JP2010508035A - エンドグリコシダーゼ(ヘパラナーゼ)酵素活性を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、試料においてエンドグリコシダーゼ活性、特にヘパラナーゼ型のものを決定する方法に関し、また、エンドグリコシダーゼ、特にヘパラナーゼ型のエンドグリコシダーゼの活性を調節する化合物を検出する方法に関する。
Description
本発明は、試料においてエンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを決定する方法に関し、一つの好ましい実施態様では、エンドグリコシダーゼの活性、特にヘパラナーゼ型の活性を有するエンドグリコシダーゼの活性を調節することができる化合物を検出する方法に関する。
エンドグリコシダーゼは、グリコシド鎖内で切断反応を触媒することができる酵素である。
ヘパラナーゼは、例えばヘパラン硫酸グリコサミノグリカン(HS−GAG又はHS)のようなグリコサミノグリカン(GAG)単位を含むポリマーを切断することができる酵素である。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HS−PG)は、ヒト及び非ヒト由来の多種多様な組織及び細胞の細胞表面又は細胞外マトリックス(ECM)と関連する複雑な巨大分子である(非特許文献1〜7)。
HS−PGの主要構造は、コアタンパク質からなり、それに、1つ又は幾つかのヘパラン硫酸鎖が共有的に結合している。線状の多糖鎖は、一般に、L−イズロン酸(あるいはグルクロン酸)及びグルコサミンから構成される反復二糖サブユニットからなる。これらの二糖は、N−及びO−結合硫酸塩基、並びにN−結合アセチル残基により多様な程度で置換されている。多様な酵素(例えば、C5−エピメラーゼ、2−O−スルホトランスフェラーゼ、6−O−スルホトランスフェラーゼ、3−O−スルホトランスフェラーゼ、N−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼなど)の活性の結果による置換パターンは、少なくとも部分的には非ランダム様式で、成長因子、ケモカインなどのような多数のリガンドとの特異的な相互作用を可能にするHS鎖内におけるドメイン構造の形成をもたらす(非特許文献8〜10)。HS鎖は、多様な数の二糖単位に起因し、それらの配列(ドメイン構造をもたらす異なる置換の結果によって生じる)に起因して著しい多様性を示すことができ、これは鎖毎に異なることができる。ヘパリンは、HSと比べると同じ基本的な二糖構造を有するが、より高度に硫酸化され、より多くの異性体変種のイズロン酸を含有する点においてHSと異なっている(非特許文献1〜9)。
多様な組織のECMは、多様なマトリックスタンパク質、例えば異なる種類のコラーゲンなど、及び異なるプロテオグリカンから構成されており、複雑な組織構造をもたらす。
基底膜(基底層)は、網状構造(network)に包埋された異なるヘパラン硫酸プロテオグリカンの高度に荷電されたHS鎖と相互作用する、異なる種類のラミニン、ナイドジェン及びIV型コラーゲンの複雑な網状構造から構成される(非特許文献11〜16)。
HS−PGは、器官形成及び増殖制御、細胞接着及び移動、信号伝達、炎症、創傷治癒、血管形成、腫瘍侵入及び転移を含む多くの生物学的機能に関わっている(非特許文献1〜10)。
エンドグリコシダーゼ、例えばヘパラナーゼ型の活性を有する酵素によるGAG切断は、上記の[0008]に記載された全てのプロセスにおいて局所分解及びECMの再構築に関わっている。これらのプロセスの一つの重要な機構は、特にHS型のGAG鎖の切断によるHS結合サイトカイン、ケモカイン、成長因子などの放出である(非特許文献17および18)。
例えば血小板、炎症性細胞又は腫瘍細胞により産生されるヘパラナーゼは、基底膜の局所分解に寄与する可能性があり、したがって、細胞が血管壁を横切って移動及び通過することを促進する可能性がある(非特許文献17および18)。このプロセスにおいて、マトリックスメタロプロテイナーゼのような他の酵素が関与することもある。通常は、この機構は好中球のような炎症性細胞が組織内の炎症性部位に到達することを可能にするが、同じ機構は、腫瘍細胞により転移巣を生じるために使用される。
エンドグリコシダーゼによるGAGの切断は、基底膜の通過に限定されず、例えば、腫瘍細胞による組織侵入の主要なプロセスである(非特許文献19〜21)。
ヘパラナーゼ活性は、肝臓、胎盤、活性化Tリンパ球、Bリンパ球、好中球及び単球、血小板、線維芽細胞及び臍帯静脈内皮細胞を含む、幾つかの組織及び細胞型において報告されている(非特許文献19〜23)。
ヘパラナーゼは、異なる研究グループによって、ヒト血小板のような幾つかの供給源から単離及び精製されている(非特許文献19〜23)。
ヘパラナーゼは、異なる研究グループにより幾つかの供給源からクローン化されている(非特許文献24〜27)。例えば、ヒトヘパラナーゼはヒト胎盤及びヒト肝細胞癌細胞株からクローン化された(非特許文献24)。単一機能性ヘパラナーゼの同定は、薬剤開発において大きな重要性がある(非特許文献19〜21、および24〜28)。
精製及びクローン化された酵素の特徴決定によって、ヘパラナーゼは、タンパク質分解性切断を受ける65kDaの不活性前駆体として合成され、ヘテロ二量体化して活性酵素を形成する8及び50kDaのタンパク質サブユニットを生じることを示した(非特許文献23および29)。
ヘパラナーゼは、ヒト腫瘍に優先的に発現し、腫瘍細胞における過剰発現は、実験動物において侵入性表現型をもたらす。ヘパラナーゼの上方制御は、腫瘍血管分布の増大及び癌患者の不十分な術後生存と相関している(非特許文献29〜33)。
ヘパラナーゼ活性は、黒色腫細胞株の転移能と関連することが示されている。例えば、ヒト及びネズミ線維肉腫及び黒色腫細胞系統の転移能は、これらの細胞のヘパラナーゼ活性と相関している(非特許文献34および35)。
ヘパリンのようなヘパラナーゼのインヒビター、並びにsiRNAによるヘパラナーゼの遺伝子サイレンシングは、実験モデルにおいて腫瘍の転移及び血管形成を阻害することができる(非特許文献30)。
現在、ヘパラナーゼが、抗癌のみならず、抗炎症性薬剤の開発において有望な標的であるという証拠がますます増えてきている(非特許文献19〜21、24〜28、および30〜33)。
増殖制御、細胞接着及び移動、信号伝達、炎症、創傷治癒及び血管形成のような他の生物学的機能におけるヘパラナーゼの重要な役割によると(非特許文献28)、エンドグリコシダーゼ活性のモジュレーター、特にヘパラナーゼ酵素活性のモジュレーターは、慢性炎症、自己免疫、創傷修復及び血管形成のような他の領域においても潜在能力を有する。
