酰肝素酶活性结合到所述染料-树脂基质上；以及
(ⅴ)从所述染料-树脂基质洗脱第二个含纯化的乙酰肝素酶的级分。
在该方面，本发明还提供了通过前面广义描述的方法制备的充分纯化的哺乳动物乙酰肝素酶，尤其是充分纯化的人血小板乙酰肝素酶，其特征在于通过凝胶过滤层析和通过SDS-PAGE进行分析时它的本征分子质量(Mr)约为50kDa，其特征还在于它既降解肝素，也降解硫酸乙酰肝素。通过凝胶过滤分析得出，本发明充分纯化的人血小板乙酰肝素酶将牛肺肝素和猪粘膜肝素从12kDa分别降解至6kDa和4kDa片段，并以逐步方式将猪粘膜硫酸乙酰肝素从22kDa降解至5kDa片段。
前面广义描述的本发明的乙酰肝素酶纯化方法还可用于纯化其它乙酰肝素酶，包括大鼠肝、大鼠13762MAT腺癌细胞和人HCT116结肠癌细胞乙酰肝素酶。充分纯化的MAT和HCT细胞乙酰肝素酶具有与如上讨论的人血小板乙酰肝素酶相似的Mr，而充分纯化的大鼠肝素肝素酶的本征Mr约为45kDa，并在SDS-PAGE上43和47kDa之间有3条带。
在说明书全文中，除非文中另外要求，“包括”这个词应理解为包含一个规定的整体或一组整体，但不排除其它任何整体或一组整体。
本发明一方面尤其涉及下列物质中哺乳动物乙酰肝素酶活性的检测：血清，包括人癌患者的血清，以及各种组织和细胞匀浆或提取物，包括例如人血小板、结肠癌细胞、脐静脉内皮细胞和大鼠乳腺癌细胞(转移和非转移变体)和肝匀浆。本方法可用于测定人和非人(例如大鼠和小鼠)血清、细胞和组织匀浆或提取物中的乙酰肝素酶活性。
优选地，该乙酰肝素酶底物是标记的底物，更优选是放射性标记的底物。该底物优选是硫酸乙酰肝素(HS)，特别优选的底物是3H-猪粘膜HS和3H-牛肾HS。优选地，猪粘膜HS是部分脱-N-乙酰化的和同3H-乙酸酐再-N-乙酰化而生成所需的放射性标记底物。
如前面广义描述的那样，将待测样品与乙酰肝素酶底物在足以使样品中的乙酰肝素酶(如果有的话)降解该底物的条件下接触一段时间。合适的温育时间和条件无需过度的实验即可轻易确定。例如，样品与底物的温育可在35℃～40℃范围内、优选约37℃的温度下进行2～48小时，优选约16小时，在4.2～7.5范围内的pH下，优选约pH5.1。优选地，该温育步骤是在牛血清白蛋白、N-乙酰甘露糖胺和/或去污剂(如Triton X-100)的存在下进行的。如下面详细所述，在合适的温育时间和条件下乙酰肝素酶活性以逐步方式使优选的猪粘膜硫酸乙酰肝素底物从22降解至17，然后至8且最后至5kDa片段或降解产物。
降解产物与未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物的分离是通过结合到硫酸乙酰肝素结合蛋白上而进行的。本文应用的术语“硫酸乙酰肝素结合蛋白”包括但不限于肝素结合蛋白。用于本发明的特别优选的硫酸乙酰肝素结合蛋白是富含组氨酸的糖蛋白。更优选地，该富含组氨酸的糖蛋白(HRG)是鸡HRG，但其它HRG(包括人HRG)也可应用。然而应懂得，本发明推广到除HRG之外的其它硫酸乙酰肝素结合蛋白和肝素结合蛋白的应用，包括例如：蛋白酶抑制剂，如抗凝血酶111和肝素辅因子11；血浆脂蛋白如载脂蛋白B-100和载脂蛋白E；生长因子，如酸性和碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子，肝细胞生长因子和血小板衍生的生长因子；胞外基质蛋白如层粘连蛋白，胶原和弹性蛋白；酶如脂蛋白裂合酶，超氧化物歧化酶，组织蛋白酶G，弹性蛋白酶和细菌肝素裂合酶1、11和111；以及其它合适的结合蛋白如血小板因子4，病毒胞吞因子(von willebrand factor)，和β-血小板球蛋白。本发明还推广到源于这些硫酸乙酰肝素结合蛋白或肝素结合蛋白(特别是HRG)的肽，它们包含硫酸乙酰肝素结合区或肝素结合区。
优选地，是通过结合到固定化硫酸乙酰肝素结合蛋白上而进行分离的。任何合适的固定化方法都可应用，但现在优选通过结合到琼脂糖珠、更优选为Sepharose珠上而固定化HRG或其它合适的结合蛋白。在该优选的方面，可将HRG-Sepharose珠装入柱中，施加温育混合物并洗过该柱以结合未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物，使降解产物未结合或低效结合到HRG-Sepharose珠上。也可将HRG或其它合适的结合蛋白加到温育混合物中以结合未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物复合体，然后可以例如通过在底物(如Immobilon或StrataClean)上的固定化而分离该复合体，在例如通过离心或过滤除去该固定化复合体之后将降解的乙酰肝素酶底物片段留在温育混合物中。
在本发明该方面的方法的最后步骤中，检测分离的降解产物以指示试验样品中乙酰肝素酶活性的存在。该检测步骤可包括降解产物的定量和/或定性检测。若应用放射性标记的乙酰肝素酶底物如3H-猪粘膜HS，则检测步骤可包括未结合的降解产物放射性量的检测。
本发明在该方面提供了从乙酰肝素酶底物分离降解产物的新方法，它利用了切割的乙酰肝素酶降解产物对硫酸乙酰肝素结合蛋白如HRG、尤其是鸡的富含组氨酸的糖蛋白(cHRG)的降低的亲和性。将温育混合物施加到cHRG-Sepharose柱上，未结合的物质对应于乙酰肝素酶降解产物。已对各种人、大鼠和小鼠细胞和组织匀浆测定了乙酰肝素酶活性。例如，高度转移的大鼠乳腺癌和鼠黑素瘤细胞系的乙酰肝素酶活性是非转移变体的4～10倍，证实乙酰肝素酶活性与转移潜能的关系。人癌患者的血清乙酰肝素酶量是正常健康成人的2倍。
本发明该方面提供了用于检测哺乳动物乙酰肝素酶对天然放射性标记底物的活性的新型、简单而迅速的定量分析法，它能检测活体内可能发生的HS链切割的最小量，而且它基于新的原理，即在链切割之后HS链上蛋白质结合位点的减少。该分析中，利用初步观测，即HS结合血浆蛋白HRG掩蔽HS链上乙酰肝素酶切割位点。在乙酰肝素酶消化后，与残余的完整底物和部分降解的底物不一样，放射性标记的HS片段(产物)未被HRG-偶合的Sepharose珠的微型柱结合，使得迅速将切割的产物与底物分离。
本发明该方面的分析法与常规分析法相比具有如下几个优点：(a)容易制备较大量的放射性标记天然底物同时保持其天然结构，(b)可迅速并同时测定大量样品以及(c)可通过检测底物的单一位点切割而准确量化乙酰肝素酶活性。
本发明另一方面涉及从含乙酰肝素酶的物质纯化哺乳动物乙酰肝素酶。用作本发明方法中起始原料的含乙酰肝素酶的物质可以是任意来源的哺乳动物乙酰肝素酶活性，例如人结肠癌HCT116细胞，大鼠乳腺癌13762MAT细胞，或大鼠肝组织。不过，本发明尤其涉及人血小板乙酰肝素酶的纯化，该物质的便利来源是通过从冷冻、洗涤后的人血小板匀浆中溶解酶活性得到的。
在去污剂(如Triton X-100)存在下，将含乙酰肝素酶的物质进行固定化凝集素亲和层析，优选为伴刀豆球蛋白A-Sepharose层析，使乙酰肝素酶活性结合到层析柱上。洗脱结合的乙酰肝素酶活性而提供第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分。
任选且优选地，再将第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分进行固定化金属离子亲和层析(IMAC)，优选应用一种基质如Zn2+-螯合Sepharose，它不结合乙酰肝素酶活性，但它除去其它污染蛋白质。再将第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分进行染料-树脂层析，优选顺次用IMAC基质，以再次结合乙酰肝素酶活性。合适的染料-树脂基质包括Blue-A琼脂糖基质，不过，也可应用其它染料如Reactive Red以及其它基质载体如Sepharose和丙烯酰胺。从染料-树脂基质洗脱第二个含纯化的乙酰肝素酶的级分后，可接着进行辛基琼脂糖层析，它再次结合污染蛋白质但不结合乙酰肝素酶活性。
