CN101307105A - 一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，涉及一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1－34肽类似物及其制备方法和用于治疗骨质疏松症的应用。该hPTH(1－34)类似物的N端存在二肽酶IV/CD26识别位点，能使其在进入体内后被二肽酶IV/CD26识别切割，发挥天然hPTH的防治骨质疏松的作用。该hPTH(1－34)类似物的制备方法是一个包括重组质粒以及相应的基因工程菌的构建、人甲状旁腺素1－34肽类似物的多联体的制备、人甲状旁腺素1－34肽类似物的获取过程。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物及其制备方法和药学用途，更具体地说，涉及一种小剂量多次皮下注射后可防治骨质疏松症的人甲状旁腺素1-34肽类似物。
背景技术
骨质疏松症是单位体积内骨矿成分和骨基质比例不断减少，骨组织显微结构破坏，骨质变薄，骨密度降低、骨脆性增加和骨折危险性升高的一种全身骨代谢障碍疾病。WHO已将骨质疏松症列为影响老年人身体健康的三大疾病(骨质疏松症、老年性痴呆和糖尿病)之一，并且是仅次于心血管疾病的第二位疾病，因此预防和治疗骨质疏松症已经受到了全世界的关注。
以往的研究表明人甲状旁腺素1-34肽[hPTH(1-34)]在体内外几乎保持有完整人甲状旁腺素(hPTH)的全部生物活性。小剂量间歇性注射hPTH(1-34)可刺激成骨细胞增殖及骨小梁增长，它不仅能使已丢失的松质骨重建，骨密度明显增加，而且能改善骨强度，促进骨膜形成及骨小梁连续性。hPTH(1-34)通过激活PTH/PTHrP受体来调节成骨细胞功能。其促进骨组织合成的首要以及必要机制为激活cAMP/PKA信号通路。多年的研究表明，hPTH(1-34)第一位的丝氨酸(Ser)和第二位的缬氨酸(Val)为激活腺苷酸环化酶所必须的，Ser缺失或者被修饰，hPTH(1-34)的活力均大大降低。研究人员多次试验结果显示，由于雌激素不足而导致骨质疏松的大鼠皮下小剂量多次注射Pro-Pro-[Arg11]-hPTH(1-34)-Pro-Pro后，骨质增加、骨结构改善、骨韧性增加。
然而hPTH及其相关肽类药物的注射剂在治疗骨质疏松时需要频繁给药给患者带来极大的不便和痛苦，因此开发hPTH(1-34)的类似物的其他非注射给药途径使患者顺应性较好尤为重要。然而，由30多个氨基酸构成的多肽经鼻饲或者口服给药的生物利用度很低，通常不大于1％，鼻饲或者口服给药的给药量是注射途径给药量的几十倍。用化学合成的方法生产hPTH(1-34)价格昂贵，患者很难承受巨额的治疗费用(约每年7200美元)，因此市场需要一种具有天然hPTH(1-34)的促骨合成机制的人甲状旁腺素1-34肽类似物[hPTH(1-34)类似物]，可通过简便、高效、低成本的方法进行大规模制备获得该产品。
发明内容
本发明的目的是公开一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物。
本发明的另一个目的是提供生产该人甲状旁腺素1-34肽类似物的方法。
本发明的再一个目的是公开该人甲状旁腺素1-34肽类似物的药物用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
所述人甲状旁腺素1-34肽类似物，其氨基酸序列为：
Pro-R1-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp
其中R1为Pro、Ala、Gly、Ser、Val或Leu。所述人甲状旁腺素1-34肽类似物的制备方法包括重组质粒以及相应的基因工程菌的构建步骤，人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备步骤，人甲状旁腺素1-34肽类似物的获得步骤。所述人甲状旁腺素1-34肽类似物用于制备治疗骨质疏松症的药物的用途。
本发明的目的还可以通过以下技术解决措施来进一步实现：
所述人甲状旁腺素1-34肽类似物的优选氨基酸序列为：
Pro-Pro-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp(简称Y肽链)。
所述人甲状旁腺素1-34肽类似物是一个前体分子，可在体内外被二肽酶IV/CD26识别切割掉N端二肽。
所述人甲状旁腺素1-34肽类似物的C端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(Pro)可以重复串联形成多联体，即一个类似物C端的Asp和下一个类似物N端的Pro形成酸水解位点，在盐酸作用下可以断开，其氨基酸序列为：
Met-Xa-Asp-(Pro-R1-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp)n
其中Xa为含有a个氨基酸残基的肽链(a为非负整数)；n≥1。Xa肽链序列可以为
Gly-Asp-Glu-Ile-Ile-His-Leu-Thr-Asp-Phe-Asp-Val-Ser-Leu-Ala-Leu-Thr-Gln-Thr；n＝8。
在重组质粒以及相应的基因工程菌的构建步骤中，质粒pET28a为表达载体质粒，质粒pED-Pro-Pro-[Arg11]]hPTH(1-34)-Pro-Pro为模板，是通过PCR反应获得含有人甲状旁腺素1-34肽类似物基因的DNA片段的扩增序列，引物的核苷酸序列为：
P1：5′ATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT3′
P2：5′CCGCAAGCTTAATCTGGCGGGAAGTTATGAACA3′
P3：5′AAAAGATCTGGCGGGAAGTTATGAACATC3′
P4：
5′AGATATACATGGGCGATGAAATCATCCACCTGACTGACTTCGATGTTTCTCTGGCTCTG3′
P5：
5′CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGGCGATGAAA3′；在人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备步骤中，将重组基因工程菌BL21/pET-8PTH′经发酵-离心-洗涤沉淀-乙醇沉淀得到多联体粗品，其中发酵温度是36-38℃，pH6.8-7.2；在人甲状旁腺素1-34肽类似物的获得步骤中，将多联体粗品经酸水解-沉淀-离子交换柱层析纯化得到人甲状旁腺素1-34肽类似物，其中酸水解用40-60mmol/L浓度的稀盐酸，CM52阳离子交换树脂纯化，乙酸铵洗脱，获得人甲状旁腺素类似物，经SDS-PAGE电泳检测，达到电泳纯。其技术路线详述如下：
