TW565614B - Detection of mammalian heparanase activity and purification of mammalian heparanase - Google Patents

Description

A7 565614 _ B7 五、發明說明（7 ) 且有高製得率來達到。血小板酵素之受質的專一性的部份 研究已被發表（〇ldberg，et a 1 ，1980 ;0 o s t a e t al * 1882；Thunber s，et al ，1982)，但卻僅有極少部份是與用 硫酸化的聚合醣來抑制酵素（類似Nakaj ima e t a 1 (1986a及b)在腫瘤细胞乙醢肝素酶活性 的抑制所作的研究）），其乃不同於使用某些修改過的肝 素及肝素本身來抑制E CM聯合的H S P G之血小板降解 (Eldor，et al，1987)。考慮血小板極 可能在腫瘤细胞的外滲作用中之肇始階段扮演重要角色乃 尤其令人意外。 為了純化定性哺乳類動物之乙釀肝素酶活性及篩選及 發展有效的乙_肝素酶抑制劑，一種簡單且快速的檢測乙 醯肝素醣活性的方法乃極其需要。然而，先前的乙醢肝素 酶檢測中之放射線標定的受質的準備及分解之產物與未分 解之受質的分離乃相當的麻煩且費時。乙醢肝素酶檢測經 常已含生化製造的放射線標定的之E CM聯合的H S PG 及偵測被從用凝膠過濾分析從E CM所釋放出來的放射線 標定的物質所分解的HS鍵（Bart lett e t a]， 1995；Vlodavsky et al， 1992，及其中所附之參考文獻）。其方法面臨的主要 缺點，乃ECM中的HS鏈的分解乃牽涉了蛋白質酵素的 協合作用，其需要暴露給H S鏈以使接下來的乙醢肝素酶 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -ϋ n I u n n n^OJI ffn ϋ an n n n ϋ I · 565614 A7 _ B7 五、發明說明（5 ) 攻擊得 Μ 進行（Bar — Ner e t a 1 ，1985 » 1986 ； Benezra e t a 1 »1 9 9 2； VI odavsky e t al ，1988)。此外， 大部分的乙醯肝素酶檢測需要放射線標定的HS受質（或 來自ECM之HSPG)大量的降解K使降解的產物及受 質能夠用凝膠過濾來分離（Bart lett e t a 1 ，1995;Klein 及 VonFigura，19

7 9 ； N a k a j i m a e t al * 1 9 8 6 a ； V

1 odavsky e t a 1 *1992)，即使 HS 鍵在單一位置處的切割是唯一的，使白血球及腫瘤细胞穿 過基礎膜的必要條件。固態乙醢肝素酶檢测也已被發展出 來，其用化學及生化來放射線標定的肝素及H S鐽乃連结 於一固定的支持物，而Μ其被酵素分解而釋放出來的放射 線標定的來測量酵素的活性（Nakaj ima e t al，1986;0〇sta e t al，1982; Swell e t al ，1989)。這樣的檢測方法 ’有一缺點’即固定在支持物上的受質可能較無法與哺乳 類動物乙藤肝素酶來接觸，而經由受質堪原端來偶合放射 線標定的受質於固定支持物上是相當複雜且沒有效率的事 情。先前的研究也已將肝素及H SK碘化的方式來放射線 標定的於自然發展的葡萄糖胺殘基上（〇〇sta e t a 1 ，1 982)或將部份為去一 N —硫酸化的受質進 行 N — 2 醯化（Nakaj ima e t al ，198 -10- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

丁 -n 11 n n n iM§ flu « · 1 mm§ n (ϋ eemw mmmtm I 565614 A7 ___B7 __ 五、發明說明（/ ) 6 a)。然而，這樣的過程導致掩蓋或產生新的乙醢肝素 酶切割點。 發明摘述 在一觀點中，本發明提供了一種在樣本如哺乳動物組 織’细胞及體液中檢測哺乳動物乙醯肝素酶活性的方法。 根據此観點，本發明提供了一種在樣本中檢測哺乳動 物乙醯肝素酶活性的方法，其包括以下步驟： (i )使待測試的樣本與乙醯肝素酶受質接觸一段時 間’且在足Μ使樣本中的乙醢肝素醏能夠降解乙醯肝素酶 受質的條件下； (i i)將已被降解的產物自未被降解或部份降解的 乙醯肝素酶受質分離，其乃藉由將未降解及部份降解的乙 醢肝素酶受質與一硫酸乙醯肝素结合蛋白質结合；及 (i i i)檢測經分離的降解產物，以顯示樣本中的 乙醢肝素酶活性。 依此觀點，本發明亦提供了一套組來偵測一樣本中哺 乳動物的乙醯肝素酶活性，其Μ分開的形式，包括： (i )乙醯肝素酶受質； (i i)硫酸乙醮肝素结合蛋白質；及 (丨i i)選擇性的，Μ上廣泛敘逑以進行本發明方 法之說明。 從另一個觀點觀之，本發明提供了 一種全新的用Μ快 速純化哺乳動物乙醯肝素酶活性的方法，尤其是血小板之 -11- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-flu n n m 1 I n 一 δ- fl n n n n I ϋρ I 565614 A7 __B7___ 五、發明說明（) 乙醯肝素酶活性，及用本方法製備之純化的哺乳動物乙酿 肝素酶活性。 根據這一個觀點，本發明提供了 一種從含有乙醢肝素 酶的物質純化哺乳動物乙醯肝素酶活性的方法，其步驟包 括： (i)使含乙醯肝素酶物質與經固定化的外源凝集素 (1 ec t i η)親和色層分析基質在清潔劑存在下接觸 Μ使乙_肝素酶活性與該基質结合； (i i)將第一純化的含乙醯肝素酶分液從該基質中 洗出； (i i i)選擇性地將第一純化的含乙醣肝素酶分液 與經固定化金屬離子親和性色層分析基質接觸； x (i v)將該第一純化之含乙醢肝素酶分液與染料一 樹脂基質接觸Μ使乙醯肝素酶活性與該染料一樹脂基質结 合；及 (V)將第二純化的含乙醯肝素酶分液自該染料一樹 脂基質中洗出。 在此觀點，本發明也提供了具體的，用Μ上所述廣泛 的方法來純化哺乳動物之乙醯肝素酶，尤其是具體地純化 的人類血小板乙醢肝素酶之定性，其中之酵素用凝膠過漶 色層分析及SDS—PAGE分析所得之原始分子量（Μ r)約為50kDa，且其中之酵素可以分解肝素及硫酸 乙醯肝素（HS)。本發明具體純化所得之人類血小板乙 -12- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂·--------- 565614 A7 B7______ 五、發明說明（|1 ) 醯肝素醣可Μ分解牛肺及豬黏膜肝素從1 2kDa到分別 為6及4kD a之片段，而豬黏膜硫酸乙醯肝素用凝膠過 滤分析有分段式從22kDa到5kDa之片段。 本發明如上述之廣泛方法來純化乙醻肝素酶也可以用 來純化其他的乙醯肝素藺，包括鼠肝*老鼠的1 3762 MAT腺癌细胞及人類HCT 1 1 6大腸癌细胞乙醯 肝素酶。具體純化出之MAT及HC T细胞乙醢肝素酶有 與上述之人類血小板乙醯肝素酶類似的Mr ，而具體純化 出之老鼠肝乙_肝素酶之原始M r約為45 k D a且在S DS—PAGE上介於43及47kDa間有3條帶。 經過這個特別描述，除非是本文中需要其他的描述’ 否則字詞“包括（C o m p r i s e ) “或如“包括（C ompr i ses) “或“包括（Comprising )“，可M被了解到是暗示包括所述及之一完蝥的要件或 一組完整的要件，但不排除任何其他的完整的要件或一組 完整的要件。 發明詳述 由一觀點觀之，本發明乃特別關於檢測血清中之哺乳 動物乙醯肝素酶活性，其包括人類癌症病人的血清，及不 同的組镞及细胞均等質或萃取物，包括例如人類血小板， 大腸癌细胞，臍帶靜脈内皮细胞及老鼠乳腺癌细胞（轉移 及非轉移類）及肝均等質。本發明的方法可Μ用來決定人 類及非人類（如老鼠和miar i ne)血清，细胞及組孅 -13- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線- 565614 A7 _______B7_I_ 五、發明說明（/>) 均等質或萃取物中之乙醢肝素酶活性。 乙醢肝素酶受質最好是標記的受質，特別是放射線標 記的受質。受質最好是硫酸乙醯肝素（HS)且尤其偏好 受質為 3 Η —豬黏膜HS及3 Η —牛腎HS。最好豬黏 膜HS為用3 Η乙酸酐來部份去一 Ν —乙醢化或再一 Ν — 乙醯化來產生欲製得的放射線標記的受質。 如Κ上廣泛所述，欲測試樣本乃與乙醯肝素酶受質接 觸一段時間後，且樣本中有足量的乙醯肝素酶之情況下Κ 分解所加入的受質。適當的作用的時間及狀況可很容易來 決定。例如實施例中，樣本與受質作用的溫度可Μ在35 £0到401的範圍下來進行，而最好是在37¾，作用2 到4 8小時，而最好是1 6小時，在p Η為4 · 2到7 · 5，而最好是約5 · 1。偏好的作用方法是在牛血清蛋白 ，Ν —乙釀化甘露糖胺及/或清潔劑如Tr i t on — X 一 1 00下來作用。如M下詳述的方法，乙醸肝素酶活性 可在適當的時間及狀況下分解偏好的豬黏膜硫酸乙醸肝素 受質，而以階段式地從22到1 7，然後8而最後到5k Da片段或降解的產物分布。

被降解或部份降解或沒有降解的產物的分雛之方法是 將其结合到肝素一结合蛋白質上。如此處使用的方法，字 為“肝素-結合蛋白質“包括，但不限於肝素一结合蛋白 質。本發明方法中特別偏好的硫酸乙醯肝素一结合蛋白質 為富含組氨酸醣蛋白。最好的富含組氨酸醣蛋白（HRG -14- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------· 565614 A7 -___Β7 五、發明說明（） )是雞HRG，然而其他的HRG，包括人類HRG，也 可Μ被使用。而其可被分解，本發明乃延伸到其他硫酸乙 醯肝素及肝素一结合一蛋白質的使用而不是HRG,包括 ，例如，蛋白酵素抑制劑如抗凝血酵素111及肝素輔因 子1 1 ，·血漿脂蛋白，如上脂蛋白Β— 100及上脂蛋白