第二个含纯化的乙酰肝素酶的级分的最后纯化可通过凝胶过滤层析法(例如Superose12层析)进行，任选接着浓缩该纯化了的酶。
如前所述，按本发明该方面得到的产物是充分纯化的哺乳动物乙酰肝素酶，尤其是充分纯化的人血小板乙酰肝素酶。用于本说明书中的术语“充分纯化的”表示已接受纯化处理的产物，乙酰肝素酶活性是含乙酰肝素酶原料活性的至少1000倍，优选至少1500倍。
还优选地，该充分纯化的哺乳动物乙酰肝素酶是均匀的，并且相对于在其天然形式中通常与之有关的其它蛋白质来说，它优选含至少75wt％、更优选至少85wt％、最优选至少95-99wt％乙酰肝素酶。
按本发明该方面，人血小板乙酰肝素酶已从预先冷冻、洗涤过的血小板被纯化至均一。已证实，与转移瘤细胞和其它种类细胞相比，当以活性/mg蛋白质表示时，人血小板含很高量的乙酰肝素酶活性。
在本发明方法该方面的一个实施方案(下面的实施例中详细描述了)中，人血小板乙酰肝素酶已通过5柱处理而被纯化1500倍至均一(收率为19％)，这5个柱包括：伴刀豆球蛋白A-Sepharose、Zn2+-螯合-Sepharose、Blue A-琼脂糖、辛基琼脂糖和凝胶过滤层析。该同样纯化处理可用于纯化其它哺乳动物乙酰肝素酶活性，例如从人结肠癌HCT116细胞、大鼠乳腺癌13762MAT细胞以及从大鼠肝纯化。既可降解肝素又可降解HS的人血小板乙酰肝素酶，通过凝胶过滤层析和通过SDS-PAGE进行分析时的本征分子质量为50kDa。通过凝胶过滤分析得知，该酶使猪粘膜HS以逐步方式从22kDa降解至17、10和最后5kDa片段，使牛肺和猪粘膜肝素从12kDa分别降解至6和4kDa片段。
从下述实施例和附图的详细描述将会更详细地理解本发明，这些实施例和附图是为了阐述而不是限制本发明。
图中：
图1：作为温育pH的函数的HS降解。37℃和pH4.2(○)、5.1(□)、6.5(△)和7.5(▲)下将HS与大鼠13762MAT匀浆以及不存在添加的酶时在pH5.1(■)下将HS温育16h。通过Superose-6凝胶过滤层析将该温育混合物分级分离。示出的Mr标准物是a)16.7,b)10.6,c)6.7,d)3.1和e)0.2kDa。至于全部细节，见方法部分。
图2：作为温育时间的函数的HS降解。在37℃和pH5.1下将HS与大鼠13762MAT匀浆温育达2(△)、4(▲)和16hr(□)以及不存在添加的酶时将HS温育4hr(■)。通过Superose6凝胶过滤层析将该温育混合物分级分离。Mr标准物a-e如图1中所述。至于全部细节，见方法部分。
图3：通过转移性和非转移性大鼠乳腺癌细胞系匀浆来降解HS。在37℃和pH5.1下将HS分别与下列物质一起温育16h：没有酶(■)，非转移性变体DMBA-Sask(□)和13762MAT(J-克隆)(▲)的匀浆，以及为方便起见一起示出高度转移性13762 MAT和DMBA-8A细胞系(△)的匀浆。通过Superose6凝胶过滤层析将温育混合物分级分离。Mr标准物a-e如图1中所述。至于全部细节，见方法部分。
图4:HS的降解作为温育时间和消化的HS产物对cHRG-Sepharose的亲和性的函数。在37℃和pH5.1下将HS温育2(□)、4(△)和16hr(▲)以及不存在添加的酶时将HS温育4hr(■)。将温育混合物加到PBS中的cHRG-Sepharose柱中，用PBS洗涤并通过NaCl-梯度洗脱。箭头表示NaCl梯度的起始。一，NaCl的浓度。至于全部细节，见方法部分。
图5:cHRG对HS降解的抑制。将HS在pH5.1和37℃下以及分别在下列条件下温育8h：不存在添加的酶或cHRG时(■)，存在(△)和不存在(▲)3∶1(cHRG∶HS)摩尔比的cHRG时与大鼠13762MAT细胞匀浆。通过Superose6凝胶过滤层析将温育混合物分级分离。Mr标准物a-e如图1中所述。至于全部细节，见方法部分。
图6：作为温育时间的函数的HS降解。在pH5.1和37℃下将HS与大鼠13762MAT匀浆温育达2(□)、4(▲)、6(△)、8(●)和10hr(○)，以及不存在添加的酶时将HS温育4hr(■)。通过A)Sepharose6凝胶过滤层析和B)结合到cHRG-Sepharose柱上将温育混合物分开和分级分离，此时在每个时间点上测定未结合的级分。Mr标准物a-e如图1中所述。至于全部细节，见方法部分。
图7：人血小板乙酰肝素酶的Superose12层析。如方法部分中所述，将步骤4的血小板乙酰肝素酶通过凝胶过滤法纯化。对各级分分析乙酰肝素酶活性(○)并监测蛋白质(-A280)。箭头1和2分别指示牛血清白蛋白和卵清蛋白的Ve。
图8：纯化的人血小板乙酰肝素酶的SDS-PAGE。用二硫赤藓糖醇还原步骤5纯化的血小板乙酰肝素酶，再将它在10％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳处理。至于实验细节，见方法部分。泳道1,Mr标准物；泳道2，步骤5的乙酰肝素酶。
实施例1
应用的缩写：bFGF，碱性成纤维细胞生长因子；BSA，牛血清白蛋白；cHRG，鸡富含组氨酸的糖蛋白；CNBr，溴化氰；CR-HS，羧基还原的硫酸乙酰肝素；ECM，胞外基质；GlcA，葡糖醛酸；GlcNAc,N-乙酰化葡糖胺；GlcNS,N-硫酸化葡糖胺；GlcNS3S,N,3-二硫酸葡糖胺；hHRG，人富含组氨酸的糖蛋白；HRG，富含组氨酸的糖蛋白；HS，硫酸乙酰肝素；HSPG，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；HUVEC，人脐静脉内皮细胞；IdoA2S,2-硫酸艾杜糖醛酸；NAM,N-乙酰甘露糖胺；PBS，磷酸盐缓冲盐水。
Ⅰ-原料
肝素衍生的16.7、10.6、6.7和3.1kDa的分子质量(Mr平均)标准物是Nova Nordisk(Gentofte，丹麦)慷慨赠送的(见Kristensen等，1991)。猪粘膜HS(ORG553)是Organon Int.Bv.(Oss，荷兰)慷慨赠送的。Pharmaeia Fine Chemicals(Uppsala，瑞典)提供了PD-10柱、DEAE-Sepharose和溴化氰活化的Sepharose4B。Sigma Chemical Co.(St Louis,MO)提供了结晶牛血清白蛋白、牛肺肝素、软骨素ABC-裂合酶、水合肼和硫酸肼。3H-乙酸酐(500mCi/mmol)的甲苯溶液得自Amersham International(悉尼，澳大利亚)。Beckmann(Gladesville，澳大利亚)提供了Ready Safe闪烁液。Dowex AG50W-X8(100-200目；H+形式)得自Bio-RadLaboratories(Richmond，加拿大)。
按以前描述的方法培养和收获如下细胞系：转移性人结肠癌HCT116(Schlechte等，1989)和KM12SM(Morikawa等，1988)；转移性鼠黑素瘤B16-F10，高度转移性的13762MAT和DMBA-8A大鼠乳腺癌，以及它们的非转移性变体J-克隆和DMBA-Sask(Parish等，1992)；人脐静脉内皮细胞和巨噬细胞系U937(Bartlett等，1995)；人平滑肌，人肺成纤维细胞和人角质形成细胞系(KJD)。人血小板是通过Bartlett等(1995)的方法获得的。鼠Lewis肺癌细胞系(转移性(D122)和非转移性(LLC)变体)以及鼠肺癌细胞系(转移性(A3a)和非转移性(SP1)变体)分别是Samuel Lunenfeld Research Institute,Mount Sinai Hospital,Toronto(加拿大)的James W.Dennis博士和Department ofImmunology,The Weizmann Institute of Science,Rehovot(以色列)的Lea Eisenbach博士慷慨赠送的。这些细胞系的冷冻(-80℃)细胞粒状沉淀是由Peter MacCallum Cancer Institute,Melbourne(澳大利亚)的Robin Anderson博士提供的。细胞匀浆是这样制备的，即将106个细胞或108个血小板(预先用生理盐水洗涤过)悬浮于0.2ml 0.1％(v∶v)Triton X-100水溶液，再通过在固态CO2/乙醇混合物中冻融三次使之破裂。
