ES2350279T3 - Procedimiento de determinación de una actividad de enzima endoglicosidasa (heparanasa). - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación de actividad de enzima endoglicosidasa, que comprende las etapas siguientes: i. poner un sustrato de endoglicosidasa en contacto con una muestra que contiene endoglicosidasa bajo condiciones suficientes para la degradación del sustrato por la endoglicosidasa. ii. separar los productos de degradación del sustrato no degradado o parcialmente degradado mediante la unión del sustrato no degradado o parcialmente degradado a una proteína de unión a heparán sulfato unida a una fase sólida, preferentemente, a la protamina proteína policatiónica. iii. medir la reducción de sustrato intacto relacionada con la actividad endoglicosidasa en la muestra. en el que el sustrato es marcado directa o indirectamente con un primer miembro de un par ligando/receptor, y la cantidad de sustrato intacto se determina midiendo una señal emitida por el sistema de detección, unido al segundo miembro del par ligando receptor.

Description

Campo y estado de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de actividad de enzima endoglicosidasa, en particular, del tipo heparanasa, en una muestra, y en una realización preferente, a un procedimiento para la detección de compuestos capaces de modular la actividad de una endoglicosidasa y, en particular, de una endoglicosidasa que tiene actividad del tipo heparanasa.

Las endoglicosidasas son enzimas capaces de catalizar reacciones de escisión dentro de cadenas glicosídicas.

La heparanasa es una enzima capaz de escindir polímeros que comprenden unidades glicosaminoglicano (GAG), tales como, por ejemplo, glicosaminoglicanos heparán sulfato (GSGAG o HS).

Los proteoglicanos heparán sulfato (HS-PG) son macromoléculas complejas asociadas con la superficie celular de la matriz extracelular (ECM) de una amplia variedad de tejidos y células de origen humano y no humano (David G. FASEB J. 7: 1023-1030, 1993; Bernfield M. et al., Ann. Rev. Cell Biol. 8: 365-393, 1992; Bernfield M. et al., Ann. Rev. Biochem. 68: 729777, 1999; David G. et al., Matrix Biol. 17:461-463, 1998; Kjellen L. et al. Annu. Rev. Biochem.

60: 443-475, 1991; Esko J. et al., Clin. Invest. 108:169-173, 2001; Kuschert G.S. et al., Biochemistry 38:12959-12968, 1999).

La estructura principal de HS-PG consiste en una proteína núcleo, a la cual están fijadas covalentemente una o varias cadenas heparán sulfato. Las cadenas polisacáridas lineales consisten generalmente en subunidades disacáridas repetidas compuestas de ácido L-idurónico (o como alternativa, ácido glucurónico) y glucosamina. Estos disacáridos son sustituidos en un grado variable con grupos sulfato enlazados con N u O y residuos acetilo enlazados con N. El patrón de sustitución, resultante de la actividad de varias enzimas (por ejemplo, C5-epimerasa, 2-O-sulfotransferasa, 6-O-sulfotransferasa, 3-O-sulfotransferasa, Ndeacetilasa / N-sulfotransferasa, etc.), conduce, al menos en parte de una manera no aleatoria, a la formación de una estructura de dominio dentro de la cadena HS que permite la interacción específica con un gran número de ligandos, tales como factores de crecimiento, quimiocinas, etc. (Esko J. et al., Annu.Rev. Biochem. 71: 435-471, 2002; Handel T.M., Annu. Rev. Biochem. 74:385-410, 2005; Lindahl U. et.al., J. Biol. Chem. 259:12368-12376, 1984). Las cadenas HS pueden exhibir una gran diversidad, debido al número variable de unidades disacáridas y a su secuencia (resultante de las diferentes sustituciones que conducen a una estructura de dominio), que puede diferir de una cadena a otra. La heparina tiene la misma estructura disacárida básica que HS, pero difiere de HS en que está más altamente sulfatada y contiene más ácido idurónico de variante isomérica (David G. FASEB J. 7:1023-1030, 1993; Bernfield M. et al., Ann. Rev. Cell Biol. 8: 365-393, 1992; Bernfield M. et al., Ann. Rev. Biochem. 68: 729777, 1999; David G. et al., Matrix Biol. 17:461-463, 1998; Kjellen L. et al., Annu. Rev. Biochem.

60: 443-475, 1991; Esko J. et al., Clin. Invest. 108:169-173, 2001; Kuschert G.S. et al., Biochemistry 38:12959-12968, 1999, Esko J. et al., Annu. Rev. Biochem. 71: 435-471, 2002; Handel T.M. et al., Annu. Rev. Biochem. 74:385-410, 2005).

La ECM de los diversos tejidos está compuesta de una variedad de proteínas matriz, por ejemplo, diferentes tipos de colágenos, etc., y diferentes proteoglicanos, que resultan en una arquitectura de tejido compleja.

La membrana base (lámina basal) está compuesta de una red compleja de diferentes tipos de laminina, nidogen y colágeno de tipo IV, que interactúan con las cadenas HS altamente cargadas de diferentes proteoglicanos heparán sulfato integrados en esta red (Paulsson M. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27: 93-107, 1992; Timpl R., et al. Matrix Biol. 14: 275-281, 1994; Timpl R. Curr. Opin. Cell. Biol. 8:618-624, 1996; Groffen A.J., Nephrol. Dial. Transplant. 14, 2119-2129, 1999; Yurchenko P.D., FASEB J. 4: 1577-1590,1990; Colognato H. et al. J. Cell Biol. 145, 619-31, 1999).

HS-PG participa en muchas funciones biológicas, incluyendo organogénesis y control del crecimiento, adhesión celular y migración, señalamiento, inflamación, cicatrización de heridas, angiogénesis, invasión tumoral y metástasis (David G. FASEB J. 7: 1023-1030, 1993; Bernfield

M. et al., Ann. Rev. Cell Biol. 8: 365-393, 1992; Bernfield M. et al., Ann. Rev. Biochem. 68: 729777, 1999; David G. et al., Matrix Biol. 17:461-463, 1998; Kjellen L. et al., Annu. Rev. Biochem.

60: 443-475, 1991; Esko J. et al., Clin. Invest. 108:169-173, 2001; Kuschert G.S. et al., Biochemistry 38:12959-12968, 1999, Esko J. et al., Annu. Rev. Biochem. 71: 435-471, 2002; Handel T.M. et al., Annu. Rev. Biochem. 74:385-410, 2005, Lindahl U. et.al., J. Biol. Chem. 259:12368-12376,1984).