Ε ;生長因子，如酸及鹼纖維織母细胞生長因子，血管內 皮生長因子，肝細胞生長因子及從血小板獲得的生長因子 ;细胞外基質蛋白質，如板膜質，膠原及彈性蛋白質；酵 素如脂蛋白裂解酵素，過氧化氫異位酵素，细胞自溶酵素 ，彈性蛋白酵素及细菌肝素裂解酵素1 ，1 1 ，及1 1 I ;其他適合的结合蛋白質如血小板因子4，vonw i 1 1 ebrand因子，及/3 —凝血酵素蛋白球。本發明亦 延伸到從硫酸乙醢肝素或肝素一結合蛋白質所衍生的胜肽 ，尤其是含硫酸乙醯肝素或肝素一结合區域的HRG。 偏好的分離方法乃是结合的固定的肝素一结合蛋白質 。任何適合的固定化方法皆可已被使用，然而目前偏好將 H RG或適合的結合蛋白質固定到瓊脂糖*尤其是S e p harose珠。在此偏好的觀點中，HRG — Seph a r o s e珠可以裝填到管柱，而被用來分離的反應混合 物，其中所含的部份降解及未降解的乙醯肝素酶受質會結 合到HRG — Se pha r o s e珠上，而被降解的產物 其不會或較不會結合到HRG — S e p h a r o s e珠上 而會被洗出來。另外的方法，HRG或其他適合的结合蛋 -1 5 - 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ---------------------訂—丨------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 565614 A7 ___B7_ 五、發明說明（l4r) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 白質可Μ被加入此反應混合物Μ結合沒有降解或部份降解 的乙醯肝素酶受質混合物，而此混合物可以被分離，例如 ，用固定到受質的方法（例如Immob ί 1 on或St r a t aC 1 ean)而使在反應混合物中的被降解的乙 醯肝素酶受質片段*在將被固定的混合物被用如雛心或過 滅的方法移除後，而被分離。 本發明的觀點之方法中之最後步驟中，被分雛的降解 產物的檢測乃用K表示受測樣本中之乙醯肝素酶活性的存 在。此檢測步驟可包含定量及/或定性測量分解產物。當 放射線標記的乙醯肝素酶受質如3 Η豬黏膜H S被使用時 ，檢測步驟可包含未结合之分解產物之放射線活性量的測 量0 本發明之從乙醯肝素酶受質分離降解產物所提供的全 新方法的觀點上乃利用降解的乙醯肝素酶降解產物對硫酸 乙醯肝素一结合蛋白質如H R G的親和力降低來達到分離 的目的，尤其是利用雞的富含組氨酸醣蛋白（cHRG) 。反應混合物置入cHRG — Se ph a r o s e管柱之 中，混合物中含有的未结合物質*其相當於乙醢肝素酶分 解產物。乙醯肝素酶活性在不同的人類，老鼠及老鼠细胞 及組織均等質中已被確定。實施例中，高轉移性的老鼠乳 腺癌及老鼠的黑色瘤细胞株之乙醯肝素酶活性乃高於非轉 移性類的4到1 0倍，其乙醯肝素酶活性乃證實與轉移能 力有關連。人類的癌症病人之血清乙醢肝素酶活性乃高於 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 ___B7 _ 五、發明說明（〆） 正常健康成人的兩倍。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明提供了一個新的，簡單的且快速定量的檢測方 法來檢測哺乳動物乙醯肝素酶活性，其檢測自然的放射線 標記的受質來檢測極少的H S鐽切割數，此分割似可發生 於活體内，而其乃根據最新的理論，也就是H S鏈上之蛋 白質结合位置在切割後的喪失。在此檢測中，其優點乃利 用初步觀察到的H S —结合血漿蛋白質H RG掩蓋在H S 鐽上之乙醯肝素酶切割點的現象◊在乙醢肝素酶分解受質 後，放射線標定的HS片段（產物）並不會結合到有HR G结合的Se ph a r o s e珠的小管柱，而完整及部份 降解的受質則會结合到珠上，如此可達到快速分離切割後 產物及受質的目的。 本發明的檢測方法有許多優點優於傳統的方法，其乃 (a)易於準備大量的放射線標記的自然受質而能維持原 來的结構，（b)可K快速且同步測量大量樣本，（c) 允許準確地偵測受質單一切割點來定量乙醯肝素酶活性。 從另一觀點，本發明關於含乙醢肝素酶物質之哺乳動 物乙醯肝素酶活性的純化。用作本發明方法中起始物質之 含乙醢肝素酶的物質可Μ是任何哺乳動物乙醯肝素酶活性 來源，例如人類大腸癌HCT 116细胞株，老鼠乳腺 癌13762 MAT细胞株，或老鼠肝組嫌。然而，本 發明特別用於純化人類血小板乙醢肝素酶，而此物質之最 便利來源乃得自於將酵素活性從冷凍的，洗過的人類血小 -17- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 _ ·_B7__ 五、發明說明（4) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 板的均等質中溶解出來。含乙醯肝素酶物質乃進行固定化 外源凝集素親和色層分析，最好是伴刀豆球蛋白A — Se pharose色層分析，在有清潔劑（如Tr i ton 一 X — 1 00)存在下來將乙醯肝素酶活性结合到色層分 析法管柱。洗出的結合的乙醯肝素酶活性乃為第一被純化 出的分疲。 選擇性地，偏好將第一純化得之含乙醯肝素酶分疲乃 置入固定化的金屬離子親和色層分析（IMAC)，最好 是使用如Zn 2 + —整合Sepharose ，其不會結 合乙醯肝素醣活性但會移除其他的污染的蛋白質。第一純 化的含乙醯肝素酶分液乃隨後置入染料-樹脂色層分析法 ，最好是連續地再I MAC基質，以再一次结合乙醢肝素 酶活性。適合的染料一樹脂基質包括B 1 ue — A瓊脂糖 基質，雖然其他的染料如React iveRed也可以 被用，而其他的支持物如Se pha r o s e及丙嫌醯胺 凝膠也可Μ被使用。第二個從染料樹脂基質洗出的，純化 出含乙醯肝素酶活性的分液，可Μ接著進入辛基一瓊脂糖 色層分析法藉Κ將污染的蛋白質结合住而不會结合乙醢肝 素酶活性。 第二個純化出的含乙醯肝素酶的分液的最後純化步驟 可Κ用凝膠過滤色層分析法管柱來進行*例如S u p e r 〇 s e 1 2色層分析法*選擇性地將純化出的酵素濃縮。 如先前敘述，根據本發明的方法所獲得的產物乃具體純化 -1 8 - 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 ___B7_____ 五、發明說明（l7/ ) 所得之哺乳動物乙醯肝素酶活性，尤其是具體鈍化出之人 類血小板乙醯肝素酶。使用於本發明的特殊辭彙“幾乎純 化“意指用本發明的方法純化出的產品，此乙醯肝素酶酵 素活性，當其活性與含乙醯肝素酶之起始物質比較起來至 少有1 000倍純度，最佳地至少有1 500倍純度。 而且，該幾乎純化之哺乳動物乙醢肝素酶活性最好是 同質性的，且最好是至少7 5%重量百分比，甚至有重量 百分比為85% *而最好者有95到99%重量百分比的 乙_肝素酶酵素，相對於其他蛋白質，其乃Μ其一般與其 原形聯合在一起。 根據本發明的觀點，同質的人類血小板乙醯肝素酶可 從先前冷凍的，洗過的血小板純化出來。人類血小板已證 實和轉移的腫瘤细胞和其他的细胞比較起來* Κ活性/ mg 蛋白質表示時發現，含有非常高量的乙醯肝素藺活性。 在本發明的方法的一具體實施例中（詳述於K下的實 施例中），人類血小板乙醯肝素酶可純化到1 900倍純 度的同質性，且在5管柱方法下有1 9%產率，其包含伴 刀豆球蛋白A—Sepharose，Zn 2+ —整合S epharose，B1 ueA —瑰脂糖，辛基一瑰脂糖 及凝膠過漶色層分析法。相同的純化方法可Μ用來純化其 他的哺乳動物乙醯肝素酶活性，例如從人類大腸癌HCT 116细胞，老鼠乳腺癌13762 MAT细胞及從 老鼠肝。人類血小板乙醢肝素酶（可降解肝素及HS)其 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂---I-----' 565614 A7 ______B7_ 五、發明說明（θ ) 原始分子量用凝膠過濾色層分析法及SDS — PAGE分 析所得為50kDa。酵素降解豬黏膜HS乃Μ階段式的 從22到17，10及最後為5kDa片段存在，然而牛 肺及豬黏膜的肝素降解為從Μ凝膠過濾分析為1 2kDa 到分別為6kDa及4kDa的片段。 本發明進一步的细節將分明地詳逑於以下的實施例， 其乃用圖示來表示，而其並非本發明的限制，Μ及所附的 圖。 圖中： 圖1:HS的降解與培養的pH的關係。HS與老鼠 13762 MAT均等質培養於pH4，2 (〇），5 •1 (□) ，6·5(Δ)及 7.5(A)，及在沒有酵 素加入的情況下於ρΗ5·1 () 16小時，37°C。 培養混合物乃用S e p h a r o s e — 6凝膠過滤色層分 析法來分液。所示之標準分子量為a) 16*7，b) 1 〇，6，c) 6*7，d) 3.1 及 e) 0.2kDa〇 詳细情形，見方法中。 圖2 : HS的降解與培養時間的關係。HS乃與老鼠 1 3 7 6 2 MAT均等質作用於ρΗ5 · 1下2小時（ △ ) ，4小時（▲)即1 6小時（□)及在缺乏酵素加入 下4小時（_) 37*0。培養混合物乃用Sepharo s e — 6凝膠過濾色層分析法來分液。欏準分子量a — e 如圖1所述。詳细情形，見方法中。 -20- 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------------1--訂·-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 565614 A7 __B7 五、發明說明（/严）