应用polytron匀浆器在含0.5M NaCl的3体积(w∶v)15mM-戊二酸二甲酯缓冲液(pH6.0)中匀化从10周龄的Fischer F344大鼠新切下的肝。人癌患者的血清以及致瘤性肺组织和相邻的正常肺组织以冷冻(-80℃)形式得自the Royal North Shore Hospital，悉尼(澳大利亚)。将该组织融化后按上述方法匀化。将得自癌患者和健康志愿者的冷冻血清融化后对4℃下的生理盐水透析16h。通过Bio-RadCoomassie蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laborato ries,Richmond,CA)应用BSA作为标准物估测蛋白质浓度。
Ⅱ-方法
放射性标记的硫酸乙酰肝素：将粗制的猪肠粘膜硫酸乙酰肝素ORG553(100mg)溶于2ml H2O，在4℃下的透析袋中对2l生理盐水透析4h，并对2lH2O透析16h，透析袋的截断值为10kDa。将透析液与含0.1mg/ml BSA和2单位软骨素ABC-裂合酶的2ml 0.1MTris·HCl(pH8.0)混合，在37℃下温育16h。在4℃下对21PBS透析16h后，将溶液加到用PBS平衡过的DEAE-Sepharose柱(1.0×6.0cm)上。先后用各为12ml的PBS和0.3M NaCl洗涤该柱，再用10ml 2M NaCl洗脱，接着冻干。将固体溶于最少量的H2O，应用Pharmacia PD-10柱使之脱盐。将先于NaCl出现的洗脱液(通过添加一滴20％硝酸银溶液检测)冻干得33mg纯化的硫酸乙酰肝素。
将纯化的硫酸乙酰肝素(26mg)溶于含硫酸肼(20mg)的水合肼(1ml)中，再将混合物于具塞玻璃小瓶中在100℃下加热2h。使该混合物冷却后在氮气流中干燥。添加甲苯(1ml)，干燥该混合物，将该操作再重复两次。将残余物溶于2ml 1M NaCl，在PD-10柱上脱盐，使脱盐后的物质通过Dowex 50X-8(Na+形式)柱(1.0×6.0cm)，该柱用10ml H2O洗涤。将流过的溶液和洗涤液合并后冷冻干燥得19mg部分地脱-N-乙酰化的硫酸乙酰肝素。
将脱-N-乙酰化的硫酸乙酰肝素(19mg)溶于含10％(v∶v)甲醇的1ml 0.5M NaHCO3中，在冰浴中冷却至0℃，添加0.1ml 3H-乙酸酐(5mCi,500mCi/mmol)的甲苯溶液，在0℃下剧烈搅拌该混合物3h。进一步添加0.05ml甲醇、0.1ml Na2CO3和0.05ml乙酸酐，在0℃下搅拌30分钟。再重复该操作两次，检查将pH保持碱性，然后用乙酸酸化该混合物至pH4.0。当该混合物被暖至22℃后，在氮气流中除去甲苯，在PD-10柱上使该溶液脱盐，所述柱在10％(v∶v)乙醇水溶液中平衡和展开过。在3H-乙酸盐峰之前出现的放射性物质被冻干得21mg放射性标记的硫酸乙酰肝素，将它以2mg/ml的浓度溶于10％(v∶v)乙醇水溶液，在-20℃下贮存。
富含组氨酸的糖蛋白-Sepharose：通过磷酸纤维素离子交换层析法(Rylatt等，1981)从鸡血浆制备鸡富含组氨酸的糖蛋白(cHRG)。通过SDS-PAGE展示该制剂的纯度，此处检测到分子质量为135kDa的单一考马斯蓝(Coomassie Blue)染色的带。将该物质浓缩至蛋白质浓度为2mg/ml，对PBS透析后在-20℃下贮存备用。
将牛肺肝素(50mg)溶于10ml含10％(v∶v)甲醇的0.5MNaHCO3，冷却至4℃，再以5分钟间隔添加5等份0.04ml乙酸酐。用1M Na2CO3将pH保持在8.0以上。进一步搅拌该混合物30分钟，然后在4℃下将该乙酰化肝素对5l含0.15M NaCl的1M NaHCO3(偶联缓冲液)透析16h。
将cHRG(10mg)在4℃下对2l偶联缓冲液透析16h，再在4℃下与上面制备的乙酰化肝素溶液混合30分钟，以防cHRG的HS-结合位点偶联到Sepharose珠上。使溴化氰(CNBr)活化的Sepharose4B(2g)在50ml 1mM HCl中溶胀30分钟，在真空下的烧结漏斗中用150ml 1mM HCl洗涤，再用20ml偶联缓冲液洗涤。立即将洗涤过的CNBr-Sepharose加到肝素-cHRG溶液中，并在4℃下轻轻地混合24h。添加4ml 2M乙醇胺的偶联缓冲液溶液(用1M HCl调节至pH8.0)，再轻轻地混合16h。将该浆液倾入色谱柱(1.5×5.0cm)，在4℃下依次用各50ml的偶联缓冲液、含2M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和最后用PBS洗涤。在4℃下将cHRG-Sepharose于PBS中贮存。偶联形成浓度为每ml珠粒结合0.8mg蛋白质，它分别结合6.2nmol和3.1nmol放射性标记的肺肝素和HS。
乙酰肝素酶分析：将cHRG-Sepharose珠(0.2ml柱床)置于一次性1ml填充玻璃棉的注射器中，再将该微型柱置于放在冰斗内静置的10ml离心管中。在应用前用1ml PBS预洗涤这些柱。所有的柱操作都是在冰上进行的。
要分析乙酰肝素酶活性，将多达2μl的样品加入温育混合物，该混合物包括于0.05M乙酸钠缓冲液(pH5.1)中的90pmol放射性标记的HS，其中含5mM N-乙酰甘露糖胺和0.1mg/ml BSA，总体积为20μl，再在37℃下温育适当时间。通过冷冻这些管而终止反应，添加0.3ml冷的PBS，必要的话在4℃下离心该溶液，将0.1ml样品加到预先在PBS中平衡过的cHRG-Sepharose微型柱上。用0.7ml PBS洗涤该柱，将洗涤液和流过物质转至闪烁小瓶，添加10ml闪烁液，测定放射性。酶活性以每小时每mg蛋白质或106个细胞或每ml血清形成产物的pmol数表示。通过添加1ml含2M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)再生该cHRG-Sepharose柱，再用PBS平衡。
还通过温育混合物在Superose6 HR 10/30柱(Pharmacia LKBBiotechnology,Uppsala，瑞典)上的凝胶过滤层析法检测乙酰肝素酶活性，在PBS中平衡后接着展开。在0.25ml/分的流速下操作该Pharmacia FPLC体系，直接将0.5ml的各级分收集入闪烁小瓶，往其中加入3ml闪烁液，测定放射性。用3H-N-乙酰葡糖胺(221Da)、牛肺肝素(12.5kDa)和肝素衍生的Mr平均标准物(16.7、10.6、6.7和3.1kDa)校正该柱，如前述关于放射性标记HS的制备那样，先使这些物质部分地脱-N-乙酰化和用3H-乙酸酐再-N-乙酰化。还通过上述方法制备放射性标记的6-硫酸软骨素和羧基还原的HS(通过Karamanos等(1988)的方法制备)。
HS与cHRG-Sepharose的结合：将200μlPBS中的样品加到4℃下在PBS中平衡过的cHRG-Sepharose微型柱(0.5×4.0cm)上。用2ml PBS洗涤该柱，用PBS和含1.2M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)的线性梯度(2×10mls)洗脱，在0.5ml/分下展开，将0.5ml的各级分直接收集入闪烁小瓶，往其中加入4ml闪烁液，测定放射性。将这些柱在PBS中重新平衡后供进一步应用。
Ⅲ-结果和讨论放射性标记的乙酰肝素酶底物的制备。