La escisión de GAG por endoglicosidasas, por ejemplo enzimas que tienen actividad del tipo heparanasa, participa en la degradación local y en el remodelado de la ECM en todos los procesos descritos anteriormente [0008]. Un importante mecanismo de estos procesos es la liberación de citocinas enlazadas a HS, quimiocinas, factores de crecimiento, etc., por escisión de cadenas GAG, especialmente del tipo HS (Roberts R. et al., Nature 332, 376-378, 1988; Saksela O. et al., J. Cell Biol. 107, 743-751, 1988).

La heparanasa, por ejemplo, producida por plaquetas, células inflamatorias o células tumorales, puede contribuir a la degradación local de la membrana base y facilitar, de esta manera, la migración celular y el paso a través de la pared de los vasos sanguíneos (Roberts

R. et al., Nature 332, 376-378, 1988; Saksela O. et al., J. Cell Biol. 107, 743-751, 1988). En este proceso puede haber también otras enzimas implicadas, tales como metaloproteinasas de matriz. Aunque normalmente este mecanismo permite que células inflamatorias, tales como neutrófilos, lleguen al sitio de inflamación dentro de un tejido, el mismo mecanismo es usado por las células tumorales para producir los focos metastáticos.

La escisión de GAG por endoglicosidasas no está restringida al paso de la membrana base, sino, por ejemplo, es un proceso principal de invasión tisular por células tumorales (Vlodavsky I. et al., J. Clin. Invest. 108:341-347, 2001; Parish C.R.et al., Biochim Biophys Acta 1471, 99-108, 2001; Vlodavsky I. et al., Cancer Biol. 12: 121-129, 2002).

Se ha informado de actividad heparanasa en diversos tipos de células y tejidos, incluyendo células hepáticas, placentarias, linfocitos T activados, linfocitos B, neutrófilos y monocitos, plaquetas, fibroblastos y células endoteliales de cordón umbilical (Vlodavsky I. et al., J. Clin. Invest. 108:341-347, 2001; Parish C.R.et al., Biochim Biophys Acta 1471, 99-108, 2001; Vlodavsky I. et al., Cancer Biol. 12: 121-129, 2002; Oldberg A. et al., Biochemistry 19: 5755-5762, 1980; Freeman C. et al., Biochem. J. 330:1341-1350, 1998).

La heparanasa ha sido aislada y purificada a partir de varias fuentes, tales como plaquetas humanas, por diferentes grupos de investigación (Vlodavsky I. et al., J. Clin. Invest. 108:341-347, 2001; Parish C.R.et al., Biochim Biophys Acta 1471, 99-108, 2001; Vlodavsky I. et al., Cancer Biol. 12: 121-129, 2002; Oldberg A. et al., Biochemistry 19: 5755-5762, 1980; Freeman C. et al., Biochem. J. 330:1341-1350, 1998).

La heparanasa ha sido clonada a partir de diversas fuentes por diferentes grupos de investigación (Vlodavsky I. et al. Nature Med. 5:793-802, 1999; Hulett M.D., Nature Med. 5: 803-809, 1999; Kussie P.H., Biochem. Biophys. Res. Commun. 261: 183-187, 1999; Toyoshima M.T., J. Biol. Chem. 274:24153-160, 1999). Por ejemplo, la heparanasa humana fue clonada a partir de placenta humana y una línea celular de hepatoma humano (Vlodavsky I. et al. Nature Med. 5:793-802, 1999). La identificación de una única heparanasa funcional es de la mayor importancia para el desarrollo de fármacos. (Vlodavsky I. et al., J. Clin. Invest. 108:341-347, 2001; Parish C.R.et al., Biochim Biophys Acta 1471, 99-108, 2001; Vlodavsky I. et al., Cancer Biol. 12: 121-129, 2002; Vlodavsky I. et al. Nature Med. 5: 793-802, 1999; Hulett M.D., Nature Med. 5: 803-809, 1999; Kussie P.H., Biochem. Biophys. Res. Commun. 261:183-187, 1999; Toyoshima M.T., J. Biol. Chem. 274: 24153-160, 1999; Zcharia E., FASEB J. 18: 211-221, 2005).

La caracterización de la enzima purificada y clonada ha demostrado que la heparanasa es sintetizada como un precursor inactivo de 65 kDa que es sometido a escisión proteolítica, proporcionando subunidades proteínicas de 8 y 50 kDa que se heterodimerizan para formar una enzima activa (Bartlett M, et al., Immunol. Cell Biol. 73: 113-124, 1995; Freeman C. et al., Biochem. J. 330: 1341-1350, 1998).

La heparanasa es expresada preferencialmente en tumores humanos y su sobre-expresión en células tumorales confiere un fenotipo invasivo en animales experimentales. La regulación al alza de la heparanasa se correlaciona con una vascularidad tumoral incrementada y una baja supervivencia post-operatoria de los pacientes con cáncer (Bartlett M, et al., Immunol. Cell Biol. 73: 113-124, 1995; Edovitsky E., J. Natl. Cancer Inst. 96:1219-1230, 2004; Takaoka M. et al., Lab. Invest. 83: 613-622, 2003; Nobuhisa T. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 131:229-237, 2005; Schoppmeyer K., Pancreatology 5, 570-575, 2005).

Se ha demostrado que la actividad heparanasa está unida al potencial metastático de las líneas celulares de melanoma. Por ejemplo, el potencial metastático de líneas celulares de malanoma y fibro-sarcoma humanas y múridas se correlaciona con la actividad heparanasa de estas células (Vlodavsky I. et al., Cancer Res. 12:112-127,1989; Nakajima M. et al., Science

220: 611-613, 1983).

Los inhibidores de heparanasa, tales como heparina, así como el silenciamiento génico de heparanasa por siRNA pueden inhibir una angiogénesis y una metástasis tumoral en modelos experimentales (Edovitsky E., J. Natl. Cancer Inst. 96:1219-1230, 2004).

En la actualidad, hay un cuerpo creciente de evidencias de que la heparanasa es un objetivo prometedor para el desarrollo de fármacos tanto anticancerígenos como antiinflamatorios (Vlodavsky I. et al., J. Clin. Invest. 108:341-347, 2001; Parish C.R.et al., Biochim Biophys Acta 1471, 99-108, 2001; Vlodavsky I. et al., Cancer Biol. 12: 121-129, 2002; Vlodavsky I. et al. Nature Med. 5:793-802, 1999; Hulett M.D. et al., Nature Med. 5: 803-809, 1999; Kussie P.H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 261: 183-187, 1999; Toyoshima

M.T. et al., J. Biol. Chem. 274:24153-160, 1999; Zcharia E. et al., FASEB J. 18: 211-221, 2005; Edovitsky E. et al., J. Natl. Cancer Inst. 96:1219-1230, 2004; Takaoka M. et al., Lab. Invest. 83: 613-622, 2003; Nobuhisa T. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 131:229-237, 2005; Schoppmeyer K. et al., Pancreatology 5, 570-575, 2005).