圖3 :用轉移性的及非轉移性的老鼠乳腺癌细胞株均 等質降解的HScHS培養於PH5 ♦ 1下16小時，3 7 1，沒有酵素存在（_)，非轉移性DMBA — Sas k 的均等質（□)及 13762 MAT (J 一 cion e ) (▲)及高轉移特性的13762 MAT及DMB A — 8A細胞株（△)。培養混合物乃MSuperos e — 6凝膠過漶色層分析法來分液。標準分子量a — e如 圖1所述。詳细情形*見方法中。 圖4 : H S的降解與培養時間的關係及降解的H S產 物在cHRG — Se phar 〇 s e中的親和性。HS在 3 7 °C及p Η 5 · 1下培養2小時（□ ) ，4小時（△) 及16小時（▲)及在無酵素加入下4小時（)。培養 混合物置入cHRG — Sepha r 〇 s e管柱於PBS 下* KPBS洗滌而KNaC 1梯度濃液洗出分液。箭頭 表示NaC 1梯度開始處。一，NaC 1的濃度。詳细情 形，見方法中。 圖5:用cHRG抑制HS的降解。HS培養於pH 5 ♦ 1 ，8小時及37°C下，無酵素或cHRG加入（ )及和老鼠1 3762 MAT细胞均等質一起而有（△ )及無（▲) (cHRG:HS)K3:l的莫耳比例存 在。反應混合物乃以Super o s e6凝膠過濾色層分 析法來分液。檷準分子量a — e如圖1所逑。詳细情形， 見方法中。 -21- 泰紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

565614 A7 _ B7_ 五、發明說明（〆） 圖6 : HS的降解與培養時間的闞係。HS與老鼠1 3 7 6 2 MAT均等質培養於ρΗ5 · 1 ，2小時（口 )，4小時（▲ ) ，6小時（△ ) ，8小時（·）及1 0 小時（〇）在無酵素加入下4小時（)，在37t)下。 培養混合物乃被A) Sepharose6凝膠過濾色層 分析法及B)結合到cHRG—Sepharose管柱 (其中未结合的分液在每一個時點被測量）來分開及分液 。標準分子量a — e如圖1所述。詳细情形，見方法中。 圖7:人類血小板乙醯肝素酶的Superosel 2色層分析法分布。從步驟4來的血小板乙醯肝素酶及K 凝膠過濾（如方法中所逑）來純化。分液乃被測量乙醢肝 素酶活性（Ο)及監測蛋白質（一 A280)。箭頭1及 2分表表示小牛血清蛋白質及卵黃蛋白質的Ve。 圖8:純化的人類血小板乙醯肝素酶之SDS—PA GE。從步驟5純化所得知血小板乙醯肝素酶乃Μ二硫代 蘇糖醇來遷原而電泳於1 〇%的丙烯醯胺聚合物膠。實驗 詳情，見方法中。第一列，標準分子量；第二列，步驟5 之乙釀肝素酶。 實施例1

縮寫：bFGF，基本缩維孅母细胞生長激素；BS A，牛血清蛋白；cHRG，雞富含组氨酸醣蛋白；CN Br ，溴化氰；CR — HS，碳氧基還原之硫酸乙醢肝素 ;ECM，细胞外基質；G1 cA，醛醣酸；G1 cNA -22- f、紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

