CN101302481A

CN101302481A - 一种石榴酒酵母的选育方法

Info

Publication number: CN101302481A
Application number: CNA2008100171870A
Authority: CN
Inventors: 张家训; 李�杰
Original assignee: ANHUI CHENGGUO POMEGRANATE WINE Co Ltd
Current assignee: ANHUI CHENGGUO POMEGRANATE WINE Co Ltd
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2008-11-12

Abstract

本发明涉及一种石榴酒酵母的选育方法。现在使用的石榴酒酵母存在着发酵不彻底，石榴酒残糖高、酒度低、挥发酸高、果香淡薄、不宜储存等缺点。本发明根据自然界中野生酵母菌的存在，取石榴园的土壤、石榴树叶、石榴树皮、腐烂石榴、完整石榴的表皮加水离心分离培养；取果酒干酵母，用水活化培养；再将上述两种菌种接种在培养基上培养；经缓冲液冲洗、蜗牛酶处理、电击、紫外光照射诱变，最后经酵母培养基培养制成。本发明的优点是：酵母发酵力强，超过任何其它酵母；对乙醇、单宁、SO₂抵抗力强；能生成更多的乙醇；酿造出的石榴干酒酒香突出，易长期保存；酵母繁殖培养容易。

Description

一种石榴酒酵母的选育方法

技术领域

本发明涉及一种酒类酵母的选育方法，具体地说是一种石榴酒酵母的选育方法。

背景技术

石榴含有大量的氨基酸、维生素和多种微量元素。石榴酒系采用石榴为主要原料，经去皮、压榨、发酵、分离、陈酿而成的果酒。石榴酒色泽光亮透明，有石榴的天然风味，含有大量的氨基酸、多种维生素等。具有很高的营养价值，并有生津化食、健脾益胃、降压降脂、软化血管、保健美容及止泻之功效。酿造石榴酒必须有酵母，现在的石榴酒酵母是用市场上购置的果酒酵母或存在于果皮中的自然酵母，但是现有酵母存在着发酵不彻底，石榴酒残糖高、酒度低、挥发酸高、果香淡薄、不宜储存等缺点。因此发明一种能够使石榴汁发酵彻底，石榴酒残糖低、酒度高、挥发酸低、果香浓郁、适宜长期储存的新的石榴酒酵母是十分必要的。

发明内容

本发明目的在于提供一种石榴汁发酵彻底，石榴酒残糖低、酒度高、挥发酸低、果香浓郁、适宜长期储存的石榴酒酵母的选育方法。

本发明内容如下：

一种石榴酒酵母的选育方法，包括下列步骤：

(1)取石榴园的土壤、石榴树叶、石榴树皮、腐烂石榴、完整石榴的表皮各10重量份，放入装有80份水的瓶中，离心机旋转30分钟，120转/分；取0.2毫升接种到用98％的无菌石榴汁和2％的琼脂制作的营养基中；

(2)取果酒干酵母1g，用35-40℃水100毫升活化后，取0.1毫升接种于培养基中，28℃培养一天；

(3)将上述(1)、(2)两种菌种接在培养基上，30℃培养一天；将培养后的酵母菌斑接种到用石榴汁97％，蛋白胨2％，酵母膏1％杀菌制成的溶液中，35℃，250转/分摇床震荡培养10-12小时；

(4)取(3)菌液5毫升，3500转/分离心5分钟，用磷酸缓冲液洗2次，加3毫升预处理剂，29℃培养10分钟后，离心5分钟，3500转/分，弃去上清液；

(5)取(3)所得菌液5毫升用蜗牛酶处理30-40分钟；

(6)取(4)、(5)所得菌液各0.5毫升混合，用0.4mol/L CaCl₂洗涤、离心，涂于培养基上，28℃培养3天；用电击仪电击，电击时间40分钟；

(7)取5毫升电击后菌液置于直径9cm的平皿中，用20W紫外光管放于30cm处照射1-2分钟，并不断搅拌，稀释涂布诱变培养基中；

(8)取澄清的石榴汁，调整糖度12-14％，PH：5-6，加琼脂2-2.5％，加热至90-95℃溶化，分装于试管中，塞上棉塞，115℃高温杀菌30-40分钟；冷凝后制成酵母培养基；取(7)菌种接种到酵母培养基上，在28-30℃恒温箱中培养3天，取出放在-10℃以下保存；数日后反复培养、提纯，置于-70℃以下贮存。

培养基为澄清石榴汁90％、蛋白胨2％、葡萄糖5％、酵母膏1％、琼脂2％制成；磷酸缓冲液为：92份0.2mol/L NaH₂PO₄和8份0.2moL/L NaHPO₄、PH＝5.8制成；预处理剂为：100毫升磷酸缓冲液中加0.1毫升EDTA和0.1毫升β-巯基乙醇制成；诱变培养基为：培养基加0.2％的LiCl制成。