Según el importante papel de la heparanasa para otras funciones biológicas, tales como el control del crecimiento, migración y adhesión celular, señalamiento, inflamación, cicatrización de heridas y angiogénesis (Zcharia E., FASEB J. 18: 211-221, 2005), los moduladores de actividad endoglicosidasa y especialmente de actividad de enzima heparanasa tendrán también potencial en otras áreas, tales como inflamación crónica, autoinmunidad, reparación de heridas y angiogénesis.

Varios grupos han desarrollado ensayos para la determinación de la actividad

heparanasa, en particular, con el objetivo de aislar nuevos compuestos que podrían ser usados, por ejemplo, para inhibir la metástasis en pacientes con cáncer.

En el pasado, la mayoría de los procedimientos desarrollados para ensayar la actividad heparanasa se basaban en el radiomarcado de un sustrato, tal como heparán sulfato, y el análisis de los fragmentos generados después de una incubación con una muestra que contenía la enzima heparanasa. Los isótopos radioactivos, tales como 35-S o 3-H, pueden ser incorporados a HS (GAG) mediante el cultivo de células en presencia de los precursores radioactivos apropiados. A continuación, el HS (GAG) radiomarcado es usado como un sustrato. La actividad heparanasa es determinada, por ejemplo, midiendo una reducción en la radioactividad o una reducción en el peso molecular de las moléculas marcadas. En el último caso, el sustrato es analizado mediante electroforesis o mediante cromatografía.

Todos estos procedimientos tienen problemas y limitaciones asociados con el uso de radioelementos, en particular, con respecto a la radioprotección. Además, los procedimientos cuantitativos de este tipo son muy laboriosos y requieren mucho tiempo, por ejemplo, cuando la reducción en el tamaño del sustrato es medida usando cromatografía de permeación en gel, recogida de fracciones y contaje centelleante líquido. Por lo tanto, estos procedimientos no son adecuados para un ensayo rutinario o cribado de alto rendimiento. La solicitud US 6.207.402 (NZ 5044386) es un ejemplo de dichos procedimientos.

La solicitud US 6207402 describe un procedimiento para ensayar la actividad de la enzima heparanasa en base a una etapa de separación y a la unión de HS radiomarcado nativo o parcialmente degradado a la proteína de unión a HS glicoproteína de pollo rica en histidina, que es inmovilizada en una columna de sefarosa.

La solicitud WO 00/03306 describe procedimientos para determinar la actividad glicosidasa, y en particular, un procedimiento para cribar agentes anticancerígenos o antiinflamatorios. Los procedimientos se basan en el estudio del efecto de un agente de ensayo sobre la actividad heparanasa en presencia de un sustrato de tipo HS.

La actividad heparanasa es determinada bien separando fragmentos del sustrato escindido mediante cromatografía en columna o mediante electroforesis, usando un ensayo de colorimetría, en particular, un ensayo colorimétrico con carbazol para detectar los azúcares reductores formados durante la escisión del sustrato, o bien ensayos basados en azul de dimetilmetileno.

Una desventaja principal de estos procedimientos es su baja sensibilidad, por ejemplo, tienen que usarse hasta 0,25 -4 µg de heparanasa recombinante parcialmente purificada y hasta 50 µg de heparán sulfato por pocillo de la placa de microtitulación. Por lo tanto, este ensayo es también extremadamente caro. Además, con estos procedimientos, eran necesarios tiempos de incubación prolongados de hasta 17 horas. De esta manera, estos procedimientos no son adecuados para ensayos rutinarios o cribado de alto rendimiento.

La solicitud WO 00/77241 divulga un procedimiento para ensayar la actividad heparanasa basado en la detección de fragmentos de HS (GAG) derivados por escisión de un sustrato marcado por la enzima heparanasa presente en la muestra de ensayo.

El sustrato de HS (GAG) es fijado primero a un soporte sólido (después de una oxidación del sustrato de HS (GAG) mediante tratamiento con periodato), segundo, el sustrato es marcado, por ejemplo, con biotina. A continuación, un regulador celular (por ejemplo, un factor de crecimiento capaz de unirse a HS (GAG)) es unido al sustrato de HS (GAG) marcado con biotina.

Después de una incubación con una muestra de ensayo (que contiene heparanasa y/o moduladores de actividad heparanasa), los fragmentos escindidos son inmovilizados mediante unión específica de fragmentos marcados con biotina del sustrato a un segundo soporte sólido recubierto con avidina/estreptavidina. Los fragmentos separados de esta manera pueden ser detectados, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para el grupo de unión o para el factor de crecimiento, mediante técnicas colorimétricas o de fluorescencia. La señal medida depende de la actividad heparanasa en la muestra.

Comparado con los procedimientos radioactivos y con el ensayo colorométrico (WO 00/03306) descritos anteriormente, el ensayo descrito en WO 00/77241 es más sensible y fácil de manipular. Sin embargo, este ensayo todavía tiene desventajas importantes. Primero, el procedimiento es complejo y requiere varias etapas de modificación y unión para producir el sustrato. Segundo, debido a algunas de estas reacciones y etapas de unión, al menos parte de los sitios de escisión de heparanasa del sustrato podrían ser destruidos, enmascarados (por ejemplo, por el factor de crecimiento unido) o son inaccesibles para la enzima debido a la unión del sustrato a una fase sólida. Por lo tanto, usando este ensayo, solo se medirá parte de la actividad heparanasa. Tercero, el ensayo es complejo y requiere mucho tiempo. Cuarto, el ensayo es relativamente caro debido al uso de factores de crecimiento, anticuerpos para factores de crecimiento, etc. Por lo tanto, este ensayo tiene desventajas importantes para el ensayo rutinario y especialmente para procedimientos de cribado de alto rendimiento.

La solicitud US 2006/0127945 describe un procedimiento para determinar una actividad de enzima endo-glicosidasa y, en particular, del tipo heparanasa, mediante la medición de una señal resultante de una transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos compuestos, fijados a un sustrato para la enzima.