565614 A7 __B7 五、發明說明（Μ ) C f N 一 乙 醯 化 葡 萄 糖 胺 G 1 c N S n N 一 硫 酸 鹽 葡 萄 糖 胺 G 1 c N S 3 S $ 乙 醯 化 葡 萄 糖 胺 N $ 3 一 雙 疏 酸 鹽 9 h Η R G f 肝 素 富 含 組 氨 酸 醣 蛋 白 l H R G 富 含 組 氨 酸 醣 蛋 白 H S $ 硫 酸 乙 醯 肝 素 1 Η s P G f 硫 酸 乙 醯 肝 素 蛋 白 多 醣 H U V E C f 人 類 臍 帶 靜 脈 内 皮 细 胞 I d 〇 A 2 S 艾 杜 糖 醛 酸 — 2 — 硫 酸 鹽 N A M f N — 乙 醯 化 甘 露 糖 胺 1 P B S 9 磷 酸 鹽 緩 衝 生 理 食 鹽 溶 液 0 I 一 實 驗 材 料 • 從 肝 素 製 得 之 分 子 量 ( Μ r a V e ) 標 準 $ 1 6 ♦ 7 1 〇 • 6 t 6 • 7 及 3 • 1 k D a 乃 由 N ο V a N 〇 Γ d i s k ( G e η t 〇 f e e $ D e η m a r k ) ( K Γ i S t e η s e η e t a 1 > 1 9 9 1 ) 所 贈 0 豬 黏 膜 Η S ( 〇 R G 5 5 3 ) 乃 由 〇 r s a η o η I η t • B V 9 所 贈 ( 〇 s s > T h e N e t h e Γ 1 a η d S ) 0 P h a r m a c i a F i η e C h e m i c a 1 S ( u P P s a 1 a 9 S w e d e n ) 提 供 Ρ D 一 1 0 管 柱 D E A E 一 S e P h a r o s e 及 溴 化 氰 活 化 的 S e P h a r ο s e 4 B 0 S i s ID a C h e m i C a 1 C ο ♦ ( S t • L o U i s $ M 0 ) 提 供 牛 血 清 蛋 白 结 晶 ， 牛 肺 肝 素 f 軟 骨 素 A B C 一 裂 解 酵 素 t 聯 氨 水 合 物 及 聯 氨 硫 酸 鹽 0 3 H - -無水醋酸 (ε i 0 0 m C i / m rr 1 0 丨1 ) ( 於 甲 苯 溶 液 中 ) 乃 得 g A m e r s h a m I η t e r η a t i Ο n a 1 ( S y d n e y $ A υ s t r a 1 i a -23- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 B7 五、發明說明（，) ) 0 B e C k m a n η ί G 1 a d e s V i 1 1 e ， A u S t r a 1 i a ) 提 供 R e a d y S a f e 閃 爍 溶 液 0 D 〇 W e X A G 5 〇 W — X 8 ( 1 0 0 一 2 0 0 網 孔 Η + 型 ) 乃 得 自 B i o 一 R a d L a b ο r a t 〇 Γ ί e s ( R i C h ΙΏ ο n d C A ) 0 以 下 的 細 胞 株 乃 用 先 前 敘 述 的 方 法 來 培 養 及 收 取 • 轉 移 性 的 人 類 大 腸 癌 H C T 1 1 6 细 胞 ( S C h 1 e c h t e f e t a 1 1 9 8 9 ) 及 K Μ 1 2 S Μ ( Μ ο r i k a W a e t a 1 f 1 9 8 8 ) f 轉 移 性 的 老 鼠 的 惡 性 瘤 B 1 6 — F 1 〇 细 胞 $ 高 轉 移 性 的 1 3 7 6 2 M A 丁 及 D Μ B A — 8 A 老 鼠 乳 腺 癌 细 胞 f 及 其 非 轉 移 特 性 的 J 一 C 1 ο n e 及 D Μ B A 一 S a S k 细 胞 ( P a Γ i S h e t a 1 j 1 9 9 2 ) 9 人 類 臍 帶 靜 脈 内 皮 細 rTfet 胞 及 巨 噬 細 胞 株 U 9 3 7 ( B a Γ t 1 e t t e t a 1 1 9 9 5 ) 人 類 平 滑 肌 细 胞 f 人 類 肺 纖 維 绷 母 细 胞 及 人 類 角 質 细 胞 株 ( K D J ) 0 人 類 血 小 板 乃 用 B a Γ t 1 e t t 等 人 ( 1 9 9 5 ) 的 方 法 來 製 得 ο 老 鼠 的 L e w i S 肺 癌 細 胞 株 ( 轉 移 的 ( D 1 2 2 ) 及 非 轉 移 性 的 ( L L C ) 品 種 ) 及 老 £3 mi 的 肺 癌 细 胞 株 ( 轉 移 性 的 ( A 3 a ) 及 非 轉 移 性 的 ( s P 1 ) 品 種 ) 乃 由 D r ♦ J a m e s W * D e η η 1 s 9 損 贈 ( S a m U e 1 L U η e η f e 1 d 研 究 中 心 1 M ο u η t S i η a i Η ο s Ρ i t a 1 $ 丁 〇 Γ o n t ο 1 c a π a d a ) 及 D Γ 令 L e a -24- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨丨丨丨丨丨丨^^ .丨丨丨丨丨丨丨丨- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 ___B7__ 五·、發明說明（外） 醯肝素0RG553 (lOOmg)乃溶於2ml水，透 析4小時於一般的生理食鹽水及1 6小時於2公升的水於 41下的透析管中，其分子量切分為1 OkDa。透析溶 液混合 0 · lMTr i s — HC1 ，ρΗ8·0，其中含 有0♦lmg/mlBSA及2單位的軟骨膠ABC裂解 酵素，且反應於371下16小時。在2公升PBS，4 °C下透析1 6小時後，此溶液乃置入DEAE — S e ph arose 管柱（1·〇Χ6· Ocm)，其 MPBS 平 衡。管柱連續地M每1 2m 1 PBS及0 · 3M — NaC 1來洗滌，之後乃K1 Om 1的2M — NaC 1來洗出， 接著將其冷凍乾燥。此固體乃溶於最小量的水中，並用P h a rma c i a的PD — 1 0管柱來去鹽。在NaC 1 前的洗出液（用滴入的20%硝酸銀溶液來偵測）乃冷凍 乾燥來產生3 3m g的纯化的硫酸乙藤肝素。 純化出的硫酸乙醯肝素（26mg)乃溶於聯氨水合 物（1ml)中，其中含有聯氨硫酸鹽（20mg)，且 此混合物乃於1 OOt!中加熱2小時於加蓋的玻璃管中。 此混合物乃冷卻並乾燥於氮蒸氣中。加入甲苯（lml) ，乾燥反應物，並再重複此步驟兩次。其殘餘物乃溶於2 ml的1M — NaCl ，用PD — 10管柱來去鹽，而被 去鹽的物質乃通過一Dowex50X—8 (Na+形式 )管柱（1.0X6*0cm)，其乃用 10mlH2 0 接著洗滌。合併起來的流過管柱的物質及洗滌液乃冷凍乾 -26- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) • -—11111— )5J·111111!1 _ 565614 A7 _ B7_ 五、發明說明（〆） 燥以產生19mg的部份去一N—乙醯化的硫酸乙醮肝素 〇 此去一 N —乙醯化的硫酸乙醢肝素（19mg)乃溶 於 1ml 的 0*5M — NaHC0 3，其含有 10% (v :v )的甲醇*用冰浴冷卻到〇 °C，接著加入在甲苯中的 0*1〇11的3 1'1無水醋酸（5111(：1 ，500mCi/ mmol)，接著此混合物乃剌烈攪拌於0 t，3小時。 接著再加入0.1ml的Na 2 C0 3及0·05γπ1 的無水醋酸，並於0¾下搅拌30分鐘。此步驟乃再重複 兩次，.檢査p Η值，使其仍然保持鹼性，接著用醋酸將其 pH調成酸性的ΡΗ4 ♦ 0。在混合物被加熱到225後 ，甲苯乃用氮蒸氣來移除而此溶液乃用PD — 1 0管柱來 去鹽，此管柱乃用10% (ν : ν)的Μ純水溶液來平衡 。在3 Η —醋酸高峰出現前流出的放射線標記的物質乃被 冷凍乾燥產生2 Img的放射線標記的硫酸乙醯肝素，其 乃溶於1 0%的乙醇水溶液而成2mg/m 1 ，並貯存於 一 2〇υΜ便日後使用。 富含組氨酸醣蛋白一 Sepharose :雞富含組 氨酸醣蛋白（cHRG)係製備自雞血清，其係經由磷酸 纖維素離子交換層析製備（Rylatt等人，1981 )。該製劑的純度由SDS—PAGE測定，其中具有分 子量 135kDa 之單一 Coomassie Blue 染色帶被測得。該物質被濃縮為蛋白質濃度2毫克/ ¾升 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -I I I I I I 1 ·11111111 · 565614 A7 __B7_ 五、發明說明（4 ) ，抗PB S透析且儲存在一 2〇υ直到被使用。 牛肺肝素（50mg)溶於含有10% (V : V)甲 醇的10ml的0·5Μ — ΝαΗ(：0 3，並冷卻到4 °C 接著將5整數倍的0 ♦ 04m 1醋酸酐Μ每5分鐘的間隔 加入。pH值乃用1Μ的Na 2 C0 3保持8·0。反 應物再攪拌3 0分鐘，並接著將乙醯化的肝素於4¾下透 析16小時於5公升的1M—NaHCO 3，其中含有0 •15M的NaCl (偶合鍰衝溶液）。 c H R G (10mg)在2公升的偁合媛衝溶液中於 4C下透析1 6小時，並在4¾與前面準備的乙醯化的肝 素溶液混合3 0分鐘Μ避免c H RG的H S —结合位置與 Sepharose珠產生偶合。溴化氰（CNBr)活 化的Sepharose4B (2g)乃吸水膨脹於50 m1的ImM—HCI30分鐘，接著M150mM—Η C 1用磨光的漏斗在真空抽氣下來洗滌，接著用2 Om 1 的偶合鍰衝溶液來洗滌。洗滌後的C N B r — S e p h a r o s e於是立即加入肝素一 cHRG溶液並溫和地混合 24小時於41下。4m 1的偶合緩衝溶液中的2M —乙 醇胺溶液（用1M—HC1將pH調至8·0)被加入並 溫和地混合1 6小時。混合物接著倒入色層分析法管柱中 (1 · 5X5 · Ocm)及在4¾下Μ每次50m 1的偶 合緩衝溶液，0 · 05M — Tr i s — HC I媛衝溶液， PH8 · 0 (含有 2M — Nac 1)及最後的 PBS，4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) II----訂·-----I--*5^ ' 565614 A7 ____B7 五、發明說明（>S ) 7 * 5 ( 含 有 2 Μ — N a C 1 ) 再 用 P Β S 平 衡 後 即 可 重 新 使 用 0 乙 醯 肝 素 酶 活 性 & 可 以 用 凝 膠 過 濾 色 層 分 析 法 的 方 法 來 偵 測 其 法 為 將 反 應 混 合 物 置 入 S U Ρ e r 〇 S e 6 Η R 1 〇 / 3 〇 管 柱 中 ( P h a Γ m a C i a L Κ B Β 1 〇 t e C h 〇 1 〇 g y 9 U P P S a 1 a 9 S W e d e η ) 接 著 用 Ρ Β S 來 平 衡 0 P h a Γ m a c i a 的 F Ρ L C 糸 統 乃 設 定 流 速 為 0 • 2 5 m i / m i n 而 Μ 每 分 液 為 〇 ♦ 5 m 1 來 直 接 收 集 於 閃 爍 小 管 中 其 中 t 每 管 有 3 m 1 的 閃 爍 溶 m f 接 著 f 放 射 線 活 性 而 被 測 知 0 管 柱 乃 Μ 3 Η - -乙醯化葡萄糖胺 (22] ,D a ) •牛肺肝素 (1 2 • 5 k D a ) 及 從 肝 素 製 得 的 Μ r a V e * 標 準 分 子 量 ( 1 6 • 7 f 1 〇 • 6 $ 6 • 7 及 3 ♦ 1 k D a ) ( 其 Κ 備 用 上 述 準 備 放 射 線 標 記 的 Η S 的 方 法 Μ 3 Η - -醋酸酐來 部 份 去 一 N — 乙 醯 化 及 再 一 Ν 一 乙 醯 化 ) 來 校 正 0 放 射 線 標 記 的 軟 骨 素 — 6 — 硫 酸 鹽 及 碳 氧 基 被 遒 原 的 Η S ( 用 Κ a Γ a m a η 〇 S e t a 1 $ ( 1 9 8 8 ) 的 方 法 製 備 ) 也 用 Μ 上 的 方 法 來 製 備 0 Η S 與 C Η R G 一 S e P h a r 〇 s e 的 結 合 ，· 在 2 〇 〇 m 1 Ρ Β S 中 的 樣 本 乃 被 置 入 C Η R G — S e Ρ h a Γ 〇 s e 的 迷 你 管 柱 ( 0 • 5 X 4 • 0 m 1 ) 中 $ 其 乃 以 P B S 於 4 下 平 衡 0 此 管 柱 乃 以 2 m 1 的 Ρ Β S 來 洗 並 Μ 一 線 性 梯 度 的 P B S ( 2 X 1 〇 m 1 s ) 及 1 0 m Μ 的 -30- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 ___B7___ 五、發明說明（>/) 磷酸納鍰衝溶液，PH7 . 2，含有1 ♦ 2M — NaC 1 洗提，其流速為0 · η而Μ每分液為〇 · 5 m 1來直接收集於閃爍小管中，其中每小管加入4 m 1的 閃爍溶液，而放射線活性乃被測知。此管住可用PBS再 平衡以便下次使用。 I结果與討論 放射線標記的乙醯肝素酶受質的製備 先前乙醯肝素酶活性對於肝素或H S的研究乃使用聯 合藥劑來進行放射性碘化（Oosta等人，1982) (其可掩蓋可能的切割點）或先前用放射線標記的醋酸酐 將去一 N —硫酸鹽HS或肝素乙醢化（Nakaj ima e t al ，1986a)。然而，如已發表所述，後 面的方法會影響受質表面上的Mr ，且在肝素中產生對乙 醯肝素酶敏感的鐽结，其在先前已證實可抑抗老鼠的B 1 6瘤细胞的乙醯肝素酶活性（Nakaj ima等人，1 986a)。為了確定製造放射線標記，有生物活性的， 天然的受質來決定在不同的生物樣本中的乙醯肝素酶活性 ，純化出的豬黏膜HS乃用3 Η醋酸酐來部份地去一 N — 乙藤化及再一 Ν —乙醯化，而有一特殊活性為1 650到 2000cpm/pmo 1 ，其乃高達原來用14 c標記 的 HS 的 100 倍（Nakaj ima 等人，1986a )。標記過程最主要的優點為在受質中沒有新的或改變的 切割點被製造出來。此受質乃被貯存於一 20 °C, 10% -31- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -n n n n n n n 一δν · n n ϋ a— n ϋ n I - 565614 A7 _ B7___ 五、發明說明（P ) (v : v)的乙醇溶液中，在其中，受質可維持一年以上 的穩定，且沒有產生太多的分解的產物，除了重複地冰凍 及解凍外。豬黏膜HS (先前已被Hahnenberg er等人（1993)分雛出來）已被證實有分子量為2 2kDa且含有肝素酵素的對抗醣（dp為2到16), 其富含IdoA2S—G1cNS序列，此序列乃中介b FGF活性（Wa 1 ker等人，1994)。其亦含有 延長的亞硝酸對抗（含有G1 cNAc)序列，dp為6 到 14 一 16 (J · E · Turnbu 1 1 ，未公佈的發 現），因此含有可變的硫酸鹽化及非硫酸鹽化的區域的典 型的H S種類。 H S受質的乙醯肝素酶消化之分析

在一新的檢測乙醯肝素酶的方法還未建立之前，基本 上，放射線標記的HS乃一有效的且適當的，用一般的凝 膠過漶的方法來分離及定性分解產物的方法。去定義本研 究中乙醯肝素酶酵素分解的產物的特性亦極其重要。乙醢 肝素酶對放射線標記的受質的分解乃用高度侵入性的老鼠 乳腺癌细胞13762 MAT及人類血小板均質化物來 分析測量，因為從癌及血小板而來的酵素，從先前的研究 已證實有不同的受質專一性，其可分解H S —種而已或亦 可分別分解肝素及HS (Nakaj ima e t a 1 » 1 9 8 8)。為了避免接下來的外一酵素的對乙醢肝素 酶分解的產物的分解，5mM — N —乙藤化甘露糖胺（N -32- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線· 565614 A7 B7