幾つかのグループは、特に、例えば癌患者において転移を阻害するために使用されうる新規化合物を単離する目的で、ヘパラナーゼ活性を決定するアッセイを開発した。
これまでは、ヘパラナーゼ活性をアッセイするために開発されたほとんどの方法が、ヘパラン硫酸のような基質を放射標識すること、及び酵素ヘパラナーゼを含有する試料と共にインキュベートした後に生成したフラグメントを分析することに基づいている。
35−S又は3−Hのような放射性同位体は、細胞を適切な放射性前駆体の存在下で培養することによってHS(GAS)に組み込まれうる。次に放射標識HS(GAG)は基質として使用される。
ヘパラナーゼ活性は、例えば、放射能の減少又は標識分子の分子量の低減のいずれかを測定することによって決定される。後者の場合では、基質は、電気泳動又はクロマトグラフィーにより分析される。
35−S又は3−Hのような放射性同位体は、細胞を適切な放射性前駆体の存在下で培養することによってHS(GAS)に組み込まれうる。次に放射標識HS(GAG)は基質として使用される。
ヘパラナーゼ活性は、例えば、放射能の減少又は標識分子の分子量の低減のいずれかを測定することによって決定される。後者の場合では、基質は、電気泳動又はクロマトグラフィーにより分析される。
これらの方法は、放射性元素の使用に関連する、特に放射線保護に関する全ての問題及び制限を有する。更に、この種類の定量的方法は、例えば、基質の大きさの減少をゲル浸透クロマトグラフィー、画分の収集及び液体シンチレーションカウントを使用して測定する場合には、非常に労力を要し、時間がかかる。したがって、これらの方法は、ルーチン的な試験又はハイスループットスクリーニングには適していない。特許文献1および2は、そのような方法の例である。
特許文献1は、分離工程、及びセファロースカラムに固定したHS結合タンパク質ニワトリヒスチジン豊富糖タンパク質への天然又は部分的に分解している放射標識HSの結合に基づいて、ヘパラナーゼ酵素活性をアッセイする方法を記載している。
特許文献3は、グリコシダーゼ活性を決定する方法、特に抗癌及び抗炎症性剤をスクリーニングする方法を記載する。この方法は、HS型の基質の存在下でヘパラナーゼ活性に対する試験作用物質の効果を研究することに基づいている。
ヘパラナーゼ活性は、比色アッセイ、特に基質の切断の際に形成された還元糖を検出する比色カルバゾールアッセイ又はジメチルメチレンブルーに基づいたアッセイを使用する、電気泳動又はカラムクロマトグラフィーによる切断基質のフラグメントの分離のいずれかにより決定される。
これらの方法の大きな欠点は、感度が乏しいことであり、例えば、マイクロタイタープレートの1ウエルあたり0.25〜4μgほどの部分的に精製された組み換えヘパラナーゼ及び50μgまでのヘパラン硫酸を使用する必要がある。したがって、このアッセイは著しく高価でもある。更に、17時間までの長時間のインキュベーションがこれらの方法において必要である。したがって、これらの方法は、ルーチン的な試験又はハイスループットスクリーニングには適していない。
ヘパラナーゼ活性は、比色アッセイ、特に基質の切断の際に形成された還元糖を検出する比色カルバゾールアッセイ又はジメチルメチレンブルーに基づいたアッセイを使用する、電気泳動又はカラムクロマトグラフィーによる切断基質のフラグメントの分離のいずれかにより決定される。
これらの方法の大きな欠点は、感度が乏しいことであり、例えば、マイクロタイタープレートの1ウエルあたり0.25〜4μgほどの部分的に精製された組み換えヘパラナーゼ及び50μgまでのヘパラン硫酸を使用する必要がある。したがって、このアッセイは著しく高価でもある。更に、17時間までの長時間のインキュベーションがこれらの方法において必要である。したがって、これらの方法は、ルーチン的な試験又はハイスループットスクリーニングには適していない。
特許文献4は、試験試料に存在する酵素ヘパラナーゼによる標識基質の切断により誘導されるHS(GAG)フラグメントの検出に基づいたヘパラナーゼ活性をアッセイする方法を開示する。
HS(GAG)基質を、最初に固体支持体に結合させ(過ヨウ素酸塩での処理による基質HS(GAG)の酸化の後)、次に、基質を例えばビオチンで標識する。その後、細胞レギュレーター(例えば、HS(GAG)に結合することができる増殖因子)を、ビオチン標識基質HS(GAG)に結合させる。
試験試料(ヘパラナーゼ及び/又はヘパラナーゼ活性のモジュレーターを含有)と共にインキュベートした後、切断フラグメントを、アビジン/ストレプトアビジンで被覆されている第2固体支持体への基質のビオチン標識フラグメントの特異的結合により固定化する。このように分離したフラグメントは、例えば、結合基又は増殖因子に特異的な標識抗体を使用して、比色又は蛍光技術により検出することができる。測定される信号は、試料におけるヘパラナーゼ活性に依存する。
HS(GAG)基質を、最初に固体支持体に結合させ(過ヨウ素酸塩での処理による基質HS(GAG)の酸化の後)、次に、基質を例えばビオチンで標識する。その後、細胞レギュレーター(例えば、HS(GAG)に結合することができる増殖因子)を、ビオチン標識基質HS(GAG)に結合させる。
試験試料(ヘパラナーゼ及び/又はヘパラナーゼ活性のモジュレーターを含有)と共にインキュベートした後、切断フラグメントを、アビジン/ストレプトアビジンで被覆されている第2固体支持体への基質のビオチン標識フラグメントの特異的結合により固定化する。このように分離したフラグメントは、例えば、結合基又は増殖因子に特異的な標識抗体を使用して、比色又は蛍光技術により検出することができる。測定される信号は、試料におけるヘパラナーゼ活性に依存する。
上記に記載された放射能法及び比色アッセイ(特許文献3)と比較すると、特許文献4に記載されたアッセイは、より感度があり、取り扱いが容易である。しかし、このアッセイは依然として大きな欠点を有する。
第1には、この方法は複雑であり、基質を生成するために幾つかの修飾及び結合工程を必要とする。第2には、これらの反応及び結合工程の幾つかによって、基質が固相に結合することにより、基質のヘパラナーゼ切断部位の少なくとも一部が破壊されるか、遮蔽される(例えば結合した増殖因子により)可能性がある又は酵素には利用不可能になる。したがって、このアッセイを使用すると、ヘパラナーゼ活性の一部しか測定されない。第3には、このアッセイは、複雑であり、時間がかかる。第4には、このアッセイは、増殖因子、増殖因子の抗体などの使用によって、比較的高価である。したがって、このアッセイは、ルーチン的な試験、特にハイスループットスクリーニング手順にとっては大きな欠点を有する。