Sin embargo, este ensayo tiene varias desventajas. Primero, el HS exhibe una heterogenicidad muy grande con respecto a la secuencia de las unidades glicosídicas y a la longitud de las cadenas, por ejemplo, una funcionalización localizada químicamente es difícil de conseguir debido a que la estructura de HS varía de una molécula a otra. Por lo tanto, un marcado preciso del sustrato con compuestos donantes y aceptores es difícil. Segundo, debido a estas dificultades, los reactivos son relativamente caros. Además, este tipo de ensayo requiere equipo técnico caro. Tercero, aunque la sensibilidad podría ser suficiente, el ensayo requiere tiempos de incubación prolongados (aproximadamente 6 horas). Por lo tanto, este ensayo tiene desventajas importantes para el ensayo rutinario y especialmente para procedimientos de cribado de alto rendimiento.

La solicitud US 2003/0170746 divulga un procedimiento para ensayar potenciales inhibidores de actividad heparanasa, en el que un sustrato marcado de la enzima es unido a un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), que estaba inmovilizado en un soporte sólido. El sustrato es marcado mediante fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína FITC o F2-FITC) o quelatos de lantánidos (europio). La interacción de una solución de enzima heparanasa con el sustrato marcado inmovilizado, en presencia o en ausencia del agente a ensayar, conduce a la liberación de un fragmento marcado del sustrato que es detectado en la solución separado del soporte sólido.

Este ensayo, que tiene varias características en común con el descrito en la solicitud US 2006/0127945, es decir, el uso de marcadores fluorescentes, tiene varias desventajas en comparación de ese ensayo. Por ejemplo, el doble marcado complejo y difícil del sustrato, que se requiere para la transferencia de energía de resonancia, puede evitarse. Además, el ensayo requiere menos tiempo.

Sin embargo, este ensayo tiene todavía desventajas importantes, por ejemplo (i) la inmovilización se consigue mediante una proteína de unión a heparán sulfato específica, es decir, FGF. El dominio de unión para FGF no está distribuido homogéneamente dentro del sustrato heterogéneo, es decir, heparán sulfato, sino que variará de una molécula a otra. (ii) los sitios de escisión para la enzima heparanasa en el sustrato marcado estarán bloqueados al menos en parte por la unión a FGF. (iii) todavía más importante es que la reacción enzimática no se lleva a cabo con un sustrato en solución sino con un sustrato unido a una fase sólida. Por lo tanto, la accesibilidad de los sitios de escisión de heparanasa en el sustrato se ve perjudicada no solo por el FGF unido, sino también por el impedimento estérico de la fase sólida. Las altas relaciones enzima/sustrato (en términos de peso) necesarias para este tipo de ensayo, en el intervalo de 7,5 : 1 (FITC-marcador) a 1 : 1 (europio-marcador) son fuertemente indicativas de la existencia de estos problemas.

La química combinatoria ha permitido producir grandes bibliotecas de compuestos que comprende más de cien mil sustancias. Con el fin de ensayar estas moléculas con respecto a su actividad moduladora de heparanasa o endoglicosidasa, dentro de una cantidad de tiempo razonable y a un costo razonable, es necesario usar un sistema de ensayo simple, rápido y fiable, que pueda ser automatizado fácilmente. Tal como se ha indicado anteriormente, las técnicas que se han desarrollado anteriormente para ensayar la actividad heparanasa no son adecuadas para este propósito.

La presente invención proporciona un ensayo para la actividad endoglicosidasa o heparanasa que cumple todos estos criterios, por ejemplo, el ensayo es extremadamente sensible y fiable. Además, el ensayo es simple, rápido y requiere cantidades mínimas de reactivos y muestras.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de actividad de enzima endoglicosidasa y, en particular, del tipo heparanasa, en una muestra (por ejemplo, un extracto de tejidos o células, sangre entera, suero, plasma, CSF, etc.), y en una realización preferente, a un procedimiento para la detección de compuestos capaces de modular la actividad de una endoglicosidasa, en particular, de una endoglicosidasa que tiene actividad del tipo heparanasa.

La invención se refiere, en particular, a un ensayo para heparanasa (formato a), donde el sustrato es marcado con un miembro de un par ligando-receptor. El miembro correspondiente del par ligando-receptor generará, directa o indirectamente (véase [0040] y [0041]), la señal a medir. En una realización preferente del procedimiento, los compuestos a ensayar para su actividad moduladora de heparanasa fueron incubados en la primera etapa junto con heparanasa y el sustrato marcado.

En este ensayo, el sustrato marcador en solución (véase [0066]) es escindido por heparanasa, en una manera dependiente de la dosis. Dependiendo del tamaño del fragmento resultante, el sustrato marcado escindido ya no se une a una proteína de unión inmovilizada en un soporte de fase sólida, que en una realización preferente del procedimiento es la protamina proteína policatiónica. El uso de protamina como proteína de unión a HS tiene varias ventajas en comparación con otras proteínas de unión a HS, tales como citocinas, factores de crecimiento, etc. (véase [0068]). En este ensayo, la protamina puede ser particularmente una protamina purificada a partir de esperma de diferentes especies, tales como salmón, arenque, etc., una protamina recombinante, una protamina de bajo peso molecular obtenida, por ejemplo, después de una escisión proteolítica de protamina, o un péptido-protamina. Además, diferentes proteínas similares a protamina, una clase de proteínas ricas en arginina que pertenecen a la familia de las histonas, pueden ser usadas en este ensayo (Lewis, J.D. et al., Chromosoma 111: 473-482, 2003).

En presencia de un compuesto que inhibe (o activa) la actividad endoglicosidasa, en particular, la actividad del tipo heparanasa, la señal medida será modificada en comparación con la señal medida en ausencia de este compuesto.

Con el objetivo de desarrollar un ensayo para la actividad de enzima endoglicosidasa y, en particular, la actividad de enzima del tipo heparanasa, el presente inventor tuvo que superar dificultades técnicas que se encuentran específicamente cuando se ensayan endoglicosidasas y, en particular, del tipo heparanasa.

Los sustratos de endoglicosidasas, y en particular del tipo heparanasa, es decir, HS, exhiben una heterogenicidad extrema en relación a la secuencia de unidades disacáridas (y sus modificaciones respectivas) y a la longitud de las cadenas. Esto es debido particularmente al hecho de que los HS son sintetizados y modificados por una gran número de enzimas específicas (véase [0005]) y, por lo tanto, son difíciles de producir mediante síntesis química. Debido a que la estructura del HS puede variar de una molécula a otra, es difícil introducir grupos funcionales localizados.