本发明的要点在于：根据自然界中野生酵母菌的存在，取石榴园的土壤、石榴树叶、石榴树皮、腐烂石榴、完整石榴的表皮加水离心分离培养；取果酒干酵母，用水活化培养；再将上述两种菌种接种在培养基上培养；经缓冲液冲洗、蜗牛酶处理、电击、紫外光照射诱变，最后经酵母培养基培养制成。

本发明的第一步是根据自然界中野生酵母菌的存在，选择样品来源。样品主要来源于石榴园的土壤，玛瑙石榴叶表皮，石榴树腐朽树皮及腐烂石榴和完整石榴的表皮。本发明采用先富集然后分离纯化的顺序，取每种样品各10份，分别放入装有80份的无菌水瓶中。离心机120转/分，旋转分离30分钟后，取0.2毫升涂布在平皿上。平皿基用98％的无菌石榴汁和2％的琼脂制作，每个样品3个平行。从上述平皿中挑选典型菌落，再通过平皿进行分离纯化，选育出直径大、活力强、纯度高的酵母菌，接种斜面培养基中。

培养基的制备方法是：澄清石榴汁、90％、蛋白胨2％、葡萄糖5％、酵母膏1％、琼脂2％，经115℃灭菌30分钟制成。

第二步取现有商品酵母果酒活性干酵母1g，用35-40℃水100毫升进行活化后，取0.1毫升接种于斜面培养基中，28℃温度培养一天。

第三步将上述第一步、第二步培养的两种菌接种在培养基斜面上，30℃培养一天，重复两次，将活化的酵母菌斑用接种针挑取适量接种到杀过菌的石榴汁97％，蛋白胨2％，酵母膏1％的溶液中，35℃，250转/分钟摇床震荡培养10-12小时，此时可达到对数生长期。

第四步制备原生质体：

取上述活化的处于对数生长期中期的菌液(浓度约为2×10⁷个毫升)5毫升，3500转/分钟离心5分钟得到菌体，用磷酸缓冲液(0.2mol/L NaH₂PO₄92毫升和0.2moL/L NaH₂PO₄8毫升，PH＝5.8)洗2次，加3毫升预处理剂(100毫升磷酸缓冲液中加0.1毫升EDTA和0.1毫升β-巯基乙醇)29℃培养10分钟。再经3500转/分钟离心5分钟，弃去上清夜，得到一种原生质体；用蜗牛酶处理30-45分钟得另一种原生质体。蜗牛酶可以购买，例如从北京欣经科生物技术有限公司购得。需经稀释，稀释方法为；取适量蜗牛酶加入到用92毫升的0.2moL/L NaH₂PO₄和8毫升的0.2moL/L NaHPO₄，加17g蔗糖配制成的溶液中，稀释成浓度为1.5％的溶液，用0.22um滤膜过滤除菌。

第五步融合处理：将两种原生质体进行种内和种间融合。

融合步骤：取两种原生质体各0.5毫升等量混合，离心；用0.4mol/L CaCl₂洗涤、离心，后涂于培养基上，28℃培养3天。

电击融合：用电击仪进行电击，条件为5KV/cm，25MF和200Ω，电击时间40分钟。

第六步诱变处理：采用紫外照射诱变，取5毫升菌液于直径9cm的平皿中，用20W紫外光管放于30cm处分别照射一段时间，一般为1-2分钟，同时不断搅拌，然后在红光下操作稀释涂布在诱变培养基中；诱变培养基用第一步所述的培养基加0.2％的LiCl制成。

第七步石榴专用酵母菌制备：取澄清的石榴汁，调整糖度：12-14％，PH：5-6，加琼脂2-2.5％，加热至90-95℃溶化，分装于预先洗净、干热杀菌的试管中，每管装量以制成斜面后约占试管长度的1/3为宜，塞上棉塞，在115℃高温锅内杀菌30-40分钟，杀菌后趁热制成斜面，冷凝后置于28-30℃恒温箱中观察培养3天。若无杂菌繁殖，便可种植由上述方法经选育、原生质体融合杂交、诱变而得到的菌株较大的菌种，将该菌种移植到斜面培养基上，在28-30℃恒温箱中培养3天，待菌株繁殖良好后，取出放在-10℃以下的冰箱中保存，数日后再重新移植培养几次，这样反复培养、提纯，以免菌种衰老变异。待该菌种稳定后，即可存入-70℃以下的专用菌种培养箱中贮存，使用时通过扩大培养，即可得到生产工艺的要求。

采用上述方法制得的石榴酒酵母细胞透明、呈圆或椭圆型，形态肥大，一般在7-12um，是酿造优质石榴干酒的主要酵母，发酵力超过任何其它现有使用的酵母，对乙醇、单宁、SO₂抵抗力强，能生成更多的乙醇，代谢附产物丰富，产香明显突出，易长期保存。