第1には、この方法は複雑であり、基質を生成するために幾つかの修飾及び結合工程を必要とする。第2には、これらの反応及び結合工程の幾つかによって、基質が固相に結合することにより、基質のヘパラナーゼ切断部位の少なくとも一部が破壊されるか、遮蔽される(例えば結合した増殖因子により)可能性がある又は酵素には利用不可能になる。したがって、このアッセイを使用すると、ヘパラナーゼ活性の一部しか測定されない。第3には、このアッセイは、複雑であり、時間がかかる。第4には、このアッセイは、増殖因子、増殖因子の抗体などの使用によって、比較的高価である。したがって、このアッセイは、ルーチン的な試験、特にハイスループットスクリーニング手順にとっては大きな欠点を有する。
特許文献5は、エンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを、酵素の基質に結合している2つの化合物の間の近接移動(FRET)によりもたらされる信号を測定することによって決定する方法を開示する。
しかし、このアッセイは幾つかの欠点を有する。第1には、HSは、グリコシド単位の配列及び鎖の長さの両方に関して多大な異質性を示し、例えば、化学的な局所官能化は、HSの構造が分子毎に変わるので達成することが困難である。したがって、ドナー及びアクセプター化合物による基質の正確な標識付けは困難である。第2には、これらの困難さのために、試薬は比較的高価になる。更に、この型のアッセイは、高価な技術装置を必要とする。第3には、感度は十分ではあるかもしれないが、アッセイは、長時間(約6時間)のインキュベーションを必要とする。したがって、このアッセイは、ルーチン的な試験、特にハイスループットスクリーニング手順にとっては大きな欠点を有する。
しかし、このアッセイは幾つかの欠点を有する。第1には、HSは、グリコシド単位の配列及び鎖の長さの両方に関して多大な異質性を示し、例えば、化学的な局所官能化は、HSの構造が分子毎に変わるので達成することが困難である。したがって、ドナー及びアクセプター化合物による基質の正確な標識付けは困難である。第2には、これらの困難さのために、試薬は比較的高価になる。更に、この型のアッセイは、高価な技術装置を必要とする。第3には、感度は十分ではあるかもしれないが、アッセイは、長時間(約6時間)のインキュベーションを必要とする。したがって、このアッセイは、ルーチン的な試験、特にハイスループットスクリーニング手順にとっては大きな欠点を有する。
特許文献6は、ヘパラナーゼ活性の潜在的なインヒビターを試験する方法を開示し、ここで酵素の標記基質は、固体支持体に固定化されている線維芽細胞増殖因子(FGF)に結合している。この基質は、フルオレセイン(フルオレセインイソチオシアネートFITC若しくはF2−FITC)又はランタニドキレート(ユーロピウム)のいずれかにより標識される。ヘパラナーゼ酵素溶液と固定化標識基質の、試験される作用物質の存在下又は不在下での相互作用によって、基質からの標識フラグメントの放出をもたらし、それは、固体支持体から離れた溶液中で検出される。
このアッセイは、特許文献5に記載されたものと共通している幾つかの特徴を有する、すなわち蛍光標識を使用することはそのアッセイと比較して幾つかの利点を有する。例えば、近接エネルギー移動に必要な、基質の複雑で困難な二重標識化を回避することができる。更に、このアッセイはあまり時間がかからない。
しかし、このアッセイは、依然として大きな欠点を有し、例えば、(i)固定化は、特異的ヘパラン硫酸結合タンパク質、すなわちFGFにより達成される。FGFへの結合ドメインは、異質基質、すなわちヘパラン硫酸内では均一に分布しておらず、分子毎に変わっている。(ii)標識基質における酵素ヘパラナーゼへの切断部位は、FGFに結合することより少なくとも部分的にブロックされている。(iii)さらに重要なことは、酵素反応が、溶液中の基質ではなく、むしろ固相結合基質により実施されることである。したがって、基質のヘパラナーゼ切断部位の利用可能性は、結合FGFのみならず、固相の立体障害によっても損なわれている。7.5:1(FITC標識)から1:1(ユーロピウム標識)の範囲である、この型のアッセイに必要な高い酵素/基質比(重量に基づく)は、これらの問題が存在することを強く示している。
このアッセイは、特許文献5に記載されたものと共通している幾つかの特徴を有する、すなわち蛍光標識を使用することはそのアッセイと比較して幾つかの利点を有する。例えば、近接エネルギー移動に必要な、基質の複雑で困難な二重標識化を回避することができる。更に、このアッセイはあまり時間がかからない。
しかし、このアッセイは、依然として大きな欠点を有し、例えば、(i)固定化は、特異的ヘパラン硫酸結合タンパク質、すなわちFGFにより達成される。FGFへの結合ドメインは、異質基質、すなわちヘパラン硫酸内では均一に分布しておらず、分子毎に変わっている。(ii)標識基質における酵素ヘパラナーゼへの切断部位は、FGFに結合することより少なくとも部分的にブロックされている。(iii)さらに重要なことは、酵素反応が、溶液中の基質ではなく、むしろ固相結合基質により実施されることである。したがって、基質のヘパラナーゼ切断部位の利用可能性は、結合FGFのみならず、固相の立体障害によっても損なわれている。7.5:1(FITC標識)から1:1(ユーロピウム標識)の範囲である、この型のアッセイに必要な高い酵素/基質比(重量に基づく)は、これらの問題が存在することを強く示している。
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コンビナトリアル化学は、10万を超える基質を含む化合物の大規模なライブラリーを生成することを可能にする。これらの分子を、エンドグリコシダーゼ又はヘパラナーゼ調節活性について妥当な時間及び妥当な費用の範囲内で試験するために、容易に自動化することができる、簡単で素早く信頼できる試験系を使用することが必要である。上記に概説されているように、ヘパラナーゼ活性をアッセイするために以前に開発された技術は、この目的に十分に適していない。
本発明は、これらの基準を全て満たすエンドグリコシダーゼ又はヘパラナーゼ活性のアッセイを提供し、例えば、このアッセイは、著しく感度及び信頼性がある。更に、このアッセイは、簡単であり、素早く、最小量の試薬及び試料しか必要としない。
本発明は、試料(例えば、組織又は細胞の抽出物、全血、血清、血漿、CFSなど)においてエンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを決定する方法に関し、一つの好ましい実施態様では、エンドグリコシダーゼの活性、特にヘパラナーゼ型の活性を有するエンドグリコシダーゼの活性を調節することができる化合物を検出する方法に関する。
本発明は、特にヘパラナーゼのアッセイ(フォーマットa)に関し、ここで基質は、リガンド−レセプター対の1つのメンバーにより標識される。リガンド−レセプター対の対応するメンバーは、測定される信号を直接的に又は間接的に([0043]および[0044]を参照すること)生成する。方法の一つの好ましい実施態様において、ヘパラナーゼ調節活性について試験する化合物を、第1工程において、ヘパラナーゼ及び標識基質と一緒にインキュベートした。