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación de actividad de enzima endoglicosidasa que comprende las etapas siguientes:

i.

poner un sustrato marcado de una endoglicosidasa en solución en contacto con

dicha endoglicosidasa bajo condiciones suficientes para la degradación del sustrato

por la endoglicosidasa

ii.

separar los productos de degradación del sustrato no degradado o parcialmente

degradado mediante la unión del sustrato no degradado o parcialmente degradado

(véase

[0034]) a una proteína de unión a HS unida a una fase sólida,

preferentemente, a la protamina proteína policatiónica

iii.

medir el cambio en la cantidad de sustrato marcado intacto, siendo representativa

una reducción en la cantidad de este sustrato de la actividad endoglicosidasa en la

muestra.

Tras la degradación del sustrato marcado por la endoglicosidasa, y en particular por una enzima del tipo heparanasa, el sustrato degradado ya no se unirá a la proteína de unión (véase [0034]), que en una realización preferente del procedimiento es la protamina proteína policatiónica unida a la fase sólida. Tras la eliminación del sustrato no unido mediante lavado, el sustrato marcado unido puede ser medido. En este procedimiento, el sustrato es marcado

directa o indirectamente.

El término “marcado directo” pretende significar la fijación de un marcador, por ejemplo, un marcador fluorescente, a un grupo funcional presente en, o introducido previamente en, o generado en el sustrato o en al menos uno de los miembros del par ligando/receptor. Puede introducirse un espaciador entre el marcador y el sustrato o al menos uno de los miembros del par ligando/receptor.

El término “marcado indirecto” pretende significar la fijación del marcador al sustrato vía el segundo miembro de un par ligando/receptor. El marcador es seleccionado bien a partir del grupo de enzimas, que se usan en inmunoensayos de enzimas, tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc., o bien a partir del grupo de marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, electroquimioluminiscentes o colorimétricos.

En una realización preferente de este procedimiento, el sustrato es marcado indirectamente con biotina vía el extremo peptídico del péptido-HS (véase [0049]) y la avidina acoplada a peroxidasa es usada como el segundo miembro del par ligando-receptor.

Este procedimiento puede ser usado para medir las endoglicosidasas capaces de escindir heparán sulfatos, tales como, por ejemplo, heparanasa.

El procedimiento de determinación de actividad de enzima endoglicosidasa descrito anteriormente puede hacer posible el estudio de los efectos de la modulación de la actividad de esta enzima, ejercida por compuestos para los cuales se desea el ensayo de la influencia sobre la actividad de la enzima.

La expresión “modulación de actividad de la enzima” pretende significar una inhibición o activación de la actividad de esta enzima, independientemente del mecanismo.

Por lo tanto, una realización preferente, la invención se refiere a un procedimiento para la detección de un compuesto capaz de modular la actividad de una enzima del tipo endoglicosidasa, que comprende las etapas siguientes:

i.

poner un sustrato de una endoglicosidasa en solución en contacto con una

endoglicosidasa, en presencia o en ausencia del compuesto de ensayo,

ii.

medir el cambio en la cantidad de sustrato intacto en función del tiempo,

iii.

comparar el cambio en la cantidad de sustrato en función del tiempo medida en

ausencia del compuesto de ensayo con la medida en presencia del com

puesto de

ensayo.

En este procedimiento, el sustrato de endoglicosidasa y/o al menos uno de los otros componentes pueden ser marcados directa o indirectamente, tal como se ha descrito

anteriormente (véase [0040] – [0042]).

En el último procedimiento, la endoglicosidasa usada puede ser particularmente una heparanasa seleccionada de entre heparanasa recombinante, heparanasa purificada y heparanasa no purificada (por ejemplo, un extracto de plaqueta). La enzima es proporcionada normalmente en al menos una forma parcialmente purificada.

El sustrato usado en los procedimientos anteriores puede ser seleccionado de entre proteoglicanos heparán sulfato (HS-PG), heparina y péptido-heparán-sulfatos (péptido-HS) o sus derivados. Los péptido-HS son derivados a partir de HS-PG después de una degradación proteolítica de la proteína núcleo, por ejemplo, mediante papaína, resultando en una cadena HS GAG con un extremo peptídico residual corto.

Los derivados de sustrato pueden ser HS, heparina o HS-PG, que son sometidos a modificaciones menores, tales como por ejemplo, pero sin limitarse a, desulfatación selectiva, N-acetilación graduada u oxiaminación reductiva, que no interfieren con el reconocimiento enzima-sustrato, es decir, pueden ser escindidos por una enzima que tiene actividad del tipo heparanasa ( Naggi A. et al, J. Biol. Chem. 280 : 12103-12113, 2005, Fernandez C. et al., Carbohydrate Res. 341: 1253-1265, 2006; Sandbäck-Pikas D, et al., J. Biol. Chem 273: 1877018777, 1998, Ramsay S., et al. Carbohydrate Res. 333: 59-71, 2001).

El procedimiento según la invención puede ser implementado usando varios formatos. Los formatos siguientes son los formatos preferentes.

Formato [a]: el sustrato es fijado covalentemente a un primer miembro de un par ligando/receptor. El otro miembro del par ligando/receptor es acoplado a un sistema de detección de enzima, tal como el sistema peroxidasa.

Formato [b]: el sustrato es fijado covalentemente a un primer miembro de un par ligando/receptor. El otro miembro del par ligando/receptor es marcado, por ejemplo, con un marcador fluorescente.

Formato [c]: el sustrato es fijado covalentemente a un marcador fluorescente, quimioluminiscente o electroquimioluminiscente. En este formato, la señal desde el sustrato marcado unido a la fase sólida es medida directamente.

El “par ligando-receptor” denota dos patrones de unión, tales como los pares: biotina / avidina; biotina / estreptavidina; sistemas hapteno / anticuerpo, tales como DNP (dinitrofenol) / anticuerpo anti-DNP o HA (péptido de hemaglutinina de influenza de 9 aminoácidos) / anticuerpo anti-HA; GST (glutatión S-transferasa) / anticuerpo anti-GST; 6HIS (péptido que comprende 6 histidinas) / anticuerpo anti-6HIS; c-myc (péptido de aminoácidos 410-419 de la proteína c-myc humana) / anticuerpo anti-c-myc, o FLAG(R) (péptido de 4 aminoácidos) / anticuerpo anti-FLAR(R). Pueden usarse otros pares ligando-receptor conocidos por las

personas con conocimientos en la materia.

Estos sistemas “ligando/receptor” son bien conocidos por las personas con conocimientos en la materia y, en la mayoría de los casos, están disponibles comercialmente.

El miembro de los pares ligando-receptor puede ser fijado covalentemente al sustrato usando una variedad de grupos reactivos, tales como éster de hidroxisuccinimida o ésteres de hidroxi-sulfo-succinimida.