本发明由于选用石榴表皮和树干、土壤中的野生酵母和优质果酒活性干酵母进行原生质体融合、诱变、驯化等方法进行杂交育种而得，具有实质性特点，特别适用于石榴酒的发酵。尤其是本发明方法可以根据各种石榴酒酿造使用的不同石榴品种，不同种植地区的土壤做样品，选取野生酵母菌，就更使得本发明具有创造性。经广泛查询国内外出版物和专利文献，均未见有相同的方法选育石榴酒酵母的报道。本发明的优点在于：1.发酵力强，超过任何其它酵母；2.对乙醇、单宁、SO₂抵抗力强；3.能生成更多的乙醇；4.酿造出的石榴干酒酒香突出，易长期保存；5.繁殖培养容易，由一菌株发出，就能逐步扩大培养制造出酿造所需的酒母。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：

1.取怀远地区玛瑙石榴园的土壤，玛瑙石榴叶表皮，石榴树腐朽树皮及腐烂石榴和完整石榴的表皮，每种样品各10克，分别放入装有80毫升无菌水的250毫升三角瓶中。离心机120转/分，旋转30分钟后，取0.2毫升涂布在平皿上，平皿基用98％的无菌石榴汁和2％的琼脂制作，3个平行样品，从上述平皿中挑选典型菌落，再通过平皿进行分离纯化，选育出直径大、活力强、纯度高的酵母菌，接种斜面培养基中。培养基的制备方法为：澄清石榴汁90％、蛋白胨2％、葡萄糖5％、酵母膏1％、琼脂2％，115℃灭菌30分钟。

2.取实验室保存的法国拉曼公司生产的DV10果酒活性干酵母1g，用35℃水100毫升进行活化后，取0.1毫升接种于斜面培养基中，28℃培养一天。

3.将上述培养的两种菌接种在培养基斜面上，30℃培养一天；再接种重复培养两次；将活化的酵母菌斑用接种针挑取适量接种到杀过菌的石榴汁97％，蛋白胨2％，酵母膏1％的溶液中，35℃，250转/分钟摇床震荡培养10-12小时，此时可达到对数生长期。

4.取上述活化的处于对数生长期中期的菌液(浓度为2×10⁷个/毫升)5毫升，3500转/分钟离心5分钟得到菌体。

配制磷酸缓冲液、预处理剂和蜗牛酶：磷酸缓冲液(0.2mol/L NaH₂PO₄ 92毫升和0.2moL/L NaH₂PO₄ 8毫升，PH＝5.8)。预处理剂(100毫升磷酸缓冲液中加0.1毫升EDTA和0.1毫升β-巯基乙醇)。蜗牛酶(92毫升的0.2moL/L NaH₂PO₄和8毫升的0.2moL/L NaHPO₄，加17g蔗糖，稀释成浓度为1.5％的溶液，用0.22um滤膜过滤除菌)。用磷酸缓冲液洗菌体2次，加3毫升预处理剂29℃培养10分钟。再经3500转/分钟离心5分钟，弃去上清液，得到一种原生质体；用蜗牛酶处理30-45分钟得另一种原生质体。

5.将两种原生质体进行种内和种间融合。

a.两种原生质体各取0.5毫升等量混合，离心；用0.4mol/L CaCl₂洗涤、离心，后涂于培养基上，28℃培养3天。

b.培养3天后用电击仪进行电击，电击时间40分钟，条件为5KV/cm，25MF和200Ω。

6.取5毫升菌液于直径9cm的平皿中，用20W紫外光管放于30cm处照射1分钟，同时搅拌，然后在红光下稀释涂布在诱变培养基中；诱变培养基用培养基加0.2％的LiCl制成。

7.石榴专用酵母菌制备：取澄清的石榴汁，调整糖度：12-14％，PH：5-6，加琼脂2-2.5％，加热至90-95℃溶化，分装于预先洗净、干热杀菌的试管中，每管装量以制成斜面后约占试管长度的1/3为宜，塞上棉塞，在115℃高温锅内杀菌30-40分钟，杀菌后趁热制成斜面，冷凝后置于28-30℃恒温箱中培养3天。再将该菌种移植到斜面培养基上，在28-30℃恒温箱中培养3天，取出放在-10℃以下的冰箱中保存。5日后再移植培养，存入-70℃以下的专用菌种培养箱中贮存。使用时取出扩大培养即可得到符合生产工艺的要求优质石榴酒酵母。命名为CG-01石榴酒专用酵母菌。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种石榴酒酵母的选育方法，包括下列步骤：

(5)取(3)所得菌液5毫升用蜗牛酶处理30-40分钟；

2.根据权利要求1所述的石榴酒酵母的选育方法，培养基为：澄清石榴汁90％、蛋白胨2％、葡萄糖5％、酵母膏1％、琼脂2％制成；磷酸缓冲液为：92份0.2mol/L NaH₂PO₄和8份0.2moL/L NaHPO₄、PH＝5.8制成；预处理剂为：100毫升磷酸缓冲液中加0.1毫升EDTA和0.1毫升β-巯基乙醇制成；诱变培养基为：培养基加0.2％的LiCl制成。