このアッセイにおいて、溶液中の標識基質([0069]を参照すること)は、ヘパラナーゼにより用量依存的に切断される。得られるフラグメントの大きさに応じて、切断標識基質は、方法の好ましい実施態様ではポリカチオン性タンパク質プロタミンである固相支持体に固定されている結合タンパク質に結合しなくなる。HS結合タンパク質としてのプロタミンの使用は、サイトカイン、増殖因子などのような他のHS結合タンパク質と比較して幾つかの利点を有する([0071]を参照すること)。このアッセイにおいて、プロタミンは、特に、サケ、ニシンなどのような異なる種の精子から精製されたプロタミン、組換えプロタミン、例えばプロタミンをタンパク質分解性切断した後に得られる低分子量プロタミン、又はプロタミンペプチドであることができる。更に、ヒストンファミリーに属するアルギニン豊富タンパク質の部類である異なるプロタミン様タンパク質を、このアッセイに使用することができる(Lewis J.D.ら、染色体(Chromosoma)111:473〜482、2003)。
エンドグリコシダーゼ活性、特にヘパラナーゼ型の活性を阻害(又は活性化)する化合物の存在下において、測定される信号は、この化合物の不在下で測定される信号と比較して修飾されている。
エンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型の酵素活性についてのアッセイを開発するために、本発明者たちは、エンドグリコシダーゼ、特にヘパラナーゼ型のものをアッセイする場合に特に遭遇する技術的困難を克服する必要があった。
エンドグリコシダーゼ、特にパラナーゼ型のもの、すなわちHSの基質は、二糖単位の配列(及びそれらの対応する修飾)と、鎖の長さの両方に関して、著しい異質性を示す。このことは、特に、HSが多数の特異的酵素により合成及び修飾されており([0005]を参照すること)、したがって、化学合成により生成することが困難であるという事実に起因している。HSの構造が分子毎に変わりうるので、局所官能基を導入することが困難である。
本発明は、以下の工程:
i.エンドグリコシダーゼの標識基質を、前記エンドグリコシダーゼと、エンドグリコシダーゼによる基質の分解に十分な条件下、溶液中で接触させる工程、
ii.非分解又は部分的に分解した基質([0037]を参照すること)を固相結合HS結合タンパク質に、好ましくはポリカチオン性タンパク質プロタミンに結合させることによって、非分解又は部分的に分解した基質から分解生成物を分離する工程、
iii.無処理標識基質の量の変化を測定する工程を含み、この基質の量の減少が試料におけるエンドグリコシダーゼ活性を表す
エンドグリコシダーゼ酵素活性を決定する方法に関する。
i.エンドグリコシダーゼの標識基質を、前記エンドグリコシダーゼと、エンドグリコシダーゼによる基質の分解に十分な条件下、溶液中で接触させる工程、
ii.非分解又は部分的に分解した基質([0037]を参照すること)を固相結合HS結合タンパク質に、好ましくはポリカチオン性タンパク質プロタミンに結合させることによって、非分解又は部分的に分解した基質から分解生成物を分離する工程、
iii.無処理標識基質の量の変化を測定する工程を含み、この基質の量の減少が試料におけるエンドグリコシダーゼ活性を表す
エンドグリコシダーゼ酵素活性を決定する方法に関する。
エンドグリコシダーゼによる、特にヘパラナーゼ型の酵素による標識基質の分解の後、分解された基質は、本方法の一つの好ましい実施態様では、固相結合ポリカチオン性タンパク質プロタミンである、結合タンパク質に結合しなくなる([0037]を参照すること)。非結合基質を洗浄により除去した後、結合標識基質を測定することができる。この方法において、基質は直接的に又は間接的に標識される。
用語「直接的標識付け」は、基質において又はリガンド/レセプター対のメンバーの少なくとも1つにおいて存在する、又は予め導入された又は生成された官能基への、標識、例えば蛍光標識の結合を意味することが意図される。スペーサーを、標識と、基質又はリガンド/レセプター対の少なくとも1つのメンバーとの間に導入することができる。
用語「間接的標識付け」は、リガンド/レセプター対の第2メンバーを介した、標識の基質への結合を意味することが意図される。標識は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどのような酵素イムノアッセイに使用される酵素の群から、又は蛍光、化学発光、電気化学発光若しくは比色標識の群から選択される。
この方法の一つの好ましい実施態様において、基質は、ペプチド−HS([0052]を参照すること)のペプチドの切れ残りを介してビオチンにより間接的に標識され、ペルオキシダーゼに結合しているアビジンは、リガンドレセプター対の第2メンバーとして使用される。
この方法は、例えばヘパラナーゼのようなヘパラン硫酸を切断することができるエンドグリコシダーゼを測定するために使用できる。
上記に記載されたエンドグリコシダーゼ酵素活性を決定する方法は、酵素活性に対する影響を試験することが望ましい化合物により発揮される、この酵素活性の調節の効果を研究することを可能にする。
表現「酵素活性の調節」は、機構に関わりなく、この酵素活性の阻害又は活性化を意味することが意図される。
したがって、一つの好ましい実施態様において、本発明は、以下の工程:
i.エンドグリコシダーゼの基質を、試験化合物の存在下又は不在下で、エンドグリコシダーゼと溶液中で接触させる工程、
ii.無処理基質の量の変化を経時的に測定する工程、及び
iii.試験化合物の不在下で測定した基質の量と、試験化合物の存在下で測定したものとの変化を経時的に比較する工程
を含む、エンドグリコシダーゼ型の酵素活性を調節することができる化合物を検出する方法に関する。
i.エンドグリコシダーゼの基質を、試験化合物の存在下又は不在下で、エンドグリコシダーゼと溶液中で接触させる工程、
ii.無処理基質の量の変化を経時的に測定する工程、及び
iii.試験化合物の不在下で測定した基質の量と、試験化合物の存在下で測定したものとの変化を経時的に比較する工程
を含む、エンドグリコシダーゼ型の酵素活性を調節することができる化合物を検出する方法に関する。
この方法において、エンドグリコシダーゼ基質及び/又は少なくとも1つの他の成分を、上記に記載されたように直接的に又は間接的に標識することができる([0043]〜[0045]を参照すること)。
後者の方法において、使用されるエンドグリコシダーゼは、特に、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ及び非精製ヘパラナーゼ(例えば、血小板抽出物)から選択されるヘパラナーゼであることができる。酵素は、通常、少なくとも部分的に精製された形態で提供される。