El procedimiento para la detección de un compuesto capaz de modular la actividad de enzima del tipo heparanasa hace posible cribar grandes bibliotecas de productos que pueden ser, particularmente, anticuerpos anti-heparanasa, productos naturales, productos sintéticos, productos de una biblioteca de compuestos obtenidos mediante química combinatoria, por ejemplo, de péptidos y proteínas, para su capacidad de modular la actividad de enzima.

Además, la invención se refiere también a kits, que contienen los reactivos que pueden usarse o que se requieren para llevar a cabo las realizaciones del procedimiento según la invención y, particularmente, los elementos siguientes:

-Un sustrato que puede ser escindido por una enzima que tiene actividad heparanasa,

particularmente, HS-(GAG) o péptido-HS (GAG) marcado con un primer miembro de

un par receptor/ligando. -Heparanasa (es decir, heparanasa recombinante, heparanasa purificada o

heparanasa no purificada). -Un sistema de detección que comprende el segundo miembro del par receptor-

ligando, acoplado a una enzima, y un sustrato adecuado. Una proteína de unión a

heparán sulfato unida a una fase sólida.

Un kit según la invención (para medir la actividad heparanasa), que contiene preferentemente:

-

El sustrato heparán sulfato (péptido-HS) marcado con biotina (vía el extremo

peptídico)

-

Avidina (o estreptavidina) acoplada a peroxidasa y un sustrato adecuado, tal como

ortofenilendiamina (OPD)

-

Una fase sólida recubierta con protamina, por ejemplo, una microplaca.

En otra realización, un kit según la invención (para ensayar potenciales moduladores de actividad heparanasa) contiene preferentemente:

-El sustrato heparán sulfato (péptido-HS) marcado con biotina (vía el extremo peptídico) -Avidina (o estreptavidina) acoplada a peroxidasa y un sustrato adecuado, tal como

OPD

-

Heparanasa (seleccionada de entre heparanasa recombinante, heparanasa

purificada, heparanasa no purificada)

-

Una fase sólida recubierta de protamina, por ejemplo, una microplaca

El procedimiento según la invención tiene muchas ventajas en comparación con los procedimientos de la técnica anterior, y particularmente:

El procedimiento es un ensayo no radioactivo (véase [0023] y [0024]).

El ensayo es muy simple de llevar a cabo ya que comprende solo pocas etapas y se completará en menos de 3 h.

El procedimiento no requiere equipo técnico caro.

La reacción enzimática de la endoglicosidasa, y particularmente de la heparanasa, con el sustrato marcado es realizada en solución y no con un sustrato acoplado a una fase sólida. Por lo tanto, se evitan los problemas con el impedimento estérico y una carencia de accesibilidad de los sitios de escisión en el sustrato para la enzima (véase [0029]).

No se requiere ningún tratamiento químico o modificación de las cadenas GAG. En este formato de ensayo, solo el extremo peptídico (de la proteína núcleo original) es marcado mediante un pequeño ligando, por ejemplo, biotina. Por lo tanto, los sitios de escisión de heparanasa del HS (GAG) están fácilmente accesibles, tal como se ha indicado anteriormente.

El procedimiento según la invención usa preferentemente como proteína de unión a HS la protamina proteína poli-catiónica en vez de otros ligandos para HS (o heparina), por ejemplo, de factores de crecimiento, tales como bFGF (véase [0029]). Al contrario de los dominios de unión para estos ligandos específicos, que generalmente tienen un patrón de expresión restringido en las cadenas HS, los grupos aniónicos, por ejemplo, grupos sulfato, que median en la interacción iónica de HS y protamina, están distribuidos uniformemente en las cadenas HS polianiónicas. Por lo tanto, el ensayo es más sensible y menos vulnerable a cambios de la composición del sustrato (véase [0037]) con respecto a los dominios de unión específicos.

Además, el uso de factores de crecimiento, citocinas, etc., como proteínas de unión

específicas para el sustrato marcado, conducirá a altos costos del ensayo.

Al contrario que un inmunoensayo, que usa por ejemplo anticuerpos monoclonales para diferentes epítopos de la molécula heparanasa, en el ensayo según la invención, se mide la actividad funcional de heparanasa en una muestra en vez de la concentración de heparanasa. Por el contrario, un inmunoensayo detectará también, dependiendo del diseño del ensayo y de los anticuerpos respectivos, la heparanasa inactiva o degradada. Por lo tanto, un inmunoensayo no permite el análisis de moduladores de actividad endoglicosidasa.

Los volúmenes usados son muy pequeños (50 µl por pocillo, en los ejemplos 4 y 5). Sin embargo, el ensayo puede miniaturizarse adicionalmente (por ejemplo, usando placas de 384 pocillos) y esto hace posible ahorrar en reactivos, por ejemplo:

Se usan solo 10 ng de sustrato en el ejemplo 4. Sin embargo, el ensayo ha sido realizado exitosamente también con 2 ng de sustrato marcado (datos no mostrados). Por el contrario, en la solicitud US 2006/0127945, se usaron al menos 30 ng de sustrato, en la solicitud US 2003/0170746, entre 18,75 ng (sustrato marcado con europio) y 150 ng de sustrato marcado con fluoresceína, y en la solicitud WO 00/03036, de 5 a 50 µg de sustrato.

Lo mismo se aplica a la cantidad de enzima usada en el ensayo. En el ejemplo 4, se usan menos de 0,1 µU (equivalente a 0,15 ng) de la enzima heparanasa, mientras que en la solicitud WO 00/03036, se usaron 3 µg de heparanasa (correspondiente a 2,1 mU) (con tiempos de incubación de hasta 24 h) y en la solicitud US 2003/0170746, se usaron al menos 20 ng de heparanasa recombinante. Por el contrario, en la solicitud US 2006/0127945, la actividad endoglicosidasa fue ensayada con la enzima bacteriana heparitinasa III (heparinasa III de Flavobacterium heparinum) en vez de heparanasa y, por lo tanto, no puede compararse directamente.

Los tiempos de incubación para todas las etapas son muy cortos, tal como se muestra en el ejemplo 4, es decir, la reacción enzimática requiere 1 h de incubación (pero puede ser reducida adicionalmente). Por el contrario, en la solicitud WO 00/03036, la reacción enzimática requiere al menos 4 h y en la solicitud US 2006/0127945, al menos 5 h, para obtener una señal.

Por lo tanto, el procedimiento según la invención hace posible la determinación de la actividad heparanasa en una muestra o el cribado rápido de bibliotecas de moléculas capaces de modular la actividad heparanasa.