五、發明説明（V am) 醵化葡 放出來 Η 在下 ，16 分析法 大小與 作比較 M r為 Η為6 ρ Η 6 延長Η 4 0小 不完全 或者是 個別的 ，在1 1或6 例子中 段（資 片段放 性物質 乃加入於反應混合物中Κ抑制3 Η —標定的Ν —乙 萄糖胺殘基在α — Ν —乙醢化葡萄糖胺活化後被釋 0 S乃與13762 MAT细胞均等質在ΝΑΜ存 起培養。於 ρΗ4.2，5· 1 ，6·5 及 7*5 小時，3 7Ό下而反應的混合物乃用凝膠穿透色層 (圖1)的方法來分析。乙醯肝素酶所得的產物的 一系列的放射線標記的肝素所得之Mr標準分子量 〇HS的最佳分解pH值為5· 1 ，而所得片段之 5kDa ，其分別與表面Mr8及16kDa在ρ • 5及7 ♦ 5比較。在pH4 ♦ 2下的分解速率比 • 5下慢，其有較不明顯的階段性的分解產物。再 S與1 3762 MAT细胞均等質培養的時間到 時，其導致在PH6 · 5及7 · 5下（資料未列） 的降解。為了確定不同的酵素活性是否表現出來， 在較高的ρ Η值下有不同的切割位置被製造出來， ，在pH為5· 1 ，6·5及7·5下降解的產物 6小時的反應下，被收集，去鹽，並在pH為5 · • 5下與新鮮的均等質再培養1 6小時。在每一個 ，每一個受試片段乃被降解成最小為5 kD a的片 料未列）。將5kDa的乙醯肝素酶消化後的產品 入DEAE — S e p h a r o s e可致使所有放射 仍舊结合，甚至在Ο ♦ 3M_NaC 1存在下依舊 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

• τ n n β-ϋ n n n · I n an n n an n n I A7 565614 B7 五、發明說明（/) 如此，其表示所有得自乙醯肝素酶消化的HS片段乃含有 高量的硫酸化的HS區域。 1 3 7 6 2 MAT细胞均等質與HS在ρΗ5 · 1 下培養2，4及1 6小時的培養時程，再一次地說明明顯 的切割點從2 2到1 6到8然後最後到5 k D a。其在ρ H5 · 1 ，6 ♦ 5，或7 ♦ 5下培養16小時，對於軟骨 素一 6 —硫酸鹽或碳氧基還原基的HS (CR — HS)沒 有活性（結果未列）。人類血小板均等質之乙醯肝素酶也 同樣地對CR — HS沒有活性，但其可切割HS成5kD a的片段，此片段可於DEAE — Sepharose在 0 ♦ 3M — NaC 1下被吸附。從不同细胞株來的均等質 ，包括高轉移性的人類大腸癌HCT1 16及KM12 — SM细胞株，人類臍帶靜脈内皮细胞（HUVEC)，老 鼠腫瘤B16—F10细胞及老鼠肝萃取物都在凝膠過滤 分析的方法下表琨出HS可能被水解成1 7，8及最後為 5kDa的片段於16小時的反應下（資料未列）’此表 示在所有细胞株中的乙醯肝素酶活性可Μ將H S切成類似 的大小的產物。先前的人類血小板，HUVEC，淋巴球 ，嗜中性白血球及白血球乙醯肝素酶活性之於牛内皮细胞 之ECM —结合的HSPG有活性，其亦形成類似大小的 HS被切割後的終產物（Vlodavsky等人，19 9 2)。 將高轉移性的老鼠1 3762 MAT及DMBA — -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ---------------------訂 ί n i^i 11 n 1— ββκκ I 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 565614 A7 _____B7 _ 五、發明說明（W) 8A细胞株及非轉移性的J — c 1 one及DMBA — S ask 來與 HS 培養，13762 MAT 及 DMBA -8A可導致HS完全分解成5kDa的片段，而J 一 c 1 ο n e及DMBA — Sa s k萃取物則僅部份分解HS成 分別為明顯的8及17kDa的片段（圖3)。高轉移性 的13762 MAT及DMBA—8A细胞株在先前的 研究中發現有較高的，可Μ分解人造的基層膜（Ma t r i ge 1)的活性，當與 J — c 1 one 及 DMBA — S ask在基層膜通透性檢測終必較時（Par i shet a 1 ，1 992)，因而證實移轉性潛力與乙釀肝素酶活 性的相關性（Nakaj ima等人，1983)。 因此，豬黏膜H S乃被認為是一種適當的，自然的受 質，可用來偵測不同種類的细胞，血小板及組镟萃取物中 的乙醯肝素酶活性，也可估計乙醯肝素酶的成份及腫瘤细 胞株的轉移潛力。然而，由於切割位置的多重性，用凝膠 過瀘的方法來分雛產物及沒有被消化的受質則使其很難精 準地定量乙醯肝素酶活性，尤其是當多重性的切割位置必 須發生Μ後產物可與受質分離的時候。此外，切割的相對 速率或每一個切割點的速率是否相同，及起始的消化後的 產物是否會因產物的抑制來影響後面的切割*尚不可知， 起導致檢測與時間並沒有線性關係，這樣的情形已在大部 分的H S分解之细胞外的活性的研究中被發現（Fr e e man and Hopwood» 1986* 1987 -3 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線· 565614 A7 B7