1.重组质粒以及相应的基因工程菌的构建
以质粒pED-Pro-Pro-[Arg11]]hPTH(1-34)-Pro-Pro为模板逐步构建重组质粒pET-8PTH′，将质粒pET-8PTH′转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21，得到含有编码人甲状旁腺素(1-34)肽类似物的多联体基因的工程菌。
2.人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备
将重组基因工程菌BL21/pET-8PTH′经发酵-离心-洗涤沉淀-乙醇沉淀得到多联体粗品。
3.人甲状旁腺素1-34肽类似物的获得
将多联体粗品经酸水解-沉淀-离子交换柱层析纯化得到人甲状旁腺素1-34肽类似物。
所述药物是含有人甲状腺旁素1-34肽类似物或其药物上可接收盐的水溶液的制剂，也可以是人甲状旁腺素1-34肽类似物与若干种可药用的载体或赋形剂构成的组合物。
本发明的有益效果为人甲状旁腺素1-34肽类似物生产成本低、产量高，可以广泛用于制备具有天然hPTH(1-34)肽活性的新的人甲状旁腺素制剂。另外，其N端存在二肽酶IV/CD26的识别位点，能使其进入人体后被二肽酶IV/CD26识别切割，发挥天然hPTH的生物活性。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1含有编码人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体基因的工程菌的构建方法。
图2人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体基因序列T7启动子正向测序结果(图A)，人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体基因序列T7终止子反向测序结果(图B)。
图3人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体经酸水解得到人甲状旁腺素1-34肽类似物的单体的示意图。
图4人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的酸水解以及纯化单体的电泳图。
图5人甲状旁腺素1-34肽类似物的电喷雾质谱图。
图6SD大鼠皮下注射人甲状旁腺素1-34肽类似物后血清钙离子浓度时效关系图。
具体实施方式
以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。
一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物，其氨基酸序列是：
Pro-R1-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp
其中R1为Pro、Ala、Gly、Ser、Val或Leu。该人甲状旁腺素1-34肽类似物是一个前体分子，可在体内外被二肽酶IV/CD26识别切割掉N端二肽。
该人甲状旁腺素1-34肽类似物的C端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(Pro)可以重复串联形成多联体，即一个类似物C端的Asp和下一个类似物N端的Pro形成酸水解位点，在盐酸作用下可以断开，其氨基酸序列为：
Met-Xa-Asp-(Pro-R1-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp)n
其中Xa为含有a个氨基酸残基的肽链(a为非负整数)；n≥1。
人甲状旁腺素1-34肽类似物的制备方法包括重组质粒以及相应的基因工程菌的构建步骤，人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备步骤，人甲状旁腺素1-34肽类似物的获得步骤。在重组质粒以及相应的基因工程菌的构建步骤中，质粒pET28a为表达载体质粒，质粒pED-Pro-Pro-[Arg11]]hPTH(1-34)-Pro-Pro为模板，是通过PCR反应获得含有人甲状旁腺素1-34肽类似物基因的DNA片段的扩增序列；在人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备步骤中，将重组基因工程菌BL21/pET-8PTH′经发酵-离心-洗涤沉淀-乙醇沉淀得到多联体粗品，其中发酵温度是36-38℃，pH6.8-7.2；在人甲状旁腺素1-34肽类似物的获得步骤中，将多联体粗品经酸水解-沉淀-离子交换柱层析纯化得到人甲状旁腺素1-34肽类似物，其中酸水解用40-60mmol/L浓度的稀盐酸，CM52阳离子交换树脂纯化，乙酸铵洗脱，获得人甲状旁腺素类似物，经SDS-PAGE电泳检测，达到电泳纯。
该人甲状旁腺素1-34肽类似物可用于制备治疗骨质疏松症的药物的用途，药物可以是含有人甲状腺旁素1-34肽类似物或其药物上可接收盐的水溶液的制剂，也可以是人甲状旁腺素1-34肽类似物与若干种可药用的载体或赋形剂构成的组合物。
本说明书中所提到的材料中
(1)宿主菌和质粒：
宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工具菌种，质粒pET28a为基因工程常用克隆载体，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
(2)酶和试剂：
分子克隆工具酶购自MBI公司；PCR纯化试剂盒为Promega公司产品。
(3)培养基：
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，ManiatisT.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术领域的经典著作，在高校图书馆均有收藏。
(4)CM52阳离子交换树脂为Whatman公司产品。
本说明书所提到的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌：在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，pp.16-340。
