JP4643260B2 - エンドグリコシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents
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Description
本発明の対象は、酵素基質に結合した2つの化合物の間のきわめて近接した移動により生じるシグナルを測定すること、そしてしたがって、上記酵素活性に由来する断片の分離ステップを必要としないことに基づいてエンドグリコシダーゼ活性をアッセイすることである。
i.エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質を前記サンプルと接触させること、そして
ii.サンプル中のエンドグリコシダーゼ活性を表す、この基質の未反応の基質の量の変化、この基質の減少量を測定すること、
を含む上記方法に関する。
i.試験化合物の存在下又は非存在下において、エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質をエンドグリコシダーゼと接触させること、
ii.未反応の基質量の変化を測定すること、そして、
iii.試験品の非存在下で測定した基質量の変化を、試験品の存在下で測定したものと比較すること、
を含む、上記方法にも関する。
R1及びR3は、以下の基:H、SO3H、SO3Hから選ばれ、
R2は、以下の基:SO3H、SO3H‐、C(O)CH3から選ばれ、
X1及びX2はH、COOH、COO-をあらわす。}
により表される単位を少なくとも1つ含む。
nは、0〜8の範囲内にあり、そして
pは、0又は1に等しく、そして、
Arは、場合により、ハロゲン原子で置換された、1〜3個のヘテロ原子を含む5又は6個の環の構成要素を有するヘテロ環である。}
により表される基のような反応基を用いて共有結合で基質に結合されることができる。
−ヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素によって切断可能な基質
−前記基質に共有結合で結合された又は間接的に結合することのできる、ドナー蛍光化合物、
−前記基質に共有結合で結合された又は間接的に結合することのできる、アクセプター化合物を含むキットにも関し、ここで、蛍光化合物が上記基質に共有結合で結合されていない場合、上記要素は同じボトル中、又は異なるボトル中にあることができる。
−ビオチン及びDNPで標識されたヘパラン硫酸
−抗DNP抗体に結合された希土類クリプテート
−ストレプトアビジンに結合されたXL665、
を含む。
−ビオチン及びDNPで標識されたヘパラン硫酸プロテオグリカン
−抗DNP抗体に結合された希土類クリプテート
−ストレプトアビジンに結合されたXL665、
を含む。
−それらは、実施が非常に単純であり、それはなぜなら、ヘパラナーゼタイプの酵素活性に特徴を有する蛍光シグナルを得ることが可能であるために、多様な試薬を接触させることで十分だからである。化学的な処理又は分離ステップは必要ない。
以下の略語が使用される:
DNP:ジニトロフェノール
EDC:1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
HS:へパラン硫酸
NHS:N−ヒドロキシサクシニミド
この場合、基質はHSのCOOH及びNH2官能基を用いて官能基化される。
使用される試薬:
20mg/mlのHS溶液:10mg HS+0.5ml 10mM PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0、0.15M NaCl
20mMのEDC溶液:2.4mg EDC(PIERCE) +0.625ml 0.1M MES緩衝液、pH6.0
47mM 5−(ビオチナミド)ペンチルアミン溶液:4.2mg 5−(ビオチナミド)ペンチルアミン(PIERCE)+0.271ml 0.1M MES緩衝液、pH6.0
1mg/mlのDNP-NHS溶液:3mg DNP-NHS(CIS-Bio)+1.0ml DMSO(Sigma D8418)
20mg/mlのHS溶液0.25ml(Seikagaku)を0.125mlの47mM 5−(ビオチナミド)ペンチルアミン溶液と混合する。0.125mlの20mM EDC溶液の存在下、混合物を18時間、室温でインキュベートする。その後、1.5mlの0.15M NaCl 含有PO4(Na/K)緩衝液(10mM)、pH 7.0を添加することによって反応を停止する。そして、Slide-A-Lyzer透析システム(Pierce)を用いて、該混合物を600mlの0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7に対して透析する。600mlの10mM PO4(Na/K)緩衝液、pH 7に対して3時間、600mlの50nMホウ酸緩衝液、pH8.3に対して16時間、さらに2回の透析を行って、以後ビオチン−HSを呼ぶ、ビオチン標識HSを含む溶液2mlを得ることができる。