前述の方法で使用される基質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HS−PG)、ヘパリン及びペプチド−ヘパラン硫酸(ペプチド−HS)又はこれらの誘導体から選択することができる。ペプチド−HSは、例えばパパインによるコアタンパク質のタンパク質分解性の分解の後に、残留した短いペプチド切れ残りを有するHS GAG鎖をもたらす、HS−PGから誘導される。
基質誘導体は、酵素−基質認識を妨げない、例えば、これらに限定されないが、選択的脱硫酸化、段階的Nアセチル化又は還元的オキシアミノ化のような僅かな修飾を受けるHS、ヘパリン又はHS−PGであることができ、すなわち、これらは、ヘパラナーゼ型の活性を有する酵素により切断されうる(Naggi A.ら、生物化学ジャーナル(J. Biol. Chem.)280:12103〜12113、2005;Fernandez C.ら、炭水化物研究(Carbohydrate Res.)341:1253〜1265、2006;Sandback−Pikas D.ら、生物化学ジャーナル(J. Biol. Chem.)273:18770〜18777、1998;Ramsay S.ら、炭水化物研究(Carbohydrate Res.)333:59〜71、2001)。
本発明の方法は、多様なフォーマットを使用して実施することができる。以下のフォーマットが好ましいフォーマットである。
フォーマット〔a〕:基質はリガンド/レセプター対の第1メンバーに共有結合している。リガンド/レセプター対の他のメンバーは、ペルオキシダーゼ系のような酵素検出系に結合している。
フォーマット〔b〕:基質はリガンド/レセプター対の第1メンバーに共有結合している。リガンド/レセプター対の他のメンバーは、例えば、蛍光標識により標識されている。
フォーマット〔c〕:基質は、蛍光、化学発光又は電気化学発光標識に共有結合している。このフォーマットでは、固相に結合している標識基質からの信号が直接測定される。
「リガンド−レセプター対」は、2つの結合パートナー、例えば、ビオチン/アビジン;ビオチン/ストレプトアビジン;DNP(ジニトロフェノール)/抗DNP抗体、若しくはHA(アミノ酸9個のインフルエンザ赤血球凝集素ペプチド)/抗HA抗体のようなハプテン/抗体系;GST(グルタチオンSトランスフェラーゼ)/抗GST抗体;6HIS(ヒスチジン6個からなるペプチド)/抗6HIS抗体;c−myc(ヒトc−mycタンパク質のアミノ酸410〜419のペプチド)/抗c−myc抗体、又はFLAG(登録商標)(アミノ酸4個のペプチド)/抗FLAG(登録商標)抗体の対を意味する。当業者に既知の他のリガンド−レセプター対を使用することができる。
これらの「リガンド/レセプター」系は、当業者によく知られており、大部分は市販されている。
リガンド−レセプター対のメンバーを、ヒドロキシスクシンイミドエステル又はヒドロキシスルホスクシンイミドエステルのような多様な反応基を使用して、基質に共有結合させることができる。
ヘパラナーゼ型の酵素活性を調節することができる化合物を検出する方法によって、特に抗ヘパラナーゼ抗体、天然生成物、合成生成物、例えばペプチド及びタンパク質のコンビナトリアル化学により得られる化合物のライブラリーからの生成物であることができる生成物の大規模なライブラリーを、酵素活性を調節する能力についてスクリーニングすることが可能となる。
更に、本発明は、また、本発明の方法の実施態様を実施するために使用可能であるか又は必要である試薬、特に以下の成分:
−ヘパラナーゼ型の活性を有する酵素により切断されうる基質、特に、好ましくはレセプター/リガンド対の第1メンバーにより標識されているHS−(GAG)又はペプチド−HS(GAS)、
−ヘパラナーゼ(すなわち、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼ)、
−レセプター/リガンド対の第2メンバーを含む検出系
を含む、キットに関する。
−ヘパラナーゼ型の活性を有する酵素により切断されうる基質、特に、好ましくはレセプター/リガンド対の第1メンバーにより標識されているHS−(GAG)又はペプチド−HS(GAS)、
−ヘパラナーゼ(すなわち、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼ)、
−レセプター/リガンド対の第2メンバーを含む検出系
を含む、キットに関する。
本発明の(ヘパラナーゼ活性を測定するための)キットは、好ましくは、下記:
−ビオチンにより(ペプチド切れ残りを介して)標識されている基質ヘパラン硫酸(ペプチド−HS)、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン(又はストレプトアビジン)及びオルトフェニレンジアミン(OPO)のような適切な基質、
−プロタミン被覆固相、例えばマイクロプレート
を含む。
−ビオチンにより(ペプチド切れ残りを介して)標識されている基質ヘパラン硫酸(ペプチド−HS)、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン(又はストレプトアビジン)及びオルトフェニレンジアミン(OPO)のような適切な基質、
−プロタミン被覆固相、例えばマイクロプレート
を含む。
別の実施態様において、本発明の(ヘパラナーゼ活性の潜在的なモジュレーターを試験する)キットは、好ましくは、下記:
−ビオチンにより(ペプチド切れ残りを介して)標識されている基質ヘパラン硫酸(ペプチド−HS)、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン(又はストレプトアビジン)及びOPOのような適切な基質、
−ヘパラナーゼ(組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼから選択)、
−プロタミン被覆固相、例えばマイクロプレート
を含む。
−ビオチンにより(ペプチド切れ残りを介して)標識されている基質ヘパラン硫酸(ペプチド−HS)、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン(又はストレプトアビジン)及びOPOのような適切な基質、
−ヘパラナーゼ(組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼから選択)、
−プロタミン被覆固相、例えばマイクロプレート
を含む。
本発明の方法は、従来技術の方法と比較して多くの利点を有し、特に下記である。
この方法は、非放射性アッセイである([0023]及び[0024]を参照すること)。
このアッセイは、僅かな工程しか含まず、3時間未満で完了するので、実施するのが非常に簡単である。