玉、發明說明（从） ,1989a，1989b)。缺乏定量乙醯肝素酶活性 加上用凝膠過«分析來分析單一的樣本所需的時間及工作 量使得一個快速的’定量極少量受質切割的乙醯肝素酶的 檢測法變得相當重要。 建立一個定量乙醯肝素酶的檢測方法 H S及肝素结合蛋白質之間的交互作用，如抗凝血酵 素I，酸性及鹼性的纖維織母细胞生長因子（FGF)， 血小板因子4，/? 一凝血酵素蛋白球及富含組氨酸醣蛋白 (H R G )和HS間的關係已有很多發表（Jackso n等人，1991)，最近也有許多研究來定義他們在Η S分子上*在化學（主要是硝酸分解）或细菌的乙醯肝素 酿及乙醯肝素酶消化的结合基體（Turnbu 1 1 a n d Gallagher，1990，1991;Tu rnbul 1 等人，1992;Walker 等人，19 94)。然而，不似哺乳類動物乙醢肝素酶活性所展現的 可從ECM釋放有活性bFGF (I sha i — Mi ch ael i等人，1990)，只有少數的研究發表HS结 合蛋白質與H S之間在哺乳類動物乙醯肝素酶活性分解後 的交互作用。 在研究雞的HRG (cHRG)(其乃大量存在的從 血漿來的HS—结合蛋白質）與HS的交互作用時，其被 觀察到不僅c HRG可掩蓋哺乳類動物MAT细胞乙醯肝 素酶在H S上的切割位置，其且在H S被乙醯肝素酶切割 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------· I -------訂·-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 565614 A7 ________Β7____ 五、發明說明（；}<) 後’在HS上的cHRG —结合基體乃喪失。因此，在乙 醯肝素酶消化後，被切的H S片段較不能有效率地结合到 cHRG聯合的Se pha r 〇 s e珠上，致使一種有效 率的’全新的，用Μ分離H S受質與乙醯肝素酶消化之產 物的方法得Μ建立。 當HS被置入cHRG — Se pha r 〇 s e管柱後 而被用鹽梯度於pH7 · 2下洗出時，相對的較微弱的结 合的HS乃在〇·27Μ—NaCl下被洗出（圖4)， 而肺肝素則在0 · 6M — NaC 1下被洗出（結果未列） 。然而，用1 3762 MAT细胞的均等質完全分解的 HS所產生之5kDa片段並不會结合到cHRG—s e pharos e。當HS被接著用13762 ΜΑ 丁细 胞乙醯肝素酶在ρΗ5 · 1 ，進行2，4，及1 6小時反 應的標準檢測法下分解時，檢測的混合液乃分為3部份並 用凝膠過漶色層分析法，结合到DEAE — s e p h a r ose及结合到cHRG — Sepharose的方法來 分析。凝膠過濾分析產生一個類似圖1的分布，其中分別 為17，8，及5kDa的產物。將檢測混合物置入cH RG — Se pha r 〇 s e管住再用鹽梯度洗出的放射線 摞記的H S產物展現出在凝膠過瀘中的H S片段之表面Μ r愈大，其物質在cHRG — Sepharose中則愈 無法與管柱结合，兩者之間有相互關聯（圖4)。在親和 性方面，HS片段與cHRG— Sepharose之間 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂·--------. 565614 A7 ____B7 五、發明說明（如） 並沒有因反應時間的加長，而有明顯的改變。HS與cH RG—Sepharose的结合（及HS在凝膠過滅分 析時的明顯Mr)並部會被僅含媛衝溶液的空白溶液，0 •lmg/ml—BSA，熱去活性酵素或具活性酵素與 H S —起在4 °C下經過色層分析法所影響（資料未列）。 在將反應混合物置入DEAE — Sepharose後， 所有的放射線活性在0 · 3M-NaC 1下仍留在管柱中 ，此表示被分解的產物，並不是由於内-硫酸鹽酵素所進 行的去硫酸鹽活性所致（Bart lettetal ，1 995 ； Dawes and Pepper，1992 ϊ W e 1 1 s and Dawes，1995) 0 為調査H S對H RG之结合是否發生在或於接近乙醢 肝素酶敏感分割位置，HSM1 3762MAT细胞均等 質消化，在沒有或於cHRG:HS之3:1莫耳比存在 下（HS呈現有3個潛勢分割位置，每一個可结合至HR G分子）。圖5顯示在cHRG存在下，與無cHRG下 之分割，其中受質被完全地降解，相比，HS (造成小片 段（5kDa)之生成）的降解速率被明顯地延遲。 乙醯肝素酶活性的測定 用cHRG—Sepharose的檢測方法*最高 的乙醯肝素酶活性在pH為5·1下觀察到，其與先前用 的凝膠過漶檢測方法觀察到的類似（圖1) 〇ΝΑΜ的加 入於反應混合物中乃用Μ抑制外切糖解酵素之醣蛋白的釋 -3 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 565614 A7 __B7__ 五、發明說明) 放3 Η — Gl cNAc ’而其並不會抑制與cHRG — S e pha r 〇 s e的结合。HS及被消化的產物與cHR G — S e P h a r o s e的結合並不會因反應混合物中含 有最終濃度為 0 · lmg/m 1 BSA，0· 1% (v : v) 丁 r i ton — X — 100 或高達 0 · 2M — NaC 1而受到影響，然而，組織均等質中的乙醯肝素酶活性則 會因檢測中含有〇 · 的Tr i tonX — 100而增 加兩倍。相對的，溶解的乙醯肝素酶活性（在用離心移除 细胞膜後）並不會因加入BSA或Tr i tonX - 10 0於反應混合物中而受到影響，而高純度的酵素製備需要 B S A存在於反應混合物中K增加活性及穩定性。有許多 用以決定H S分解的外切酵素活性的報告指出’用Μ決定 最佳的高純度的酵素活性，BSA是必須的，而Tr i t ο ηΧ — 1 00的存在，對於組織均等質的最佳活性則是 必須（Freeman and Hopwood » 19 86，1987，1989a，1989b，1992) 0 cHRG — Se pha r o s e管柱乃經常用商濃度的 鹽來洗，並用PBS來重新平衡。此管柱乃貯存於4^的 P B S下，而且在超過2年的不停使用，並不會有明顯的 結合容積降低的情形發生。 圖6中，比較HS用1 3762MAT均等質乙醯肝 素酶消化後產生的表面M r的變化（圖6 A )及將培養混 合物在置入c HRG — S e P h a r o s e後的未结合的 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — --------訂·-------- 565614 A7 _____B7___ 五、發明說明（汾） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 放射線活性HS片段的分布（圖6Β)。在6小時反應後 ，沒有與cHRG — Se ph a r 〇 s e结合的物質用凝 膠過滅分析後發現一表面Mr為17kDa的物質（结果 未列），用cHRG — Sepharose分析所決定的 酵素活性和時間的關係為線性的，其關係直到1 0小時的 反應，且有高達30%的受質轉換成產品（F i g6B) 。在延長的培養下（24小時），84%的放射性通過c HRG - Sepharose管柱且其表面Mr為5kD a。仍舊與管柱结合的物質，可能含有高親和力的HRG 一结合基體或為乙醯肝素酶反抗物質，此一現象尚未被研 究。沒有與cHRG — Sepharose结合的背景物 質通常是低Mr ，其小於6kDa，而其可代表先前從豬 黏膜中純化HS過程中，被切過的HS片段。此片段可K 在親和性純化HS受質前，用cHRG — Sepharo s e，來將其移除，或在凝膠過漶前移除此較小Mr的片 段。 人類 HRG(hHRG) — Sepharose 可 Μ 成功地取代c HRG — S e p h a r o s e來測量乙賭肝 素酶。然而hHRG的結合親和力對BALB/C3丁3 细胞表面HSPG而言較cHRG所觀察到的為低（Br own and Parish，1994)而其乃從 c HRG — Se pha r o s e對於豬黏膜HS的親和力高 於hHRG—Sepharose (结果未列）所表琨出 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 565614 A7 ____B7___ 五、發明說明) 來的高可看出。雞的HRG有另一儍點*其可從血漿中純 化出比hHRG高的產量（C · Par丨sh ，未發表的 觀察）。市面可購得的牛腎HS (1^1'171^〇8.)可以 用來取代豬的小腸H S來決定乙醯肝素酶活性。相對的， 市面上可購得的牛小腸H S並不能用來決定乙醯肝素酶活 性，因其Mr小於5kDa ，而用凝膠過濾及cHRG — S e p h a r 〇 s e分析時，哺乳類動物乙醯肝素酶活性 對其並不敏感。 在不同的生物樣本中的乙醯肝素酶活性的分析 不同的细胞株，組織及血小板均等質及從正常的及癌 症病人的血清乃用定量的cHRG — Sephar o s e 乙醯肝素酶檢測方法來測試他們的乙醯肝素酶活性。表1 中顯示高轉移性的老鼠乳腺癌13762MAT及DMB A - 8 A细胞株之均等質的乙醯肝素酶活性乃分別為4倍 及10倍高於相對於非轉移性的J 一 c 1 one及DMB A - Sa s k。這些數值高度相關於這些细胞株分解人工 的（Matr i ge 1)基層膜相對的能力（Par i s h等人，1992)及這些细胞均等質分解HS的能力（ 用凝膠過濾方法來分析，詳見前述）。轉移性的老鼠的L ewi s肺腫瘤（D122)及肺腫瘤（A3a)分解Η S的速率為2♦5及4·8倍快於其相對的非轉移性變異 (表 1) 〇Nakajima e t a 1 (1986a ，b)先前曾發表在不太有轉移性的B 1 6 — F 1次细胞 -41- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂·--------*5^ 565614 A7 B7 五、發明說明（ (J 一c 1 one) DMBA-BA Yes 35 . 6土3 ♦ 2 DMBA-Sask No 3 · 4土0 · 1 人類大腸癌細胞 HCT 116 Yes 1 0 . 3，1 0 · 4 人類單核球细胞 U 937 No 7 · 6，8 . 2 人類角質细胞 K JD No 7 . 8，1 0 . 2 老鼠的L e w i s D 1 22 Yes 1 6.4土 1 ♦ 1 肺癌细胞 LLC No 6 · 5土0 ♦ 5 老鼠的肺癌细胞 A3 a Yes 1 6 . 3土 1 · 2 SP 1 No 3 · 4土0 · 2 表2人類及老鼠的细胞及組織中的乙醯肝素酶活性 在不同的人類及老鼠組绷及培養的细胞中的乙醯肝素 酶活性的範圍，在用cHRG—Sepharose分液 培養混合物後，加以評估。詳细的情形，見方法中。 細胞或組織 乙醯肝素酶活性（pm〇 1/小時/毫克蛋白質) 人類血小板 2178 — 3591 (n = 6) 人類大腸癌細胞株(HCT 116) 38 · 2 — 66 . 6 (n=4) -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------I----訂--------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 565614 A7 B7 五、發明說明（ Η U V E C S 人類平滑肌细胞 人類肺纖維織母细胞 人類角質细胞（K JD) 老鼠13762ΜΑΤ细胞 老鼠肝细胞 2 1 .〇一42.6 (η=4) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 50 . 3，75 . 9 1 · 5，3 . 0 62 · 2，78 · 4 14 1 . 1-349.2 (η = 6) 9 · 5 — 28 . 3 (η = 6) 實施例2 縮 寫 l B S A 牛 血 清 蛋 白 f c H R G $ 雞 的 富 含 組 氨 酸 釀 蛋 白 H R G 9 富 含 組 氨 酸 醣 蛋 白 Η S > 硫 酸 乙 藤 肝 素 9 Η S P G f 硫 酸 乙 醯 肝 素 蛋 白 多 醣 Η U V Ε C 9 人 類 臍 帶 靜 脈 內 皮 细 胞 > Ρ B S f 磷 酸 生 理 食 鹽 水 緩 衝 溶 液 0 I — 實 驗 材 料 肝 素 衍 生 的 標 準 分 子 量 ( Μ r a V e ) 1 6 * 7 » 1 〇 * 6 f 6 • 7 $ 及 3 ♦ 1 k D a 乃 由 N Ο V a N 〇 Γ d i S k ( G e η t 〇 f e e f D e η m a r k ) ( Κ Γ i S t e η s e η 等 人 9 1 9 9 1 ) 所 贈 0 豬 黏 膜 Η S ( 〇 R G 5 5 3 ) 乃 由 〇 Γ S a η o n I η t ♦ B V $ 所 贈 ( 〇 s s 9 T h e N e t h e r 1 a η d s ) 0 Ρ h a r m a c i a F 1 η e C h e τη i c a 1 S ( U P P S a 1 a S w e d e η ) 提 供 伴 刀 豆 球 蛋 白 A 一 S e 4 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7