实施例1
1.重组质粒以及相应的基因工程菌的构建
(1)重组质粒pET-8PTH′的构建
在基因水平上于每个肽单体两端预留编码酸水解位点(Asp-Pro)的核苷酸序列，设计引物P1(含有Xba I酶切位点)和P2(含有HindIII酶切位点以及编码Asp的GAT和终止密码子TAA)，以质粒pED-Pro-Pro-[Arg11]]hPTH(1-34)-Pro-Pro(该质粒的构建方法见公开号CN1597697A的专利申请)为模板，用PCR方法扩增得到编码Y肽链的DNA片段，用XbaI、HindIII消化，与用相同限制性内切酶消化的pET28a质粒连接，得到载体pED-PTH′，该载体中编码人甲状旁腺素1-34肽类似物的核苷酸序列前具有BamHI酶切位点。
设计编码Met-Xa-Asp肽链(即fusion partner)的序列，其中Xa为Gly-Asp-Glu-Ile-Ile-His-Leu-Thr-Asp-Phe-Asp-Val-Ser-Leu-Ala-Leu-Thr-Gln-Thr，以pED-PTH′为模板，P3(含有BglII酶切位点)、P4为引物，用PCR反应得到一段DNA序列，以该序列为模板，P3、P5(含有XbaI酶切位点)为引物，再用PCR反应得到编码Met-Xa-Asp-PTH′肽链的插入序列，用XbaI、BglII消化，与用XbaI和BamHI消化的载体pED-PTH′连接，得到载体pET-2PTH′。
以pET-2PTH′为模板，P3、P5为引物，PCR反应得到编码Met-Xa-Asp-2PTH′肽链的插入序列，用XbaI、BglII消化，与用XbaI和BamHI消化的载体pET-2PTH′连接，得到载体pET-4PTH′。
将含有2段人甲状旁腺素1-34肽类似物的插入序列XbaI、BglII消化后的片段再分次与用XbaI和BamHI消化的载体pET-4PTH′连接得到pET-6PTH′。
将含有2段人甲状旁腺素1-34肽类似物的插入序列XbaI、BglII消化后的片段再分次与用XbaI和BamHI消化的载体pET-6PTH′连接，最终得到重组质粒pET-8PTH′，其步骤见附图1。
(2)相应得基因工程菌的构建
转化大肠杆菌Escherichia coli BL21后经PCR筛选，得到重组基因工程菌BL21/pET-8PTH′。
从该工程菌中抽提的质粒由上海英骏公司核苷酸自动测序仪进行测定，进一步验证人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体基因序列的正确性，序列测定结果见附图2。
其中，5条引物序列如下：
P1：5′ATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT3′
P2：5′CCGCAAGCTTAATCTGGCGGGAAGTTATGAACA3′
P3：5′AAAAGATCTGGCGGGAAGTTATGAACATC3′
P4：
5′AGATATACATGGGCGATGAAATCATCCACCTGACTGACTTCGATGTTTCTCTGGCTCTG3′
P5：
5′CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGGCGATGAAA3′
2.人甲状旁腺素1-34肽类似物的制备
(1)人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备
挑取表达量达50％以上的重组基因工程菌BL21/pET-8PTH′接种到LB培养基中，37℃恒温过夜培养，按2％比例转接种入新鲜的LB液体培养基中，37℃培养4小时后加入终浓度为5mmol/L的乳糖诱导，继续培养。离心回收的菌体按10倍重量体积加入菌体裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，5mmol/LEDTA，0.75％Triton X-100，100mg/L溶菌酶)，剧烈混匀，冻融，37℃振摇至溶液不粘稠，12000rpm离心20分钟回收沉淀。沉淀按10倍重量体积加入包涵体洗涤液I(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，5mmol/LEDTA pH8.0，0.75％TritonX-100)，洗涤3次，再按相同比例用包涵体洗涤液II(50mmol/LTris-HCl pH8.0，5mmol/LEDTA pH8.0，150mmol/LNaCl，0.75％TritonX-100)和III(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，2mol/LUrea)分别洗涤1次，每次洗涤后均是12000rpm离心20分钟，收获沉淀，得人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体包涵体粗品。
该包涵体粗品按20倍重量体积加入包涵体溶解液(50mmol/LTris-HCl pH8.0，8mol/LUrea)，混匀，4℃缓慢搅拌过夜至包涵体溶解，离心后收集上清并在上清中加入0.7倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀20分钟后离心，上清再加入原体积3.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2小时，离心收集沉淀，干燥，即为人甲状旁腺素1-34肽多联体粗品。以上每次离心均为12000rpm，20分钟。
(2)人甲状旁腺素1-34肽类似物的制备
按每1g多联体粗品加入10mL 50mmol/L HCl溶解，置48℃水浴48小时。多联体粗品酸水解后，用NaOH调节水解液pH值至4.6，有大量沉淀生成，12000rpm离心20min，去除沉淀后上清液对80mmol/L乙酸铵透析(透析袋截留分子量为2000Da)后流动上样于以80mmol/L乙酸铵平衡的CM52阳离子交换树脂，以80mmol/L乙酸铵对300mmol/L乙酸铵进行梯度洗脱，收集样品峰，透析除盐，冻干收集纯品蛋白，见附图3。SDS-PAGE电泳，结果见图4，图中1.人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体；2.人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体经50mmol/L盐酸48℃水浴24h得到的产物；3.人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体经50mmol/L盐酸48℃水浴48h得到的产物；4.人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体酸水解产物调节等电点得到的沉淀；5.人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体酸水解产物调节等电点得到的上清；6.阳离子交换层析(CM-52)得到的穿透峰；7.阳离子交换层析(CM-52)纯化后的人甲状旁腺素1-34肽类似物单体。