この方法は高価な技術装置を必要としない。
エンドグリコシダーゼ、特にヘパラナーゼのものの、標識基質との酵素反応は、溶液中で実施され、固相に結合した基質により実施されない。したがって、立体障害及び酵素による基質の切断部位の利用可能性の欠如という問題が回避される([0029]を参照すること)。
GAG鎖の化学処理又は修飾の必要がない。このアッセイフォーマットにおいて、(元のコアタンパク質の)ペプチド切れ残りのみが、小型リガンド、例えばビオチンにより標識される。したがって、HS(GAG)のヘパラナーゼ切断部位は、上記に概説されているように、容易に利用可能である。
本発明の方法は、好ましくは、HS結合タンパク質として、HS(又はヘパリン)の他のリガンド、例えばbFGF([0029]を参照すること)のような増殖因子の代わりに、ポリカチオン性タンパク質プロタミンを使用する。一般にHS鎖に限定された発現パターンを有する、これらの特異的リガンドのための結合ドメインと対照的に、HSとプロタミンとのイオン性相互作用を仲介するアニオン性基、例えば硫酸塩基は、ポリアニオン性HS鎖に均一に分布している。したがって、このアッセイは、特定の結合ドメインについて、より感度があり、基質の組成の変化によって損傷を受けることが少ない([0040]を参照すること)。
加えて、標識基質の特異的結合タンパク質としての増殖因子、サイトカインなどの使用は、アッセイを高価にする。
加えて、標識基質の特異的結合タンパク質としての増殖因子、サイトカインなどの使用は、アッセイを高価にする。
例えばヘパラナーゼ分子の異なるエピトープに対してモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイと対照的に、本発明のアッセイでは、ヘパラナーゼ濃度の代わりに、試料中のヘパラナーゼの機能活性が測定される。対照的に、イムノアッセイは、アッセイ設計及び対応する抗体に応じて、不活性な又は分解したヘパラナーゼも検出する。したがって、イムノアッセイでは、エンドグリコシダーゼ活性のモジュレーターを分析することは可能ではない。
使用される容量は、非常に少量である(例4及び5において、1ウエルあたり50μl)。しかし、このアッセイを(例えば、384ウエルプレートを使用して)更に小型化することができ、このことは、例えば試薬を節約することを可能にする。
10ngほどの基質が例4において使用される。しかし、このアッセイは、2ngの標識基質(図示せず)によっても成功裏に実施されている。対照的に、出願US2006/0127945では、少なくとも30ngの基質、出願US2003/0170746では、18.75ng(ユーロピウム標識基質)から150ngのフルオレセイン標識基質、出願WO00/03036では、5〜50μgの基質が使用される。
同じことが、このアッセイに使用される酵素の量について言える。例4では、0.1μU(0.15ngと同等)未満の酵素ヘパラナーゼが使用されるが、出願WO00/03036では、3μgのヘパラナーゼ(2.1mUに相当)が(最大24時間のインキュベーション時間で)使用され、出願US2003/0170746では、少なくとも20ngの組み換えヘパラナーゼが使用された。対照的に、出願US2006/0127945では、エンドグリコシダーゼ活性を、ヘパラナーゼの代わりに、細菌酵素のヘパチリナーゼIII(フラボバクテリウムヘパリヌム(Flavobacterium heparinum)のヘパリナーゼIII)により試験し、したがって、直接比較することができない。
全ての工程においてインキュベーションの時間は、例4に示されているように短時間であり、すなわち酵素反応は、1時間のインキュベーションを必要とする(更に削減することができる)。対照的に、出願WO00/03036では、酵素反応は、信号を得るためには、少なくとも4時間必要であり、出願US2006/0127945では、少なくとも5時間必要である。
したがって、本発明の方法は、試料においてヘパラナーゼ活性を決定すること、又はヘパラナーゼ活性を調節することができる分子のライブラリーを素早くスクリーニングすることを可能にする。
したがって、本発明の方法の実施態様において、インビトロ診断の分野のみならず、製薬産業でのハイスループットスクリーニングの分野にとって重要な用途が存在する。
以下の例は、本発明の方法の好ましい実施態様を非限定的に例示する。
実験セクション
次の略語が使用される:
HS:ヘパラン硫酸
NHS:N−ヒドロキシスクシンイミド
PBS:リン酸緩衝食塩水
POD:ホースラディッシュペルオキシダーゼ
OPD:オルトフェニレンジアミン
次の略語が使用される:
HS:ヘパラン硫酸
NHS:N−ヒドロキシスクシンイミド
PBS:リン酸緩衝食塩水
POD:ホースラディッシュペルオキシダーゼ
OPD:オルトフェニレンジアミン
例では、基質は、ペプチド−HS(ペプチド−HSは、精製ヘパラン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をパパインのようなタンパク質分解性酵素により消化し、短いペプチド切れ残りを有するグリコサミノグリカン鎖をもたらすことによって生成される)のNH2官能基を使用して官能化されている。
例1
HS−ビオチン基質の調製
使用される試薬
−HS溶液(Sigma H9902)5mg/ml:HS 5mg+PBS(Gibco)1ml
−スルホ−NHS−LC−ビオチン溶液(EZ−Link(登録商標)スルホ−NHS−LC−ビオチン)20mM:スルホ−NHS−LC−ビオチン(Pierce)11mg+PBS(Gibco)1ml
HS−ビオチン基質の調製
使用される試薬
−HS溶液(Sigma H9902)5mg/ml:HS 5mg+PBS(Gibco)1ml
−スルホ−NHS−LC−ビオチン溶液(EZ−Link(登録商標)スルホ−NHS−LC−ビオチン)20mM:スルホ−NHS−LC−ビオチン(Pierce)11mg+PBS(Gibco)1ml
ビオチン標識付け
5mg/mlのHS溶液(Sigma)1mlを、20mMのスルホ−NHS−LC−ビオチン0.1mlと混合する。混合物を37℃で18時間インキュベートする。過剰量のビオチンを、PBSで平衡にした5mlのZeba(商標)脱塩スピンカラム(Desalt Spin Column)(Pierce)を使用して除去する。これによって、ビオチン化HS(以降、ビオチン−HSと呼ぶ)を含有する1mlの溶液を得た。
5mg/mlのHS溶液(Sigma)1mlを、20mMのスルホ−NHS−LC−ビオチン0.1mlと混合する。混合物を37℃で18時間インキュベートする。過剰量のビオチンを、PBSで平衡にした5mlのZeba(商標)脱塩スピンカラム(Desalt Spin Column)(Pierce)を使用して除去する。これによって、ビオチン化HS(以降、ビオチン−HSと呼ぶ)を含有する1mlの溶液を得た。