以前有关乙酰肝素酶对肝素或HS的活性的研究已应用了连接试剂以允许放射性碘化(Oosta等，1982)，它能掩蔽潜在的切割位点，或者原先脱-N-硫酸化HS的乙酰化或肝素与放射性标记的乙酸酐的乙酰化(Nakajima等，1986a)。但是，如报道的那样，后一种方法既影响底物的表观Mr，又影响肝素中产生的乙酰肝素酶易感性键合，以前已证实它抗鼠B16黑素瘤乙酰肝素酶活性(Nakajima等，1986a)。为保障产生放射性标记的、生物活性的天然底物以测定各种生物样品中的乙酰肝素酶活性，将纯化的猪粘膜HS部分地脱-N-乙酰化和用3H-乙酸酐再-N-乙酰化至比活性为1650～2000cpm/pmol，它高达以前报道的14C标记HS(Nakajima等，1986a)的100倍。该标记处理的主要优点在于，未在底物中引入新的或改变了的切割位点。将该底物在-20℃下贮存于10％(v∶v)乙醇水溶液中，该底物能稳定一年，即使反复冷冻和融化也不产生可测量到的降解产物。以前由Hahnenberger等(1993)分离的猪粘膜HS已被证实其平均Mr为22kDa，它含dp2～16的类肝素酶抗性糖类，富含介导bFGF活性的IdoA2S-GlcNS序列(Walker等，1994)。它还包含dp6～14-16的伸展亚硝酸抗性(含GlcNAc的)序列(J.E.Turnbull，未发表的观察值)，因此包含HS物质典型的硫酸化和非硫酸化交替区。乙酰肝素酶消化HS底物的分析。
在可以开发出新的乙酰肝素酶分析法之前，关键是要应用常规凝胶过滤来分离和鉴定降解产物以证实放射性标记的HS是一种合适的底物。确定用于该研究中的乙酰肝素酶的降解性能也很重要。应用高度侵袭性大鼠乳腺癌13762MAT和人血小板匀浆来估测乙酰肝素酶对放射性标记底物的降解，因为以前已证实该肿瘤和血小板衍生的酶具有不同的底物特异性，要么只降解HS，要么既降解肝素又降解HS(Nakajima等，1988)。为防止后续的乙酰肝素酶降解产物的胞外酶降解，将5mMN-乙酰甘露糖胺(NAM)加入温育混合物以抑制在α-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性之后释放3H-标记的N-乙酰葡糖胺残基(Hopwood和Elliott,1982)。
在37℃下，在NAM存在下将HS与13762MAT细胞匀浆在pH4.2、5.1、6.5和7.5下温育16h，通过凝胶渗透层析法分析反应混合物(图1)。将乙酰肝素酶衍生的产物的尺寸与一系列放射性标记的肝素衍生的Mr标准物对比。HS在pH5.1下被最大程度地降解至表观Mr为5kDa的片段，对比分别在pH6.5和7.5下表观Mr为8和16kDa。pH4.2下的降解速度低于pH6.5下的降解速度，更不明显的逐步分解至产物。延长HS与13762MAT细胞匀浆的温育时间至40h，再次导致在pH6.5和7.5下的不完全降解(未示出数据)。为测定在更高pH值下是否存在不同的酶活性或者是否产生了不同的切割位点，在16h温育后，收集在pH5.1、6.5和7.5下降解的各产物，脱盐后在pH5.1或6.5下与新鲜的匀浆进一步温育16h。各情况下，各测试片段都被降解至5kDa的最小尺寸(未示出数据)。将乙酰肝素酶消化的5kD产物加到DEAE-Sepharose上导致即使存在0.3M NaCl时也保持结合所有的放射性，表明乙酰肝素酶消化产生的所有HS片段都包含高度硫酸化的HS域。
13762MAT细胞匀浆与HS在pH5.1下的时程温育达2、4和16h再次证明了HS明显的逐步降解(图2)，伴随3次明显的切割，即从22至16至8和最后至5kDa。在pH5.1、6.5或7.5下温育16h后未检测到对6-硫酸软骨素或者对羧基还原的HS(CR-HS)的活性(未示出结果)。人血小板匀浆乙酰肝素酶活性同样未作用于CR-HS但消化HS至5kDa的片段，通过DEAE-Sepharose将这些片段保持在0.3M NaCl中。各种细胞系(包括高度转移性人结肠癌HCT116和KM12-SM系、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、小鼠黑素瘤B16-F10细胞)的匀浆和大鼠肝提取物，都通过凝胶过滤分析证实在16h温育期间能将HS水解成17、8和最后5kDa的片段(未示出结果)，表明各细胞系中的乙酰肝素酶活性都将HS切割成相似尺寸的产物。以前还证实了人血小板、HUVEC、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和白细胞乙酰肝素酶对牛内皮ECM结合的HSPG的活性导致形成相似尺寸的HS消化终产物(Vlodavsky等，1992)。
高度转移性大鼠13762MAT和DMBA-8A细胞系以及非转移性变体J-克隆和DMBA-Sask的提取物与HS温育导致HS被13762MAT和DMBA-8A乙酰肝素酶活性完全降解至5kDa片段，而J-克隆和DMBA-Sask提取物只部分地降解HS至分别为8和17kDa的表观Mr的片段(图3)。以前在基膜渗透性分析中已证实，高度转移性13762MAT和DMBA-8A细胞系降解人造基膜Matrigel的效能比J-克隆和DMBA-Sask变体更大(Parish等，1992)，于是证实了转移潜能与乙酰肝素酶活性的关系(Nakajima等，1983)。
因此，建议将猪粘膜HS作为合适的天然底物用于检测各种细胞、血小板和组织提取物中的乙酰肝素酶活性，并用于估测肿瘤细胞系的乙酰肝素酶含量和转移潜能。但是，由于切割位点的多重性，应用凝胶过滤作为将产物与未消化底物分离的方法使得难于准确地量化乙酰肝素酶活性，尤其是因为要求产生多重切割以便将底物与产物分离。此外，不知道相对速度或每次切割是否相似，或者消化的初始产物是否可通过产物抑制作用而抑制进一步的切割，这就导致该分析法关于时间缺乏线性，大多数有关HS降解体外活性研究中已观察到该情况(Freeman和Hopwood,1986,1987,1989a,1989b)。结合通过凝胶过滤分析法分析单个样品所需的时间和人力考虑，乙酰肝素酶活性的量化方法的缺乏特别需要一种能检测最少数目的底物切割的迅速、定量分析乙酰肝素酶的方法。乙酰肝素酶定量分析法的开发
HS结合蛋白和肝素结合蛋白(例如抗凝血酶Ⅲ、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板因子4、β-血小板球蛋白和富含组氨酸的糖蛋白(HRG))与HS的相互作用已有很好的文献记载(Jackson等，1991)，以及最近的研究以试图弄清楚在化学的(主要是亚硝酸降解)或细菌乙酰肝素酶和类肝素酶消化后它们在HS分子上的结合基元(Turnbull和Gallagher,1990,1991；Turnbull等，1992；Walker等，1994)。但是，除了证实哺乳动物乙酰肝素酶能从ECM释放活性bFGF(Ishai-Michaeli等，1990)之外，关于哺乳动物乙酰肝素酶降解后HS结合蛋白与HS之间的相互作用方面的研究报道得很少。
在研究鸡HRG(cHRG)(一种丰富的血浆衍生的HS结合蛋白)与HS的相互作用时，发现不但cHRG掩蔽了HS链上的哺乳动物MAT细胞乙酰肝素酶切割位点，而且在乙酰肝素酶切割HS之后，HS上的cHRG结合基元也损失了。因此，在乙酰肝素酶消化之后，切割了的HS片段与cHRG-偶联Sepharose珠低效地结合，使得可开发将HS底物与乙酰肝素酶消化产物分离的有效而新型的方法。
当将HS加到cHRG-Sepharose柱上，再在pH7.2下用盐梯度洗脱时，与0.6M NaCl洗脱的肺肝素(未示出结果)相比，0.27M NaCl洗脱的是较弱结合的HS(图4)。然而，HS被13762MAT细胞匀浆完全消化后形成的5kDa片段未结合到cHRG-Sepharose上。然后应用标准分析法在pH5.1下由13762MAT细胞乙酰肝素酶降解HS达2、4和16h时，将分析混合物分成3组，通过凝胶过滤层析法、结合到DEAE-Sepharose和结合到cHRG-Sepharose上进行分析。凝胶过滤分析得出与图1相似的曲线图，产物分别在17、8和5kDa。该分析混合物的施加，以及随后放射性标记的HS产物通过盐梯度从cHRG-Sepharose柱洗脱，证实了通过凝胶过滤分析得出的HS片段表观Mr的降低与未结合在cHRG-Sepharose上的物质的增多有关(图4)，表明了在乙酰肝素酶消化之后HS上的HRG结合基元损失了。温育期后结合的HS片段对cHRG-Sepharose柱的亲和性没有明显变化。HS与cHRG-Sepharose的结合(以及凝胶过滤分析中HS的表观Mr)未受只含缓冲液(0.1mg/ml BSA)、热灭活的酶或在4℃下与HS层析分离的活性酶的分析空白样的影响(未示出数据)。在将温育混合物加到DEAE-Sepharose上之后，在0.3M NaCl的存在下所有放射性仍保持结合，表明消化产物不是因为被某些内硫酸酯酶活性脱硫酸盐的缘故(Bartlett等，1995；Dawes和Pepper,1992；Wells和Dawes,1995)。