上記のビオチン−HS溶液2mlを1mlの3mg/ml DNP-NHS溶液と混合し、1mlの50mM ホウ酸緩衝液、pH8.3、及び0.5mlのDMSOの存在下、室温で2時間、インキュベートした。反応混合物をその後、Sephadex G25 SFタイプ(Pharmacia)のカラム上のクロマトグラフィーによって、0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7で溶出した。こうして、以後「DNP-HS-ビオチン」と呼ぶ、ビオチン及びDNPで標識されたヘパラン硫酸の溶液を8.83ml得る。
DNP-HS-ビオチンのアッセイ
HSのアッセイキット(Byscan, Biocolor Ltd)が、DNP-HS-ビオチン濃度の決定を可能とする。
DNP濃度は、DNP-HS-ビオチン溶液の360nmにおける吸収を分光光度計で測定することによって決定し、DNP濃度は、測定された値を標準曲線と比較することによって決定する。
ビオチン濃度は、FRET現象に基づくアッセイを使用して測定し、第一の曲線は、既知濃度のビオチン、クリプテート−ストレプトアビジンドナーコンジュゲート及びXL-ビオチンアクセプターコンジュゲートを合わせることによって確立し、得られるシグナルをRubystar蛍光光度計(BMG)によって測定する。置換曲線をプロットし、標準範囲として使用する。
本実施例は、均一媒体中での照射性の移動によって発せられた蛍光の時間分解測定に基づいたアッセイにおける、DNP-HS-ビオチン産物の使用の有効性を確認することを可能とする。
10μg/mlのストレプトアビジン−XLコンジュゲートの溶液:3.2μlの625μg/ml SA-XL(CIS bio international)+197μlの0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0;0.1%BSA 0.4M KF
1μg/mlのストレプトアビジン−XLコンジュゲートの溶液:18μlの20μg/ml SA-XL(CIS biointernational)+162μlの0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0;0.1%BSA 0.4M KF
1μg/mlの抗-DNP抗体−クリプテートコンジュゲート(以後、aDNP-Kと呼ぶ)溶液:4.5μlの100μg/ml aDNP-K(CIS bio international)+445μlの0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0;0.1%BSA 0.4M KF
様々な濃度の(22.2〜5400ng/ml)DNP-HS-ビオチン溶液を、実施例1で得られた溶液から0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7中で調製する。
使用する試薬:
20mM PO4緩衝液、pH 7.2;0.15M NaCl;0.1%BSA中、0.2〜20000μ単位/mlのヘパリチナーゼIII(Sigma)溶液
1μg/mlのSA-XL溶液: 1μlの625μg/ml SA-XL(CIS bio international)+624μlの0.1M PO4緩衝液、pH 7.2;0.4M KF NaCl;0.1%BSA
0.8μg/mlのaDNP-K溶液:2μlの100μg/ml aDNP-K(CIS bio international)+248μlの0.1M PO4緩衝液、pH 7.2;0.4M KF NaCl;0.1%BSA
1.2μg/mlのDNP-HS-ビオチン溶液:3.8μlの45μg/ml DNP-HS-ビオチン+140μlの20mM PO4緩衝液、pH 7.2;0.15M NaCl;0.1%BSA
混合物を室温で5時間放置する。
10μlの各反応混合物をマイクロプレートのウエル中に入れ、そこへ5μl/ウエルのaDNP-K(0.8μg/ml)及び5μl/ウエルのSA-XL(1μg/ml)を添加する。
室温での1時間のインキュベーション後、Rubystar蛍光光度計(BMG)上でプレートを読み取る。
実施例4と同じ手順を実施するが、試験化合物の存在下又は非存在下において多様な反応混合物が同一の酵素活性とともにインキュベートされる。
この場合においては、HSのOH官能基及びタンパク質成分(プロテオグリカン)のNH2基を用いて基質を官能基化する。
使用する試薬:
HSPG:Sigma、分子量200kDa
ビオチンヒドラジド:Pierce、分子量258.33Da
NalO4:Sigma
NaCNBH4:Sigma
HSPGは、100mM炭酸塩溶液、pH9に対して透析する。
HSPG及びDNP-NHSの溶液を周囲温度で1時間反応させる。使用する量は、初期モル比で、HSPGあたり15DNPである。その後、反応混合物をSephadex G-25カラム(NAP-5、Pharmacia)上で100mM PO4緩衝液、pH7で溶出する。DNP-HSPGの溶液が得られる。