冻干品经电喷雾质谱鉴定，计算得分子量为4663.76Da，与理论分子量4664.01相比误差小于0.01％，见附图5。
3.人甲状旁腺素1-34肽类似物生物学活性的检测
选用平均体重为200g的SD雌性大鼠，人甲状旁腺素1-34肽类似物给药组和hPTH(1-34)对照组各5只。用无菌生理盐水将人甲状旁腺素1-34肽类似物和hPTH(1-34)分别稀释至15μg/mL，每只大鼠皮下注射1ml。分别在给药前以及给药后15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时取血，凝血后离心取血清，观察供测血钙变化趋势见附图6。大鼠血清中钙离子浓度随时间的变化，说明人甲状旁腺素1-34肽类似物比天然hPTH(1-34)有相似的生物活性。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
序列表.doc
SEQUENCE LISTING
<110>中国药科大学
<120>一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物及其制备方法和应用
<130>人甲状旁腺素1-34肽类似物
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>39
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人甲状旁腺素1-34肽类似物
<400>1
Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His
1 5 10 15
Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp
20 25 30
Val His Asn Phe Pro Pro Asp
35
<210>2
<211>333
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人甲状旁腺素1-34肽类似物多联体
<400>2
Met Gly Asp Glu Ile Ile His Leu Thr Asp Phe Asp Val Ser Leu Ala
1 5 10 15
Leu Thr Gln Thr Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His
20 25 30
Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg
35 40 45
Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val
50 55 60
Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met
65 70 75 80
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe
85 90 95
Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg
100 105 110
Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys
115 120 125
Leu Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu
130 135 140
Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg
145 150 155 160
Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro
165 170 175
Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys
180 185 190
His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln
195 200 205
Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln
210 215 220
Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu
225 230 235 240
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro
245 250 255
Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu
260 265 270
Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val
275 280 285
His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met
290 295 300
His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp
325 330
<210>3
<211>24
<212>DNA
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<220>
<223>P1
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attcccctct agaaataatt ttgt 24
<210>4
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<212>DNA
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<223>P2