为了研究HS与HRG的结合是发生在乙酰肝素酶敏感性切割位点上还是位点附近，当不存在和存在3∶1摩尔比的cHRG∶HS时用13762MAT细胞匀浆消化HS(HS似乎有3个可能的切割位点，它们中每一个都可能结合到HRG分子上)。图5显示了，与不存在cHRG时(此时底物被完全降解)相比，在cHRG存在下，HS的降解(导致形成小(5kDa)片段)速度显著被减缓了。乙酰肝素酶活性的测定
应用cHRG-Sepharose分析法，在pH5.1下观测到最大的乙酰肝素酶活性(未示出结果)，类似于以前通过凝胶过滤法分析的结果(图1)。将NAM加入温育混合物以抑制3H-GlcNAc(它不会结合到cHRG-Sepharose上)的外切糖苷酶释放。HS和消化产物对cHRG-Sepharose的亲和性未受含最终浓度为0.1mg/ml BSA、0.1％(v∶v)Triton X-100或高达0.2M NaCl的温育混合物的影响。但是，在0.1％Triton X-100存在下分析时，组织匀浆乙酰肝素酶活性增大达2倍。反之，可溶性乙酰肝素酶活性(在通过离心除去膜之后)未因温育混合物中BSA或Triton X-100的添加而受影响，不过高度纯化的酶制剂要求温育混合物中存在BSA以获得最适活性和稳定性。在关于HS降解外切酶活性的测定方面广泛报道了需要BSA以测定高度纯化的酶的最适活性，并需要Triton X-100用于组织匀浆的最大活性(Freeman和Hopwood,1986,1987,1989a,b,1992)。该cHRG-Sepharose柱按常规用高浓度的盐洗脱，然后在PBS中再平衡。在4℃下的PBS中贮存这些柱，常用达2年之久也不会明显降低结合容量。
图6将13762MAT匀浆乙酰肝素酶消化HS之后表观Mr的变化(图6A)，与将温育混合物加到cHRG-Sepharose上之后未结合的放射性HS片段的表现作了比较(图6B)。对于在6h的温育后未结合到cHRG-Sepharose上的物质的凝胶过滤分析示出表观Mr为17kDa(未示出结果)。通过cHRG-Sepharose分析测定的酶活性关于长达10h的温育时间和高达30％的底物至产物的转化率呈线性(图6B)。在延长的温育时间(24h)后，84％的放射性通过了该cHRG-Sepharose柱，表观Mr为5kDa。猜测保持与柱结合的物质含更高亲和性的HRG-结合基元或是乙酰肝素酶抗性的，这是未曾研究过的现象。未结合到cHRG-Sepharose上的本底物质通常是低Mr(小于6kDa)的物质，可能代表在从猪粘膜分离HS期间得到的先前切割的HS片段。这些片段可这样除去，即先通过应用cHRG-Sepharose亲和纯化HS底物，或者先通过凝胶过滤除去较小的Mr物质。
可应用人HRG(hHRG)-Sepharose有效地代替cHRG-Sepharose来测定乙酰肝素酶。然而，hHRG对BALB/c3T3细胞表面HSPG的结合亲和力弱于观测到的cHRG的结合亲和力(Brown和Parish1994)，由cHRG-Sepharose对猪粘膜HS的亲和力高于观测到的hHRG-Sepharose的亲和力(未示出结果)反映了这一点。鸡HRG的另一个优点在于它可从血浆以比hHRG更高的收率被纯化(C.Parish，未公开的观测结果)。可应用可商购的牛肾HS(Mr 17kDa)代替猪肠HS以测定乙酰肝素酶活性。反之，可商购的牛肠HS不能用来测定乙酰肝素酶活性，因为它的Mr小于5kDa，而且通过凝胶过滤分析和cHRG-Sepharose分析得知它根本不是哺乳动物乙酰肝素酶敏感性的。不同生物样品中乙酰肝素酶活性的分析
应用定量的cHRG-Sepharose乙酰肝素酶分析法测试了得自正常人和癌患者的各种细胞系、组织和血小板匀浆以及血清的乙酰肝素酶活性。表1示出，存在于高度转移性的大鼠乳腺癌13762MAT和DMBA-8A细胞系匀浆中的乙酰肝素酶活性分别比各个非转移性J-克隆和DMBA-Sask变体高4倍和10倍。这些值既与这些细胞系降解人造(Matrigel)基膜的相对能力密切相关(Parish等，1992)，也与通过凝胶过滤分析估测的细胞匀浆降解HS的相对能力密切相关(见前面)。鼠Lewis肺癌(D122)和肺癌(A3a)的转移性变体降解HS分别比它们各自的非转移性变体快2.5倍和4.8倍(表1)。以前，Nakajima等(1986a,b)报道了应用其对脱N-硫酸化、再N-乙酰化HS的固相分析得出，在差转移性B16-F1亚系的提取物与更高转移性B16-BL6、B16-F10和B16-B16b亚系的提取物之间乙酰肝素酶活性只差1.5～2.2倍。
本发明乙酰肝素酶分析法的灵敏度可适用于临床估测癌患者。测定了取自6名肺癌患者的肺肿瘤组织中乙酰肝素酶活性。这些患者中，5名患者的原发肿瘤中乙酰肝素酶活性比患者的相邻非肿瘤肺组织中的高2～4倍(未示出结果)。虽然几乎检测不出人血浆中的乙酰肝素酶活性(小于4pmol/hr/ml血浆)，但在正常成人血清和患有转移性恶性肿瘤的患者血清中检测到明显的乙酰肝素酶活性。测得癌患者中血清乙酰肝素酶活性比正常对比组的高2倍(癌患者为229.7±28.8(n=8)，对比组为116.6±13.3(n=5)pmol/hr/ml血清)，证实了从恶性黑素瘤患者的血清观测到的结果(Nakajima等，1988)。实际上，这些作者们观察到存在组织转移的患者中血清乙酰肝素酶活性增大了4倍。Nakajima等(1986c,1988)还观察到，注射高度转移性13762NF乳腺癌细胞30天后的大鼠中的血清乙酰肝素酶含量比正常大鼠的高17倍，而携带MTLn3肿瘤的大鼠的血清中酶活性与转移程度相关性良好。
也检测了多种人的和大鼠的细胞系血小板和组织匀浆中的乙酰肝素酶活性(表2)，这些匀浆应该代表供将来纯化的有价值乙酰肝素酶来源。为了方便细胞和组织之间的比较，以/mg提取的蛋白质表示乙酰肝素酶活性。该迅速、定量分析乙酰肝素酶的方法的开发对于从各种来源纯化乙酰肝素酶活性很有价值，它将能使得迅速筛选推定的乙酰肝素酶抑制剂。表1．转移性和非转移性肿瘤细胞系的乙酰肝素酶活性
肿瘤细胞匀浆乙酰肝素酶活性是在将温育混合物在cHRG-Sepharose上分级分离后估测的。除了另外指出外，酶活性都以3次单独试验的平均值±SEM表示。至于全部细节，见方法部分。肿瘤类别        细胞系    转移性   乙酰肝素酶活性
                                 (pmol/hr/106个细胞)大鼠乳腺癌      13762MAT     是        47.4±2.2
            13762MAT     非        12.8±0.5
            (J-克隆)
            DMBA-8A      是        35.6±3.2
            DMBA-Sask    非        3.4±0.1人结肠癌        HCT116       是        10.3,10.4人单核细胞      U937         非        7.6,8.2人角质形成细胞  KJD          非        7.8,10.2鼠Lewis肺癌     D122         是        16.4±1.1
            LLC          非        6.5±0.5鼠肺癌          A3a          是        16.3±1.2