例2
最終モル比の決定
ビオチンをアッセイする
ビオチン濃度は、アビジンに結合するビオチン−HSとHABA(4′−ヒドロキシアゾベンゼン−2−カルボン酸)との競合に基づいた光度アッセイを使用して測定する。HABA/アビジン複合体の吸光度を500nmで測定する。続いて、ビオチン−HSを加え、吸光度の減少を記録する。既知量のビオチン標識PODを基準として使用して、ビオチンおよびHSのモル比を計算する。
最終モル比の決定
ビオチンをアッセイする
ビオチン濃度は、アビジンに結合するビオチン−HSとHABA(4′−ヒドロキシアゾベンゼン−2−カルボン酸)との競合に基づいた光度アッセイを使用して測定する。HABA/アビジン複合体の吸光度を500nmで測定する。続いて、ビオチン−HSを加え、吸光度の減少を記録する。既知量のビオチン標識PODを基準として使用して、ビオチンおよびHSのモル比を計算する。
例3
ビオチン標識HSのプロタミン被覆固相への結合を試験する
使用される試薬
−ビオチン標識HS(上記の例1を参照すること)
−ニシンからの硫酸プロタミン、等級III、Sigma P4505
−アビジン−POD(Sigma A 3151)
−PBS/0.01%ツイーン20
−OPD(Dako S 204530)
ビオチン標識HSのプロタミン被覆固相への結合を試験する
使用される試薬
−ビオチン標識HS(上記の例1を参照すること)
−ニシンからの硫酸プロタミン、等級III、Sigma P4505
−アビジン−POD(Sigma A 3151)
−PBS/0.01%ツイーン20
−OPD(Dako S 204530)
固相、例えばマイクロタイタープレートを、100μl/ウエルの0.003%溶液の硫酸プロタミンと、37℃で24時間インキュベートすることによって、プロタミンにより被覆する。その後、プレートを蒸留水で3回洗浄し、暗所で保存した。
固相、例えばマイクロプレートのウエルの結合能を、増加量のビオチン標識HS(0.1〜100ng/ml)により室温で60分間インキュベートすることによって分析した。
プレートを緩衝液(PBS/0.01%ツイーン20)で3回洗浄し、アビジン−POD(PBS/5%BSA中1μg/ml)を加えた。
15分後、プレートを、クエン酸/リン酸緩衝液(pH6.2;34.7mMのクエン酸/66.7mMのNa2HPO4)で5回洗浄し、100μlのOPD溶液(0.667mg/ml)を加えた。
15分後、反応を、100μlの0.5Mol H2SO4の添加により停止させた。ODを、マイクロプレートリーダーを使用して490nmで測定した。
図1は、プロタミン被覆固相へのビオチン標識HSの用量依存的結合を示す。
例4
ヘパラナーゼ型の活性をアッセイする
使用される試薬
−例3と同じ
−標準的なフィコール密度勾配手順を使用して抹消血から単離し、Vlodavskyのグループにより記載された方法(Matzner Y.ら、臨床試験ジャーナル(J. Clin. Invest.)76:1306〜1313、1985)に従って調製した、多形核好中球からのヘパラナーゼ。20mMのクエン酸/リン酸緩衝液(pH6.2)中のこのヘパラナーゼの溶液10μlは、0.1μU又は0.15ngの組み換え酵素ヘパラナーゼと等しい。
ヘパラナーゼ型の活性をアッセイする
使用される試薬
−例3と同じ
−標準的なフィコール密度勾配手順を使用して抹消血から単離し、Vlodavskyのグループにより記載された方法(Matzner Y.ら、臨床試験ジャーナル(J. Clin. Invest.)76:1306〜1313、1985)に従って調製した、多形核好中球からのヘパラナーゼ。20mMのクエン酸/リン酸緩衝液(pH6.2)中のこのヘパラナーゼの溶液10μlは、0.1μU又は0.15ngの組み換え酵素ヘパラナーゼと等しい。
酵素反応は、50μlのビオチン標識HSを0.2μg/mlで増加量のヘパラナーゼ(0.5〜20μlのヘパラナーゼ、0.01〜0.2μUを表す)と混合することによって実施される。試料を、20mMのクエン酸/リン酸緩衝液(pH6.2)の添加により100mlの容量にした。
この混合物を室温で1時間放置した。
試料(50μlの試料)を、プロタミン被覆マイクロプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。以下の工程は、例3([0088]〜[0090])に記載されたものと同一である。
結果を図2に表し、これは、酵素ヘパラナーゼの濃度の増加による信号の変化を示す。
信号の減少は、酵素活性、すなわちビオチン標識HS基質の切断の増加と完全に相関している。
例5
ヘパラナーゼ型の酵素活性のモジュレーター、例えばインヒビターの決定
使用される試薬
−例4と同じ
−ヘパリン(ナトリウム塩、ブタ腸粘膜からの未分画ヘパリン(等級Ia、170USP/mg)(Sigma H3393))
ヘパラナーゼ型の酵素活性のモジュレーター、例えばインヒビターの決定
使用される試薬
−例4と同じ
−ヘパリン(ナトリウム塩、ブタ腸粘膜からの未分画ヘパリン(等級Ia、170USP/mg)(Sigma H3393))
例4と同じ手順が実施されるが、増加量のモジュレーター、すなわちインヒビターを、ヘパラナーゼ(一定量)及びビオチン標識HS(一定量)の反応混合物に加えた。
この実験において、10μlのヘパラナーゼの量を用量依存性曲線(図2)から選択して、1時間後に約80〜90%のビオチン標識HSがヘパラナーゼにより分解されるのを確実にする。このことは、曲線の直線部分におけるヘパリンのようなインヒビターの活性を検出することを可能にする。
この実験において、ヘパリンをインヒビターとして0.1〜5ng/mlの濃度で使用した。
試験化合物(すなわち、インヒビター)による酵素の阻害(又は活性化)率は、試験化合物の存在下又は不在下で得られる結果を比較することにより決定する。
阻害は、以下の式:
に従って計算し、
ここでOD(max*)は、ヘパラナーゼ及びインヒビターの不在下でのビオチン標識HS(10ng/ml)についてのOD(490nm)である。OD(max*)は、OD(max)− OD(hep-10)に設定されており、ここでOD(hep-10)は、10μlのヘパラナーゼによるビオチン標識HSの分解後にもたらされるOD(490nm)である。次にOD(x)は、濃度xのインヒビターについて測定されたOD(490nm)である。OD(x*)は、OD(x)− OD(hep-10)に設定されている。結果は、阻害率として提示される。
に従って計算し、