<400>4
ccgcaagctt aatctggcgg gaagttatga aca 33
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<211>29
<212>DNA
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<220>
<223>P3
<400>5
aaaagatctg gcgggaagtt atgaacatc 29
<210>6
<211>59
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<220>
<223>P4
<400>6
agatatacat gggcgatgaa atcatccacc tgactgactt cgatgtttct ctggctctg 59
<210>7
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>P5
<400>7
ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatgggcg atgaaa 56
Claims (10)
1、一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物，其氨基酸序列为：
Pro-R1-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp
其中R1为Pro、Ala、Gly、Ser、Val或Leu。
2、根据权利要求1所述的一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物，其氨基酸序列为：
Pro-Pro-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-Hi s-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp。
3、根据权利要求1所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物，其特征在于：所述人甲状旁腺素1-34肽类似物是一个前体分子，可在体内外被二肽酶IV/CD26识别切割掉N端二肽。
4、根据权利要求1所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物，其特征在于：所述人甲状旁腺素1-34肽类似物C端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(Pro)重复串联形成多联体，是一个类似物C端的Asp和下一个类似物N端的Pro形成酸水解位点，在盐酸作用下可以断开，其氨基酸序列为：
Met-Xa-Asp-(Pro-R1-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp)n
其中Xa为含有a个氨基酸残基的肽链(a为非负整数)；n≥1。
5、根据权利要求4所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物，其特征在于：所述Xa肽链序列为
Gly-Asp-Glu-Ile-Ile-His-Leu-Thr-Asp-Phe-Asp-Val-Ser-Leu-Ala-Leu-Thr-Gln-Thr；n＝8。
6、根据权利要求1所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物的制备方法，包括重组质粒以及相应的基因工程菌的构建步骤，人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备步骤，人甲状旁腺素1-34肽类似物的获得步骤，其特征在于：在重组质粒以及相应的基因工程菌的构建步骤中，质粒pET 28a为表达载体质粒，质粒pED-Pro-Pro-[Arg11]]hPTH(1-34)-Pro-Pro为模板，是通过PCR反应获得含有人甲状旁腺素1-34肽类似物基因的DNA片段的扩增序列，引物的核苷酸序列为：
P1：5′ATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT 3′
P2：5′CCGCAAGCTTAATCTGGCGGGAAGTTATGAACA 3′
P3：5′AAAAGATCTGGCGGGAAGTTATGAACATC 3′
P4：
5′AGATATACATGGGCGATGAAATCATCCACCTGACTGACTTCGATGTTTCTCTGGCTCTG3′
P5：
5′CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGGCGATGAAA3′。
7、根据权利要求6所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物的制备方法，其特征在于：在人甲状旁腺素1-34肽类似物的多联体的制备步骤中，将重组基因工程菌BL21/pET-8PTH′经发酵-离心-洗涤沉淀-乙醇沉淀得到多联体粗品，其中发酵温度是36-38℃，pH6.8-7.2。
8、根据权利要求6所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物的制备方法，其特征在于：在人甲状旁腺素1-34肽类似物的获得步骤中，将多联体粗品经酸水解-沉淀-离子交换柱层析纯化得到人甲状旁腺素1-34肽类似物，其中酸水解用40-60mmol/L浓度的稀盐酸，CM52阳离子交换树脂纯化，乙酸铵洗脱，获得人甲状旁腺素类似物，经SDS-PAGE电泳检测，达到电泳纯。
9、根据权利要求1所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物的应用，其特征在于：所述的人甲状旁腺素1-34肽类似物用于制备治疗骨质疏松症的药物的用途。
10、根据权利要求9所述一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物的应用，其特征在于：所述药物是含有人甲状旁腺素1-34肽类似物或其药物上可接收盐的水溶液的制剂；所述药物是人甲状旁腺素1-34肽类似物与若干种可药用的载体或赋形剂构成的组合物。
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