            SP1          非         3.4±0.2表2．人的和大鼠的细胞和组织中乙酰肝素酶活性。
将温育混合物在cHRG-Sepharose上分级分离后估测人的和大鼠的组织和培养细胞的各种匀浆中乙酰肝素酶活性范围。至于全部细节，见方法部分。细胞或组织                  乙酰肝素酶活性
                        (pmol/hr/mg蛋白质)人血小板                    2178-3591(n=6)人结肠癌(HCT116)            38.2-66.6(n=4)HUVECS                      21.0-42.6(n=4)人平滑肌细胞                50.3,75.9人肺成纤维细胞              1.5,3.0人角质形成细胞(KJD)         62.2,78.4大鼠13762MAT细胞            141.1-349.2(n=6)大鼠肝                      9.5-28.3(n=6)实施例2
应用的缩写：BSA，牛血清白蛋白；cHRG，鸡富含组氨酸的糖蛋白；HRG，富含组氨酸的糖蛋白；HS，硫酸乙酰肝素；HSPG，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；HUVEC，人脐静脉内皮细胞；PBS，磷酸盐缓冲盐水。
Ⅰ-原料
肝素衍生的16.7、10.6、6.7和3.1kDa的分子质量(Mr平均)标准物是Nova Nordisk(Gentofte，丹麦)慷慨赠送的(见Kristensen等，1991)。猪粘膜HS(ORG553)是Organon Int.Bv.(Oss，荷兰)慷慨赠送的。Pharmacia Fine Chemicals(Uppsala，瑞典)提供了伴刀豆球蛋白A-Sepharose4 B、螯合-Sepharose4 B、Superose6和12HR 10/30凝胶层析柱，用于校准凝胶过滤柱和SDS-PAGE凝胶及辛基-Sepharose的分子质量标准试剂盒。Sigma Chemical Co.(StLouis,MO)提供了结晶牛血清白蛋白(BSA)、牛肺和猪粘膜肝素、牛肾HS、3,3-二甲基戊二酸、Blue A-琼脂糖、辛基-琼脂糖、CHAPS、乙酸锌。Amicon Corp.(Beverly,MA)提供了Centricon100和30微量浓缩器。Beckmann(Gladesville，澳大利亚)提供了Ready Safe闪烁液。Stratagene USA(La Jolla,CA)提供了StrataClean Resin。
富含死亡血小板的血浆得自the Canberra Hospital，用生理盐水通过在20℃下以1600xg将悬浮的血小板离心15分钟洗涤两次，在-80℃下冷冻贮存粒状沉淀。人血小板也通过Bartlett等(1995)的方法获得，并在生理盐水中洗涤两次。细胞匀浆的制备如下：将108个血小板悬浮于0.2ml 0.1％(v∶v)Triton X-100水溶液中，通过在固态CO2/乙醇混合物中冷冻和融化三次使之破裂。蛋白质浓度是通过Bio-RadCoomassie蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA)应用BSA作标准物估测的。
Ⅱ-方法放射性标记底物的制备
放射性标记的猪肠粘膜硫酸乙酰肝素(ORG553)、猪肠粘膜肝素和牛肺肝素是应用实施例1的方法通过用肼进行N-脱乙酰化和用3H-乙酸酐进行N-乙酰化而制备的。乙酰肝素酶分析：分析方法1。测定了人血小板乙酰肝素酶对HS的活性，应用实施例1的鸡富含组氨酸的糖蛋白(cHRG)-Sepharose珠分离方法将产物与底物分离。将多达2μl的样品加入温育混合物，该温育混合物包括于0.05M乙酸钠缓冲液(pH5.1)中的90pmol放射性标记的HS，其中含5mM N-乙酰甘露糖胺和0.1mg/ml BSA，总体积为20μl；在37℃下温育适当时间至5～20％的底物分解成产物。通过冷冻试管终止反应，添加0.3ml冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)，如果需要的话在4℃下离心该溶液，将0.1ml样品加到预先用PBS平衡的cHRG-Sepharose微型柱(0.2ml)上。用0.7ml PBS洗涤这些柱，将洗涤液和流过的物质转移到闪烁小瓶中，添加10ml闪烁液，测定放射性。酶活性以每小时每mg蛋白质形成的产物pmol数表示。分析方法2。如前所述在37℃下分析乙酰肝素酶对2μg放射性标记的HS或肝素类似物的活性达16h，通过温育混合物在Superose6上(对于HS降解)或Superose12上(对于肝素降解)的凝胶过滤分析进行检测。用PBS在0.25ml/分的流速下平衡和展开这些层析柱，将0.5ml的各级分直接收集入闪烁小瓶，添加3ml闪烁液，测定放射性。用3H-N-乙酰葡糖胺(221Da)、牛肺肝素(12.5kDa)和肝素衍生的Mr平均标准物(16.7、10.6、6.7和3.1kDa)校正这些柱，这些标准物已如前面关于放射性标记HS的制备所述被部分地脱N-乙酰化和用3H-乙酸酐再N-乙酰化。血小板乙酰肝素酶的纯化
除非另有说明，所有操作都在4℃下进行。应用分析方法1测定乙酰肝素酶对HS的活性。在各步骤(除了步骤3中0.8M NaCl洗涤BlueA-琼脂糖之外)中，缓冲液对柱的洗涤持续到应用Bio-Rad蛋白质分析法在柱的洗脱液中不再能检测到蛋白质为止。
步骤1．酶活性的增溶：将50单位冷冻、洗涤过的人血小板悬浮于4体积含0.5M NaCl的15mM二甲基戊二酸钠缓冲液(pH6.0)(缓冲液A)中而使之融化，将样品浸入固态CO2/乙醇浴中后冻/融三次。在35000xg下将悬浮血小板匀浆离心60分钟，上清液被用于步骤2中。将沉淀物重悬浮于200ml缓冲液A中，再次冻/融，再如上述那样离心。重复该操作两次，最后将沉淀物在含1％(v∶v)CHAPS的缓冲液A中匀化，如上述那样离心。严格按下述方法纯化该CHAPS上清液中的乙酰肝素酶活性，只是在步骤2中向提取物中加入Triton X-100。
步骤2．伴刀豆球蛋白A-Sepharose层析：将步骤1的上清液在Triton X-100中配成0.2％(v∶v)，然后在约1ml/分下加到在含0.2％Triton X-100的缓冲液A(缓冲液B)中平衡过的伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱(1.5×5.0cm)上。在4℃下依次用25ml缓冲液B和40mls缓冲液A洗涤该柱，再用预先暖至20℃的40ml缓冲液A洗涤。应用预先被暖至20℃的、含20％α-甲基甘露糖苷(w∶v)的40ml缓冲液A洗脱乙酰肝素酶活性。将洗脱液收集入保持在冰斗中的容器。
步骤3．Zn2+螯合Sepharose/Blue A-琼脂糖层析：将步骤2的酶溶液在1ml/分下加到与Blue A-琼脂糖柱(1.0×2.0cm)串联连接的Zn2+螯合Sepharose柱(1.0×10.0cm)上。用50ml缓冲液A洗涤组合的柱，接着依次用20ml含0.5M NaCl的Tris缓冲液(60mM Tris/HCl缓冲液，pH7.4，配于10％(v∶v)甘油中)和1.5ml含0.8M NaCl的Tris缓冲液洗涤断开的Blue A-琼脂糖柱。
步骤4．Blue A-琼脂糖/辛基琼脂糖层析：将步骤3的Blue A-琼脂糖柱连接到在含2M NaCl的Tris缓冲液中平衡过的辛基-琼脂糖柱(1.0×1.5cm)上。用15ml含2M NaCl的Tris缓冲液在0.5ml/分下洗脱该Blue A-琼脂糖柱。立即将辛基-琼脂糖洗脱液在包括一层PM10膜的Amicon超滤搅拌池中浓缩至5ml体积，再通过Centricon30离心浓缩至0.2ml体积。添加含10％(v∶v)甘油的缓冲液A(缓冲液C)，再将该酶溶液浓缩至0.4ml。