上で得られたDNP-HSPG溶液を10mMNalO4溶液で30分間、周囲温度で酸化した。SephadexG25カラム上で100mMリン酸緩衝液で溶出することによって精製後、酸化DNP-HSPG溶液をビオチンヒドラジド溶液と混合する。使用量は、初期モル比でDNP-HSPGあたり10ビオチンヒドラジドである。反応混合物を4℃で16時間インキュベート後、15mM NaCNBH4溶液で4℃で40分間還元する。SephadexG215カラム上で100mMリン酸緩衝液pH7.0で溶出することによって精製後、DNP-HSPG-ビオチンの溶液が得られる。
本実施例は、均一な媒体中での照射性の移動によって発せられた蛍光の時間分解測定に基づくアッセイにおけるDNP-HSPG‐ビオチン産物の使用の有効性を想定することを可能とする。
0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、0.2% BSA 0.8M KFで希釈した625μg/mlのSa-XLから調製した、10μg/mlのストレプトアビジン−XLコンジュゲート(以後、Sa-XLと呼ぶ)溶液
0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、0.2% BSA 0.8M KFで希釈したaDNP-K(CIS bio international)から調製した、0.4μg/mlの100μg/mlの抗-DNP抗体−クリプテートコンジュゲート(以後、aDNP-Kと呼ぶ)溶液
0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、0.2% BSA 0.8M KFで希釈した200μg/mlのSa-K(CIS bio international)から調製した、0.8μg/mlのストレプトアビジン−クリプテートコンジュゲート(以後、Sa-Kと呼ぶ)溶液
0.1M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、0.2% BSA 0.8M KFで希釈した250μg/mlのaDNP-XL(CIS bio international)から調製した、4μg/mlの抗DNP抗体−XLコンジュゲート(以後、aDNP-XLと呼ぶ)溶液
多様な濃度のDNP-HSPG-ビオチン溶液(10〜5000ng/ml)は、実施例6において得られた溶液から、0.1MPO4(Na/K)緩衝液、pH7中で調製した。
Claims (13)
- サンプル中のエンドグリコシダーゼ酵素活性の測定方法であって、以下のステップ:
i.エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質を前記サンプルと接触させること、及び、
ii.未反応の基質の量の変化を測定すること、ここで、この基質の量の減少は、上記サンプル中のエンドグリコシダーゼ活性を表す、
を含み、
(1)上記基質が直接的又は間接的に第1の蛍光ドナー化合物及び第2の蛍光アクセプター化合物で標識され、そして前記未反応の基質の量が上記アクセプター化合物により発せられたシグナルを測定することによって決定され、このシグナルが、上記ドナー及び上記アクセプター間のエネルギー移動により生じ;
(2)エンドグリコシダーゼが、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ、非精製ヘパラナーゼおよびヘパリチナーゼから選ばれる、ヘパラナーゼタイプの酵素であり;
(3)上記基質が、へパラン硫酸プロテオグリカン及びそれらの誘導体、細胞外マトリックスに結合したヘパラン硫酸塩およびそれらの誘導体、ヘパリン、並びにヘパラン硫酸塩及びそれらの誘導体から選ばれ、以下の式:
R1及びR3は、以下の:H、SO3H、SO3H‐から成る群から選ばれ、
R2は、SO3H、SO3H‐、C(O)CH3から成る群から選ばれ、
X1及びX2がH又はCOOHを表す。}
により表される単位を1〜30単位含む
ことに特徴を有する、前記測定方法。 - エンドグリコシダーゼ酵素活性を変更することのできる化合物の検出方法であって、以下のステップ:
i.試験化合物の存在下または非存在下で、エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質をエンドグリコシダーゼと接触させること、
ii.未反応の基質の量の変化を測定すること、及び、
iii.上記試験化合物の非存在下で測定した基質量の変化を、試験化合物の存在下で測定した基質量の変化と比較すること、
を含み、
(1)上記基質が、直接的または間接的に、第1の蛍光ドナー化合物及び第2の蛍光アクセプター化合物で標識され、そして前記未反応の基質量が上記アクセプター化合物により発せられたシグナルを測定することによって決定され、このシグナルが上記ドナー及び上記アクセプター間のエネルギー移動により生じ;
(2)エンドグリコシダーゼが、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ、非精製ヘパラナーゼおよびヘパリチナーゼから選ばれる、ヘパラナーゼタイプの酵素であり;