De esta manera, para las realizaciones del procedimiento según la invención, hay importantes aplicaciones en el campo de la diagnosis in vitro y también en el del cribado de alto rendimiento en la industria farmacéutica.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: El gráfico de barras muestra la unión dependiente de dosis de HS marcado con biotina a la fase sólida recubierta con protamina.

Figura 2: El gráfico de barras muestra la degradación dependiente de dosis de heparán sulfato marcado con biotina mediante heparanasa humana, aislada de neutrófilos polimorfonucleares (PMN).

Figura 3: El gráfico de barras muestra la inhibición dependiente de dosis de la actividad heparanasa mediante heparina.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran, en una manera no limitativa, las realizaciones preferentes de los procedimientos según la invención:

Sección experimental

Se usan las siguientes abreviaturas:

HS:

heparán sulfato

NHS:

N-hidroxisuccinimida

PBS:

salina tamponada con fosfato

POD:

peroxidasa de rábano

OPD:

ortofenilendiamina

Para los ejemplos, el sustrato es funcionalizado usando las funciones NH2 del péptido-HS (el péptido-HS es producido mediante digestión de las proteínas núcleo de proteoglicanos heparán sulfato con una enzima proteolítica, tal como papaína, resultando en una cadena glicosaminoglicano con extremos péptidos cortos)

EJEMPLO 1

Preparación de un sustrato -HS-biotina

Reactivos usados:

-Solución de HS (Sigma H9902) a 5 mg/ml: 5 mg HS +1 ml PBS (Gibco). -Solución de Sulfo-NHS-LC-Biotina (EZ-Link® Sulfo-NHS-LC-Biotina) a 20 mM: 11 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) + 1 ml PBS (Gibco)

Marcado con biotina

1 ml de una solución de HS a 5 mg/ml (Sigma) es mezclado con 0,1 ml de Sulfo-NHS-LC-Biotina 20 mM. La mezcla es incubada durante 18 h a 37ºC. El exceso de biotina es retirado usando una columna ZebaTM Desalt Spin de 5 ml (Pierce), equilibrada con PBS. Como resultado, se obtiene 1 ml de solución que contiene el HS biotinilado, denominado en adelante biotina-HS.

EJEMPLO 2

Determinación de las relaciones molares finales

Ensayo de la biotina:

La concentración de biotina se mide usando un ensayo fotométrico basado en la competición de biotina-HS y HABA (4’-hidroxiazobenceno-2-ácido carboxílico) para unirse a avidina. La absorbencia del complejo HABA/avidina se mide a 500 nm. Subsiguientemente, se añade biotina-HS y se registra la reducción de la absorbencia. Se usan cantidades conocidas de POD marcado con biotina como estándar para calcular la relación molar de biotina y HS.

EJEMPLO 3

Ensayo de unión de HS marcado con biotina a fase sólida recubierta con protamina

Reactivos usados:

-

HS marcado con biotina (véase ejemplo 1 anterior)

-

Sulfato de protamina, a partir de arenque, de grado III, Sigma P4505

-

Avidina-POD (Sigma A 3151)

-

PBS / 0,01% Tween-20

-

OPD (Dako S 204530)

Una fase sólida, por ejemplo una placa de microtitulación, es recubierta con protamina mediante incubación de 100 µl / pocillo de una solución al 0,003% de sulfato de protamina a 37ºC durante 24 horas. A continuación, las placas son lavadas 3 veces con A destilado y son almacenadas en la oscuridad.

La capacidad de unión de la fase sólida, por ejemplo, los pocillos de la microplaca, fue analizada mediante incubación de cantidades crecientes de HS marcado con biotina (0,1 -100 ng/ml) durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Las placas fueron lavadas 3 veces con tampón (PBS / 0,01% Tween 20) y se añadió Avidina-POD (1 µg/ml en PBS / 5% BSA).

Después de 15 minutos, las placas fueron lavadas 5 veces con tampón citrato/fosfato (pH 6,2; 34,7 mM ácido cítrico/66,7 mM Na2HPO4) y se añadieron 100 µl de solución OPD (0,667 mg/ml).

Después de 15 minutos, la reacción fue detenida mediante adición de 100 µl de H2SO4 0,5 Mol. Se midió la OD a 490 nm usando un lector de microplaca.

La Fig. 1 muestra la unión dependiente de dosis de HS marcado con biotina a la fase sólida recubierta con protamina.

EJEMPLO 4

Ensayo de la actividad del tipo heparanasa

Reactivos usados:

-

Igual que en el ejemplo 3

-

Heparanasa de neutrófilos polimorfonucleares, aislada de sangre periférica usando

procedimientos

de gradiente de densidad ficoll estándar, preparada según el

procedimiento descrito por el grupo de Vlodavsky (Matzner Y. et al., J. Clin. Invest.

76:1306-1313, 1985). 10 µl de esta solución de heparanasa

en tampón citrato /

fosfato 20 mM (pH 6,2) son equivalentes a 0,1 µU o 0,15 ng de enzima recombinante

heparanasa.

La reacción enzimática es llevada a cabo mezclando 50 µl de HS marcado con biotina a 0,2 µg/ml con cantidades crecientes de heparanasa (0,3 -20 µl de heparanasa, representando 0,01 a 02 µU). Las muestras se llevaron a un volumen de 100 ml mediante adición de tampón citrato / fosfato 20 mM (pH 6,2).

Esta mezcla se deja a temperatura ambiente durante 1 h.

Las muestras (50 µl de las muestras) fueron transferidas a la microplaca recubierta con protamina y fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las etapas siguientes son idénticas a las descritas para el ejemplo 3 ([0089]-[0091]).

Los resultados se expresan en la Fig. 2, que muestra el cambio en la señal para un incremento en la concentración de la enzima heparanasa.

La reducción en la señal se correlaciona perfectamente con el incremento en la actividad de la enzima, es decir, la escisión del sustrato HS marcado con biotina.

EJEMPLO 5

Determinación de un modulador, por ejemplo, un inhibidor, de la actividad de enzima del tipo heparanasa

Reactivos usados:

-

Igual que en el ejemplo 4

-

Heparina (sal de sodio, heparina no fraccionada de mucosa intestinal porcina (grado

Ia, 170 USP/mg) (Sigma H 3393)

Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el ejemplo 4, pero se añadieron cantidades crecientes del modulador, es decir, el inhibidor, a las mezclas de reacción de heparanasa (constante) y HS marcado con biotina (constante).

En este experimento, la cantidad de 10 µl de heparanasa fue seleccionada a partir de la curva dependiente de dosis (Fig. 2) para garantizar que después de 1 hora aproximadamente el 80 -90% de HS marcado con biotina es degradado por la heparanasa. Esto permite detectar la actividad de inhibidores, tales como heparina, en la parte lineal de la curva.