步骤5．Superose12层析：将步骤4的浓缩了的酶溶液分成各200μ1的两份加到串联连接的两个Superose12HW 10/30柱上，用缓冲液C平衡该柱并在0.5ml/分下展开。收集0.5ml的各级分而分析乙酰肝素酶活性，通过Centricon30离心来浓缩含乙酰肝素酶活性的级分至0.4ml。该纯化的酶在4℃下的缓冲液C中贮存时可稳定数月。
步骤6．Centricon100和30离心：对于从小于20单位的已洗涤的血小板获得的血小板制剂，将得自步骤4中辛基-Sepharose柱的2M NaCl洗脱液通过在Centricon100微量浓缩器中离心而浓缩，再如步骤4中所述应用Centricon30微量浓缩器浓缩含乙酰肝素酶活性的滤液并对缓冲液C透析。本征Mr和亚单位Mr
通过上面步骤5中所述在两个串联连接的Superose12 HW 10/30柱上的层析测定了纯化的人血小板乙酰肝素酶活性的本征Mr。用下列Mr标准物校正该柱，即甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)、过氧化氢酶(232kDa)、果糖-二磷酸醛缩酶(158kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、胰凝乳蛋白酶原(25kDa)和核糖核酸酶A(13kDa)。
按Laemmli(1981)的方法操作不连续SDS-PAGE，并用CoomassieBrilliant Blue R250染色。用下列Mr标准物校正10％聚丙烯酰胺凝胶，即：磷酸化酶b(94kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、大豆胰蛋白酶抑制剂(20kDa)和α-乳清蛋白(14kDa)。这样浓缩样品，即添加10μl StrataClean Resin，按生产厂商的说明涡动和离心该悬浮液。通过在二硫苏糖醇中煮沸而还原该沉淀物，再通过标准方法将悬浮液加到积层凝胶上。
Ⅲ-结果和讨论血小板乙酰肝素酶的纯化
以前，已证实人血小板匀浆含2.2-3.6nmol/h/mg蛋白质乙酰肝素酶对HS的活性，比在转移性人结肠癌肿瘤细胞系HCT116中观测到的活性高60倍(实施例1)。因此，血小板是哺乳动物乙酰肝素酶活性的极丰富资源。乙酰肝素酶活性可从通过凝血酶诱导的脱粒(Hoogewerf等，1995)而获得的新鲜血小板中释放，但发现通过凝血酶刺激过时的血小板而释放的乙酰肝素酶活性水平可变性很大。所以乙酰肝素酶活性是通过冻/融预先冷冻的已洗涤血小板使之溶解而得到的。
由于报道过的该酶的不稳定性(Oldberg等，1980)以及在该酶的纯化期间所得活性的较低回收率(Hoogewerf等，1995；Oosta等1982)，所以改进了层析条件以最大程度地浓缩洗脱的蛋白质。这是通过分批(或等度)洗脱而不是梯度洗脱达到的，并设计条件使酶通过一个柱时未被结合，但通过串联连接的下一个柱时被结合。这使得可在盐梯度洗脱之后节省分析酶活性的时间，并将因酶的稀释引起的活性损失减至最小程度。
事先冷冻的已洗涤血小板在缓冲液A(它含0.5M NaCl)中的匀化不会释放任何明显的可溶性酶活性。然而，通过反复冻/融血小板接着将匀浆离心把总乙酰肝素酶活性的大约75％溶解(表3)。残余的膜相关性酶只能通过在含1％(v∶v)CHAPS的缓冲液A中匀化而被释放。该膜与含1％TritonX-100的缓冲液A一起匀化溶解了该酶，但它迅速失去活性。该膜结合酶是通过与用于分离可溶性酶相同的方法从50个单位已洗涤的血小板纯化的。
当在去污剂存在下施加时，加到伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱上的所有酶活性被牢固地结合了。在20℃下应用缓冲液A洗涤该柱比单独在4℃下洗涤除去了更多非特异性地结合的蛋白质。与在4℃下的正常洗脱相比，在20℃下洗脱该柱大大提高了酶活性的回收率和洗脱速度(用小于5个柱体积的洗脱液)。乙酰肝素酶活性被纯化了19倍，从原血小板上清液回收了56％的酶活性(表3)。该步骤中酶活性的回收率一般在55～70％范围内。用含α-甲基甘露糖苷和0.1％Triton X-100的缓冲液在20℃下不再能从柱中洗脱乙酰肝素酶活性。已被相当成功地用于纯化HS-降解胞外酶活性(Bielicki等，1990；Clements等，1985；Freeman和Hopwood,1986,1987,1989)的螯合-Sepharose和染料-基质层析的应用，以前未被用于分离哺乳动物乙酰肝素酶活性。不结合到锌螯合柱上的该酶，被牢固地结合到染料柱上，这就使得将肝素降解胞外酶活性α-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酸酶和α-N-乙酰氨基葡糖苷酶与血小板乙酰肝素酶完全分离(未示出结果)。在未结合的级分中或者在该染料柱的低盐(0.5和0.8M NaCl)Tris缓冲液洗涤液中未检测到乙酰肝素酶活性。从该Blue A-琼脂糖柱高盐(2M NaCl)洗脱乙酰肝素酶导致多数污染蛋白结合到该辛基-琼脂糖柱上，同时通过凝胶层析的最后纯化以几乎纯净的形式浓缩未结合的乙酰肝素酶。虽然该酶未结合到辛基-琼脂糖上，但在2M NaCl中施加时它确实结合到辛基-Sepharose上，不过用1M NaCl可将它从柱上洗脱(未示出结果)。比步骤2进一步将乙酰肝素酶活性纯化了80倍，给出总纯化程度为1500倍，活性的回收率为26％。用分别含0.1M咪唑和1％Triton X-100的缓冲液A从柱上洗脱余下的结合蛋白质之后从螯合-Sepharose柱或者从辛基-琼脂糖柱不再能回收到活性。此外，与Hoogewerf等(1995)报道的相反，在Centricon30浓缩该几乎纯净的酶之后的滤液中检测不到乙酰肝素酶活性。
凝胶过滤层析(图7)导致比步骤4又将酶纯化1.1倍，使得从原始匀浆最后将酶活性纯化1900倍，回收率达19％。这比得上Oosta等(1982)和Hoogewerf等(1995)分别报道的从富含血小板的血浆以5.6％的收率纯化240000倍和以8％的收率纯化4100倍。应用本实施例中所述方法可在2天内以高达30％的收率制备纯化的人血小板乙酰肝素酶(应用小于20单位的洗涤了的血小板)的更小制剂。此时，应用按比例更小的柱，且凝胶过滤步骤5代之以通过Centricom100过滤该辛基-琼脂糖洗脱液，再通过Centricom30滤器浓缩。还纯化了膜相关性酶，酶活性的收率为25％，比活性为6600nmol/h/mg蛋白质，与对于可溶性酶所观测到的情况相似。该酶的膜相关形式表现出与该酶的可溶形式相同的层析性能。本征分子质量
对纯化的乙酰肝素酶(见图7)和在伴刀豆球蛋白A-Sepharose层析(步骤2)之后所得酶的凝胶过滤分析证实该酶的表现Mr为50kDa。在相应于8～10kDa的Mr值或者相应于如Hoogewerf等(1995)报道的趋化因子二聚体或四聚体尺寸的血小板乙酰肝素酶活性的情况下都未检测到酶活性，在相应于如Oosta等(1982)报道的表观Mr为134kDa的情况下也未检测到任何活性。然而，本实施例中给出的结果类似于Graham和Underwood(1996)关于人血小板提取物获得的40～60kD的Mr值。该值也类似于报道的关于纯化了的人胎盘乙酰肝素酶的45kDa本征Mr(Gilat等，1995)和报道的关于部分纯化了的人脾乙酰肝素酶的50kDa(Sewell等，1989)，但不同于报道的关于鼠黑素瘤酶的94kDa的Mr值(Jin等，1990)。此外，纯化了的人乙酰肝素酶未被Centricon 100kDa膜阻留，但被Centricon 30kDa膜阻留。如Hoogewerf等(1995)报道的那样，在30kDa膜滤液中未检测到乙酰肝素酶活性。然而，在步骤2的层析之后，酶活性被Centricon 100kDa膜阻留了，这表明在浓缩过程中与其它蛋白质的显著相互作用，因为通过凝胶过滤分析得知步骤2的物质表观Mr为50kDa(未示出结果)。已纯化的酶的SDS-PAGE分析指出在还原条件(图8)和非还原条件(未示出结果)下相应于50kDa的Mr值的单一考马斯蓝染色带，它与凝胶过滤分析所得的值相同。通过凝胶过滤分析和SDS-PAGE分析测得已纯化的膜相关性酶也具有50kDa的本征Mr和亚单位Mr(在还原条件下)。尚不知该酶如何与膜有关。因为它的尺寸类似于可溶性酶，所以有可能乙酰肝素酶可呈可溶性形式和膜相关性形式存在，这类似于溶酶体酶酸性磷酸酶，它通过与甘露糖-6-磷酸无关的途径被转运到溶酶体，而且它具有一个2kDa C端跨膜肽，该跨膜肽导致该酶以膜结合的形式和可溶性形式存在于溶酶体中。(Peters等，1990)。以前，Gallagher等(1988)报道了大鼠肝膜乙酰肝素酶活性的存在。然而，与本文报道的酶不同，该酶在小于7.5的pH值下无活性。纯化的血小板乙酰肝素酶的底物特异性