五、發明說明（从) P h a r ο S e 4 B ， 螯 合 一 S e P h a Γ 〇 S e 4 B 9 S υ Ρ e r ο S e 6 及 1 2 Η R 1 〇 / 3 0 凝 膠 過 狻 管 柱 9 分 子 量 標 準 藥 劑 組 ( 用 Μ 作 為 管 柱 及 S D S — P A G Ε 凝 膠 $ 及 辛 基 — S e P h a Γ 〇 S e 的 檷 準 分 子 躉 ) 0 S i S m a C h a ΙΏ 1 C a 1 C 〇 ( S t L 〇 U i s 9 Μ 0 ) 提 供 牛 血 清 蛋 白 結 晶 ( B S A ) 1 牛 肺 及 豬 黏 膜 的 肝 素 f 牛 腎 Η S s 3 3 — 二 甲 基 戊 二 酸 9 B 1 u e A 一 瓊 脂 糖 » 辛 基 一 瓊 脂糖 1 C Η A P S % 醋 酸 鉾 A m i C ο η C r 〇 P ( B e V e Γ 1 y 9 Μ A ) 提 供 C e η t Γ 1 C 〇 η 1 0 〇 及 3 0 微 濃 縮 器 0 B e C k m a m ( G 1 a d e S V i 1 1 e 9 A U S t Γ a 1 i a ) 提 供 R Ε A D Y S a f e 閃 爍 疲 0 S t Γ a t a s e n e U S A ( L a J o 1 1 a $ C A ) 提 供 s t r a t a C 1 e a η R e s i η 0 過 期 的 富 含 血 小 板 血 漿 仍 得 白 於 C a η b e r Γ a Η ο s P i t a 1 $ 其 乃 用 正 常 的 生 理 食 鹽 水 以 離 心 的 方 式 將 m 浮 的 血 小 板 用 1 6 〇 〇 X 9 1 5 分 鐘 % 於 2 〇 下 洗 兩 次 9 而 離 心 的 沈 澱 乃 存 放 於 — 8 0 1C 下 0 人 類 血 小 板 也 用 B a Γ t 1 e t t 等 人 的 方 法 ( 1 9 9 5 ) 用 正 常 的 生 理 食 鹽 水 洗 兩 次 0 细 胞 的 均 等 質 製 備 乃 將 血 小 板 1 〇 8 懸 浮 於 0 2 m 1 的 0 1 % ( V V ) 的 液 狀 的 Τ r i t 〇 η X 一 1 0 0 中 $ 並 在 固 態 C 0 2 / 乙 酵 混 合 物 中 > 冰 凍 及 解 凍 3 次 Μ 製 成 0 蛋 白 質 濃 度 乃 用 Β 1 〇 -4 6 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % 訂---------線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 _______B7___ 五、發明說明（g) 一 Rad C〇〇mass i e蛋白質檢測藥劑組（Bi 〇 - Rad Laborator ί es »Richmo 來測量，而MBSA為定量標準。 1 一實驗方法 放射線標記的受質的製備 放射線標記的豬小腸黏膜硫酸乙藤肝素（0RG55 3) ’豬小腸黏膜及牛肺肝素乃用實驗例1中的方法來製 作’所用方法為用聯氨來N —去乙藤及用3 Η —無水醋酸 來Ν —乙醮化。 乙醯肝素酶分析 分析1 *人類血小板乙醯肝素酶之於HS的活性之決 定及使用雞富含組氨酸醣蛋白（cHRG) — Sepha r 〇 s e珠來分離產物及受質乃採用實施例1中的方法。 多至2 w 1的樣本乃被加入培養混合物中，此混合物含有 90pmo】的放射線標記的HS於0 · 05M —醋酸鈉 鍰衝溶液中，pH為5 · 1 ，其中含有5mM — N —乙酿 化甘露糖胺及0 · lmg/m 1 BSA，總體積為2〇u 1 ，反應於37¾中適當的時間，Μ產生介於5到20% 的受質分解成產品。此反應乃用冰凍試管的方式來终止， 此反應乃用冰凍試管的方式來終止，0 · 3m 1的冷的ρ B S乃被加入，此溶液若需要，則需離心於4它下，接著 將 0‘ 1ml 的樣本置入 cHRG—SepharoSe 迷你管柱中（PBS做預平衡）。此管柱乃用0 ♦ 7m ί 一 4 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） 丨」-----------Φ--------^---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 565614 B7 五、發明說明（P) 的P B S洗滌，洗滌液及流過管柱的物質乃放入一閃爍小 管子，加入1 〇 m 1的閃爍溶液，而放射線活性則可被測 知。酵素活性乃Μ每小時每mg的蛋白質有多少pmo 1 產物來表示。 分析2 ·乙醯肝素酶對2 y g的放射線標記的HS或 肝素類似物的活性乃用上述的方法，於3 7 °C下1 6小時 來檢測，其可用凝膠過滤分析法* MS u p e r o s e 6 (用來檢測HS的分解）來檢測培養混合物。色層分析法 管柱乃用PBS來平衡及設立，流速定在0 · 25m 1/ mi η ，每分液0 · 5ml來收集於閃爍管中，此管有3 m I的閃爍液體加入，而放射線活性則可Μ被決定。管柱 乃以3 Η—乙醯化葡萄糖胺（221Da)，牛肺肝素（ 12 ♦ 5kDa)及從肝素製得的Mrave ♦標準分子 量（16·7，10·6，6·7 及 3，lkDa)(其 已被用上逑準備放射線標記的H S的方法M3 Η —醋酸酐 來部份去一Ν—乙醯化及再一Ν—乙醯化）來校正。放射 線標記的軟骨素一6—硫酸鹽及碳氧基被堪原的HS (用 Karamanos等人，（1988)的方法製備）也 用Μ上的方法來製備。 血小板乙醯肝素酶的純化 所有的方法皆在4 °C下進行，除非另行註解。乙醢肝 素酶對H S之活性的決定乃採用分析1中的方法。在每一 個步驟中（除了步驟3中用〇 · 8Μ — NaC 1洗滌Β 1 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '1------^ ·11111---· A7 565614 ___B7______ 五、發明說明（川） ια e A —瓌脂糖外），用媛衝溶疲來洗管柱，直到沒有任 何可Μ用B i 〇 — R a d檢測到的蛋白質被洗出為止。 步驟1 酵素活性的溶解：5 0單位的冰凍的，洗過的人類血 小板乃溶化並懸浮於4倍體積的1 5 m Μ二甲基戊二酸納 鹽緩衝溶液，ρΗ6 ♦ 0，其中含有0，5Μ — NaC 1 (緩衝溶液A)，而樣本在浸入一固態C02/乙醇浴中 後，冷凍/解凍三次。懸浮的血小板均等質用3 6 0〇〇 X g離心60分鐘後，將上清液用於步驟2中。沈澱下來 的物質乃懸浮於2 0 0 m 1的媛衝溶液A，再冷凍/解凍 一次，再用上述的方法離心一次。此步驟在最後將沈澱物 用含有1% (v : v) CHAPS的媛衝溶液A均質化後 ，再重複兩次，且用上述的方法離心。在CHAPS上清 液中的乙醯肝素酶活性乃用Μ下的方法純化，但不包括加 Tr i tonX — 100到步驟2中的萃取物中。 步驟2 伴刀豆球蛋白A-S e p ha r 〇 s e色層分析法： 步驟1中的上清液乃K0 · 2%溶於Tr i t onX—l 0 0 ( v ： v )，並將其置入流速約為1 m 1 / m i n的 伴刀豆球蛋白A — Sepharose管柱中（1 ·5Χ 5 * 0 c m )，此管柱乃以含有〇.2%TritonX 一 100 (鑀衝溶液B)的鑀衝溶液來平衡。此管柱乃接 著用25m 1的媛衝溶液B及40m 1的媛衝溶液六在4 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂·-------丨*^ · 565614 A7 --------B7_ 五、發明說明（心） Ό下交替的來洗，接著乃以預熱到2〇lC的4〇ΓΠ 1嫒衝 溶液Α來洗。乙醯肝素酶活性乃用4〇m丨的媛衝溶液a (含有2〇%α —甲基甘露醣（w ; v))洗出，此媛衝 溶液預先預熱到2 Ot：。洗出液乃收集於在冰中的小管的 乘器中。 步驟3

Zn 2 + —蟹合 Sepharose/BI ueA — 瓊脂糖色層分析法·♦從步驟2中的酵素溶液乃置入一流速 為Iml/min的Zn 2 +—蟹合Sepharose 管柱（l.OxiOcm)，其Μ連縝的方式連接到B1 ueA —壤脂糖管柱（1 ♦ 〇χ2 ♦ Ocm)。未連接的 B 1 ueA -瓊脂糖管柱先用含0 · 5M — NaC 1的2 0ml 的 Tr ί s 緩衝溶液（60mM — Tr i s/HC 1媛衝溶液，ρ Η 7 · 4 ,含1 〇 % ( v ; v )甘油）， 及1 · 5ml的含0 · 8M — NaCl的Tr i s的緩銜 溶液交替來洗之後，將聯絡後的管柱，用50m 1的媛衝 溶液A來洗。 步驟4 B ] u eA -瓊脂糖/辛基一瓊脂糖色層分析法：步 驟3中的B i u eA —瓊脂糖管柱乃與辛基一瓊脂糖管柱 (1♦0X1·5cm)聯合，後者乃用含有2M—Na C 1的T r i s的媛衝溶液來平衡。B 1 u e a -瓊脂糖 管柱乃用含有2M — NaCl的Tr丨sl5mlM流速 -50- 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) • — — — — — — — ·11111111 . 565614 A7 _B7 五、發明說明（（^) 為0 ♦ 5m 1 / m i η來洗滌。辛基一瓊脂糖之洗出液乃 立刻用Ami con的超膜過濾攪拌器ΜΡΜ10膜來濃 縮，接著用Centr i con30的離心將最後體積濃 縮成0 ♦ 2ml 。加入含有10% (v ; v)甘油的媛衝 溶液A (媛衝溶液C )並將酵素溶液再次濃縮到0，4 τη ' 1 〇 步驟5

Slip e r 〇 s e 1 2色層分析法：從步驟4濃縮所 得的酵素溶液乃Μ成份二涸2 0 0 // 1部份置入二個以串 聯方式聯結的Supe r 〇 s e 1 2HW1 0/30管柱 。此管柱乃Μ媛衝溶液C用流速為0 · 5m 1/m i η來 平衡。Κ0 · 5m 1為收集單位的分液乃用以作乙醢肝素 醏活性的檢測，而含乙醯肝素酶活性的分液乃用C e n t r i con30離心管來濃縮成0 ·4τη1 。純化的酵素 在4¾的媛衝溶液C下貯存，可保數個月的穩定。 步驟6