(3)上記基質が、へパラン硫酸プロテオグリカン及びそれらの誘導体、細胞外マトリックスに結合したヘパラン硫酸塩およびそれらの誘導体、ヘパリン、並びにヘパラン硫酸塩及びそれらの誘導体から選ばれ、以下の式:
R1及びR3は、以下の:H、SO3H、SO3H‐から成る群から選ばれ、
R2は、SO3H、SO3H‐、C(O)CH3から成る群から選ばれ、
X1及びX2がH又はCOOHを表す。}
により表される単位を1〜30単位含む
ことに特徴を有する、前記方法。 - 上記基質が、ドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物に共有結合で結合されていることに特徴を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 上記基質が第1のリガンド−受容体対の要素及び第2のリガンド−受容体対の要素に共有結合で結合されており、そして上記ドナー蛍光化合物が上記第1のリガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合され、そして、上記ドナー蛍光化合物が上記第2のリガンド‐受容体対の他の要素に結合されていることに特徴を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 上記基質が上記ドナー蛍光化合物に共有結合で結合され、そしてリガンド−受容体対の要素に共有結合で結合されており、そして上記アクセプター蛍光化合物が前記リガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合されていることに特徴を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 上記基質が上記アクセプター蛍光化合物に共有結合で結合され、そしてリガンド−受容体対の要素に共有結合で結合されており、そして、上記ドナー蛍光化合物が前記リガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合されていることに特徴を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 上記第1の及び上記第2のリガンド−受容体対が異なり、そして以下の対:ハプテン/抗体、DNP/抗−DNP抗体、GST/抗−GST抗体、ビオチン/アビジン、6HIS/抗−6HIS抗体、Cmyc/抗−Cmyc抗体;FLAG(登録商標)/抗−FLAG(登録商標)抗体;HA/抗−HA抗体から選ばれることに特徴を有する、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 上記ドナー化合物が希土類クリプテート又はキレートであり、そして上記アクセプター蛍光化合物がローダミン、シアニン、スクアレン、ボディピー色素、フルオレセイン、アロフィコシアニン及びそれらの誘導体から選ばれることに特徴を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物が、抗ヘパラナーゼ抗体、天然物、合成物、コンビナトリアルケミストリーによって得られた化合物ライブラリーからの生成物、ペプチド及びタンパク質から選ばれることに特徴を有する、請求項2に記載のヘパラナーゼタイプの酵素活性を変更可能な化合物の検出方法。
- ビオチン及びDNP基を含む複数のヘパラン硫酸を含み、上記DNP/ヘパラン硫酸の最終モル比が0.7に等しく、そして上記ビオチン/ヘパラン硫酸の最終モル比が1に等しいことに特徴を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法において使用可能な組成物。
- 以下の要素:
ヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素によって切断可能な基質、
前記基質に共有結合で結合された、又は間接的に結合することのできる、ドナー蛍光化合物、
前記基質に共有結合で結合された、又は間接的に結合することのできる、アクセプター化合物、
を含み、ここで、上記蛍光化合物が共有結合で前記基質に結合されていない場合、前記要素が同じボトル又は異なるボトル中にあることができる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキット。 - 以下の要素:
ビオチン及びDNPに共有結合で結合されたヘパラン硫酸、
抗−DNP抗体に共有結合で結合された希土類クリプテート、及び
ストレプトアビジンに結合された架橋アロフィコシアニン、
を含むことに特徴を有する、請求項11に記載のキット。 - 以下の要素:
ビオチン及びDNPで標識されたヘパラン硫酸プロテオグリカン、
抗−DNP抗体に結合された希土類クリプテート、及び
ストレプトアビジンに結合された架橋アロフィコシアニン、
を含むことに特徴を有する、請求項11に記載のキット。
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