如通过分析方法1测定的，纯化了的人血小板乙酰肝素酶对HS的活性在pH5.1下最大，类似于关于血小板匀浆乙酰肝素酶活性所报道的情况(实施例1)。通过凝胶过滤分析得知该纯化的酶既切割HS也切割肝素。如报道过的关于血小板匀浆乙酰肝素酶对粘膜HS的活性(实施例1)那样，猪粘膜HS(22kDa)、和牛肾HS(17kDa)各自都被切割至5kDa的片段。以前，证实了猪粘膜HS呈逐步方式从22kDa被切割至17至11和最后至5kDa的片段(实施例1)。
粘膜肝素和更高度硫酸化的肺肝素各自从12.5kDa分别切割至4和6kDa的片段。与一次切割的肺肝素相比，粘膜肝素似乎呈逐步方式被切割了两次。然而，与Hoogewerf等(1995)报道的不同，没有迹象表明在持久温育纯化的酶或者步骤1的匀浆乙酰肝素酶之后从HS或者肝素(或修饰的肝素)的切割产生主要为二糖的产物，甚至如那些作者所述用还原剂和氧化剂预处理该酶之后也一样。表3．从人血小板纯化乙酰肝素酶。
步骤 乙酰肝素酶活性(nmol/h) 总的蛋白质(mg) 比活性(nmol/h/mg) 纯化(～倍) 收率(％)
 1． 匀浆上清液沉淀物 1219298924480 34652098552 3.524.728.12 -1(1.7) -100.0-
 2． 伴刀豆球蛋白A-Sepharose 5523 63.1 87.53 18.5 55.8
 3．4． Zn-Sepharose/Blue-琼脂糖/辛基-琼脂糖 2579 0.37 6970.3 1476.7 26.1
 5． Superose12 1873 0.24 7804.2 1653.4 18.9
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Claims (35)

1．检测样品中哺乳动物乙酰肝素酶活性的方法，该方法包括如下步骤：
ⅰ．将待测样品与乙酰肝素酶底物在样品中的乙酰肝素酶足以降解该乙酰肝素酶底物的条件下接触一段时间；
ⅱ．通过把未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物与硫酸乙酰肝素结合蛋白结合将降解产物与未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物分离；以及
ⅲ．检测分离的降解产物以指示样品中的乙酰肝素酶活性。
2．权利要求1的方法，其中所述样品选自人的和非人的血清、细胞和组织匀浆或提取物。
3．权利要求1或权利要求2的方法，其中所述乙酰肝素酶底物是标记的底物。
4．权利要求3的方法，其中所述乙酰肝素酶底物是放射性标记底物。
5．权利要求1～4任一项的方法，其中所述乙酰肝素酶底物是硫酸乙酰肝素。
6．权利要求5的方法，其中所述硫酸乙酰肝素是猪粘膜硫酸乙酰肝素或牛肾硫酸乙酰肝素。
7．权利要求6的方法，其中所述硫酸乙酰肝素是3H猪粘膜硫酸乙酰肝素或3H牛肾硫酸乙酰肝素。
8．权利要求1～7任一项的方法，其中所述硫酸乙酰肝素结合蛋白是鸡的富含组氨酸的糖蛋白。
9．权利要求8的方法，其中所述富含组氨酸的糖蛋白是鸡富含组氨酸的糖蛋白。
10．权利要求1～9任一项的方法，其中所述硫酸乙酰肝素结合蛋白被固定化。
11．权利要求10的方法，其中所述硫酸乙酰肝素结合蛋白是通过结合到琼脂糖珠上而被固定化的。
12．权利要求1～11任一项的方法，其中所述样品与所述乙酰肝素酶底物在35℃～40℃范围内的温度下，优选在约37℃下，以及在4.2～7.5范围内的pH下，优选在约pH5.1下接触2～48小时，优选约16小时。
13．用于检测样品中哺乳动物乙酰肝素酶活性的试剂盒，它包括呈区室化形式的：
ⅰ．乙酰肝素酶底物；
ⅱ．硫酸乙酰肝素结合蛋白；以及
ⅲ．任选地，进行权利要求1～12任一项的本发明方法的说明。
14．权利要求13的试剂盒，其中所述乙酰肝素酶底物是标记的底物。
15．权利要求14的试剂盒，其中所述乙酰肝素酶底物是放射性标记底物。
16．权利要求13～15任一项的试剂盒，其中所述乙酰肝素酶底物是硫酸乙酰肝素。
17．权利要求16的试剂盒，其中所述硫酸乙酰肝素是猪粘膜硫酸乙酰肝素或牛肾硫酸乙酰肝素。
18．权利要求17的试剂盒，其中所述硫酸乙酰肝素是3H猪粘膜硫酸乙酰肝素或3H牛肾硫酸乙酰肝素。
19．权利要求13～18任一项的试剂盒，其中所述硫酸乙酰肝素结合蛋白是富含组氨酸的糖蛋白。
20．权利要求19的试剂盒，其中所述富含组氨酸的糖蛋白是鸡富含组氨酸的糖蛋白。
21．权利要求13～20任一项的试剂盒，其中所述硫酸乙酰肝素结合蛋白被固定化。
22．权利要求21的试剂盒，其中所述硫酸乙酰肝素结合蛋白是通过结合到琼脂糖珠上而被固定化的。
23．从含乙酰肝素酶的物质纯化哺乳动物乙酰肝素酶的方法，该方法包括如下步骤：
ⅰ．在去污剂存在下将含乙酰肝素酶的物质与固定化凝集素亲和层析基质接触，使乙酰肝素酶活性结合到所述基质上；
ⅱ．从所述基质洗脱第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分；
ⅲ．任选将所述第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分与固定化金属离子亲和层析基质接触；
ⅳ．将所述第一个含纯化的乙酰肝素酶的级分与染料-树脂基质接触，使乙酰肝素酶活性结合到所述染料-树脂基质上；以及
ⅴ．从所述染料-树脂基质洗脱第二个含纯化的乙酰肝素酶的级分。
24．权利要求23的方法，其中所述含乙酰肝素酶的物质包括人血小板。
25．权利要求23或24的方法，其中所述固定化凝集素亲和层析基质包括伴刀豆球蛋白A-Sepharose基质。
26．权利要求23～25任一项的方法，其中所述去污剂包括Triton X-100。
27．权利要求22～26任一项的方法，其中所述固定化金属离子亲和层析基质包括Zn2+-螯合Sepha-rose基质。
28．权利要求22～27任一项的方法，其中所述染料树脂基质包括Blue A-树脂或Reactive Red-树脂基质。
29．权利要求28的方法，其中所述染料-树脂基质中的树脂包括琼脂糖、Sepharose或丙烯酰胺。
30．权利要求22～29任一项的方法，它包括进一步的步骤，即将第二个含纯化的乙酰肝素酶的级分与辛基琼脂糖基质接触以除去污染蛋白。
31．权利要求23～30任一项的方法，它包括进一步的步骤，即纯化所述第二个含纯化的乙酰肝素酶的级分或者凝胶过滤层析。
32．权利要求31的方法，其中所述凝胶过滤层析包括Superose 12层析。
33．通过权利要求23～32任一项的方法制备的充分纯化的哺乳动物乙酰肝素酶。
34．充分纯化的人血小板乙酰肝素酶，其特征在于：
ⅰ．通过凝胶过滤层析和通过SDS-PAGE进行分析时它的本征分子质量(Mr)约为50kDa；以及
ⅱ．它既降解肝素也降解硫酸乙酰肝素。
35．权利要求34的充分纯化的人血小板乙酰肝素酶，其特征在于，通过凝胶过滤分析得知，它将牛肺和猪粘膜肝素从12kDa分别降解至6和4kDa片段，并以逐步方式将猪粘膜硫酸乙酰肝素从22kDa降解至5kDa片段。
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