En este experimento, la heparina fue usada como inhibidor a concentraciones de 0,1 -5 ng/ml.

El porcentaje de inhibición (o activación) de la enzima debido al compuesto de ensayo (es decir, el inhibidor) se determina mediante una comparación de los resultados obtenidos en presencia y en ausencia del compuesto de ensayo.

La inhibición fue calculada según la fórmula siguiente

imagen1

5 en la que OD(max) es la OD(490 nm) para HS marcado con biotina (10 ng/ml) en ausencia de heparanasa e inhibidores. OD(max*) se fija a OD(max) – OD(hep-10), donde OD(hep-10) es la OD(490 nm) que resulta después de la degradación de HS marcado con biotina por 10 µl de heparanasa. OD(x) es entonces la OD(490 nm) medido para la concentración x de un inhibidor. OD(x*) se fija a OD(x) -OD(hep-10). Los resultados se proporcionan como porcentaje de inhibición

10 Los resultados se expresan en la Fig. 3, que muestra el cambio en la señal para un incremento en la concentración del inhibidor, es decir, heparina. El formato [a] (véase [0052]) usado en los ejemplos 1-5 es, por lo tanto, totalmente adecuado para un procedimiento para la medición de la actividad de enzima endoglicosidasa, y particularmente del tipo heparanasa, y también para el ensayo de un modulador de esta

15 actividad de enzima.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la determinación de actividad de enzima endoglicosidasa, que comprende las etapas siguientes:

   i. poner un sustrato de endoglicosidasa en contacto con una muestra que contiene endoglicosidasa bajo condiciones suficientes para la degradación del sustrato por la endoglicosidasa.

   ii. separar los productos de degradación del sustrato no degradado o parcialmente degradado mediante la unión del sustrato no degradado o parcialmente degradado a una proteína de unión a heparán sulfato unida a una fase sólida, preferentemente, a la protamina proteína policatiónica.

   iii. medir la reducción de sustrato intacto relacionada con la actividad endoglicosidasa en la muestra.

   en el que el sustrato es marcado directa o indirectamente con un primer miembro de un par ligando/receptor, y la cantidad de sustrato intacto se determina midiendo una señal emitida por el sistema de detección, unido al segundo miembro del par ligando receptor.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el primer miembro del par ligando/receptor es biotina y el segundo miembro del par ligando receptor es avidina

   o estreptavidina acoplada a una enzima como parte del sistema de detección, o porque el par ligando/receptor es seleccionado de entre los pares hapteno / anticuerpo: DNP / anticuerpo anti-DNP; GST / anticuerpo anti-GST; 6HIS / anticuerpo anti-6HIS; c-myc / anticuerpo anti-c-myc; FLAG(R) / anticuerpo anti-FLAR(R); HA / anticuerpo anti-HA;

3. 3.

   Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha muestra es un extracto de tejidos o células, sangre entera, suero, plasma, fluido cerebroespinal.

4. 4.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la detección de un compuesto capaz de modular una actividad de enzima endoglicosidasa, que comprende además la etapa siguiente:

   iv. comparar el cambio en la cantidad del sustrato unido medida en ausencia del compuesto de ensayo con la medida en presencia del compuesto de ensayo.

5. 5.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la

   endoglicosidasa es una enzima del tipo heparanasa, seleccionada de entre heparanasa recombinante, heparanasa purificada y heparanasa no purificada, preferentemente la enzima es proporcionada en al menos una forma parcialmente purificada.

6. 6.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el sustrato es seleccionado de entre proteoglicanos heparán sulfato, heparán sulfatos asociados a matriz extracelular, heparina y heparán sulfatos o sus derivados respectivos.

7. 7.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína de unión a heparán sulfato es seleccionada de entre protamina u otros miembros de la familia de proteínas similares a protamina, ricas en arginina, de la familia de las histonas, y en el que estas proteínas de unión son proteínas naturales, purificadas a partir de esperma de diferentes especies, formas de bajo peso molecular de estas proteínas, derivadas por ejemplo mediante escisión proteolítica, péptidos o proteínas recombinantes.

8. 8.

   Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, en el que el sustrato está fijado covalentemente a un primer miembro del par ligando/receptor y el segundo miembro está acoplado a una enzima como parte de un sistema de detección.

9. 9.

   Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el segundo miembro del par ligando/receptor está marcado con un marcador fluorescente, quimioluminiscente o electroquimioluminiscente.

10. 10.

    Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, en el que el sustrato está fijado covalentemente a un compuesto fluorescente, quimioluminiscente o electroquimioluminiscente y la señal de fluorescencia o luminiscencia del sustrato unido a la proteína de unión a heparán sulfato es medida directamente.

11. 11.

    Procedimiento para la detección de un compuesto capaz de modular una actividad de enzima del tipo heparanasa según la reivindicación 4, en el que dicho compuesto es seleccionado de entre anticuerpos anti-heparanasa, productos naturales, productos sintéticos, productos de una biblioteca de compuestos obtenidos mediante química combinatoria, péptidos y proteínas.

12. 12.

    Kit para llevar a cabo los procedimientos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende los componentes siguientes:

    (a)

    Un sustrato que puede ser escindido por una enzima que tiene actividad heparanasa, en particular, HS-(GAG) o péptido-HS (GAG), marcado con un primer miembro de un par receptor/ligando.

    (b)

    Heparanasa, preferentemente heparanasa recombinante, heparanasa purificada o

    heparanasa no purificada.

    (c)

    Un sistema de detección que comprende: el segundo miembro del par receptor/ligando, acoplado a una enzima, preferentemente avidina-peroxidasa o estreptavidina-peroxidasa; y un sustrato adecuado.

    5 (d) Una proteína de unión a heparán sulfato, unida a una fase sólida.
13. 13. Kit para la medición de actividad heparanasa según la reivindicación 12, que comprende:

    10 -heparán sulfato, preferentemente péptido-HS, marcado con biotina; -avidina o estreptavidina acoplada a peroxidasa, y un sustrato de peroxidasa; -una fase sólida recubierta con protamina, preferentemente una microplaca.
14. 14. Kit para el ensayo de potenciales moduladores de actividad heparanasa según las 15 reivindicaciones 12 ó 13, que comprende:

    -heparán sulfato, preferentemente péptido-HS, marcado con biotina; -avidina o estreptavidina acoplada a peroxidasa, y un sustrato de peroxidasa; -heparanasa seleccionada de entre heparanasa recombinante, heparanasa

    20 purificada y heparanasa no purificada; -una fase sólida recubierta con protamina, preferentemente una microplaca.

    -