Centr i conlOO及30離心：從少於20 單位的洗過的血小板所得之血小板製備產物，其從步驟4 的辛基一 Se p h a r o s e管柱所得之2M — N aC 1 洗出液乃用Centr i conlOO的微量離心器濃縮 ，而含有乙醯肝素酶活性的過«液乃用Cen t r i c 〇 η 3 0的濃縮並用媛衝溶液C的透析，其方法如步驟4所 述。 -51- 幸、紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # -------訂---------- 565614 A7 B7 五、 發明說明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的細胞膜中的酵素可Μ用均質化於含1% (v : v) CH APS的媛衝溶液Α中來將其釋放。用含有l%Tri t 〇n X—100的媛衝溶液A來均質化细胞膜Μ溶解酵 素的方法，則會很快地喪失酵素的活性。留在细胞膜中的 酵素可Μ從5 0單位的洗過的血小板用分雛溶解的酵素相 同的方法來純化。 所有置入伴刀豆球蛋白A—S e p h a r 〇 s e管柱 之酵素活性在清潔劑存在下緊緊地结合住。在20 °C下， 用媛衝溶液A來將更多的结合的非專一性蛋白質去除，然 後再於4 °C下洗滌此管柱。酵素活性的回收率及洗出液的 速度（在少於5個管柱體積的洗出液）在2〇υ下洗管柱 與在來洗比較起來大大的提高了。有1 9倍純度及5 6%回收率的乙醯肝素酶活性乃從原來的血小板上清液上 純化出來（表3)。本步驟所得之酵素活性的回收率的範 圍，通常為55到70%。沒有進一步的乙醯肝素酶活性 可Μ用含有alpha —甲基甘露醣及0 . l%Tr i t on X — 1 00的媛衝溶液在20¾下從管柱中洗出。用蝥合 的S e p h a r o s e及染料一基質色層分析法的方法（ 其已被成功地用來純化分解H S的外切一酵素活性（B i elicki e t al，1990;Clement s，et al ,1985；Freeman and Hopwood，1986，1987，1989))先 前還未用於分離哺乳類動物乙醯肝素酶活性。此酵素並不 -5 4 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 B7___ 五、發明說明（0) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 會與鋅一螯合管柱结合，而可Μ緊緊地與染色管柱结合而 使分解肝素的外切一酵素活性alpha - L —艾杜糖醛酸酵 素，beta —D —醛醣酸及 alpha _N —乙醯化葡萄糖胺 與血小板乙，醯肝素酶完全分離（结果未列）。在沒有结合 的分液中或用低鹽（0 . 5及0 . 8M — NaCl) Tr i s媛衝溶液洗滌的染色管柱中並不能偵測到乙釀肝素酶 活性。用高濃度的鹽（2M — NaC 1)從B 1 ue — A 一瓊脂糖管柱洗出乙醢肝素酶，會導致大部分為污染的， 可與辛基一瓊脂糖管柱结合的蛋白質，而此不結合的乙醯 肝素酶則可用最後的凝膠過滹色層分析法來純化得到純度 極高的且濃縮的乙醯肝素酶。酵素並不會與辛基一瓊脂糖 结合，而其可與辛基一 Se pha r o s e在2M_Na C 1下结合，但卻可以用1M — NaC 1把它從管柱中洗 出（結果未列）。乙醯肝素酶活性的純度乃進一步用步驟 2的方法純化到80倍，而使得最後的總純度為1 500 一倍，而活性的回收率為26%螯合一 Se p h a r o s e管柱或辛基一瓊脂糖管柱用分別含0 . 1 M -二氮二烯 五圜及1%的Tr〗tonX — 100的媛衝溶液Α —將 剩下的结合的蛋白質從管柱中洗出後，並不能增加任何的 活性。此外，在用Centr i con30處理極純的濃 縮的酵素所得之過濾疲中並不似Hoogewer f e t a 1 (1995)所稱，含有乙醯肝素酶活性。 步驟4之凝膠過濾色層分析法（圖7 )的方法得到一 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 B7 五、發明說明（4 ) 一次比起來*似乎是被K階段式的方式切二次。然而，不 像Hoogewerf等人（1 995)的發表的，本發 明中不管是用純化出來的酵素或步驟1中的均等質乙醯肝 素酶之延長培養的時間，皆沒有發現主要為以雙醣為主要 的從H S或肝素（或修改過的肝素）切割成產物，即使是 在用那些作者所逑的用遷原劑或氧化劑預先處理酵素之後 來反應，亦如此。 表3 來自人類血小板之乙醯肝素酶之純化 丨丨-----------%--------β---------$·· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 步驟 乙醯肝素 酶活性 (iuaol/h) 蛋白質總量 (飑） 比活性 (nmol/h/mg) 純化度 (倍數） 產量 % 1. 均等質 12192 3465 3.52 - 霉 上清液 9892 2098 4.72 1 100.0 離心沈澱物 (pellet) 4480 552 8.12 (1.7) .- 2. 伴刀豆球蛋白A— Sepharose 5523 63.1 87.53 18.5 55.8 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565614 A7 B7 五 、發明説明（0) 一 1 3. ----- — Zn-Sepharose/ Blue—琪脂糖/ 4. 辛基-瓊脂糖 2579 0.37 6970.3 1476.7 26.1 5. Superose 12 1873 0.24 7804.2 1653.4 18.9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # I訂 參考文獻

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Claims (1)

1. A8B8C8D8 565614 六、申請專利範圍 肝素結合蛋白質為一種富含組氨酸的醣蛋白。 9. 根據申請專利範圍第8項的方法，其中該富含組氨 酸的醣蛋白為雞的富含組氨酸的醣蛋白。 10. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該硫酸乙 醯肝素結合蛋白質係被固定化。 11 .根據申請專利範圍第1 0項的方法，其中該硫酸乙 醯肝素結合蛋白質係藉由結合至瓊脂糖珠上而被固定化。 12 .根據申請專利範圍第1項的方法，其中該樣本係 與該乙醯肝素酶受質於35D至40¾的範圍之溫度，在pH為 4· 2至7 .5的範圍下接觸2至48小時。 1 3 ♦根據申請專利範圍第1 2項的方法，其中該樣本係 與該乙醯肝素酶受質於約37¾之溫度，在約ρΗ5 · 1下接觸約 1 6小時。 1 4 . 一種使用於檢測樣本中哺乳動物乙隨肝素酶受質 的套組，其K分開的形式，包括： i .乙醯肝素酶受質； 11. 硫酸乙藤肝素結合蛋白質；及 iii .選擇性地，用K進行根據申請專利範圍第1至13 項中任一項的本發朋方法之說明書。 1 5，·根據申請專利範圍第i 4項的套組，其中該乙醯肝 素醏受質為被標記的受質。 1 6 .根據申請專利範圍第1 5項的套組，其中該乙_肝 素酶受r為一種被放射悖同位素標記的受質。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂： 565614 A8B8C8D8 六、申請專利範圍 組 套 的 項 一 任 中 〇 項素 ΛΟ 1 肝 至醯 4 i 1 乙 第酸 圍硫 範為 利質 專受 請酶 申素 據肝 根醯 . 乙 17該 中 其 乙 酸 硫 。 該素 中肝 其醯 ， 乙 組酸 套硫 的腎 項牛 7— 1 或 第素 圍肝 範醯 利乙 專酸 請硫 申膜 據黏 根豬 為 18素 肝 醯 乙肝 酸醯 硫乙 該酸 中硫 其腎 ， 牛 組H 套 3 的 或. 項素 18肝 第醯 圍乙 範酸 利硫 專膜 請黏 申豬 據 Η 根 3 . 為 19素 肝。 醯素 乙 酸 硫 該 中 ο 其白 ， 蛋 組醣 套的 的酸 項氨 4 1 組 第含 圍富 範種 利一 專為 請質 甲白 據蛋 根合 . 結 2 素 肝 •醜 組 含 富 該 中 其 5 ο 組白 套蛋 的醣 項的 20.酸 第氨 圍 組 範含 利富 專的 請雞 申為 據白 根蛋 1 _ 2 酸 氨 乙 酸 硫 該 中 其 組 套 的 項 4 1 ο 第化 圍 定 範固 利被 專係 請質 申白 據蛋 根合 . 結 2 素 肝 醯 乙 。 酸化 硫定 該固 中被 其而 , 上 組珠 套糖 的脂 項瓊 22至 第合 園結 範由 利藉 專係 請質 申白 據蛋 根合 . 結 23素 肝 醯 醯 乙 物 39 乳 哺 化 純 中 質 物 ： 的驟 酾步 素下 肝 Μ 醯括 乙包 含其 S , 6Ε bpA 種法 1 方 . 的 4* 2 酶 素 肝 定 固 經 與 下 在 存 劑 潔 清 在 質 物 的 酶 素 肝 醯 乙 含 將 分 層 色 和 親 素 集 凝 源 外 的 化 醯 乙 使 觸 接 質 基 活 酶 素 出 洗 中 質 基 該 從 液 分 酶 素 肝 醯 乙 含 的 化 ; 純 合 一 结第 質將 基 . 該II 與 性 與 液 分 酶 素 肝 醯 乙 含 之 化 純 1 第 該 將 地 性 擇 選 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格<210 X 297公釐) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A8B8C8D8 565614 々、申請專利範圍 經固定化的金屬離子親和色層分析基質接觸； (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) iv .將該第一純化之含乙醯肝素酶分液與一染料-樹 脂基質接觸Μ使乙醯肝素酶活性與該染料-樹脂基質結合 ;及 ν.將第二純化的含乙醯肝素酶分液自該染料-樹脂基 質中洗出。 25 .根據申請專利範圜第24項的方法，其中該含乙醯 肝素酶的物質包括人類血小板。 26 .根據申請專利範圍第24或2 5項的方法，其中該經 固定化的外源凝集素親和色層分析基質包括伴刀豆球蛋白 (cone anavalin-A) -Sepha rose基質。 27 .根據申請專利範圍第24項的方法，其中該清潔劑 包括 Triton X-100。 28 .根據申請專利範圍第24項的方法，其中該經固定 参 化的金屬離子親和色層分析基質包括Ζ η2 + -螯合Sepharose 基質。 2S .根據申請專利範圍第24項的方法，其中該染料-樹脂基質包括Blue A-樹脂或Reactive Red-樹脂基質。 3 0 .根據申請專利範圍第2 9項的方法，其中該染料-樹脂基質包括瓊脂糖，Sepharose或丙烯醯胺。 31·根據申請專利範圍第24項的方法，其包括進一步 將第二純化之含乙薩肝素酶分液與辛基-瓊脂糖基質接觸以 除去污染的蛋白質之步驟。 >4- ' 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 565614 A8B8C8D8 々、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 3 2 ♦根據申請專利範圍第2 4項的方法，其包括進一步 純化該第二純化之含乙醯肝素酶分液或凝膠過濾色層分析 之步驟。 33 ♦根據申請專利範圍第32項的方法，其中該凝膠過 濾色層分析包括Superose 12色層分析。 34，根據申請專利範圍第2 4至3 3項中任一項的方法， 其中該哺乳動物乙醯肝素酶為幾乎純化之人類血小板乙醯 肝素酶，其具有下列特徵： i·當經由凝膠過濾色層分析及經由SDS-PAGE分析時， 其具有約為50kDa之原始分子量（Mr);且 Π.其可K降解肝素及硫酸乙醯肝素。 3 5 ·根據申請專利範圍第3 3項的方法，其中該幾乎純 化之人類血小板乙醯肝素酶特徵在於經由凝膠過滤分析其 可K將牛肺及豬黏膜肝素自12 kD a降解至分別為6及4 kD a之 片段，且Μ —種分段方式將豬黏膜硫酸乙醯肝素自22kDa 降解至5kDa之片段。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X 297;釐)