ここでOD(max*)は、ヘパラナーゼ及びインヒビターの不在下でのビオチン標識HS(10ng/ml)についてのOD(490nm)である。OD(max*)は、OD(max)− OD(hep-10)に設定されており、ここでOD(hep-10)は、10μlのヘパラナーゼによるビオチン標識HSの分解後にもたらされるOD(490nm)である。次にOD(x)は、濃度xのインヒビターについて測定されたOD(490nm)である。OD(x*)は、OD(x)− OD(hep-10)に設定されている。結果は、阻害率として提示される。
結果を図3に表し、これは、インヒビター、すなわちヘパリンの濃度の増加による信号の変化を示す。
したがって、例1〜5で使用されたフォーマット〔a〕([0055]を参照すること)は、エンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを測定する方法ばかりでなく、この酵素活性のモジュレーターを試験するためにも完全に適切である。
Claims (14)
- エンドグリコシダーゼ酵素活性を決定する方法であって、以下の工程:
i.エンドグリコシダーゼ基質を、エンドグリコシダーゼ含有試料と、エンドグリコシダーゼによる基質の分解に十分な条件下で接触させる工程、
ii.非分解又は部分的に分解した基質を固相結合ヘパリン硫酸結合タンパク質に、好ましくはポリカチオン性タンパク質プロタミンに結合させることによって、該非分解又は部分的に分解した基質から分解生成物を分離する工程、
iii.試料中のエンドグリコシダーゼ活性に関連する無処理基質の減少を測定する工程
を含み、
該基質がリガンド/レセプター対の第1メンバーにより直接的又は間接的に標識されており、該無処理基質の量が、リガンド/レセプター対の第2メンバーに結合している検出系により発信される信号を測定することにより決定される
方法。 - リガンド/レセプター対の第1メンバーがビオチンであり、リガンド/レセプター対の第2メンバーが、検出系の一部として酵素に結合しているアビジン又はストレプトアビジンであるか、又はリガンド/レセプター対が、ハプテン/抗体対:DNP/抗DNP抗体、GST/抗GST抗体、6HIS/抗6HIS抗体;c−myc/抗c−myc抗体;FLAG(登録商標)/抗FLAG(登録商標)抗体;HA/抗HA抗体から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、組織又は細胞の抽出物、全血、血清、血漿、脳脊髄液などである、請求項1又は2に記載の方法。
- エンドグリコシダーゼ酵素活性を調節することができる化合物を検出する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法であって、追加的に、以下の工程:
iv.試験化合物の不在下で測定した結合基質の量と、試験化合物の存在下で測定したものとの変化を比較する工程
を含む方法。 - エンドグリコシダーゼが、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ及び非精製ヘパラナーゼから選択されるヘパラナーゼ型の酵素であり、好ましくは酵素が、少なくとも部分的に精製された形態で提供される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 基質が、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、細胞外マトリックス関連ヘパラン硫酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸又はこれらの対応する誘導体から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ヘパラン硫酸結合タンパク質が、プロタミン又はヒストンファミリーのアルギニン豊富プロタミン様タンパク質のファミリーの他のメンバーから選択され、これらの結合タンパク質が、天然タンパク質、異なる種の精液から精製されたもの、これらのタンパク質の低分子量形態、例えばタンパク質分解性切断により誘導されたもの、ペプチド、又は組み換えタンパク質である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 基質が、リガンド/レセプター対の第1メンバーに共有結合しており、第2メンバーが検出系の一部として酵素に結合している、請求項6又は7に記載の方法。
- リガンド/レセプター対の第2メンバーが、蛍光、化学発光又は電気化学発光標識により標識されている、請求項8に記載の方法。
- 基質が、蛍光、化学発光又は電気化学発光化合物に共有結合しており、ヘパラン硫酸結合タンパク質に結合している基質の蛍光又は発光信号が直接測定される、請求項6又は7に記載の方法。
- 請求項4に記載のヘパラナーゼ型の酵素活性を調節することができる化合物を検出する方法であって、前記化合物が、抗ヘパラナーゼ抗体、天然生成物、合成生成物、コンビナトリアル化学により得られる化合物のライブラリーからの生成物、ペプチド及びタンパク質から選択される方法。
- 以下の成分:
(a)ヘパラナーゼ型の活性を有する酵素により切断されうる基質、特に、好ましくはレセプター/リガンド対の第1メンバーにより標識されているHS−(GAG)又はペプチド−HS(GAG)、
(b)ヘパラナーゼ、好ましくは、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼ、
(c)酵素、好ましくはアビジン−ペルオキシダーゼ又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび適切な基質に結合しているレセプター/リガンド対の第2メンバーを含む検出系、
(d)好ましくは固相に結合しているヘパラン硫酸結合タンパク質
を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキット。 - −ヘパラン硫酸、好ましくはビオチンで標識されているペプチド−HSと、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン又はストレプトアビジン及びペルオキシダーゼ基質と、
−プロタミン被覆固相、好ましくはマイクロプレートと
を含む、請求項12に記載のヘパラナーゼ活性を測定するためのキット。 - −ヘパラン硫酸、好ましくはビオチンで標識されているペプチド−HSと、
−ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼに結合しているアビジン又はストレプトアビジンと、
−組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ及び非精製ヘパラナーゼから選択されるヘパラナーゼと、
−プロタミン被覆固相、好ましくはマイクロプレートと
を含む、請求項12又は13に記載のヘパラナーゼ活性の潜在的モジュレーターを試験するためのキット。
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